نود أن نشكر الدكتور جيفري روثشتين لتوفير BAC GLT1 الفئران EGFP والأجسام المضادة GLT1؛ تافتس مركز البحوث العصبية (NIH P30 NS047243؛ PI، روب جاكسون) لتوفير المرافق الأساسية قيمة؛ جديد كلية منحة التوظيف (NIH P30-02 5P30NS069254 ؛ PI، فيل هايدون) في علم الأعصاب تافتس الإدارة.

1. جمعية الثقافة ميكروفلويديك الدائرة (MCP) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> MCP (الشكل 1) هي الدوائر المفتوحة مصممة للثقافات مجزا من أنواع مختلفة من الخلايا 4. لديها عادة اثنين من مقصورات التي ترتبط من خلال القنوات المركزية (3 ميكرون في القطر). جمعية MCP مع الزجاج ذات قاع الأطباق ضروري لإعداد الثقافات واللاحقة تحليل التصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأولى، ومعطف العقيمة ذات قاع زجاجي مع الأطباق Polyornithine (سيغما الدريخ، 1 ملغ / مل) الذائب في بورات ثنائي الصوديوم (سيغما الدريخ، 10 ملي درجة الحموضة 8.5) وحضنت بين عشية وضحاها في C. ° 37 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم التالي، تم غسلها المغلفة الزجاج ذات قاع أطباق ثلاث مرات مع DDH 2 O ويجفف تحت غطاء محرك السيارة والدخان العقيمة. كانت الأطباق الزجاجية القاع ثم المغلفة مع مزيد من laminin (سيغما الدريخ، 1 ملغ / مل) وتجفيفها تحت أشعة UV لمدة 1 ساعة. الأطباق المغلفة تكون جاهزة للاستخدام أو يمكن تخزينها في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام. هذه لطلاءإعادة طلاء الخلايا العصبية اللازمة لوالخلايا النجمية في الثقافة المشتركة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتجميع منصة الثقافة، وضعت منصات الثقافة ميكروفلويديك على رأس من الأطباق الزجاجية ذات قاع المغلفة مع قنوات الاتصال المركزية على الجانب السفلي لتشكيل ختم مشددة. أضيفت الخلايا العصبية العادية أو وسائل الثقافة نجمية (من المناطق الطلاء الخلية) على كلا الجانبين (الشكل 1) في MCP تجميعها وحضنت لمدة 2-4 ساعات في C ° 37، لضمان عدم وجود تسرب بين MCP والزجاج قاع الطبق. لقد اختبرنا قبل الخلايا المتوسطة مع الطلاء لضمان عدم وجود تسرب. وينبغي جمعية MCP على صحن من الزجاج ذات قاع الطازجة قبل استخدامها. </li></ol> 2. إعداد الثقافة الخلايا العصبية ومحاور عصبية تحريض الخلايا العصبية في تجميعها MCP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وأعدت طازجة القشرية مزارع الخلايا العصبية الجنينية من أدمغة فئران 14-16 يوما. وتتكون ثقافة المتوسط ​​الخلايا العصبية من neurobasal المتوسطة، 2٪ B27 neurobasaL الملحق، 2 مم الجلوتامين بإضافة 1٪ من GlutaMAX 100X، و 1٪ البنسلين-streptomysin. بعد تشريح مخ الفأر، تمت إزالة القشرة من السحايا تحت المجهر تشريح. ومفروم ثم الأنسجة مع شفرة حلاقة لجعل كتل الأنسجة الصغيرة من أجل زيادة مساحة السطح المعرض للالتربسين. وtrypsinized كتل الأنسجة (سيغما الدريخ، التربسين 0.05٪) لمدة 10 دقيقة في حمام مائي 37 ° C، وفصلها بعد ذلك بلطف بواسطة سحن مع ماصة باستور النار مصقول. تم تصفية الخلايا من خلال مصفاة فصل ميكرون 70 إلى جمع واضحة التعليق الخلية العصبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كانت مطلية الخلايا العصبية (2-3 × 10 6 / مل، 150 ميكرولتر) على المناطق الطلاء الخلية على الجانب الأيمن (الشكل 1) من MCP تجميعها بحيث الخلايا العصبية يمكن أن نعلق في الخلية الاحتفاظ المنطقة (الشكل 1). كانت مطلية الخلايا العصبية الطازجة مع طلاء الخلايا العصبية التي المتوسطة وتستكمل مع 5٪ مصل بقري جنيني (Hyclone) في اللوائح التنظيميةR المتوسطة الخلايا العصبية الثقافة. فقط لأن الخلايا العصبية التي تربط الخلايا في منطقة الاحتفاظ القابلة للنمو محاور عصبية في الجانب الآخر من MCP تجميعها من خلال القنوات المركزية، من المهم أن الكثافة العالية لوحة من الخلايا العصبية في منطقة الخلية الطلاء لضمان ما يكفي من الخلايا العصبية هي التي تعلق على خلية الاحتفاظ المنطقة. يظهر صورة ممثل كثافة عالية من محاور عصبية الخلايا العصبية في الشكل 2A. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم التالي، تم استبدال المتوسطة الطلاء من قبل الخلايا العصبية الخلايا العصبية الثقافة المتوسطة العادية. تم انجازه من قبل الشفط تغيير المتوسطة بعناية المتوسطة من الخلية المنطقة الطلاء للغرفة، ولكن ليس من الخلية المنطقة الإبقاء على MCP تجميعها. من أجل تجنب فقاعات الهواء في الخلية والاحتفاظ المنطقة الوسطى قنوات الاتصال وسوف فقاعات الهواء تمنع بشدة ثمرة محور عصبي ودخولها لاحقا في القنوات المركزية في MCP. وأضيف أيضا خلايا الدبقية عامل التغذية العصبية المشتقة (GDNF، 10-20 نانوغرام / مل) على الجانب (اليسار) أخرىللغرفة في نفس اليوم لتسهيل ثمرة تحريض محور عصبي 5 من الجانب العصبية وعبر من خلال القنوات المركزية للتجمع MCP (الشكل 2A). ويلاحظ أيضا قدر لا بأس به من عفوية دون ثمرة محوار GDNF من الجانب العصبية وعبر من خلال القنوات المركزية للتجمع MCP. ويلاحظ في كثير من الأحيان محاور عصبية التي تدخل في قناة المركزي 2-3 أيام بعد الطلاء. وبمجرد أن يدخل في محاور عصبية القناة الوسطى، وعادة ما يدخلون الجانب الآخر خلال يوم واحد. محاور عصبية سليمة عادة ما تكون لمدة أسبوع على الأقل بعد دخول الجانب الآخر. </li></ol> 3. إضافة إلى الخلايا النجمية مثقف MCP لإنشاء مجزأة المشارك ثقافة النظام وأعدت الثقافات نجمية الأساسي من المخ P1-3 الماوس الجرو. الإجراء تفارق الدماغ مشابه للإجراء زنزانة انفرادية العصبية المذكورة أعلاه. كانت مطلية 1 الخلايا النجمية في صحن 10 سم التي تم مسبقا-المغلفة مع Polyornithine (سيغما الدريخ، 1 ملغ / مل). تم تغيير ثقافة المتوسط ​​نجمية (DMEM، و 10٪ مصل بقري جنيني، 1٪ البنسلين-streptomysin) كل يوم لمدة اليومين المقبلين لإزالة الحطام. بعد ذلك، تم تغيير المتوسطة كل ثلاثة أيام. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخلايا النجمية تصبح متموجة 90٪ وتشكيل أحادي الطبقة بعد 7 أيام. وtrypsinized الخلايا النجمية ومتموجة و150 ميكرولتر من إعادة علقت الخلايا النجمية (1x10 6 / مل) إعادة مطلي في الخلية طلاء المنطقة من الجانب الأيسر من MCP تجميعها عند محاور عصبية على وشك الدخول أو دخلت فقط في الجانب الأيسر من وتجميعها MCP. كانت مطلية عادة 4-5 أيام بعد النجمية الخلايا العصبية كانت مطلية. كان أولا من إزالة الطلاء GDNF قبل إعادة من الخلايا النجمية في الجانب الأيسر من MCP. كانت تعلق إعادة مطلي الخلايا النجمية في الخلية الاحتفاظ المنطقة، كما هو موضح من قبل المناعية GFAP (الشكل 1). تدفق سوى الحد الأدنى من المتوسط ​​بين الجانبين للدوائر (يحددها د مضانتم العثور نعم) في MCP، كما هو موضح سابقا 4،6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخلايا النجمية تصبح متموجة 90٪ وتشكيل أحادي الطبقة بعد 7 أيام. وtrypsinized الخلايا النجمية متموجة و 150 ميكرولتر من إعادة علقت الخلايا النجمية (1 × 10 6 / مل) تم إعادة مطلي في الخلية طلاء المنطقة من الجانب الأيسر من MCP تجميعها عند محاور عصبية على وشك الدخول أو دخلت للتو الى اليسار جانب من MCP تجميعها. كانت مطلية عادة 4-5 أيام بعد النجمية الخلايا العصبية كانت مطلية. كان أولا من إزالة الطلاء GDNF قبل إعادة من الخلايا النجمية في الجانب الأيسر من MCP. كانت تعلق إعادة مطلي الخلايا النجمية في الخلية الاحتفاظ المنطقة، كما هو موضح من قبل المناعية GFAP (الشكل 1). تم العثور على تدفق فقط الحد الأدنى من المتوسط ​​بين الجانبين للدوائر (يحدده الأصباغ مضان) في MCP، كما هو موضح سابقا 4،6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد إعادة الطلاء من الخلايا النجمية، محاور عصبية التي دخلت الجانب الأيسر من MCP تجميعها تتفاعل مباشرة مع النجمocytes عن طريق الاتصال المباشر إما محور عصبي أو إطلاق العوامل القابلة للذوبان. المناعية من astroglial GLT1 غشاء البلازما نقل الغلوتامات والعصبية تويولين βIII-أجريت لتصور التفاعل بين الخلايا النجمية ومحاور عصبية، وكما هو مبين في الشكل 2D-F. </li></ol>

<ol>
	<li>Stevens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuron-astrocyte+signaling+in+the+development+and+plasticity+of+neural+circuits.">Neuron-astrocyte signaling in the development and plasticity of neural circuits.</a> Neuro-Signals. 16, 278-288 (2008).</li><li>Paixao, S., Klein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuron-astrocyte+communication+and+synaptic+plasticity.">Neuron-astrocyte communication and synaptic plasticity.</a> Current opinion in neurobiology. 20, 466-473 (2010).</li><li>Fields, R. D., Stevens-Graham, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+neuron-glia+communication.">New insights into neuron-glia communication.</a> Science. 298, 556-562 (2002).</li><li>Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+culture+platform+for+neuroscience+research.">Microfluidic culture platform for neuroscience research.</a> Nature. 1, 2128-2136 (2006).</li><li>Wang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+neuromuscular+synapse+development+by+glial+cell+line-derived+neurotrophic+factor+and+neurturin.">Regulation of neuromuscular synapse development by glial cell line-derived neurotrophic factor and neurturin.</a> The Journal of biological chemistry. 277, 10614-10625 (2002).</li><li>Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+regulation+of+astroglial+excitatory+neurotransmitter+transporter+GLT1.">Presynaptic regulation of astroglial excitatory neurotransmitter transporter GLT1.</a> Neuron. 61, 880-894 (2009).</li><li>Regan, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variations+in+promoter+activity+reveal+a+differential+expression+and+physiology+of+glutamate+transporters+by+glia+in+the+developing+and+mature+CNS.">Variations in promoter activity reveal a differential expression and physiology of glutamate transporters by glia in the developing and mature CNS.</a> The Journal of neuroscience. 27, 6607-6619 (2007).</li><li>Swanson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+regulation+of+glutamate+transporter+subtype+expression+in+astrocytes.">Neuronal regulation of glutamate transporter subtype expression in astrocytes.</a> The Journal of neuroscience. 17, 932-940 (1997).</li><li>Schlag, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+glial+Na+-dependent+glutamate+transporters+by+cyclic+AMP+analogs+and+neurons.">Regulation of the glial Na+-dependent glutamate transporters by cyclic AMP analogs and neurons.</a> Molecular pharmacology. 53, 355-369 (1998).</li><li>Ponomarev, E. D., Novikova, M., Maresz, K., Shriver, L. P., Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+culture+system+that+supports+adult+microglial+cell+proliferation+and+maintenance+in+the+resting+state.">Development of a culture system that supports adult microglial cell proliferation and maintenance in the resting state.</a> Journal of immunological. 300, 32-46 (2005).</li><li>Espinosa-Jeffrey, A., Wakeman, D. R., Kim, S. U., Snyder, E. Y., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+system+for+rodent+and+human+oligodendrocyte+specification,+lineage+progression,+and+maturation.">Culture system for rodent and human oligodendrocyte specification, lineage progression, and maturation.</a> Current protocols in stem cell biology. Chapter 2, (2009).</li><li>Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mystery+and+magic+of+glia:+a+perspective+on+their+roles+in+health+and+disease.">The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease.</a> Neuron. 60, 430-440 (2008).</li><li>Debanne, D., Rama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+shape+axonal+signaling.">Astrocytes shape axonal signaling.</a> Science signaling. 4, pe11 (2011).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

الخلايا العصبية القائمة على MCP والخلايا النجمية نظام المشاركة في الثقافة يسمح تشريح الخلايا العصبية إشارات تفصيلية لمسارات دبق نجمي الخلايا عن طريق السماح فقط محاور عصبية تمرير القنوات المركزية والتفاعل مع الخلايا astroglial. ويمكن هذا النظام شارك في وضع مريح الثقافة م?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> المصل البقري الجنين </td><td> Hyclone </td><td> SH30070.03 </td><td> وبالنسبة للطلاء الخلايا العصبية للعصبون المتوسطة cutlure </td></tr><tr><td> المصل البقري الجنين </td><td> سيغما الدريخ </td><td> F4135 </td><td> لثقافة المتوسط ​​نجمية </td></tr><tr><td> الدبقية مشتقة عامل الأعصاب </td><td> R &amp; D أنظمة </td><td> 212-GD </td><td> تطبيق 10-20 نانوغرام / مل إلى جانب الخلايا العصبية من غرفة </td></tr><tr><td> Dulbecco تعديل النسر المتوسط ​​ارتفاع نسبة الجلوكوز </td><td> سيغما الدريخ </td><td> 11995 </td><td></td></tr><tr><td> 70 مم مصفاة الخلية </td><td> BD الصقر </td><td> 352350 </td><td></td></tr><tr><td> طبق زجاج معقمة أسفل </td><td> شركة ماتيك </td><td></td><td></td></tr><tr><td> منصات الثقافة ميكروفلويديك </td><td> Xona على microfluidics LLC </td><td> SND150 </td><td></td></tr><tr><td> 6 آبار لوحة الثقافة </TD&gt; <td> Cellstar </td><td> 657 160 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> مستنبت الخلايا العصبية <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Neurobasal المتوسطة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2٪ B27 الملحق Neurobasal </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 الغلوتامات ملي بإضافة 1٪ 100X GlutaMAX </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1٪ البنسلين-streptomysin </li></ul></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> الخلايا العصبية للخلية ثقافة المتوسط ​​الطلاء <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Neurobasal المتوسطة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2٪ B27 الملحق Neurobasal </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 الغلوتامات ملي بإضافة 1٪ 100X GlutaMAX </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1٪ البنسلين-streptomysin </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5٪ مصل بقري جنيني SH30070.03 </li></ul></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> نجمية مستنبت <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dulbecco تعديل عصامGLE ارتفاع نسبة الجلوكوز المتوسطة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10٪ الجنين مصل بقري F4135 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1٪ البنسلين-streptomysin </li></ul></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> الجدول 1. المواد المستخدمة في محور عصبي ميكروفلويديك منصة القائمة على العصبية والخلايا الدبقية الثقافة نظام المشاركة في الثقافة. </td></tr></tbody></table>

imaging analysis of neuron to glia interaction in microfluidic culture platform (mcp)-based neuronal axon and glia co-culture system

الخلايا العصبية المناسبة لتفاعل الخلايا الدبقية أمر بالغ الأهمية للعمل الفسيولوجية للجهاز العصبي المركزي (CNS). وتوسطت متطور هذا الاتصال ثنائي الاتجاه عن طريق محددة مسارات الإشارات العصبية بين الخلايا الدبقية و1،2. تحديد وتوصيف هذه المسارات إشارة ضرورية لفهم كيفية الخلايا العصبية لعلم وظائف الأعضاء الدبقية التفاعل CNS الأشكال. سابقا، تم الخلايا العصبية والخلايا الدبقية الثقافات المختلطة المستخدمة على نطاق واسع لاختبار وتميز بين مسارات الإشارات العصبية والخلايا الدبقية. ما تعلمناه من هذه الاستعدادات وغيرها من الأدوات في الجسم الحي، ومع ذلك، فقد اقترح أن يشير المتبادل بين الخلايا العصبية والخلايا الدبقية وقعت في كثير من الأحيان في حجرات داخل الخلايا العصبية المحددة (أي محور عصبي، التغصنات، أو سوما) 3. هذا يجعل من المهم لوضع نظام ثقافة جديدة تسمح فصل الأجزاء العصبية ويتناول على وجه التحديد التفاعل بين الخلايا الدبقية والعصبيةنال محاور عصبية / التشعبات. وبالإضافة إلى ذلك، فإن النظام التقليدي ثقافة مختلطة غير قادر على التمييز بين العوامل القابلة للذوبان وإشارات الاتصال المباشر بين الخلايا العصبية وغشاء الخلايا الدبقية. وعلاوة على ذلك، فإن كمية كبيرة من الخلايا العصبية والخلايا الدبقية في نظام المشاركة في الثقافة التقليدية تفتقر إلى القرار اللازم لمراقبة التفاعل بين محور عصبي واحد وخلية الدبقية. في هذه الدراسة، ونحن تصف الرواية ومحور عصبي الدبقية نظام المشاركة في الثقافة مع استخدام منصة ميكروفلويديك الثقافة (MCP). في هذا النظام شارك في الثقافة، والمثقف الخلايا العصبية والخلايا الدبقية في غرفتين منفصلتين التي ترتبط من خلال قنوات متعددة المركزية. في هذا المنبر الثقافة ميكروفلويديك، يمكن لعمليات الخلايا العصبية فقط (محاور عصبية خاصة) أدخل الجانب الدبقية عن طريق القنوات المركزية. في تركيبة مع وضع العلامات القوية بروتين فلوري، وهذا النظام يسمح الفحص المباشر للإشارة مسارات التفاعلات بين محور عصبي / شجيري والدبقية، فإن مثل هذاق محور عصبي بوساطة تنظيم النسخي في، الدبقية الاتجار مستقبلات الخلايا الدبقية بوساطة الخلايا العصبية في محطات، والخلايا الدبقية بوساطة نمو محور عصبي. قطر الدائرة الضيقة ليحظر أيضا بشكل كبير من تدفق المتوسطة الخلايا العصبية التخصيب الى غرفة الدبقية، وتسهيل التحقيق للتفاعل غشاء من البروتين مباشرة بين محاور عصبية / التشعبات والسطوح الدبقية.

الوقت الفاصل بين التصوير من محور عصبي تحليل الناجم عن تفعيل الخلايا النجمية في المروج GLT1 الخلايا العصبية ومجزا نجمية نظام المشاركة في الثقافة يسمح فقط العمليات العصبية، محاور عصبية خاصة، للتفاعل مع انتقائي الخلايا النجمية. بعد ن?...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform MCP-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System at JoVE.com

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform MCP-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

هذه الدراسة توضح إجراءات إنشاء محور عصبي رواية العصبية و(الفلكية) الدبقية منصة شارك في الثقافة. في هذا النظام المشترك والثقافة، والتلاعب التفاعل المباشر بين محور عصبي واحد (واحد الخلية الدبقية) يصبح ممكنا، مما يسمح للتحليل الآلي للعصبون إشارات متبادلة لالدبقية.

تحليل التصوير من الخلايا العصبية إلى الخلايا الدبقية في التفاعل منهاج الثقافة ميكروفلويديك (MCP) على أساس الخلايا العصبية والخلايا الدبقية اكسون نظام المشاركة في الثقافة

Proper  neuron to glia interaction is critical to physiological function of the central  nervous system (CNS). This bidirectional communication is ...

imaging-analysis-neuron-to-glia-interaction-microfluidic-culture

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform (MCP)-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

14.9K Views.  Tufts University. هذه الدراسة توضح إجراءات إنشاء محور عصبي رواية العصبية و(الفلكية) الدبقية منصة شارك في الثقافة. في هذا النظام المشترك والثقافة، والتلاعب التفاعل المباشر بين محور عصبي واحد (واحد الخلية الدبقية) يصبح ممكنا، مما يسمح للتحليل الآلي للعصبون إشارات متبادلة لالدبقية...

Video: Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform MCP-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or co-culture model. This system is suitable for a variety of experimental needs requiring either a glass or plastic growth substrate and can also be used for culture of other types of neurons.
Rat cortical neurons obtained from the late embryonic stage (E17) are plated on glass coverslips or tissue culture dishes facing a feeder layer of glia grown on dishes or plastic coverslips (known as Thermanox), respectively. The choice between the two configurations depends on the specific experimental technique used, which may require, or not, that neurons are grown on glass (e.g. calcium imaging versus Western blot). The glial feeder layer, an astroglia-enriched secondary culture of mixed glia, is separately prepared from the cortices of newborn rat pups (P2-4) prior to the neuronal dissection.
A major advantage of this culture system as compared to a culture of neurons only is the support of neuronal growth, survival, and differentiation provided by trophic factors secreted from the glial feeder layer, which more accurately resembles the brain environment in vivo. Furthermore, the co-culture can be used to study neuronal-glial interactions1.
At the same time, glia contamination in the neuronal layer is prevented by different means (low density culture, addition of mitotic inhibitors, lack of serum and use of optimized culture medium) leading to a virtually pure neuronal layer, comparable to other established methods1-3. Neurons can be easily separated from the glial layer at any time during culture and used for different experimental applications ranging from electrophysiology4, cellular and molecular biology5-8, biochemistry5, imaging and microscopy4,6,7,9,10. The primary neurons extend axons and dendrites to form functional synapses11, a process which is not observed in neuronal cell lines, although some cell lines do extend processes.
A detailed protocol of culturing rat hippocampal neurons using this co-culture system has been described previously4,12,13. Here we detail a modified protocol suited for cortical neurons. As approximately 20x106 cells are recovered from each rat embryo, this method is particularly useful for experiments requiring large numbers of neurons (but not concerned about a highly homogenous neuronal population). The preparation of neurons and glia needs to be planned in a time-specific manner. We will provide the step-by-step protocol for culturing rat cortical neurons as well as culturing glial cells to support the neurons.

Here we provide a protocol for culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer. The cultured neurons establish polarity and create synapses, and can be separated from the glia for use in various applications, such as electrophysiology, calcium imaging, cell survival assays, immunocytochemistry, and RNA/DNA/protein isolation.

ثنائي الصفائح المشارك ثقافة الجرذ الخلايا العصبية الابتدائية القشرية والدبقية

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices

Innervation plays a key role in the development, homeostasis and regeneration of organs and tissues. However, the mechanisms underlying these phenomena are not well understood yet. In particular, the role of innervation in tooth development and regeneration is neglected.
Several in vivo studies have provided important information about the patterns of innervation of dental tissues during development and repair processes of various animal models. However, most of these approaches are not optimal to highlight the molecular basis of the interactions between nerve fibres and target organs and tissues.
Co-cultures constitute a valuable method to investigate and manipulate the interactions between nerve fibres and teeth in a controlled and isolated environment. In the last decades, conventional co-cultures using the same culture medium have been performed for very short periods (e.g., two days) to investigate the attractive or repulsive effects of developing oral and dental tissues on sensory nerve fibres. However, extension of the culture period is required to investigate the effects of innervation on tooth morphogenesis and cytodifferentiation.
Microfluidics systems allow co-cultures of neurons and different cell types in their appropriate culture media. We have recently demonstrated that trigeminal ganglia (TG) and teeth are able to survive for a long period of time when co-cultured in microfluidic devices, and that they maintain in these conditions the same innervation pattern that they show in vivo.
On this basis, we describe how to isolate and co-culture developing trigeminal ganglia and tooth germs in a microfluidic co-culture system.This protocol describes a simple and flexible way to co-culture ganglia/nerves and target tissues and to study the roles of specific molecules on such interactions in a controlled and isolated environment.

Co-cultures represent a valuable method to study the interactions between nerves and target tissues and organs. Microfluidic systems allow co-culturing ganglia and whole developing organs or tissues in different culture media, thus representing a valuable tool for the in vitro study of the crosstalk between neurons and their targets.

تحليل وضع الأسنان جرثومة تعصيب استخدام أجهزة ميكروفلويديك المشارك الثقافة

Innervation plays a key role in the development, homeostasis and regeneration of organs and tissues. However, the mechanisms underlying these phenomena ...

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly controlled formation and maintenance of complex neuronal networks are not completely understood thus far. The open questions concerning neurons in health and disease are diverse and reaching from understanding the basic development to investigating human related pathologies, e.g.,&#160;Alzheimer&#39;s disease and&#160;Schizophrenia. The most detailed analysis of neurons can be performed in vitro. However, neurons are demanding cells and need the additional support of astrocytes for their long-term survival. This cellular heterogeneity is in conflict with the aim to dissect the analysis of neurons and astrocytes. We present here a cell-culture assay that allows for the long-term cocultivation of pure primary neurons and astrocytes, which share the same chemically defined medium, while being physically separated. In this setup, the cultures survive for up to four weeks and the assay is suitable for a diversity of investigations concerning neuron-glia interaction.

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

This protocol describes the indirect neuron-astrocyte coculture for compartmentalized analysis of neuron-glia interactions.

وغير المباشرة العصبية نجمية Coculture الفحص: هناك<em&gt; في المختبر</em&gt; مجموعة المتابعة للتحقيق مفصل من التفاعلات العصبية، الدبقية

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

Isolation and Culture of Primary Neurons and Glia from Adult Rat Urinary Bladder

The lower urinary tract has two main functions, namely, periodic urine storage and micturition; these functions are mediated through central and peripheral neuroregulation. Although extensive research on the lower urinary tract nervous system has been conducted, most studies have focused on primary culture. This protocol introduces a method for the isolation and culture of bladder neurons and glia from Sprague&#8211;Dawley rats. In this method, the neurons and glia were incubated in a 37 &#176;C, 5% CO2 incubator for 5&#8211;7 days. As a result, they grew into mature shapes suitable for related subsequent immunofluorescence experiments. Cells were morphologically observed using an optical microscope. Neurons, synaptic vesicles, and glia were identified by &#946;-III-tubulin and MAP-2, Synapsin-1, and GFAP staining, respectively. Meanwhile, immunocytochemistry was performed on several neurotransmitter-related proteins, such as choline acetyltransferase, DYNLL2, and SLC17A9.

This protocol attempts to establish a repeatable protocol for primary neurons and glia isolation from rat bladder for further cellular experiments.

عزل وثقافة الخلايا العصبية الأولية وغليا من المثانة البولية الجرذ الكبار

The lower urinary tract has two main functions, namely, periodic urine storage and micturition; these functions are mediated through central and ...

Targeted Neuronal Injury for the Non-Invasive Disconnection of Brain Circuitry

Surgical intervention can be quite effective for treating certain types of medically intractable neurological diseases. This approach is particularly useful for disorders in which identifiable neuronal circuitry plays a key role, such as epilepsy and movement disorders. Currently available surgical modalities, while effective, generally involve an invasive surgical procedure, which can result in surgical injury to non-target tissues. Consequently, it would be of value to expand the range of surgical approaches to include a technique that is both non-invasive and neurotoxic.
Here, a method is presented for producing focal, neuronal lesions in the brain in a non-invasive manner. This approach utilizes low-intensity focused ultrasound together with intravenous microbubbles to transiently and focally open the Blood Brain Barrier (BBB). The period of transient BBB opening is then exploited to focally deliver a systemically administered neurotoxin to a targeted brain area. The neurotoxin quinolinic acid (QA) is normally BBB-impermeable, and is well-tolerated when administered intraperitoneally or intravenously. However, when QA gains direct access to brain tissue, it is toxic to the neurons. This method has been used in rats and mice to target specific brain regions. Immediately after MRgFUS, successful opening of the BBB is confirmed using contrast enhanced T1-weighted imaging. After the procedure, T2 imaging shows injury restricted to the targeted area of the brain and the loss of neurons in the targeted area can be confirmed post-mortem utilizing histological techniques. Notably, animals injected with saline rather than QA do demonstrate opening of the BBB, but dot not exhibit injury or neuronal loss. This method, termed Precise Intracerebral Non-invasive Guided surgery (PING) could provide a non-invasive approach for treating neurological disorders associated with disturbances in neural circuitry.

The goal of the protocol is to provide a method for producing non-invasive neuronal lesions in the brain. The method utilizes Magnetic Resonance-guided Focused Ultrasound (MRgFUS) to open the Blood Brain Barrier in a transient and focal manner, in order to deliver a circulating neurotoxin to the brain parenchyma.

إصابة عصبية مستهدفة لقطع غير الغازية من دوائر الدماغ

Surgical intervention can be quite effective for treating certain types of medically intractable neurological diseases. This approach is particularly ...

Dissection and Isolation of Murine Glia from Multiple Central Nervous System Regions

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine neonates for the isolation of glial subpopulations. The purpose of the procedure is to dissociate microglia, oligodendrocyte progenitor cells (OPCs), and astrocytes from cortical, cerebellar, brainstem, and spinal cord tissue to facilitate further in vitro analysis. The CNS region isolation procedures allow for the determination of regional heterogeneity among glia in multiple cell culture systems. Rapid CNS region isolation is performed, followed by the mechanical removal of meninges to prevent meningeal cell contamination of glia. This protocol combines gentle tissue dissociation and plating on a specified matrix designed to preserve cell integrity and adherence. Isolating mixed glia from multiple CNS regions provides a comprehensive analysis of potentially heterogenous glia while maximizing the use of individual experimental animals. Additionally, following dissociation of regional tissue, mixed glia are further divided into multiple cell types including microglia, OPCs, and astrocytes for use in either single cell type, cell culture plate inserts, or co-culture systems. Overall, the demonstrated techniques provide a comprehensive protocol of broad applicability for careful dissection of four individual CNS regions from murine neonates and includes methods for the isolation of three individual glia cell types to examine regional heterogeneity in any number of in vitro cell culture systems or assays.

Here we present a protocol for in vitro isolation of multiple glial cell populations from a mouse CNS. This method allows for the segregation of regional microglia, oligodendrocyte precursor cells, and astrocytes to study the phenotypes of each in a variety of culture systems.

تشريح وعزل الفئران الدبقية من مناطق الجهاز العصبي المركزي المتعددة

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine ...

A Cell Culture Model for Studying the Role of Neuron-Glia Interactions in Ischemia

Ischemic stroke is a clinical condition characterized by hypoperfusion of brain tissue, leading to oxygen and glucose deprivation, and the consequent neuronal loss. Numerous evidence suggests that the interaction between glial and neuronal cells exert beneficial effects after an ischemic event. Therefore, to explore potential protective mechanisms, it is important to develop models that allow studying neuron-glia interactions in an ischemic environment. Herein we present a simple approach to isolate astrocytes and neurons from the rat embryonic cortex, and that by using specific culture media, allows the establishment of neuron- or astrocyte-enriched cultures or neuron-glia cultures with high yield and reproducibility.
To study the crosstalk between astrocytes and neurons, we propose an approach based on a co-culture system in which neurons cultured in coverslips are maintained in contact with a monolayer of astrocytes plated in multiwell plates. The two cultures are maintained apart by small paraffin spheres. This approach allows the independent manipulation and the application of specific treatments to each cell type, which represents an advantage in many studies.
To simulate what occurs during an ischemic stroke, the cultures are subjected to an oxygen and glucose deprivation protocol. This protocol represents a useful tool to study the role of neuron-glia interactions in ischemic stroke.

Here, we present a simple approach using specific culture media that allows the establishment of neuron- and astrocyte-enriched cultures, or neuron-glia cultures from the embryonic cortex, with high yield and reproducibility.

نموذج ثقافة الخلية لدراسة دور التفاعلات العصبية-غليا في الإقفاري

Ischemic stroke is a clinical condition characterized by hypoperfusion of brain tissue, leading to oxygen and glucose deprivation, and the consequent ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.

في الجسم الحي تصوير الكالسيوم في الزيتون السفلي الماوس

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Visualizing Shifts on Neuron-Glia Circuit with the Calcium Imaging Technique

Here, we report on selective in vitro models of circuits based on glia (astrocytes, oligodendrocytes, and microglia) and/or neurons from peripheral (dorsal root ganglia) and central tissues (cortex, subventricular zone, organoid) that are dynamically studied in terms of calcium shifts. The model chosen to illustrate the results is the retina, a simple tissue with complex cellular interactions. Calcium is a universal messenger involved in most of the important cellular roles. We explain in a step-by-step protocol how retinal neuron-glial cells in culture can be prepared and evaluated, envisioning calcium shifts. In this model, we differentiate neurons from glia based on their selective response to KCl and ATP. Calcium permeable receptors and channels are selectively expressed in different compartments. To analyze calcium responses, we use ratiometric fluorescent dies such as Fura-2. This probe quantifies free Ca2+ concentration based on Ca2+-free and Ca2+-bound forms, presenting two different peaks, founded on the fluorescence intensity perceived on two wavelengths.

Cell calcium imaging is a versatile methodology to study dynamic signaling of individual cells, on mixed populations in culture or even on awakened animals, based on the expression of calcium-permeable channels/receptors that gives unique functional signatures.

تصور التحولات على دائرة الخلايا العصبية الدبقية باستخدام تقنية تصوير الكالسيوم

Here, we report on selective in vitro models of circuits based on glia (astrocytes, oligodendrocytes, and microglia) and/or neurons from peripheral ...

Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Microglia in Immunocompetent Mice Brain via Non-Invasive Transnasal Route

Microglia are the specialized population of macrophage-like cells of the brain. They play essential roles in both physiological and pathological brain functions. Most of our current understanding of microglia is based on experiments performed in the mouse. Human microglia differ from mouse microglia, and thus response and characteristics of mouse microglia may not always represent that of human microglia. Further, due to ethical and technical difficulties, research on human microglia is restricted to in vitro culture system, which does not capitulate in vivo characteristics of microglia. To overcome these issues, a simplified method to non-invasively transplant induced pluripotent stem cell-derived human microglia (iPSMG) into the immunocompetent mice brain via a transnasal route in combination with pharmacological depletion of endogenous microglia using a colony-stimulating factor 1 receptor (CSF1R) antagonist is developed. This protocol provides a way to non-invasively transplant cells into the mouse brain and may therefore be valuable for evaluating the in vivo role of human microglia in physiological and pathological brain functions.

The protocol presented here allows the transplantation of induced pluripotent stem cell-derived human microglia (iPSMG) into the brain via a transnasal route in immunocompetent mice. The method for the preparation and transnasal transplantation of cells and the administration of cytokine mixture for the maintenance of iPSMG is shown.

زرع الخلايا الدبقية الصغيرة المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان في دماغ الفئران المناعية عبر طريق الأنف غير الغازي

Microglia are the specialized population of macrophage-like cells of the brain. They play essential roles in both physiological and pathological brain ...