ويدعم هذا العمل من جانب صناديق بدء التشغيل من مختبر جاكسون.

1. إعداد الماوس الثقافة الدبقية لتكييف ثقافة العصبية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> والمغلفة T75 القوارير مع الحل الكولاجين (1:3 التخفيف من Purecol في DDH 2 O). يتم تعيين قوارير تستقيم وتترك لتجف ليلة وضحاها في نسيج الثقافة هود. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح العازلة (ACSF: 119 مم كلوريد الصوديوم، 5 ملي بوكل، 1 ملم MgCl 2، 30 مم سكر العنب، HEPES 25 مم، ودرجة الحموضة 7.4، دون الكالسيوم) وسائل الإعلام الدبقية (DMEM تستكمل مع FBS 10٪، ووحدات 10 / البنسلين مل، 10 يتم إعداد ميكروغرام / مل الستربتوميسين، وGlutamax) وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى جاهزة للاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم الثقافة الدبقية، وتحسنت وسائل الإعلام الدبقية لمدة لا تقل 30 دقيقة في حمام مائي 37 ° C تشريح أدمغة قبل الماوس. يصرح باستخدامها في الفئران الجنينية أو بقطع الرأس حديثي الولادة السريعة. واللحاء الدماغي من تشريح تحت المجهر تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم هضمها تشريح أنسجة المخ في حل غراء (100 مل و 20 ميكرولتر غراء 1٪ الدناز I في 2 مل العازلة تشريح) في 37 ° C FOص 20 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الهضم غراء، وتشطف أنسجة المخ مع 10 مل وسائل الاعلام قبل تحسنت الخلايا الدبقية. ثم يتم إضافة وسائل الإعلام الدبقية الطازجة (2 مل) إلى أنسجة المخ هضمها، وtriturated الأنسجة مع ماصة باستور النار مصقول الزجاج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يضاف سائل الإعلام الدبقية الطازجة (8 مل) إلى الأنسجة فصلها. ويستخدم 70 ميكرومتر مصفاة الخلية لتصفية التعليق الأنسجة فصلها. والمصنف ثم الخلايا في قوارير T75 (عادة 2-3 الأجنة يمكن البذور من قارورة T75)، ووضع في 37 ° C الخلية الحاضنة الثقافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم التالي، ويستنشق وسائل الإعلام من قوارير T75. وشطف القوارير مع PBS مل 10. ثم يتم إضافة وسائل الإعلام الدبقية الطازجة (10-15 مل) إلى كل القارورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في غضون 10-12 يوما، ينبغي الدبقية في قوارير T75 تكون متموجة. وتشطف الخلايا الدبقية مع PBS، ويضاف 5 مل من التربسين 0.05٪ لكل قارورة T75. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد مرور فترة الحضانة التربسين عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، والخلايا الدبقية هي تقسيم الخلايا الدبقية وفصلها عن بعضها قارورة T75 إلى قسمينالكولاجين مختلفة المغلفة T75 القوارير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتعد إدراج الثقافة (ميليبور PICM03050) عن طريق وضعها في لوحات 6 حسنا، طلاء لهم الكولاجين، وتجفيف الهواء بين عشية وضحاها. يتم وضع وسائل الإعلام الدبقية (2 مل لكل منهما) تحت كل إدراج الثقافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وtrypsinized الدبقية من قوارير T75 متكدسة والمصنف على وإدراج الثقافة (واحد T75 قارورة في لوحة 6 جيدا، 2 مل كل إدراج). وسوف تستخدم هذه الثقافة الدبقية لإدراج شرط الثقافات العصبية. </li></ol> 2. العصبية الثقافة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تنظيف الزجاج coverslips للثقافة العصبية عن طريق نقع في 70٪ على الأقل HNO 3 ليلة وضحاها. ثم تغسل مع Coverslips 2 مرات على الأقل DDH 3 O، وتجفف في فرن Isotemp (&gt; 200 ° C) بين عشية وضحاها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توضع في coverslips تنظيف لوحة 6 جيدا، واحدة ساترة لكل بئر. والمغلفة مع البولي Coverslips-L-يسين الحل (2 مل، 0.1٪ في حامض البوريك 100 ملم، ودرجة الحموضة = 8.5) بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية الحاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التتم إزالة بولي-L-يسين حل من coverslips وتغسل coverslips 3 مرات مع 2 تعقيمها O. DDH ثم يتم تحضين Coverslips في 37 ° C حاضنة ليلة وضحاها في وسائل الإعلام الطلاء (Neurobasal تستكمل مع 5٪ من مصل الحصان للحرارة المعطل، ووحدات 10 / البنسلين مل، 10 ميكروغرام / مل الستربتوميسين، Glutamax، 2٪ B27 الملحق يضاف إلى الطلاء المتوسطة في اليوم يتم استخدامه). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وأضاف في اليوم التالي، وسائل الإعلام والطلاء تتم إزالة 2 مل من وسائل الإعلام الطلاء الطازجة مع B-27 لكل بئر يحتوي على ساترة الزجاج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يصرح باستخدامها في الفئران الحوامل (E15-18) مع CO 2، ويصرح باستخدامها في الفئران الجنينية بقطع الرأس. يتم تشريح قرن آمون أو المخطط من أنسجة المخ، ووضع في أنبوب 15 مل المخروطية مع الثلج الباردة العازلة تشريح، للثقافة من الخلايا العصبية قرن آمون أو الخلايا العصبية الشوكية المتوسطة الجسم المخطط، على التوالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح أنسجة المخ هي فصل مع غراء كما هو موضح في الخطوات 1.4) و 1.5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Following التفكك، يتم حساب عدد الخلايا العصبية في كل التعليق مع عدادة الكريات. والمصنف ثم الخلايا العصبية على كل ساترة في مناطق ذات كثافة الخلايا قدره 0.4 × 6 10 في جانب من لوحة 6 جيد، ومثقف في 37 ° C حاضنة ليلة وضحاها (الخلايا العصبية هي DIV 0). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإعداد إدراج الثقافة الدبقية لتكييف الثقافات العصبية، تتم إزالة وسائل الإعلام من الخلايا الدبقية إدراج الثقافة الدبقية ويضاف الطازجة المتوسطة الطلاء (2 مل في إدراج و2 مل تحت إدراج). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم التالي (DIV 1)، يتم وضعها coverslips مع الخلايا العصبية تحت إدراج الثقافة الدبقية، واحدة في كل ساترة أيضا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويتم تغذية الخلايا العصبية مع حجم نصف الطازجة وسائل الاعلام قبل تحسنت التغذية (مع B-27) كل 3-4 أيام حتى تكون جاهزة للتجارب ترنسفكأيشن والتصوير. </li></ol> 3. ترنسفكأيشن <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تنفيذ ترنسفكأيشن العصبية باستخدام Lipofectamine 2000. لكل ثقافة العصبية (ثقافة واحدة في ساترة)، 2 ميكرولتروتستخدم Lipofectamine 2000 و 1 ميكروغرام من الحمض النووي. ويستخدم المتوسط ​​Neurobasal الطازجة مع عدم وجود ملحق لتخفيف Lipofectamine وDNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويتم تحضين DNA Lipofectamine لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة بعد الخلط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حفظ 1 مل من وسائل الإعلام من تحت كل الدبقية إدراج الثقافة، و1 مل من داخل كل إدراج، ونقل وسائل الإعلام لأنبوب مخروطي الشكل. إضافة وحدة التخزين نفسها من وسائل الاعلام تغذية + B27 إلى حفظ المتوسطة واحتضان عند 37 درجة مئوية. يتم استخدام هذه الوسيلة للثقافة العصبية بعد ترنسفكأيشن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الحضانة Lipofectamine / 20-DNA دقيقة، يتم إزالة إدراج الثقافة الدبقية حظات من 6 لوحات جيدا. يتم إضافة 200 ميكرولتر Lipofectamine / DNA الخليط إلى كل ساترة مع الخلايا العصبية. يتم إرجاع ثم إدراج الثقافة الدبقية إلى كل بئر، فوق الخلايا العصبية. وينبغي تجنب توليد فقاعات تحت غشاء من إدراج الثقافة. يتم تحضين الخلايا العصبية مع خليط Lipofectamine / C DNA في ° 37 لمدة 2-4 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد اله الحضانة 2-4 ساعة فترة، تتم إزالة الخلايا الدبقية إدراج مرة أخرى. تتم إزالة وسائل الإعلام والثقافة مع خليط Lipofectamine / DNA من كل بئر. وأضاف وسائل الإعلام بحفظه في الخطوة 3.3) إلى الخلايا العصبية (2 مل لكل بئر). يتم إرجاع إدراج الثقافة الدبقية إلى كل بئر، وتتم إزالة الخلايا الدبقية وسائل الإعلام من كل إدراج، ويضاف 2 مل من وسائل الإعلام من الخطوة 3.3) في كل إدراج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم استزراع الخلايا العصبية لساعة إضافية للسماح 24-72 يتم تنفيذ التعبير عن [كدنا] تقاس قبل التصوير TIRF على هذه الخلايا العصبية. </li></ol> 4. TIRF التصوير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وسوف تستخدم لتصوير تجارب حية: السائل النخاعي الاصطناعي (119 ملي كلوريد الصوديوم، 2.5 ملي بوكل، 30 ملم الجلوكوز، 2 مم CaCl 2، 1 ملم MgCl 2 و 25 ملي HEPES، ودرجة الحموضة = 7.4 ACSF). نظامنا التصوير TIRF هو العرف انشاء مع ليزر ازرق سماوي 100-ميغاواط لالإثارة، وضرب شحنة الإلكترون إلى جانب جهاز (EMCCD) وكاميرا للكاشف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل التجارب والتصوير، وحذر ACSF في 37 و دعلى سبيل المثال؛ C حمام الماء لمدة لا تقل عن 30 دقيقة. يتم وضع إدراج التدفئة للتصوير حية على المسرح المجهر، ويتم إدراج حرارة التسخين، ليزر، والكاميرا ما لا يقل عن 30 دقيقة قبل بدء التجارب التصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تجميع الخلايا العصبية مع ساترة بالنقل الى غرفة التصوير الحية. يتم وضع ACSF قبل تحسنت في غرفة بعد غرفة يتم تجميعها، وينبغي أن تكتمل هذه الخطوة في أسرع وقت ممكن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة يتم وضع دائرة على إدراج التدفئة على المسرح المجهر، ويتم تحديد الخلايا العصبية بالنقل بصريا تحت وضع التصوير برنامج التحصين الموسع-الفلورسنت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد تحديد الخلايا العصبية بالنقل صحية (يرجى الرجوع إلى الأرقام 1 و 2)، ونحن عادة ما تؤدي 1 دقيقة من التبييض، صور للقضاء على القائمة من قبل pHluorin مضان على الغشاء البلازمي، وpHluorin المستقبلات على غشاء البلازما لديهم مستويات عالية جدا عندما مضان وبدأت لأول مرة TIRF التصوير، والتي تتعارض مع التصور من الوظائف الفرديةertion الأحداث. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد photobleach، تم تعيين إعداد مكسب مضاعف من الإلكترون على الكاميرا EMCCD إلى الحد الأقصى، ويتم تنفيذ التسجيل لمدة 1 دقيقة في 10 هرتز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سوف تحتوي على 600 تسجيل كل الصور. يتم تحديد الأحداث الفردية من خلال اللعب الإدراج الجزء الخلفي التسجيل باستخدام يماغيج. يتم تحليل الأحداث الإدراج الفردية يدويا باستخدام يماغيج. </li></ol> 5. ممثل النتائج ثقافة العصبية يتفق هو المفتاح لتجارب حية للتصوير ناجحة. ويظهر الشكل 1 الخلايا العصبية قرن آمون الماوس مثقف باستخدام بروتوكول لدينا من 11 إلى DIV DIV 18. يبدو واضحا من الصور التي وضعت الخلايا العصبية عمليات واسعة النطاق والتي يتم تناولها في عمليات كثيفة مع شجيري العمود الفقري شجيري، مؤشرات على أن هذه الخلايا العصبية في صحة جيدة في الثقافة. ويمكن أيضا بروتوكول ثقافتنا أن تستخدم لأنواع أخرى من الخلايا العصبية في الدماغ. على سبيل المثال، كنا في الآونة الأخيرة هذا البروتوكول للثقافةالجسم المخطط الخلايا العصبية الشوكية المتوسطة في دراسة مستقبلات D2 لدراسة الدوبامين (DRD2) الإدراج في الجسم المخطط الماوس مثقف الخلايا العصبية الشوكية المتوسطة 9. ويبين الشكل 2 الماوس الجسم المخطط المتوسطة الخلايا العصبية الشوكية مثقف باستخدام بروتوكول لدينا في DIV 8. لدينا أيضا أجريت بنجاح TIRF تصوير superecliptic DRD2s pHluorin الموسومة في هذا النوع من الخلايا العصبية. ويبين الشكل 3 التعبير عن pHluorin الموسومة DRD2 (درجة الحموضة، DRD2) في الخلايا العصبية الشوكية المتوسطة والتصور من درجة الحموضة DRD2-الإدراج في هذه الخلايا العصبية. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/4450/4450fig1.jpg" /> ثقافة الرقم الماوس 1. الحصين باستخدام طريقة اجهة الثقافة. DIV: أيام في المختبر، ويعتبر اليوم من ثقافة وDIV 0. من الصور، من الواضح أن الخلايا العصبية قرن آمون ناضجة في هذا النوع من الثقافة بين 11 و DIV DIV 15. في DIV 11 و 13، وتغطي التشعبات العصبية والعمود الفقري مع filipodia غير ناضجة. و 15 في DIV18، وتغطي التشعبات العصبية مع العمود الفقري كبيرة، مؤشرا على الخلايا العصبية أكثر نضجا. لوحات من الزمن: منخفضة التكبير الصور من الخلايا العصبية قرن آمون الماوس في أعمار مختلفة. لوحات اليمين: عالية التكبير الصور (التكبير في التشعبات العصبية من اللوحة اليسرى) من عمليات شجيري الخلايا العصبية مع العمود الفقري شجيري في أعمار مختلفة. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/4450/4450fig2.jpg" /> الشكل 2. ماوس الجسم المخطط مستنبت الخلايا العصبية الشوكية باستخدام طريقة اجهة الثقافة. الخلايا العصبية في الصور هي في DIV 8. <img alt="الشكل 3" src="/files/ftp_upload/4450/4450fig3.jpg" /> الشكل 3. فأر الجسم المخطط الخلايا العصبية الشوكية المتوسطة transfected مع مسير الشمس السوبر مستقبلات D2 pHluorin الموسومة الدوبامين (درجة الحموضة، DRD2). الصورة على اليسار هو الحد الأقصى الإسقاط كثافة تسجيل الوقت الفاصل بين (600 الصور، 100 ميللي ثانية لكل صورة). رؤوس سهام بيضاء تشير الإدراج حويصلي الفردية من درجة الحموضة-DRD2. هذه الصورة يحتفظ المعلومات الإدراج في البعد XY لكن يفقد معلومات الوقت. الصورة على اليمين يظهر YT الإسقاط كثافة الحد الأقصى، الذي هو مكدس xyt استدارة 90 درجة حول محور y، ويتوقع أن الحد الأقصى بكسل في كل سطر على محور س ص بكسل محور واحد. هذه الصورة يحتفظ المعلومات الإدراج على طول محور YT لكن يفقد المعلومات محور س.

<ol>
	<li>Thomas, G. M., Hayashi, T., Chiu, S. L., Chen, C. M., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palmitoylation+by+DHHC5/8+targets+GRIP1+to+dendritic+endosomes+to+regulate+AMPA-R+trafficking.">Palmitoylation by DHHC5/8 targets GRIP1 to dendritic endosomes to regulate AMPA-R trafficking.</a> Neuron. 73, 482-496 (2012).</li><li>Anggono, V., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+AMPA+receptor+trafficking+and+synaptic.">Regulation of AMPA receptor trafficking and synaptic.</a> Curr. Opin. Neurobiol. , (2012).</li><li>Makuch, L., Volk, L., Anggono, V., Johnson, R. C., Yu, Y., Duning, K., Kremerskothen, J., Xia, J., Takamiya, K., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+AMPA+receptor+function+by+the+human+memory-associated+gene+KIBRA.">Regulation of AMPA receptor function by the human memory-associated gene KIBRA.</a> Neuron. 71, 1022-1029 (2011).</li><li>Thomas, G. M., Lin, D. T., Nuriya, M., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+bi-directional+regulation+of+AMPA+receptor+phosphorylation+and+trafficking+by+JNK.">Rapid and bi-directional regulation of AMPA receptor phosphorylation and trafficking by JNK.</a> EMBO J. 27, 361-372 (2008).</li><li>Lin, D. T., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PICK1+and+phosphorylation+of+the+glutamate+receptor+2+(GluR2)+AMPA+receptor+subunit+regulates+GluR2+recycling+after+NMDA+receptor-induced+internalization.">PICK1 and phosphorylation of the glutamate receptor 2 (GluR2) AMPA receptor subunit regulates GluR2 recycling after NMDA receptor-induced internalization.</a> J. Neurosci. 27, 13903-13908 (2007).</li><li>Hayashi, T., Rumbaugh, G., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+AMPA+receptor+subunit+trafficking+by+palmitoylation+of+two+distinct+sites.">Differential regulation of AMPA receptor subunit trafficking by palmitoylation of two distinct sites.</a> Neuron. 47, 709-723 (2005).</li><li>Lin, D. T., Makino, Y., Sharma, K., Hayashi, T., Neve, R., Takamiya, K., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+AMPA+receptor+extrasynaptic+insertion+by+4.1N,+phosphorylation.">Regulation of AMPA receptor extrasynaptic insertion by 4.1N, phosphorylation.</a> 12, 879-887 (2009).</li><li>Araki, Y., Lin, D. T., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+insertion+of+the+AMPA+receptor+GluA2+subunit+is+regulated+by+NSF+binding+and+Q/R+editing+of+the+ion+pore.">Plasma membrane insertion of the AMPA receptor GluA2 subunit is regulated by NSF binding and Q/R editing of the ion pore.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 11080-11085 (2010).</li><li>Li, Y., Roy, B. D., Wang, W., Zhang, L., Zhang, L. F., Sampson, S. B., Yang, Y. P., Lin, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Two+Functionally+Distinct+Endosomal+Recycling+Pathways+for+Dopamine+D2+Receptor.">Identification of Two Functionally Distinct Endosomal Recycling Pathways for Dopamine D2 Receptor.</a> Journal of Neuroscience. , (2012).</li><li>Yu, Y. J., Dhavan, R., Chevalier, M. W., Yudowski, G. A., von Zastrow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+delivery+of+internalized+signaling+receptors+to+the+somatodendritic+surface+by+sequence-specific+local+insertion.">Rapid delivery of internalized signaling receptors to the somatodendritic surface by sequence-specific local insertion.</a> J. Neurosci. 30, 11703-11714 (2010).</li><li>Yudowski, G. A., Puthenveedu, M. A., von Zastrow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+modes+of+regulated+receptor+insertion+to+the+somatodendritic+plasma+membrane.">Distinct modes of regulated receptor insertion to the somatodendritic plasma membrane.</a> Nat. Neurosci. 9, 622-627 (2006).</li><li>Yudowski, G. A., Puthenveedu, M. A., Leonoudakis, D., Panicker, S., Thorn, K. S., Beattie, E. C., von Zastrow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+discrete+exocytic+events+mediating+surface+delivery+of+AMPA+receptors.">Real-time imaging of discrete exocytic events mediating surface delivery of AMPA receptors.</a> J. Neurosci. 27, 11112-11121 (2007).</li><li>Ashby, M. C., De La Rue, S. A., Ralph, G. S., Uney, J., Collingridge, G. L., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+AMPA+receptors+(AMPARs)+from+synapses+is+preceded+by+transient+endocytosis+of+extrasynaptic+AMPARs.">Removal of AMPA receptors (AMPARs) from synapses is preceded by transient endocytosis of extrasynaptic AMPARs.</a> J. Neurosci. 24 (AMPARs), 5172-5176 (2004).</li><li>Kopec, C. D., Real, E., Kessels, H. W., Malinow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GluR1+links+structural+and+functional+plasticity+at+excitatory+synapses.">GluR1 links structural and functional plasticity at excitatory synapses.</a> J. Neurosci. 27, 13706-13718 (2007).</li><li>Makino, H., Malinow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPA+receptor+incorporation+into+synapses+during+LTP:+the+role+of+lateral+movement+and+exocytosis.">AMPA receptor incorporation into synapses during LTP: the role of lateral movement and exocytosis.</a> Neuron. 64, 381-390 (2009).</li><li>Makino, H., Malinow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalized+versus+global+synaptic+plasticity+on+dendrites+controlled+by+experience.">Compartmentalized versus global synaptic plasticity on dendrites controlled by experience.</a> Neuron. 72, 1001-1011 (2011).</li><li>Wang, Z., Edwards, J. G., Riley, N., Provance, D. W., Karcher, R., Li, X. D., Davison, I. G., Ikebe, M., Mercer, J. A., Kauer, J. A., Ehlers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+Vb+mobilizes+recycling+endosomes+and+AMPA+receptors+for+postsynaptic+plasticity.">Myosin Vb mobilizes recycling endosomes and AMPA receptors for postsynaptic plasticity.</a> Cell. 135, 535-548 (2008).</li><li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins.">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394, 192-195 (1998).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).</li><li>Sekine-Aizawa, Y., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+receptor+trafficking+by+using+alpha-bungarotoxin-binding-site-tagged+receptors.">Imaging of receptor trafficking by using alpha-bungarotoxin-binding-site-tagged receptors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17114-17119 (2004).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

لأسباب غير معروفة، الخلايا العصبية الماوس دائما أكثر صعوبة من الخلايا العصبية في الثقافة الفئران. في تجربتنا، وثقافة مختلطة من الخلايا العصبية والخلايا الدبقية يعمل بشكل جيد لالخلايا العصبية الأولية الماوس مثقف. ومع ذلك، هذه الثقافة المختلطة ليست مناسبة للتجارب ا?...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; اسم الكاشف</strong</td&gt;<td<strong&gt; شركة</strong</td&gt;<td<strong&gt; كتالوج رقم</strong</td&gt;<td<strong&gt; التعليقات</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; تنقية الكولاجين البقري الحل (Purecol)</td&gt;<td&gt; خيارات متقدمة Biomatrix</td&gt;<td&gt; 5005-B</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; هانك محلول الملح المتوازن (HBSS)</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 14185-045</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; البنسلين الستربتوميسين (القلم بكتيريا)</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 15140-122</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; الصوديوم البيروفات</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 11360-070</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; DMEM ارتفاع نسبة الجلوكوز</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 10313-021</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; مصل بقري جنيني (FBS)</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; GlutaMAX</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 35050-061</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; غراء</td&gt;<td&gt; شركة بيوكيميائية ورثينجتون</td&gt;<td&gt; LS003126</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; I ديوكسي ريبونيوكلياز من البنكرياس البقري (الدناز I)</td&gt;<td&gt; SIGMA</td&gt;<td&gt; DN25-10MG</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<tdالتخزين المؤقت الفوسفات&gt; Dulbecco في المؤسسة العامة لتحلية (DPBS)</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 14190-144</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; التربسين 0.05٪</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 25300-054</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; بولي-L-يسين هيدروبروميد</td&gt;<td&gt; SIGMA</td&gt;<td&gt; P2636-1G</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; حمض البوريك</td&gt;<td&gt; فيشر العلمية</td&gt;<td&gt; BP 168-500</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; متوسطة Neurobasal</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 21103-049</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; B-27 المصل خالية من الملحق</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 17504-044</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; مصل الحصان الحرارة غير نشط</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 26050-070</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Lipofectamine 2000</td&gt;<td&gt; إينفيتروجن</td&gt;<td&gt; 11668 019</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; HEPES</td&gt;<td&gt; فيشر العلمية</td&gt;<td&gt; BP310-500</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; الثقافة إدراج</td&gt;<td&gt; ميليبور</td&gt;<td&gt; PICM03050</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

imaging phluorin-tagged receptor insertion to the plasma membrane in primary cultured mouse neurons

A فهم أفضل للآليات التي تحكم الاتجار مستقبلات بين غشاء البلازما (PM) ومقصورات داخل الخلايا يتطلب المنهج التجريبي مع ممتازة الدقة المكانية والزمانية. وعلاوة على ذلك، يجب أن هذا النهج أيضا لديها القدرة على التمييز المستقبلات المترجمة على PM عن تلك الموجودة في حجرات داخل الخلايا. الأهم من ذلك، كشف المستقبلات في حويصلة واحدة يتطلب المعلقة حساسية الكشف، لأن كل حويصلة يحمل سوى عدد قليل من المستقبلات. نهج قياسية لدراسة الاتجار مستقبلات تشمل biotinylation سطح تليها الكشف الكيمياء الحيوية، والتي تفتقر إلى كل القرارات اللازمة المكانية والزمانية، ومضان المجهري الفحص من المستقبلات السطحية immunolabeled، الأمر الذي يتطلب التثبيت الكيميائي للخلايا وبالتالي تفتقر إلى القرار الزمنية الكافية 1-6. للتغلب على هذه القيود، وضعنا وغيرهم وتوظيف سترا جديدةtegy أن تمكن من التصور الدينامي للمستقبلات الإدراج في قرارات PM مع ممتازة المكانية والزمانية 7-17. يشمل النهج علامات من GFP درجة الحموضة حساسة، وpHluorin superecliptic 18، إلى المجال N-محطة خارج الخلية من المستقبلات. Superecliptic pHluorin له خاصية فريدة من كونها الفلورسنت في الرقم الهيدروجيني محايدة وغير الفلورسنت، في الرقم الهيدروجيني الحمضية (الرقم الهيدروجيني &lt;6.0). ولذلك، فإن مستقبلات المفتاحية هي غير الفلورسنت عندما الحمضية داخل التجويف من الحويصلات الاتجار داخل الخلايا أو الأجزاء endosomal، وتصبح بسهولة تصور فقط عندما تتعرض للبيئة محايد الرقم الهيدروجيني خارج الخلية، على السطح الخارجي للPM. استراتيجيتنا يسمح بالتالي لنا أن نميز بين مستقبلات سطح PM من داخل تلك الحويصلات الاتجار داخل الخلايا. لتحقيق ما يكفي من القرارات المكانية والزمانية، وكذلك الحساسية اللازمة لدراسة الاتجار ديناميكية من المستقبلات، قمنا بتوظيف الداخلية تعكس إجماليأيون المجهر الفلورسنت (TIRFM)، والتي مكنتنا من تحقيق القرار الأمثل المكاني للتصوير الضوئي (~ 170 نانومتر)، والقرار الزمني للفيديو معدل المجهري (30 إطارات / ثانية)، وحساسية للكشف عن مضان GFP من واحد جزيء. عن طريق التصوير pHluorin الموسومة تحت المستقبلات TIRFM، كنا قادرين على تصور الأحداث مباشرة الفردية الإدراج في مستقبلات الخلايا العصبية مثقف PM في. يمكن أن يحتمل هذا النهج التصوير تطبيقها على أي بروتين الغشاء مع مجال خارج الخلية التي يمكن أن يكون المسمى مع pHluorin superecliptic، وسوف تسمح تشريح آليات مفصلة الرئيسية التي تحكم الإدراج من البروتينات الغشاء مختلفة (المستقبلات، وقنوات أيون، نقل، الخ) ل وPM.

Watch this Scientific Journal Video about Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons at JoVE.com

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

من علامات المجالات خارج الخلية من مستقبلات الغشاء مع pHluorin superecliptic، والتصوير هذه المستقبلات في الخلايا العصبية الماوس الانصهار مثقف، يمكننا تصور الأحداث مباشرة الفردية الإدراج حويصلي في المستقبلات إلى غشاء البلازما. هذه التقنية سوف يكون مفيدا في توضيح الآليات الجزيئية التي تحكم الإدراج مستقبلات للغشاء البلازما.

التصوير pHluorin الموسومة الإدراج مستقبلات غشاء البلازما إلى الخلايا العصبية في الابتدائية الماوس مثقف

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

imaging-phluorin-tagged-receptor-insertion-to-plasma-membrane-primary

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.1K Views.  The Jackson Laboratory. من علامات المجالات خارج الخلية من مستقبلات الغشاء مع pHluorin superecliptic، والتصوير هذه المستقبلات في الخلايا العصبية الماوس الانصهار مثقف، يمكننا تصور الأحداث مباشرة الفردية الإدراج حويصلي في المستقبلات إلى غشاء البلازما. هذه التقنية سوف يكون مفيدا في توضيح الآليات ...

Video: Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

متعددة الماوس تشريحي عصبي التصوير بالرنين المغناطيسي

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

تحليل كمي متشابك الحويصلة التجديد حمام سباحة في الخلايا العصبية مثقف الحبيبية للدماغ باستخدام الأصباغ FM

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs 4-6. Altered patterns of dendritic growth and plasticity are associated with impaired neurobehavioral function in experimental models 7, and are thought to contribute to clinical symptoms observed in both neurodevelopmental disorders 8-10 and neurodegenerative diseases 11-13. Such observations underscore the functional importance of precisely regulating dendritic morphology, and suggest that identifying mechanisms that control dendritic growth will not only advance understanding of how neuronal connectivity is regulated during normal development, but may also provide insight on novel therapeutic strategies for diverse neurological diseases.
Mechanistic studies of dendritic growth would be greatly facilitated by the availability of a model system that allows neurons to be experimentally switched from a state in which they do not extend dendrites to one in which they elaborate a dendritic arbor comparable to that of their in vivo counterparts. Primary cultures of sympathetic neurons dissociated from the superior cervical ganglia (SCG) of perinatal rodents provide such a model. When cultured in defined medium in the absence of serum and ganglionic glial cells, sympathetic neurons extend a single process which is axonal, and this unipolar state persists for weeks to months in culture 14,15. However, the addition of either bone morphogenetic protein-7 (BMP-7) 16,17 or Matrigel 18 to the culture medium triggers these neurons to extend multiple processes that meet the morphologic, biochemical and functional criteria for dendrites. Sympathetic neurons dissociated from the SCG of perinatal rodents and grown under defined conditions are a homogenous population of neurons 19 that respond uniformly to the dendrite-promoting activity of Matrigel, BMP-7 and other BMPs of the decapentaplegic (dpp) and 60A subfamilies 17,18,20,21. Importantly, Matrigel- and BMP-induced dendrite formation occurs in the absence of changes in cell survival or axonal growth 17,18.
Here, we describe how to set up dissociated cultures of sympathetic neurons derived from the SCG of perinatal rats so that they are responsive to the selective dendrite-promoting activity of Matrigel or BMPs.

We describe a protocol for using bone morphogenetic protein-7 (BMP-7) or Matrigel to selectively induce dendritic growth in primary sympathetic neurons dissociated from the superior cervical ganglia (SCG) of perinatal rats.

حفز النمو في الخلايا العصبية شجيري متعاطف مثقف

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This directed trafficking is of fundamental importance to deliver, maintain or remove synaptic proteins.
Super-ecliptic pHluorin (SEP) is a pH-sensitive derivative of eGFP that has been extensively used for live cell imaging of plasma membrane proteins1-2. At low pH, protonation of SEP decreases photon absorption and eliminates fluorescence emission. As most intracellular trafficking events occur in compartments with low pH, where SEP fluorescence is eclipsed, the fluorescence signal from SEP-tagged proteins is predominantly from the plasma membrane where the SEP is exposed to a neutral pH extracellular environment. When illuminated at high intensity SEP, like every fluorescent dye, is irreversibly photodamaged (photobleached)3-5. Importantly, because low pH quenches photon absorption, only surface expressed SEP can be photobleached whereas intracellular SEP is unaffected by the high intensity illumination6-10. 
FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) of SEP-tagged proteins is a convenient and powerful technique for assessing protein dynamics at the plasma membrane. When fluorescently tagged proteins are photobleached in a region of interest (ROI) the recovery in fluorescence occurs due to the movement of unbleached SEP-tagged proteins into the bleached region. This can occur via lateral diffusion and/or from exocytosis of non-photobleached receptors supplied either by de novo synthesis or recycling (see Fig. 1). The fraction of immobile and mobile protein can be determined and the mobility and kinetics of the diffusible fraction can be interrogated under basal and stimulated conditions such as agonist application or neuronal activation stimuli such as NMDA or KCl application8,10. 
We describe photobleaching techniques designed to selectively visualize the recovery of fluorescence attributable to exocytosis. Briefly, an ROI is photobleached once as with standard FRAP protocols, followed, after a brief recovery, by repetitive bleaching of the flanking regions. This 'FRAP-FLIP' protocol, developed in our lab, has been used to characterize AMPA receptor trafficking at dendritic spines10, and is applicable to a wide range of trafficking studies to evaluate the intracellular trafficking and exocytosis.

This report describes the use of live cell imaging and photobleach techniques to determine the surface expression, transport pathways and trafficking kinetics of exogenously expressed, pH-sensitive GFP-tagged proteins at the plasma membrane of neurons.

المقررة الإنتشار الأفقي والإيماس من غشاء بروتينات في الخلايا العصبية مثقف باستخدام الاسترداد الإسفار وPhotobleaching الإسفار الخسارة

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion channel, and transporter cell surface presentation on a minutes time scale.&#160;There is a broad diversity of mechanisms that control endocytic trafficking of individual proteins. Studies investigating the molecular underpinnings of trafficking have primarily relied upon surface biotinylation to quantitatively measure changes in membrane protein surface expression in response to exogenous stimuli and gene manipulation.&#160;However, this approach has been mainly limited to cultured cells, which may not faithfully reflect the physiologically relevant mechanisms at play in adult neurons.&#160;Moreover, cultured cell approaches may underestimate region-specific differences in trafficking mechanisms.&#160;Here, we describe an approach that extends cell surface biotinylation to the acute brain slice preparation.&#160;We demonstrate that this method provides a high-fidelity approach to measure rapid changes in membrane protein surface levels in adult neurons.&#160;This approach is likely to have broad utility in the field of neuronal endocytic trafficking.

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Neuronal membrane trafficking dynamically controls plasma membrane protein availability and significantly impacts neurotransmission.&#160;To date, it has been challenging to measure neuronal endocytic trafficking in adult neurons.&#160;Here, we describe a highly effective, quantitative method to measure rapid changes in surface protein expression ex vivo in acute brain slices.

الدماغ شريحة Biotinylation: و<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; النهج لقياس منطقة محددة بلازما بروتين غشاء الاتجار الكبار الخلايا العصبية

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions such as motor control, motivation, and working memory. Nigrostriatal dopaminergic neurons selectively degenerate in Parkinson&#39;s disease (PD). This progressive neuronal loss is unequivocally associated with the motors symptoms of the pathology (bradykinesia, resting tremor, and muscular rigidity). The main agent responsible of dopaminergic neuron degeneration is still unknown. However, these neurons appear to be extremely vulnerable in diverse conditions. Primary cultures constitute one of the most relevant models to investigate properties and characteristics of dopaminergic neurons. These cultures can be submitted to various stress agents that mimic PD pathology and to neuroprotective compounds in order to stop or slow down neuronal degeneration. The numerous transgenic mouse models of PD that have been generated during the last decade further increased the interest of researchers for dopaminergic neuron cultures. Here, the video protocol focuses on the delicate dissection of embryonic mouse brains. Precise excision of ventral mesencephalon is crucial to obtain neuronal cultures sufficiently rich in dopaminergic cells to allow subsequent studies. This protocol can be realized with embryonic transgenic mice and is suitable for immunofluorescence staining, quantitative PCR, second messenger quantification, or neuronal death/survival assessment.

Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson's disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.

الثقافة الابتدائية من الخلايا العصبية الدوبامين ماوس

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular guidance cues like netrin-1 and results in dramatic increases to the surface area of the axonal plasma membrane. Netrin-1-dependent axon branching likely involves temporal and spatial control of plasma membrane expansion, the components of which are supplied through exocytic vesicle fusion. These fusion events are preceded by formation of SNARE complexes, comprising a v-SNARE, such as VAMP2 (vesicle-associated membrane protein 2), and plasma membrane t-SNAREs, syntaxin-1 and SNAP25 (synaptosomal-associated protein 25). Detailed herein isa multi-pronged approach used to examine the role of SNARE mediated exocytosis in axon branching. The strength of the combined approach is data acquisition at a range of spatial and temporal resolutions, spanning from the dynamics of single vesicle fusion events in individual neurons to SNARE complex formation and axon branching in populations of cultured neurons. This protocol takes advantage of established biochemical approaches to assay levels of endogenous SNARE complexes and Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy of cortical neurons expressing VAMP2 tagged with a pH-sensitive GFP (VAMP2-pHlourin) to identify netrin-1 dependent changes in exocytic activity in individual neurons. To elucidate the timing of netrin-1-dependent branching, time-lapse differential interference contrast (DIC) microscopy of single neurons over the order of hours is utilized. Fixed cell immunofluorescence paired with botulinum neurotoxins that cleave SNARE machinery and block exocytosis demonstrates that netrin-1 dependent axon branching requires SNARE-mediated exocytic activity.

Light microscopy techniques coupled with biochemical assays elucidate the involvement of SNARE-mediated exocytosis in netrin-dependent axon branching. This combination of techniques permits identification of molecular mechanisms controlling axon branching and cell shape change.

الاستفادة المشتركة منهجيات لتحديد دور البلازما غشاء تسليم خلال أكسون التشعب والعصبية التشكل

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their post-natal development, abundance, and accessibility, CGNs are an ideal model to study neuronal processes, including neuronal development, neuronal migration, and physiological neuronal activity stimulation. In addition, CGN cultures provide an excellent model for studying different modes of cell death including excitotoxicity and apoptosis. Within a week in culture, CGNs express N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors, a specific ionotropic glutamate receptor with many critical functions in neuronal health and disease. The addition of low concentrations of NMDA in conjunction with membrane depolarization to rodent primary CGN cultures has been used to model physiological neuronal activity stimulation while the addition of high concentrations of NMDA can be employed to model excitotoxic neuronal injury. Here, a method of isolation and culturing of CGNs from 6 day old pups as well as genetic manipulation of CGNs by adenoviruses and lentiviruses are described. We also present optimized protocols on how to stimulate NMDA-induced excitotoxicity, low-potassium-induced apoptosis, oxidative stress and DNA damage following transduction of these neurons.

This protocol describes a simple method for isolating and culturing primary mouse cerebral granule neurons (CGNs) from 6-7 day old pups, efficient transduction of CGNs for loss and gain of function studies, and modelling NMDA-induced neuronal excitotoxicity, low-potassium-induced cell death, DNA-damage, and oxidative stress using the same culture model.

وضع نماذج لموت الخلايا العصبية وضمور في الخلايا العصبية الأولية الحبيبية للدماغ الماوس

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral tissues. The hypothalamus in the central nervous system (CNS) is the control center for energy and insulin signal response regulation. Chronic inflammation in peripheral tissues and imbalances of certain chemokines (such as CCL5, TNF&#945;, and IL-6) contribute to diabetes and obesity. However, the functional mechanism(s) connecting chemokines and hypothalamic insulin signal regulation still remain unclear.
In vitro primary neuron culture models are convenient and simple models which can be used to investigate insulin signal regulation in hypothalamic neurons. In this study, we introduced exogeneous GLUT4 protein conjugated with GFP (GFP-GLUT4) into primary hypothalamic neurons to track GLUT4 membrane translocation upon insulin stimulation. Time-lapse images of GFP-GLUT4 protein trafficking were recorded by deconvolution microscopy, which allowed users to generate high-speed, high-resolution images without damaging the neurons significantly while conducting the experiment. The contribution of CCR5 in insulin regulated GLUT4 translocation was observed in CCR5 deficient hypothalamic neurons, which were isolated and cultured from CCR5 knockout mice. Our results demonstrated that the GLUT4 membrane translocation efficiency was reduced in CCR5 deficient hypothalamic neurons after insulin stimulation.

This protocol describes a technique for observation of real-time Green Fluorescence Protein (GFP) tagged Glucose Transporter 4 (GLUT4) protein trafficking upon insulin stimulation and characterization of the biological role of CCR5 in the insulin&#8211;GLUT4 signaling pathway with Deconvolution Microscopy.

صور حية من GLUT4 البروتين الاتجار بالماوس الخلايا العصبية طائي الأولية باستخدام الفحص المجهري Deconvolution

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral ...

Primary Culture of Neurons Isolated from Embryonic Mouse Cerebellum

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model system is to provide a controlled microenvironment and maintain the high survival rate and the natural features of dissociated neuronal and nonneuronal cells as much as possible under in vitro conditions. In this article, we demonstrate a method of isolating primary neurons from the developing mouse cerebellum, placing them in an in vitro environment, establishing their growth, and monitoring their viability and differentiation for several weeks. This method is applicable to embryonic neurons dissociated from cerebellum between embryonic days 12&ndash;18.

Conducting in vitro experiments to reflect in vivo conditions as adequately as possible is not an easy task. The use of primary cell cultures is an important step toward understanding cell biology in a whole organism. The provided protocol outlines how to successfully grow and culture embryonic mouse cerebellar neurons.

الثقافة الاساسيه للخلايا العصبية معزولة عن المخيخ الفئران الجنينية

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model ...