ברצוננו להודות לד&quot;ר ג&#39;פרי רוטשטיין למתן עכברי BAC GLT1 eGFP וGLT1 נוגדנים; טאפטס מרכז למדעי מוח מחקר (NIH P30 NS047243; PI, רוב ג&#39;קסון) לאספקת מתקני גרעין יקרים; סגל גיוס מענק חדש (NIH P30 5P30NS069254-02 , PI, פיל היידון) בטאפטס Neuroscience מחלקה.

1. אסיפה של לשכת תרבות Microfluidic (MCP) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> MCP (1 איור) הם תאים פתוחים המיועדים לתרבויות מחולקות לסוגים שונים של תאים 4. זה בדרך כלל יש שני תאים המחוברים באמצעות הערוצים המרכזיים (3 מיקרומטר בקוטר). הרכבה של MCP עם מנות עם רצפת זכוכית היא הכרחית להכנת תרבויות וניתוח הדמיה שלאחר מכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית, מנות סטריליים מעייל עם רצפת זכוכית עם Polyornithine (סיגמה אולדריץ, 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל) מומסות tetraborate נתרן (סיגמה אולדריץ, 10 המ&quot;מ pH 8.5) והודגרו למשך הלילה ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום למחרת, את הכלים המצופים רצפת זכוכית נשטפו שלוש פעמים עם DDH 2 O והתייבשו תחת מנדף סטרילי. המנות עם רצפת הזכוכית היו אז עוד יותר מצופות עם laminin (סיגמה אולדריץ, 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל) והתייבש תחת אור UV במשך שעה 1. מנות מצופות מוכנות לשימוש או שניתן לאחסן ב -20 ° C עד לשימוש. אלה ציפוימחדש נחוץ לנוירונים ציפוי והאסטרוציטים בשיתוף התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להרכיב את פלטפורמת התרבות, פלטפורמות תרבות microfluidic הונחו על גבי הכלים המצופים רצפת הזכוכית עם ערוצי חיבור מרכזיים בצד התחתון שלו כדי ליצור חותם חזק. נוירון הרגיל או מדיומי התרבות astrocyte נוספו (מאזורי הציפוי הסלולריים) משני הצדדים (איור 1) לMCP התאסף ודגר 2-4 שעות על 37 מעלות צלזיוס, על מנת להבטיח שאין דליפה בין MCP והזכוכית צלחת תחתית. בדקנו עם מדיום לפני תאי ציפוי על מנת להבטיח שאין דליפה. ההרכבה של MCP על צלחת זכוכית בעל תחתית צריכה להיות מוכנה טרי לפני השימוש. </li></ol> 2. הכנה של תרבות ואינדוקציה העצביות של האקסונים עצביים בMCP Assembled <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרביות תאים עצביות בקליפת המוח היו מוכנות טריה 14-16 מוח עכבר בני יום עוברי. מדיום תרבות נוירון מורכב מבינוני neurobasal, 2% B27 neurobasaתוסף הליטר, 2 מ&quot;מ גלוטמין ידי הוספת 1% מ100x GlutaMAX, ו1% פניצילין-streptomysin. בעקבות נתיחה של מוח העכבר, קרומי המוח הוסרו מהקליפה תחת מיקרוסקופ לנתח. הרקמה הייתה אז קצוצות בסכין גילוח כדי להפוך בלוקים קטנים של רקמה על מנת להגדיל את שטח הפנים החשופים לטריפסין. לוקי רקמות היו trypsinized (סיגמא אולדריץ, טריפסין 0.05%) למשך 10 דקות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן ניתק בעדינות על ידי טחינה דקה עם פיפטה פסטר אש מלוטשת. תאים ניתקו סוננו דרך מסננת מיקרומטר 70 לאסוף השעית תא עצבית ברורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנוירונים (2-3 x 10 6 / מ&quot;ל, 150 μl) היו מצופים על אזורי הציפוי הסלולריים בצד ימין (איור 1) של MCP הורכב כך שנוירונים יכולים לצרף באזור החזקת התא (איור 1). הנוירונים טריים מוכנים היו מצופים בינוני ציפוי תא עצב אשר היא השלים עם 5% בסרום שור עוברי (Hyclone) להתקנותמדיום תרבות נוירון r. מפני שרק הנוירונים המחברים את האזור בהחזקת התא מסוגלים לגדול אקסונים לצד השני של MCP התאסף בערוצים מרכזיים, חשוב לצפיפות גבוהה צלחת של נוירונים באזור ציפוי התא על מנת להבטיח מספיק נוירונים מחוברים תא שטח שייר. תמונה מייצגת של צפיפות גבוהה של האקסונים עצביים מוצגת באיור 2 א. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום למחרת, בינוני ציפוי נוירון הוחלף על ידי התרבות הבינונית נוירון הרגיל. בינוני שינוי בוצע על ידי aspirating הבינוני בזהירות מאזור תא הציפוי של החדר, אבל לא מאזור החזקת התא של MCP התאסף, כדי למנוע בועות אוויר באזור החזקת התא ומחברים את הערוצים המרכזיים. בועות אוויר תהיינה קשות לדכא את תולדת האקסון והכניסה הבאה לערוצים המרכזיים בMCP. גורם גליה תאים נגזר neurotrophic (GDNF, 10-20 ng / ml) הוסיף גם בצד השני (משמאל)של החדר באותו היום כדי להקל על הגיוס של תולדת האקסון 5 מהצד והצלב העצבי בערוצים מרכזיים של MCP כנס (איור 2 א). כמות נכבדה של תולדת neurite ספונטנית ללא GDNF הוא ציין גם מהצד הנגדי והעצבי בערוצים מרכזיים של MCP כנס. אקסונים הנכנסים לתוך הערוץ המרכזי לעתים קרובות נצפו 2-3 ימים לאחר ציפוי. ברגע שייכנסו לאקסונים הערוץ המרכזי, שהם בדרך כלל להיכנס לצד השני בתוך יום אחד. האקסונים הם בדרך כלל ללא פגע במשך שבוע אחד לפחות לאחר הכניסה לצד השני. </li></ol> 3. תוספת של האסטרוציטים מתורבתים לMCP להקים מערכת ממודרת שיתוף תרבות תרבויות astrocyte העיקריות הוכנו ממוח גור P1-3 עכבר. הליך ניתוק המוח דומה להליך בידוד התא העצבי שתואר לעיל. האסטרוציטים היו מצופים הראשון לתוך צלחת 10 סנטימטרים שהיו מראשמצופים עם Polyornithine (סיגמה אולדריץ, 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל). מדיום תרבות astrocyte (DMEM, 10% בסרום שור עוברי, 1% פניצילין-streptomysin) שונה בכל יום במשך הימים הבאים כדי להסיר את הפסולת. אחרי זה, המדיום היה שונה כל שלושה ימים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האסטרוציטים הופכים confluent 90% ויוצרים monolayer לאחר 7 ימים. האסטרוציטים confluent היו trypsinized ו150 μl של האסטרוציטים מחדש מושעים-(1x10 6 / מ&quot;ל) היו מצופים מחדש, לאזור ציפוי התא של הצד השמאלי של MCP התאסף כאשר האקסונים עומדים להיכנס, או סתם נכנסו בצד השמאל של התאסף MCP. האסטרוציטים בדרך כלל מצופים 4-5 ימים לאחר את הנוירונים היו מצופים. GDNF הוסר ראשון לפני הציפוי מחדש של האסטרוציטים לצד השמאל של MCP. האסטרוציטים העניין מצופים היו צמודים באזור החזקת התא, כפי שמוצגים על ידי immunostaining GFAP (איור 1). רק זרימה מינימאלית של מדיום בין שני הצדדים של התאים (הנקבע על ידי הקרינה דכן) נמצא בMCP, כפי שמוצג 4,6 בעבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האסטרוציטים הופכים confluent 90% ויוצרים monolayer לאחר 7 ימים. האסטרוציטים confluent היו trypsinized ו150 μl של האסטרוציטים מחדש מושעים (1-x 10 6 / מ&quot;ל) היו מצופים מחדש, לאזור ציפוי התא של הצד השמאלי של MCP התאסף כאשר האקסונים עומדים להיכנס, או פשוט נכנס מהשמאל צד של MCP כנס. האסטרוציטים בדרך כלל מצופים 4-5 ימים לאחר את הנוירונים היו מצופים. GDNF הוסר ראשון לפני הציפוי מחדש של האסטרוציטים לצד השמאל של MCP. האסטרוציטים העניין מצופים היו צמודים באזור החזקת התא, כפי שמוצגים על ידי immunostaining GFAP (איור 1). רק זרימה מינימאלית של מדיום בין שני הצדדים של התאים (הנקבע על ידי צבעי קרינה) נמצאה בMCP, כפי שמוצג 4,6 בעבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הציפוי מחדש של האסטרוציטים, האקסונים שנכנסו לצד השמאל של MCP התאסף ישירות אינטראקציה עם astrocytes ידי או מגע ישיר אקסונלית או שחרור של גורמים מסיסים. Immunostaining של GLT1 astroglial פלזמת הקרום גלוטמט טרנספורטר וβIII-טובולין העצבי בוצע כדי להמחיש את האינטראקציה בין אקסונים ואת האסטרוציטים, כפי שמוצג באיור 2D-F. </li></ol>

<ol>
	<li>Stevens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuron-astrocyte+signaling+in+the+development+and+plasticity+of+neural+circuits.">Neuron-astrocyte signaling in the development and plasticity of neural circuits.</a> Neuro-Signals. 16, 278-288 (2008).</li><li>Paixao, S., Klein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuron-astrocyte+communication+and+synaptic+plasticity.">Neuron-astrocyte communication and synaptic plasticity.</a> Current opinion in neurobiology. 20, 466-473 (2010).</li><li>Fields, R. D., Stevens-Graham, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+neuron-glia+communication.">New insights into neuron-glia communication.</a> Science. 298, 556-562 (2002).</li><li>Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+culture+platform+for+neuroscience+research.">Microfluidic culture platform for neuroscience research.</a> Nature. 1, 2128-2136 (2006).</li><li>Wang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+neuromuscular+synapse+development+by+glial+cell+line-derived+neurotrophic+factor+and+neurturin.">Regulation of neuromuscular synapse development by glial cell line-derived neurotrophic factor and neurturin.</a> The Journal of biological chemistry. 277, 10614-10625 (2002).</li><li>Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+regulation+of+astroglial+excitatory+neurotransmitter+transporter+GLT1.">Presynaptic regulation of astroglial excitatory neurotransmitter transporter GLT1.</a> Neuron. 61, 880-894 (2009).</li><li>Regan, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variations+in+promoter+activity+reveal+a+differential+expression+and+physiology+of+glutamate+transporters+by+glia+in+the+developing+and+mature+CNS.">Variations in promoter activity reveal a differential expression and physiology of glutamate transporters by glia in the developing and mature CNS.</a> The Journal of neuroscience. 27, 6607-6619 (2007).</li><li>Swanson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+regulation+of+glutamate+transporter+subtype+expression+in+astrocytes.">Neuronal regulation of glutamate transporter subtype expression in astrocytes.</a> The Journal of neuroscience. 17, 932-940 (1997).</li><li>Schlag, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+glial+Na+-dependent+glutamate+transporters+by+cyclic+AMP+analogs+and+neurons.">Regulation of the glial Na+-dependent glutamate transporters by cyclic AMP analogs and neurons.</a> Molecular pharmacology. 53, 355-369 (1998).</li><li>Ponomarev, E. D., Novikova, M., Maresz, K., Shriver, L. P., Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+culture+system+that+supports+adult+microglial+cell+proliferation+and+maintenance+in+the+resting+state.">Development of a culture system that supports adult microglial cell proliferation and maintenance in the resting state.</a> Journal of immunological. 300, 32-46 (2005).</li><li>Espinosa-Jeffrey, A., Wakeman, D. R., Kim, S. U., Snyder, E. Y., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+system+for+rodent+and+human+oligodendrocyte+specification,+lineage+progression,+and+maturation.">Culture system for rodent and human oligodendrocyte specification, lineage progression, and maturation.</a> Current protocols in stem cell biology. Chapter 2, (2009).</li><li>Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mystery+and+magic+of+glia:+a+perspective+on+their+roles+in+health+and+disease.">The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease.</a> Neuron. 60, 430-440 (2008).</li><li>Debanne, D., Rama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+shape+axonal+signaling.">Astrocytes shape axonal signaling.</a> Science signaling. 4, pe11 (2011).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

האסטרוציטים מערכת שיתוף תרבות נוירון מבוסס MCP ומאפשר נתיחה של נוירון המפורט למסלולי astroglia איתות שהיא מאפשרת רק את האקסונים עוברים בערוצים המרכזיים ואינטראקציה עם תאי astroglial. מערכת זו שיתוף התרבות ניתן להגדיר בנוחות עם נוירון הקונבנציונלי ונהלי התרבות astrocyte. אנחנו גם ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> סרום שור עוברי </td><td> Hyclone </td><td> SH30070.03 </td><td> לציפוי נוירון לנוירון בינוני cutlure </td></tr><tr><td> סרום שור עוברי </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> F4135 </td><td> למדיום התרבות astrocyte </td></tr><tr><td> גורם עצבי נובע גליה </td><td> מו&quot;פ מערכות </td><td> 212-GD </td><td> החל 10-20 ng / ml לצד עצב של קאמרי </td></tr><tr><td> Dulbecco modified נשר בינוני גלוקוז גבוה </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> 11995 </td><td></td></tr><tr><td> מסננת תא 70 מ&quot;מ </td><td> BD פלקון </td><td> 352350 </td><td></td></tr><tr><td> צלחת תחתית זכוכית סטרילית </td><td> מאטק תאגיד </td><td></td><td></td></tr><tr><td> פלטפורמות התרבות microfluidic </td><td> Xona מיקרופלואידיקה LLC </td><td> SND150 </td><td></td></tr><tr><td> 6 בארות של צלחת התרבות </td&gt; <td> Cellstar </td><td> 657 160 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> מדיום תרבות Neuron <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינוני Neurobasal </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2% B27 תוסף Neurobasal </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלוטמט 2 מ&quot;מ על ידי הוספת 1% 100x GlutaMAX </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1% פניצילין-streptomysin </li></ul></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> מדיום תרבות נוירון לתא ציפוי <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינוני Neurobasal </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2% B27 תוסף Neurobasal </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלוטמט 2 מ&quot;מ על ידי הוספת 1% 100x GlutaMAX </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1% פניצילין-streptomysin </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5% בסרום שור עוברי SH30070.03 </li></ul></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> מדיום התרבות astrocyte <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dulbecco modified eaרמת סוכר גבוה בינונית gle </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10% עוברי שור בסרום F4135 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1% פניצילין-streptomysin </li></ul></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> לוח 1. חומרים בשימוש במערכת גליה שיתוף תרבות האקסון microfluidic התרבות מבוססת פלטפורמה והעצבית. </td></tr></tbody></table>

imaging analysis of neuron to glia interaction in microfluidic culture platform (mcp)-based neuronal axon and glia co-culture system

נוירון הנכון לאינטראקצית גליה הוא קריטי לתפקוד פיסיולוגי של מערכת העצבים המרכזית (CNS). תקשורת דו כיוונית זו מתווכת על ידי מתוחכמת מסלולי איתות ספציפיים בין תא העצב ו1,2 גליה. זיהוי ואפיון של מסלולי האיתות הללו חיוניים להבנה של איך נוירון לפיזיולוגית CNS צורות אינטראקצית גליה. בעבר, תרבויות נוירון וגליה המעורבות כבר נוצל באופן נרחב לבדיקה ואפיון מסלולי איתות בין תא העצב וגליה. מה למד מהכנות ואחרות אלה בכלי vivo, לעומת זאת, הציע כי איתות הדדית בין תא עצב וגליה שאירעה לעתים קרובות בתאים ספציפיים בתוך הנוירונים (כלומר, אקסון, דנדריט, או סומא) 3. זה עושה את זה חשוב לפתח מערכת תרבות חדשה המאפשרת פרדה של תאים עצביים ובמיוחד בוחן את האינטראקציה בין גליה ונוירואקסונים / דנדריטים nal. בנוסף, מערכת התרבות המעורבת הקונבנציונלית אינה מסוגלת להבדיל את הגורמים המסיסים ואותות קשר ישירים בין קרום תא העצב וגליה. יתר על כן, הכמות הגדולה של תאי עצב ותאי גליה במערכת הקונבנציונלית שיתוף התרבות חסרת רזולוצית הצורך לקיים אינטראקציה בין האקסון אחת ותא גליה. במחקר זה, אנו מתארים מערכת גליה שיתוף תרבות האקסון רומן ועם השימוש בפלטפורמת תרבות microfluidic (MCP). במערכת זו שיתוף התרבות, נוירונים ותאי גלייה מתורבתים בשני חדרים נפרדים המחוברים באמצעות ערוצים מרכזיים מרובים. במצע תרבות microfluidic זה, רק תהליכים עצביים (בעיקר אקסונים) יכולים להיכנס לצד גליה בערוצים המרכזיים. בשילוב עם תיוג חלבון פלואורסצנטי חזק, מערכת זו מאפשרת חקירה ישירה של מסלולי איתות בין אינטראקציות axonal / הדנדריטים וגליה, כגוןרגולציה של האקסון בתיווך בתעתיק גליה סחר, גליה בתיווך הקולטן במסופים עצביים, וצמיחת האקסון גליה בתיווך. הקוטר הצר של החדר גם אוסר באופן משמעותי את הזרימה הבינונית נוירון המועשר לתא גלייה, בהנחיית חיטוט אינטראקצית קרום החלבון הישיר בין האקסונים / דנדריטים ומשטחי גליה.

ניתוח זמן לשגות הדמיה של הפעלת אמרגן האקסון המושרה GLT1 בהאסטרוציטים מערכת astrocyte שיתוף תרבות נוירון והמחולק מאפשר רק את התהליכים העצביים, בעיקר אקסונים, באופן סלקטיבי אינטראקציה עם האסטרוציטים. בעקבות ההקמה המוצלחת של האקסון ו( או ת...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform MCP-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System at JoVE.com

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform MCP-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

מחקר זה מתאר את ההליכים של הקמת אקסון עצבי רומן ופלטפורמה (אסטרו) גליה שיתוף תרבות. במערכת זו שיתוף התרבות, מניפולציה של אינטראקציה ישירה בין האקסון יחיד (ותאי גלייה יחידים) הופכת להיות ריאלית, המאפשרת ניתוח מכניסטית של נוירון ההדדי לאיתות גליה.

ניתוח הדמיה של תא עצב לאינטראקצית גליה בפלטפורמת תרבות Microfluidic (MCP)-מבוסס אקסון העצבי ומערכת גליה שיתוף תרבות

Proper  neuron to glia interaction is critical to physiological function of the central  nervous system (CNS). This bidirectional communication is ...

imaging-analysis-neuron-to-glia-interaction-microfluidic-culture

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform (MCP)-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

14.9K Views.  Tufts University. מחקר זה מתאר את ההליכים של הקמת אקסון עצבי רומן ופלטפורמה (אסטרו) גליה שיתוף תרבות. במערכת זו שיתוף התרבות, מניפולציה של אינטראקציה ישירה בין האקסון יחיד (ותאי גלייה יחידים) הופכת להיות ריאלית, המאפשרת ניתוח מכניסטית של נוירון ההדדי לאיתות גליה.

Video: Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform MCP-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or co-culture model. This system is suitable for a variety of experimental needs requiring either a glass or plastic growth substrate and can also be used for culture of other types of neurons.
Rat cortical neurons obtained from the late embryonic stage (E17) are plated on glass coverslips or tissue culture dishes facing a feeder layer of glia grown on dishes or plastic coverslips (known as Thermanox), respectively. The choice between the two configurations depends on the specific experimental technique used, which may require, or not, that neurons are grown on glass (e.g. calcium imaging versus Western blot). The glial feeder layer, an astroglia-enriched secondary culture of mixed glia, is separately prepared from the cortices of newborn rat pups (P2-4) prior to the neuronal dissection.
A major advantage of this culture system as compared to a culture of neurons only is the support of neuronal growth, survival, and differentiation provided by trophic factors secreted from the glial feeder layer, which more accurately resembles the brain environment in vivo. Furthermore, the co-culture can be used to study neuronal-glial interactions1.
At the same time, glia contamination in the neuronal layer is prevented by different means (low density culture, addition of mitotic inhibitors, lack of serum and use of optimized culture medium) leading to a virtually pure neuronal layer, comparable to other established methods1-3. Neurons can be easily separated from the glial layer at any time during culture and used for different experimental applications ranging from electrophysiology4, cellular and molecular biology5-8, biochemistry5, imaging and microscopy4,6,7,9,10. The primary neurons extend axons and dendrites to form functional synapses11, a process which is not observed in neuronal cell lines, although some cell lines do extend processes.
A detailed protocol of culturing rat hippocampal neurons using this co-culture system has been described previously4,12,13. Here we detail a modified protocol suited for cortical neurons. As approximately 20x106 cells are recovered from each rat embryo, this method is particularly useful for experiments requiring large numbers of neurons (but not concerned about a highly homogenous neuronal population). The preparation of neurons and glia needs to be planned in a time-specific manner. We will provide the step-by-step protocol for culturing rat cortical neurons as well as culturing glial cells to support the neurons.

Here we provide a protocol for culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer. The cultured neurons establish polarity and create synapses, and can be separated from the glia for use in various applications, such as electrophysiology, calcium imaging, cell survival assays, immunocytochemistry, and RNA/DNA/protein isolation.

Bilaminar משותף התרבות של נוירונים בקליפת המוח עכברוש ראשי גליה

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices

Innervation plays a key role in the development, homeostasis and regeneration of organs and tissues. However, the mechanisms underlying these phenomena are not well understood yet. In particular, the role of innervation in tooth development and regeneration is neglected.
Several in vivo studies have provided important information about the patterns of innervation of dental tissues during development and repair processes of various animal models. However, most of these approaches are not optimal to highlight the molecular basis of the interactions between nerve fibres and target organs and tissues.
Co-cultures constitute a valuable method to investigate and manipulate the interactions between nerve fibres and teeth in a controlled and isolated environment. In the last decades, conventional co-cultures using the same culture medium have been performed for very short periods (e.g., two days) to investigate the attractive or repulsive effects of developing oral and dental tissues on sensory nerve fibres. However, extension of the culture period is required to investigate the effects of innervation on tooth morphogenesis and cytodifferentiation.
Microfluidics systems allow co-cultures of neurons and different cell types in their appropriate culture media. We have recently demonstrated that trigeminal ganglia (TG) and teeth are able to survive for a long period of time when co-cultured in microfluidic devices, and that they maintain in these conditions the same innervation pattern that they show in vivo.
On this basis, we describe how to isolate and co-culture developing trigeminal ganglia and tooth germs in a microfluidic co-culture system.This protocol describes a simple and flexible way to co-culture ganglia/nerves and target tissues and to study the roles of specific molecules on such interactions in a controlled and isolated environment.

Co-cultures represent a valuable method to study the interactions between nerves and target tissues and organs. Microfluidic systems allow co-culturing ganglia and whole developing organs or tissues in different culture media, thus representing a valuable tool for the in vitro study of the crosstalk between neurons and their targets.

ניתוח של פיתוח שיניים נבט עצבוב שימוש בהתקני Microfluidic משותף התרבות

Innervation plays a key role in the development, homeostasis and regeneration of organs and tissues. However, the mechanisms underlying these phenomena ...

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly controlled formation and maintenance of complex neuronal networks are not completely understood thus far. The open questions concerning neurons in health and disease are diverse and reaching from understanding the basic development to investigating human related pathologies, e.g.,&#160;Alzheimer&#39;s disease and&#160;Schizophrenia. The most detailed analysis of neurons can be performed in vitro. However, neurons are demanding cells and need the additional support of astrocytes for their long-term survival. This cellular heterogeneity is in conflict with the aim to dissect the analysis of neurons and astrocytes. We present here a cell-culture assay that allows for the long-term cocultivation of pure primary neurons and astrocytes, which share the same chemically defined medium, while being physically separated. In this setup, the cultures survive for up to four weeks and the assay is suitable for a diversity of investigations concerning neuron-glia interaction.

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

This protocol describes the indirect neuron-astrocyte coculture for compartmentalized analysis of neuron-glia interactions.

את assay Coculture Neuron-astrocyte העקיפה: An<em&gt; במבחנה</em&gt; הגדרה לחקירה המפורטת של נוירון, גליה אינטראקציות

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

Isolation and Culture of Primary Neurons and Glia from Adult Rat Urinary Bladder

The lower urinary tract has two main functions, namely, periodic urine storage and micturition; these functions are mediated through central and peripheral neuroregulation. Although extensive research on the lower urinary tract nervous system has been conducted, most studies have focused on primary culture. This protocol introduces a method for the isolation and culture of bladder neurons and glia from Sprague&#8211;Dawley rats. In this method, the neurons and glia were incubated in a 37 &#176;C, 5% CO2 incubator for 5&#8211;7 days. As a result, they grew into mature shapes suitable for related subsequent immunofluorescence experiments. Cells were morphologically observed using an optical microscope. Neurons, synaptic vesicles, and glia were identified by &#946;-III-tubulin and MAP-2, Synapsin-1, and GFAP staining, respectively. Meanwhile, immunocytochemistry was performed on several neurotransmitter-related proteins, such as choline acetyltransferase, DYNLL2, and SLC17A9.

This protocol attempts to establish a repeatable protocol for primary neurons and glia isolation from rat bladder for further cellular experiments.

בידוד ותרבות של נוירונים ראשוניים גליה משלפוחית השתן של חולדה בוגרת

The lower urinary tract has two main functions, namely, periodic urine storage and micturition; these functions are mediated through central and ...

Targeted Neuronal Injury for the Non-Invasive Disconnection of Brain Circuitry

Surgical intervention can be quite effective for treating certain types of medically intractable neurological diseases. This approach is particularly useful for disorders in which identifiable neuronal circuitry plays a key role, such as epilepsy and movement disorders. Currently available surgical modalities, while effective, generally involve an invasive surgical procedure, which can result in surgical injury to non-target tissues. Consequently, it would be of value to expand the range of surgical approaches to include a technique that is both non-invasive and neurotoxic.
Here, a method is presented for producing focal, neuronal lesions in the brain in a non-invasive manner. This approach utilizes low-intensity focused ultrasound together with intravenous microbubbles to transiently and focally open the Blood Brain Barrier (BBB). The period of transient BBB opening is then exploited to focally deliver a systemically administered neurotoxin to a targeted brain area. The neurotoxin quinolinic acid (QA) is normally BBB-impermeable, and is well-tolerated when administered intraperitoneally or intravenously. However, when QA gains direct access to brain tissue, it is toxic to the neurons. This method has been used in rats and mice to target specific brain regions. Immediately after MRgFUS, successful opening of the BBB is confirmed using contrast enhanced T1-weighted imaging. After the procedure, T2 imaging shows injury restricted to the targeted area of the brain and the loss of neurons in the targeted area can be confirmed post-mortem utilizing histological techniques. Notably, animals injected with saline rather than QA do demonstrate opening of the BBB, but dot not exhibit injury or neuronal loss. This method, termed Precise Intracerebral Non-invasive Guided surgery (PING) could provide a non-invasive approach for treating neurological disorders associated with disturbances in neural circuitry.

The goal of the protocol is to provide a method for producing non-invasive neuronal lesions in the brain. The method utilizes Magnetic Resonance-guided Focused Ultrasound (MRgFUS) to open the Blood Brain Barrier in a transient and focal manner, in order to deliver a circulating neurotoxin to the brain parenchyma.

פגיעה עצבית ממוקדת לניתוק לא פולשני של מעגלי מוח

Surgical intervention can be quite effective for treating certain types of medically intractable neurological diseases. This approach is particularly ...

Dissection and Isolation of Murine Glia from Multiple Central Nervous System Regions

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine neonates for the isolation of glial subpopulations. The purpose of the procedure is to dissociate microglia, oligodendrocyte progenitor cells (OPCs), and astrocytes from cortical, cerebellar, brainstem, and spinal cord tissue to facilitate further in vitro analysis. The CNS region isolation procedures allow for the determination of regional heterogeneity among glia in multiple cell culture systems. Rapid CNS region isolation is performed, followed by the mechanical removal of meninges to prevent meningeal cell contamination of glia. This protocol combines gentle tissue dissociation and plating on a specified matrix designed to preserve cell integrity and adherence. Isolating mixed glia from multiple CNS regions provides a comprehensive analysis of potentially heterogenous glia while maximizing the use of individual experimental animals. Additionally, following dissociation of regional tissue, mixed glia are further divided into multiple cell types including microglia, OPCs, and astrocytes for use in either single cell type, cell culture plate inserts, or co-culture systems. Overall, the demonstrated techniques provide a comprehensive protocol of broad applicability for careful dissection of four individual CNS regions from murine neonates and includes methods for the isolation of three individual glia cell types to examine regional heterogeneity in any number of in vitro cell culture systems or assays.

Here we present a protocol for in vitro isolation of multiple glial cell populations from a mouse CNS. This method allows for the segregation of regional microglia, oligodendrocyte precursor cells, and astrocytes to study the phenotypes of each in a variety of culture systems.

דיסקציה ובידוד של מורין גליה ממספר אזורים במערכת העצבים המרכזית

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine ...

A Cell Culture Model for Studying the Role of Neuron-Glia Interactions in Ischemia

Ischemic stroke is a clinical condition characterized by hypoperfusion of brain tissue, leading to oxygen and glucose deprivation, and the consequent neuronal loss. Numerous evidence suggests that the interaction between glial and neuronal cells exert beneficial effects after an ischemic event. Therefore, to explore potential protective mechanisms, it is important to develop models that allow studying neuron-glia interactions in an ischemic environment. Herein we present a simple approach to isolate astrocytes and neurons from the rat embryonic cortex, and that by using specific culture media, allows the establishment of neuron- or astrocyte-enriched cultures or neuron-glia cultures with high yield and reproducibility.
To study the crosstalk between astrocytes and neurons, we propose an approach based on a co-culture system in which neurons cultured in coverslips are maintained in contact with a monolayer of astrocytes plated in multiwell plates. The two cultures are maintained apart by small paraffin spheres. This approach allows the independent manipulation and the application of specific treatments to each cell type, which represents an advantage in many studies.
To simulate what occurs during an ischemic stroke, the cultures are subjected to an oxygen and glucose deprivation protocol. This protocol represents a useful tool to study the role of neuron-glia interactions in ischemic stroke.

Here, we present a simple approach using specific culture media that allows the establishment of neuron- and astrocyte-enriched cultures, or neuron-glia cultures from the embryonic cortex, with high yield and reproducibility.

מודל תרבות תא לחקר התפקיד של אינטראקציות נוירון-גליה באיסכמיה

Ischemic stroke is a clinical condition characterized by hypoperfusion of brain tissue, leading to oxygen and glucose deprivation, and the consequent ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.

אין ויוו הדמיית סידן בעכבר זית נחות

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Visualizing Shifts on Neuron-Glia Circuit with the Calcium Imaging Technique

Here, we report on selective in vitro models of circuits based on glia (astrocytes, oligodendrocytes, and microglia) and/or neurons from peripheral (dorsal root ganglia) and central tissues (cortex, subventricular zone, organoid) that are dynamically studied in terms of calcium shifts. The model chosen to illustrate the results is the retina, a simple tissue with complex cellular interactions. Calcium is a universal messenger involved in most of the important cellular roles. We explain in a step-by-step protocol how retinal neuron-glial cells in culture can be prepared and evaluated, envisioning calcium shifts. In this model, we differentiate neurons from glia based on their selective response to KCl and ATP. Calcium permeable receptors and channels are selectively expressed in different compartments. To analyze calcium responses, we use ratiometric fluorescent dies such as Fura-2. This probe quantifies free Ca2+ concentration based on Ca2+-free and Ca2+-bound forms, presenting two different peaks, founded on the fluorescence intensity perceived on two wavelengths.

Cell calcium imaging is a versatile methodology to study dynamic signaling of individual cells, on mixed populations in culture or even on awakened animals, based on the expression of calcium-permeable channels/receptors that gives unique functional signatures.

הדמיה של שינויים במעגל נוירון-גליה בטכניקת הדמיית הסידן

Here, we report on selective in vitro models of circuits based on glia (astrocytes, oligodendrocytes, and microglia) and/or neurons from peripheral ...

Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Microglia in Immunocompetent Mice Brain via Non-Invasive Transnasal Route

Microglia are the specialized population of macrophage-like cells of the brain. They play essential roles in both physiological and pathological brain functions. Most of our current understanding of microglia is based on experiments performed in the mouse. Human microglia differ from mouse microglia, and thus response and characteristics of mouse microglia may not always represent that of human microglia. Further, due to ethical and technical difficulties, research on human microglia is restricted to in vitro culture system, which does not capitulate in vivo characteristics of microglia. To overcome these issues, a simplified method to non-invasively transplant induced pluripotent stem cell-derived human microglia (iPSMG) into the immunocompetent mice brain via a transnasal route in combination with pharmacological depletion of endogenous microglia using a colony-stimulating factor 1 receptor (CSF1R) antagonist is developed. This protocol provides a way to non-invasively transplant cells into the mouse brain and may therefore be valuable for evaluating the in vivo role of human microglia in physiological and pathological brain functions.

The protocol presented here allows the transplantation of induced pluripotent stem cell-derived human microglia (iPSMG) into the brain via a transnasal route in immunocompetent mice. The method for the preparation and transnasal transplantation of cells and the administration of cytokine mixture for the maintenance of iPSMG is shown.

השתלה של מיקרוגליה שמקורה בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם במוח עכברים מדוכאי חיסון דרך נתיב טרנסנסאלי לא פולשני

Microglia are the specialized population of macrophage-like cells of the brain. They play essential roles in both physiological and pathological brain ...