انخفاض كفاءة نقل هو عقبة رئيسية في تحديد كيفية تنشيط البروتين نوريت خارج في الخلايا العصبية الأولية. بروتوكولنا التغلب على هذه المسألة عن طريق co-transfection من EGFP لتحديد الخلايا المصابة بنجاح. ارتفاع معدل co-transfection من EGFP والبروتينات ذات الأهمية يضمن دقة المقايسة.
وبالتالي، فإن تلطيخ الفلورة المناعية مطلوب الآن. كما يحدث نمو النوري أثناء التجديد العصبي، يمكن تطبيق هذه الطريقة لتحديد أهداف جديدة لاستعادة شبكة الخلايا العصبية التالفة في صدمة الدماغ أو الأمراض العصبية. قبل البدء في الإجراء، ضع غطاء دائري معقمة 18 ملليمتر في كل بئر من 12 بئراً من لوحة ثقافة الأنسجة ومعطف كل غطاء مع خمسة ميكروغرام لكل ملليمتر من حل Poly-D-Lysine في حاضنة درجة مئوية مرطبة لمدة ساعة واحدة على الأقل.
في نهاية الحضانة، تعرق حل بولي-د-ليسين وشطف الأغطية بالماء العقيم. في اليوم الجنيني 18، ضع الرحم الذي تم حصاده من فأر Sprague Dawley الحامل في الوقت المناسب في طبق بيتري طوله 10 سنتيمترات واستخدم مقصًا صغيرًا للتشريح لفتح الرحم وساك السلوي. استخدم المقص لإزالة المشيمة واستخدام ملقط لنقل جنين كامل واحد إلى طبق بيتري جديد طوله 10 سنتيمترات يحتوي على جلوكوز PBS المبرد.
استخدام مقص لقطع على طول خياطة القوس من الجمجمة واستخدام ملعقة صغيرة شقة لنقل الدماغ الجنينية في طبق جديد بيتري 10 سنتيمترا تحتوي على الجليد الطازجة الباردة PBS الجلوكوز. باستخدام اثنين من ملاقط رقم خمسة ومجهر تشريح، وفصل نصفي الدماغين من المخيخ والدماغ الجذعية وإزالة السحايا. ثم عزل القشرة من نصفي الكرة الدماغية ووضع القشرة في أنبوب 15 ملليلتر يحتوي على الجليد الطازجة الباردة PBS الجلوكوز.
لثقافة الخلايا العصبية القشرية الأولية، في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية من الدرجة الثانية، والسماح للقشرة لتسوية الجاذبية لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية قبل استبدال الجلوكوز PBS مع 0.05٪التربسين EDTA. اخلطي مع التنصّت اللطيف وحضن الأنسجة في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق مع نقرة لطيفة إضافية كل دقيقتين. في نهاية الحضانة ، أوقف الهضم مع أربعة ملليلترات من متوسط الصيانة واستخدم ماصة ملليلتر واحدة لفك الأنسجة مع التثلث اللطيف.
رواسب الخلايا عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق بيليه في ملليلتر واحد من وسط الصيانة للطرد المركزي الثاني. Resuspend بيليه شكلت بعد الطرد المركزي الثاني في ملليلتر واحد من متوسطة الصيانة الطازجة للعد وطبقة الخلايا العصبية المعزولة في 6.5 مرات 10 إلى الخلايا الرابعة القابلة للحياة لكل سنتيمتر التركيز التربيعي في ملليلتر واحد من الصيانة المتوسطة في بئر في 12 لوحة جيدا. بعد يومين في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون، وتمييع EGFP واستهداف البروتين plasmid DNAs ومعدّر في اثنين من أنابيب منفصلة 1.5 ملليلتر ومن ثم مزجها معا.
نقل الخلايا مع بناء EGFP بإضافة مزيج transfection إلى الآبار. بعد 24 ساعة، وغسل الخلايا مع 37 درجة مئوية برنامج تلفزيوني وإصلاحها مع 4٪ شبهformaldehyde في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق في الظلام في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة، وغسل الخلايا الثابتة ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني جديد في غسل وإضافة الحد الأدنى من حجم الفلوريسنس تصاعد المتوسطة على شريحة زجاجية المجهر واحد لكل عينة.
ثم نقل بعناية الأغطية المغلفة على وسائل الإعلام المتصاعدة مع العينات التي تواجه الشرائح الزجاجية. لتصوير نمو نيوريت، حدد الهدف 40X على مجهر epifluorescent وانقر فوق ابدأ لالتقاط الصور من ما لا يقل عن 40 الخلايا العصبية إيجابية EGFP سليمة لكل transfection. عندما تم تصوير جميع neurites ، افتح الصور الملتقطة في ImageJ مع Plugin NeuronJ وقياس طول أطول نيوريت لكل خلية عصبية من جسم الخلية إلى طرف مخروط النمو.
ثم تحليل البيانات التي تم الحصول عليها مع البرنامج لتحديد تأثير البروتينات المستهدفة على النمو نيوريت. Cytochalasin D يقمع تمديد نيوريت بطريقة تعتمد على الجرعة في حين يتم تعزيز نوريت outgrowth في الخلايا العصبية تعامل مع عامل نمو الأعصاب. وبالإضافة إلى ذلك, بروتين محول النمو العصبي FE65 يحفز بشكل كبير نيوريت خارج نمو مزدوج بالمقارنة مع الخلايا العصبية غير المُصابة.
على الرغم من انخفاض كفاءة العدوى، يكشف تحليل الفلور المناعي أن أكثر من 80٪ من ثقافة الخلايا لمدة يومين يمكن أن تكون ناجحة في العدوى مع EGFP و FE65. يتم الكشف عن تعبير EGFP في ست ساعات بعد القذف في حين يتم الكشف عن FE65 لأول مرة في الساعة 12 ويتم اكتشاف كلتا الإشارات لمدة تصل إلى سبعة أيام بعد القذف. إن نقل الخلايا العصبية القشرية الأولية للفئران بكميات مختلفة من الحمض النووي FE65 plasmid يكشف عن زيادة تعتمد على الجرعة في تمديد نيوريت مع 0 إلى 0.5 ميكروغرام من FE65 plasmid.
ومع ذلك، لا يوجد فرق كبير في النمو في الخلايا العصبية التي اُصيبت بـ 0.5 أو ميكروغرام واحد من البلازميد. عند محاولة البروتوكول، من المهم عزل المنطقة المناسبة من الدماغ الجنيني. ويمكن أيضا أن تطبق هذه التقنية لدراسة النمو العصبي في الخلايا العصبية المشتقة من iPSC الإنسان التي لديها أدوات قيمة للطب التجديدي.
