Authors would like to thank Charisse Montgomery for her editing service. A. Alomran&#8217;s work partially fulfills the requirements for a master&#8217;s degree in Pharmacology.This work is funded by The University of Toledo&#8217;s intramural startup fund for W.A.A and NIH grant (DK080640) for S.M.N.

تمت الموافقة على إجراءات للاستخدام الحيواني من لجنة المؤسسي رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) من جامعة توليدو وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي في المعاهد الوطنية للصحة ودليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية. 1. الدماغ استخراج، باجتزاء والأنسجة التحضير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تضحية من نوع السلالة البرية الماوس C57BL / 6 قبل القتل الرحيم بعمق مع CO 2 اختناق لمدة 5 دقائق. أؤكد وفاة خلع عنق الرحم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنظيف رأس الفأر مع الايثانول 70٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء قطع القحف باستخدام مقص العقيمة وملقط عن طريق سحب لأول مرة خارج الجلد، بدءا من قمة الرأس إلى فضح الجمجمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم، عندما يتعرض الجمجمة، وإزالة الجمجمة عن طريق تقشير قطعة تلو قطعة العظم، بدءا من الجانب الخلفي والتحرك نحو الجانب الأمامي. الحرص على عدم تدمير البطينات الدماغية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">جمع الدماغ كله. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الدماغ في 100 مم طبق بتري تحتوي على DMEM / ارتفاع الجلوكوز تستكمل مع المصل 10٪ بقري جنيني (FBS) و 1٪ محلول البنسلين / الستربتومايسين تحتوي على 10000 وحدة / مل من البنسلين و 10،000 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين وقبل حرارة إلى 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شريحة الدماغ على المستوى السهمي متوسط ​​باليد بشفرة حادة، والحصول على أول 100-200 ملم قسم من كل شوط باستخدام vibratome. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف أنسجة المخ مع حرارة ما قبل 37 ° C الفوسفات مخزنة المالحة (1X PBS) حل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المكان على الفور قسم الدماغ في DMEM / الإعلام السامية الجلوكوز مسبقا تحسنت إلى 37 درجة مئوية. </li></ol> 2. لايف التصوير تكوين وإعداد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع المقاطع أنسجة المخ في أطباق ثقافة أسفل الزجاج 30 ملم تحتوي على 1 مل من DMEM / وسائل الإعلام عالية الجلوكوز، ضبط بيئة غرفة مغلقة المجهر في 37 ° C، و 95٪ / 5٪ O 2 / CO 2 المحتوى (الشكل 1 </strأونج&gt;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام 60X موضوعية عدسة الغمر النفط، وجمع خلايا البطانة العصبية / صور أهداب عن طريق وضع أول هبوط النفط في عدسة الهدف 60X، والتركيز على الخلايا مع مدينة دبي للإنترنت العادية التي تنتقل عن طريق الضوء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم اتبع اتجاه حركة فقاعة DMEM كدليل لمكان وجود أهداب بطانية عصبية متحركة عن الضرب الهدبية خلق نوع من الحركة فقاعة في المنطقة. اختيار المنطقة التي تحتوي على الخلايا السليمة مع أهداب متحركة في البطين الجانبي للمخ باستخدام فلتر DIC. حالما يتم العثور على أهداب بطانية عصبية، وضبط ضوء والتركيز على الحصول على صورة مرضية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين المعلمات التصوير الحية وفقا لهدف معين باستخدام برامج التصوير Metamorph. في التظاهرة الحالية، والحصول على عشرين أربع صور بت مع binning مجموعة الكاميرا إلى 1 × 1 جنبا إلى جنب مع 60X موضوعي و5-10 مللي ثانية زمن التعرض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الصور DIC عن طريق فتح فتحة المجهر إلى المستوى الأمثل من أجل أن يكون الحد الأدنى لإكسبالوقت osure. مراقبة الصور الحية تيار إلى الكاميرا لتوفير الحصول على الصور سريع وفوري دون تأخير. حساب سرعة أهداب الضرب استنادا إلى متطلبات العصر التعرض الحد الأدنى للحصول على ما يكفي من النقيض من الصورة. </li></ol> 3. التصور البيانات وتحليل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب عدد من الضرب أهداب عن طريق حساب عدد من الضرب في 1 دقيقة. القيام بذلك عن طريق خفض سرعة الفيديو وحساب عدد دقات باستخدام عداد الخلية أو أداة مماثلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لحساب تواتر الضرب ومضاعفة زمن التعرض الذي يتم تسجيل الفيديو من قبل عدد من الأطر أو الوقت الفاصل بين الصور المكتسبة للحصول على عدد من ثانية. (مثال: زمن التعرض 5 ميللي ثانية 200 إطارات = 1000 ميللي ثانية أو 1 ثانية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احسب عدد الضرب في ثانية واحدة للحصول على وتيرة والتي يتم التعبير عن عدد من الضرب في واحدة ثانية. القيام بذلك عن طريق قسمة عدد من الضرب أهداب أكثر من مرة بين ثانية واحدةفال (مثال: أهداب يدق 50 مرة في شريط فيديو 200 إطارات سجلت في وقت تعرض 5 ميللي ثانية أي 5 ميللي ثانية × 200 إطارات = 1 ثانية؛ تقسيم الآن 50 نبض ب 1 ثانية = 50 هرتز). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب الزاوية الهدبية الضرب من خلال تقييم المسار الذي اتخذه أهداب بطانية عصبية خلال كل من السكتات الدماغية القوة والانتعاش. تنفيذ هذا وفقا لطريقة وصفها سابقا، مع بعض التعديلات الطفيفة 11. لوحظ حركة دقيقة من أهداب الفردي خلال دورة ضربات كاملة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على ورقة خلات وضعت على الشاشة، ورسم خط أفقي على طول حافة البطانة العصبية وخط عمودي من خلال موقف خط الوسط من أهداب في بداية شوط القدرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رسم موقف دقيق للإطار هدب من جانب الإطار وهي تتحرك إلى الأمام خلال شوط القدرة. بطريقة مماثلة، رسم حركة أهداب أثناء السكتة الدماغية الانتعاش. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب الزاوية الهدبية الضرب من الانحراف إلى أقصى حد من هدب من خط الوسط خلال رانه السكتة الدماغية السلطة وكذلك السكتة الدماغية الانتعاش. </li></ol> 4. الكالسيوم تسجيل الإشارات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح المخ بعد، وشطف لفترة وجيزة شريحة الدماغ مع 1X PBS أو PBS Dulbecco و(7.0 درجة الحموضة). إعداد جديدة فلوو-2 لتجنب مضان التبريد والحصول على نسبة جيدة إشارة إلى الضجيج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 1 ملم حل سهم فلوو-2 الحل في dimethylsulfoxide (DMSO)، ومزيج دوامة الحل لمدة 5 دقائق على الأقل لضمان فلوو-2 تم ​​حل متجانس في DMSO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع الحل الأسهم فلوو-2 في 500 مل من DMEM / ارتفاع الجلوكوز تستكمل مع 2٪ B27 قبل تحسنت إلى 37 درجة مئوية إلى تركيز النهائي من 20 ملغ / مل. ملاحظة: B-27 هو الأمثل المصل خالية ملحق التي تحتوي على فيتامين A، كوكتيل المضادة للأكسدة والأنسولين المستخدمة لدعم استمرارية قصيرة أو طويلة الأجل للقرن آمون والخلايا العصبية CNS أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان فورا شريحة الدماغ مع 20 ملغ / مل فلوو-2 لمدة 30 دقيقة عند 37 ° C في لوحة من الزجاج السفلي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحديد تركيز التحميل الأمثل للfluorophore الكالسيوم فلوو-2 وتجنب سمية خلية الصبغة الكالسيوم، وخلايا التحدي مع ATP، والتحقق من بقاء الخلية عن طريق تحديد مسار الوقت وحجم الذروة من إشارات الكالسيوم ردا على ATP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسجيل فيديو لالتذبذب الكالسيوم بمعدل القبض على 5 ميللي ثانية مدة لا تقل عن 1 ثانية (200 لقطة في الثانية)، مع الإثارة وانبعاث موجات من 488 نانومتر و 515 نانومتر، على التوالي (فيلم 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتمييز إشارة الكالسيوم فلوو-2 من تألق ذاتي أو حركة القطع الأثرية، تأكد من أن شدة المنبعثة عند 515 نانومتر ويتم رصد كل على حدة. ملاحظة: فلوو-2 ليست fluoremetric الكالسيوم مناسبة لقياس الكالسيوم داخل الخلايا. ومع ذلك، فإنه هو صبغة دينامية الكالسيوم ممتازة للكشف عن تغيرات سريعة الكالسيوم، مثل التذبذبات الكالسيوم. لتقدير الكالسيوم أكثر دقة، يوصى FURA-2. ومع ذلك، فإن التغييرات ديناميكية للFURA 2 محدودة بسبب ratiometric لهاطبيعة الصبغة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتبع الصيغ المقدمة من قبل الشركة المصنعة لحساب القيم الكالسيوم داخل الخلايا الحرة بالضبط. مثال [كا 2+] = K د × (R - R دقيقة) / (R ماكس - R). حيث K d هو ثابت التفكك للصباغة من الكالسيوم المفرج عنهم، R هو مضان محسوب في 488، وR دقيقة وR ماكس هي نسب مضان في الحد الأدنى والحد الأقصى للتركيز أيون 12. </li></ol> 5. المناعي المجهري <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح أقسام الدماغ مع الفوسفات مخزنة محلول ملحي يحتوي على 4٪ لامتصاص العرق (PFA) و 2٪ سكروز لمدة 10 دقيقة. بدلا من ذلك، وتحديد الدماغ كله مع 4٪ PFA ثم قسم إلى 50 ملم المقاطع باستخدام ناظم البرد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الأنسجة ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1X لمدة 5 دقائق في كل مرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان شريحة الدماغ مع solutiعلى 0.1٪ تريتون-X في برنامج تلفزيوني 1X لمدة 5 دقائق، ثم شطف ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1X لمدة 5 دقائق في كل مرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان شريحة المخ مع الأجسام المضادة الماوس الابتدائي، antiacetylated على تويولين، وتستخدم في التخفيف 1: 5000 في 10٪ FBS في برنامج تلفزيوني 1X لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة (RT) أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الأنسجة ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1X لمدة 5 دقائق في كل مرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان شريحة الدماغ في الضد الثانوية، فلوريسئين المضادة للماوس مفتش في التخفيف من 1: 500 في 10٪ FBS في برنامج تلفزيوني 1X الحل لمدة 1 ساعة على RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل الملاحظة تحت المجهر الفلورسنت، مباين القسم مع 4، 6-diamidino-2-phenylindole (دابي) لمدة 5 دقائق إلى وصمة عار على النواة (أو DNA) 13. لتقليل photobleaching من والصورة الأقسام فورا مع الحد الأدنى من الوقت احتمال التعرض. </li></ol>

<ol>
	<li>AbouAlaiwi, W. A., Lo, S. T., Nauli, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cilia:+Highly+sophisticated+biological+sensors.">Primary cilia: Highly sophisticated biological sensors.</a> Sensors. 9 (9), 7003-7020 (2009).</li><li>Nonaka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Randomization+of+left-right+asymmetry+due+to+loss+of+nodal+cilia+generating+leftward+flow+of+extraembryonic+fluid+in+mice+lacking+kif3b+motor+protein.">Randomization of left-right asymmetry due to loss of nodal cilia generating leftward flow of extraembryonic fluid in mice lacking kif3b motor protein.</a> Cell. 95 (6), 829-837 (1998).</li><li>Satir, P., Christensen, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+structure+and+function+of+mammalian+cilia.">Overview of structure and function of mammalian cilia.</a> Annual review of physiology. 69, 377-400 (2007).</li><li>Delbigio, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ependyma+-+a+protective+barrier+between+brain+and+cerebrospinal-fluid.">The ependyma - a protective barrier between brain and cerebrospinal-fluid.</a> Glia. 14 (1), 1-13 (1995).</li><li>Genzen, J. R., Platel, J. C., Rubio, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bordey+A.+Ependymal+cells+along+the+lateral+ventricle+express+functional+p2x(7)+receptors.">Bordey A. Ependymal cells along the lateral ventricle express functional p2x(7) receptors.</a> Purinergic signalling. 5 (3), 299-307 (2009).</li><li>Appelbe, O. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+mouse+jhy+gene+causes+abnormal+ciliary+microtubule+patterning+and+juvenile+hydrocephalus.">Disruption of the mouse jhy gene causes abnormal ciliary microtubule patterning and juvenile hydrocephalus.</a> Developmental biology. 382 (1), 172-185 (2013).</li><li>Sawamoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+neurons+follow+the+flow+of+cerebrospinal+fluid+in+the+adult+brain+(New+York,+N.Y.).">New neurons follow the flow of cerebrospinal fluid in the adult brain (New York, N.Y.).</a> Science. 311 (5761), 629-632 (2006).</li><li>Banizs, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunctional+cilia+lead+to+altered+ependyma+and+choroid+plexus+function,+and+result+in+the+formation+of+hydrocephalus.">Dysfunctional cilia lead to altered ependyma and choroid plexus function, and result in the formation of hydrocephalus.</a> Development. 132 (23), 5329-5339 (2005).</li><li>Kawanabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cilostazol+prevents+endothelin-induced+smooth+muscle+constriction+and+proliferation.">Cilostazol prevents endothelin-induced smooth muscle constriction and proliferation.</a> PloS one. 7 (9), e44476 (2012).</li><li>Liu, T., Jin, X., Prasad, R. M., Sari, Y., Nauli, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+types+of+ependymal+cells+with+intracellular+calcium+oscillation+are+characterized+by+distinct+cilia+beating+properties.">Three types of ependymal cells with intracellular calcium oscillation are characterized by distinct cilia beating properties.</a> J Neurosci Res. 92 (9), 1199-1204 (2014).</li><li>Chilvers, M. A., O'Callaghan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+ciliary+beat+pattern+and+beat+frequency+using+digital+high+speed+imaging:+Comparison+with+the+photomultiplier+and+photodiode+methods.">Analysis of ciliary beat pattern and beat frequency using digital high speed imaging: Comparison with the photomultiplier and photodiode methods.</a> Thorax. 55 (4), 314-317 (2000).</li><li>Nauli, S. M., Jin, X., AbouAlaiwi, W. A., El-Jouni, W., Su, X., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-motile+primary+cilia+as+fluid+shear+stress+mechanosensors.">Non-motile primary cilia as fluid shear stress mechanosensors.</a> Methods in enzymology. 525, 1-20 (2013).</li><li>AbouAlaiwi, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survivin-induced+abnormal+ploidy+contributes+to+cystic+kidney+and+aneurysm+formation.">Survivin-induced abnormal ploidy contributes to cystic kidney and aneurysm formation.</a> Circulation. 129 (6), 660-672 (2014).</li><li>AbouAlaiwi, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+polycystin-2+is+a+mechanosensitive+calcium+channel+involved+in+nitric+oxide+signaling+cascades.">Ciliary polycystin-2 is a mechanosensitive calcium channel involved in nitric oxide signaling cascades.</a> Circulation research. 104 (7), 860-869 (2009).</li><li>Jin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cilioplasm+is+a+cellular+compartment+for+calcium+signaling+in+response+to+mechanical+and+chemical+stimuli.">Cilioplasm is a cellular compartment for calcium signaling in response to mechanical and chemical stimuli.</a> Cell Mol Life Sci. 71 (11), 2165-2178 (2014).</li><li>Praetorius, H. A., Spring, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bending+the+mdck+cell+primary+cilium+increases+intracellular+calcium.">Bending the mdck cell primary cilium increases intracellular calcium.</a> The Journal of membrane biology. 184 (1), 71-79 (2001).</li><li>Smith, C. M., Radhakrishnan, P., Sikand, K., O'Callaghan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+ethanol+and+acetaldehyde+on+brain+ependymal+and+respiratory+ciliary+beat+frequency.">The effect of ethanol and acetaldehyde on brain ependymal and respiratory ciliary beat frequency.</a> Cilia. 2 (1), 5 (2013).</li></ol>

أعلنت أي تضارب في المصالح.

هو موضح هنا هو بروتوكول لإعداد أنسجة المخ الماوس لكل من يعيش التصوير والفحص المجهري مضان التي توفر الملاحظة السريعة والحساسة وثيقة من أهداب بطانية عصبية داخل البطينات الدماغية. ولا تقتصر هذه التقنية إلى البطين الجانبي فقط؛ يمكن استخدامه لمراقبة أهداب في البطينات ا?...

أهداب هي عضيات القائم على أنيبيب الحسية التي تمتد من سطح الخلية إلى البيئة خارج الخلية. حسب منظمة أنيبيب، ويمكن تصنيف أهداب إلى نوعين - &quot;9 + 0&quot; أو &quot;9 + 2&quot;. وظيفيا، استنادا إلى الحركة، ويمكن ان تصنف هذه كما متحركة أو غير متحركة أهداب 1. أهداب الأساسي هو مصطلح يستخدم عادة للدلالة على &quot;9 + 0&quot; أهداب غير متحركة. هذه تسع الأنابيب الدقيقة صدرة موازية (الرمز بواسطة &#39;9&#39;) وزوج المركزي من الأنابيب الدقيقة غائب داخل غمد المركزي (الرمز بواسطة &#39;0&#39;). ومع ذلك، بعض &quot;9 + 0&quot; أهداب، مثل أهداب العقدي، التي تنظم الجنين تجانب هم متحركة 2. من ناحية أخرى، تتميز أهداب متحركة، بالإضافة إلى تسعة الحلل أنيبيب بالتوازي مع ذلك، عن طريق الزوج المركزي إضافي من الحلل أنيبيب والمرتبطة البروتينات داينين ​​السيارات لتسهيل الحركة. بالإضافة إلى ذلك، بعض &quot;9+2 &quot;أهداب مثل أهداب الشم غير قابلة للمتحرك 3. وتتميز خلايا البطانة العصبية تبطن البطينات الدماغ والقناة المركزية للحبل الشوكي عن طريق أهداب متحركة التي تدفع السائل النخاعي (CSF) جنبا إلى جنب البطينين الدماغ 4. الهدف العام من هذه الطريقة هو تسهيل دراسة ديناميات أهداب والتشوهات الهيكلية متحركة. صحة الدماغ والتنمية تعتمد بشكل كبير على التداول بكفاءة CSF داخل البطينات الدماغية. على سبيل المثال، وتدفق CSF طبيعي وتوازن السوائل يتطلب الضرب الطبيعي والوظيفي أهداب بطانية عصبية 5،6، والتي بدورها تلعب أدوارا حاسمة في تنظيم حركة الاتجاه الخلايا العصبية ووقف الهجرة الخلية 7. على هذا النحو، غير طبيعي وظيفة الأهداب البطانة العصبية أو بنية يمكن أن يؤدي إلى تدفق CSF الشاذ، الذي يرتبط مع استسقاء الدماغ، وهي حالة طبية التي يوجد فيها تراكم غير طبيعي للCSF في بطينات بالمطر. هذا قد يسبب بالتالي زيادة الضغط داخل الجمجمة والتوسيع التدريجي من الرأس، والتشنج، رؤية النفق، والإعاقة العقلية 8. مزايا هذه التقنية على الطرق القائمة هو أنه سمح للمرة الأولى أن يقدم ثلاثة أنواع الخلايا البطانة العصبية متميزة: I، II، III و، على أساس فريد من نوعه تردد الهدبية الضرب والضرب زاوية. يتم ترجمة هذه خلايا البطانة العصبية في مناطق معينة في الدماغ البطينين. وعلاوة على ذلك، فإن آثار العمر وكلاء الدوائية مثل الكحول وcilostazol على تغيير الأنماط الخلوية البطانة العصبية أو تعريب بهم يمكن البرهنة، الذي لم يكن ممكنا من قبل هذا التصنيف من خلايا البطانة العصبية. Cilostazol هو المانع من الفوسفو-3، وهو الانزيم الذي يتأيض المخيم لAMP وينظم أيضا الكالسيوم داخل الخلايا 9. باستخدام عالية السرعة تحليل التصوير مضان يسمح التصوير وقياس للداخل خلوية فريدة من نوعهاخصائص التذبذب الكالسيوم من الخلايا البطانة العصبية. على سبيل المثال، على حد سواء الكحول وcilostazol تغيير كبير في بطانية عصبية تردد الهدبية الضرب وكذلك الخلايا خصائص التذبذبات الكالسيوم، والذي بدوره يمكن أن يؤدي إلى تغيير في النخاعي استبدال حجم السوائل عن طريق أهداب بطانية عصبية 10. باختصار، كانت هذه التقنية الرئيسية لتوفير أول دليل على ثلاثة أنواع متميزة من خلايا البطانة العصبية مع مختلف خصائص التذبذب الكالسيوم. في المقطع التالي، وتقدم خطوة بخطوة محة مفصلة عن الإجراء، مع إيلاء اهتمام وثيق لإعداد الأنسجة والتعامل معها.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM/HIGH GLUCOSE</td>
			<td>Cellgro Mediatech Inc.</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30088-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30256-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S-2395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-2&#160;</td>
			<td>TEF Labs</td>
			<td>#0200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD HardSet Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-acetylated a-tubulin antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7451&#160;</td>
			<td>clone 6-11B1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Anti-mouse antibody</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>FI-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture plate</td>
			<td>VWR Vista Vision</td>
			<td>30-2041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Slip (18x18)</td>
			<td>VWR Vista Vision</td>
			<td>16004.326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>Leica VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>Leica CM1860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Fluorescence Microscope</td>
			<td>Nikon&#160;</td>
			<td>Nikon TE2000</td>
			<td>60X oil&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass 24x60mm</td>
			<td>VWR Vista Vision</td>
			<td>16004-312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI filter cube</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of the ependymal cilia in the lateral ventricles of the mouse brain

خلايا البطانة العصبية Multiciliated خط البطينين في الدماغ الكبار. ويرتبط ظيفة غير طبيعية أو بنية أهداب بطانية عصبية مع مختلف عجز عصبي. التيار فيفو السابقين التصوير المباشر متحركة تقنية أهداب البطانة العصبية يسمح لدراسة تفصيلية لديناميات الهدبية بعد عدة خطوات. وتشمل هذه الخطوات: الفئران القتل الرحيم مع ثاني أكسيد الكربون وفقا لبروتوكولات جامعة الرعاية المؤسسية توليدو الحيوان واللجنة الاستخدام (IACUC)؛ قطع القحف تليها إزالة المخ وسهمي تشريح الدماغ مع vibratome أو شفرة حادة للحصول على المقاطع رقيقة جدا من خلال البطينين الوحشي الدماغ، حيث يمكن تصور أهداب بطانية عصبية. حضانة شرائح الدماغ في لوحة من الزجاج السفلي مخصصة تحتوي على التعديل النسر المتوسطة (DMEM) / ارتفاع الجلوكوز، Dulbecco وعند 37 درجة مئوية في ظل وجود 95٪ / 5٪ O 2 / CO 2 مزيج أمر ضروري للحفاظ على الأنسجة على قيد الحياة خلالالتجربة. ثم يتم تسجيل الفيديو من الضرب أهداب باستخدام مجهر تدخل الفرق التباين العالي الدقة. ثم يتم الفيديو تحليل الإطار من جانب الإطار لحساب التردد الهدبية الضرب. وهذا يسمح تصنيف واضح للخلايا البطانة العصبية إلى ثلاث فئات أو أنواع على أساس تردد الهدبية الضرب وزاوية. وعلاوة على ذلك، وهذا الأسلوب يسمح استخدام عالية السرعة تحليل التصوير مضان لتحديد خصائص فريدة من نوعها داخل الخلايا خصائص التذبذب الكالسيوم من خلايا البطانة العصبية فضلا عن تأثير كلاء الدوائية على التذبذبات الكالسيوم وتردد الهدبية الضرب. بالإضافة إلى ذلك، هذا الأسلوب هو مناسبة للتصوير المناعي للهيكل الهدبية والهدبية البروتين توطين الدراسات. هذا مهم بشكل خاص في تشخيص المرض والنمط الظاهري الدراسات. ويعزى القيد الرئيسي لهذه التقنية إلى انخفاض في حي حركة أهداب متحركة كما تبدأ أنسجة المخ في الموت.

قياس وظيفة الأهداب البطانة العصبية في دماغ الفأر الحي يتم استخدام الطريقة الموصوفة في هذا البروتوكول لمراقبة وظيفة الأهداب البطانة العصبية وهيكل في أنسجة جديدة تشريح من مخ الفأر وكذلك لرصد ودراسة أهداب تردد الضرب. وصفت الخطوات ...

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain at JoVE.com

Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain

باستخدام عالية الدقة تدخل الفرق النقيض (DIC) المجهري، ويتجلى ملاحظة المجراة سابقا من ضرب أهداب بطانية عصبية متحركة تقع داخل البطينات الدماغية الماوس عن طريق الحية التصوير. هذه التقنية تتيح للتسجيل فريدة من نوعها تردد الهدبية الضرب والضرب زاوية وكذلك الكالسيوم داخل الخلايا خصائص التذبذب سرعة الخاصة بهم.

التصوير المباشر لالبطانة العصبية سيليا في البطينات الجانبية للدماغ الفأر

Multiciliated ependymal cells line the ventricles in the adult brain. Abnormal function or structure of ependymal cilia is associated with various ...

live-imaging-ependymal-cilia-lateral-ventricles-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.6K Views.  University of Toledo, College of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences.  باستخدام عالية الدقة تدخل الفرق النقيض (DIC) المجهري، ويتجلى ملاحظة المجراة سابقا من ضرب أهداب بطانية عصبية متحركة تقع داخل البطينات الدماغية الماوس عن طريق الحية التصوير. هذه التقنية تتيح للتسجيل فريدة من نوعها تردد الهدبية الضرب وال?...

Video: Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured neurons for extended durations1-3. This is now possible through the use of vital dyes and fluorescent proteins with which cytoskeletal components, organelles, and other structures in living cells can be labeled and then visualized via dynamic fluorescence microscopy. For example, in embryonic chicken sympathetic neurons, mitochondrial movement was characterized using the vital dye rhodamine 1234. In another study, mitochondria were visualized in rat forebrain neurons by transfection of mitochondrially targeted eYFP5. However, imaging of primary neurons over minutes, hours, or even days presents a number of issues. Foremost among these are: 1) maintenance of culture conditions such as temperature, humidity, and pH during long imaging sessions; 2) a strong, stable fluorescent signal to assure both the quality of acquired images and accurate measurement of signal intensity during image analysis; and 3) limiting exposure times during image acquisition to minimize photobleaching and avoid phototoxicity.
Here, we describe a protocol that permits the observation, visualization, and analysis of mitochondrial movement in cultured hippocampal neurons with high temporal resolution and under optimal life support conditions. We have constructed an affordable stage-top incubator that provides good temperature regulation and atmospheric gas flow, and also limits the degree of media evaporation, assuring stable pH and osmolarity. This incubator is connected, via inlet and outlet hoses, to a standard tissue culture incubator, which provides constant humidity levels and an atmosphere of 5-10% CO2/air. This design offers a cost-effective alternative to significantly more expensive microscope incubators that don't necessarily assure the viability of cells over many hours or even days. To visualize mitochondria, we infect cells with a lentivirus encoding a red fluorescent protein that is targeted to the mitochondrion. This assures a strong and persistent signal, which, in conjunction with the use of a stable xenon light source, allows us to limit exposure times during image acquisition and all but precludes photobleaching and phototoxicity. Two injection ports on the top of the stage-top incubator allow the acute administration of neurotransmitters and other reagents intended to modulate mitochondrial movement. In sum, lentivirus-mediated expression of an organelle-targeted red fluorescent protein and the combination of our stage-top incubator, a conventional inverted fluorescence microscope, CCD camera, and xenon light source allow us to acquire time-lapse images of mitochondrial transport in living neurons over longer durations than those possible in studies deploying conventional vital dyes and off-the-shelf life support systems.

We describe a protocol that allows imaging of mitochondria in living neurons via fluorescence microscopy over long durations. Imaging over extended periods is accomplished through lentivirus-mediated expression of a mitochondrially targeted fluorescent protein and use of an inexpensive stage-top incubator that was designed and built in our laboratory.

تعديل العمليات العصبية والنقل الميتوكوندريا : تصوير مباشر في الخلايا العصبية الحصين خلال فترات طويلة

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Manual Drainage of the Zebrafish Embryonic Brain Ventricles

Cerebrospinal fluid (CSF) is a protein rich fluid contained within the brain ventricles. It is present during early vertebrate embryonic development and persists throughout life. Adult CSF is thought to cushion the brain, remove waste, and carry secreted molecules1,2. In the adult and older embryo, the majority of CSF is made by the choroid plexus, a series of highly vascularized secretory regions located adjacent to the brain ventricles3-5. In zebrafish, the choroid plexus is fully formed at 144 hours post fertilization (hpf)6. Prior to this, in both zebrafish and other vertebrate embryos including mouse, a significant amount of embryonic CSF (eCSF) is present . These data and studies in chick suggest that the neuroepithelium is secretory early in development and may be the major source of eCSF prior to choroid plexus development7.
eCSF contains about three times more protein than adult CSF, suggesting that it may have an important role during development8,9. Studies in chick and mouse demonstrate that secreted factors in the eCSF, fluid pressure, or a combination of these, are important for neurogenesis, gene expression, cell proliferation, and cell survival in the neuroepithelium10-20. Proteomic analyses of human, rat, mouse, and chick eCSF have identified many proteins that may be necessary for CSF function. These include extracellular matrix components, apolipoproteins, osmotic pressure regulating proteins, and proteins involved in cell death and proliferation21-24. However, the complex functions of the eCSF are largely unknown.
We have developed a method for removing eCSF from zebrafish brain ventricles, thus allowing for identification of eCSF components and for analysis of the eCSF requirement during development. Although more eCSF can be collected from other vertebrate systems with larger embryos, eCSF can be collected from the earliest stages of zebrafish development, and under genetic or environmental conditions that lead to abnormal brain ventricle volume or morphology. Removal and collection of eCSF allows for mass spectrometric analysis, investigation of eCSF function, and reintroduction of select factors into the ventricles to assay their function. Thus the accessibility of the early zebrafish embryo allows for detailed analysis of eCSF function during development.

We present a method to collect cerebrospinal fluid (CSF) and to create a system which lacks CSF within the embryonic zebrafish brain ventricular system. This allows for further examination of CSF composition and its requirement during embryonic brain development.

دليل الصرف من البطينين الدماغ الجنينية اسماك الزرد

Cerebrospinal fluid  (CSF) is a protein rich fluid contained within the brain ventricles. It is  present during early vertebrate embryonic development and ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

التصوير حية من الانقسام في تطوير الجنينية الماوس اللحاء

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and lifespan. In addition, telomerase protects the mitochondria from oxidative stress and confers resistance to apoptosis, suggesting its possible importance for the surviving of non-mitotic, highly active cells such as neurons. We previously demonstrated the ability of novel telomerase activators to increase telomerase activity and expression in the various mouse brain regions and to protect motor neurons cells from oxidative stress. These results strengthen the notion that telomerase is involved in the protection of neurons from various lesions. To underline the role of telomerase in the brain, we here compare the activity of telomerase in male and female mouse brain and its dependence on age. TRAP assay is a standard method for detecting telomerase activity in various tissues or cell lines. Here we demonstrate the analysis of telomerase activity in three regions of the mouse brain by non-denaturing protein extraction using CHAPS lysis buffer followed by modification of the standard TRAP assay.
In this 2-step assay, endogenous telomerase elongates a specific telomerase substrate (TS primer) by adding TTAGGG 6 bp repeats (telomerase reaction). The telomerase reaction products are amplified by PCR reaction creating a DNA ladder of 6 bp increments. The analysis of the DNA ladder is made by 4.5% high resolution agarose gel electrophoresis followed by staining with highly sensitive nucleic acid stain.
Compared to the traditional TRAP assay that utilize 32P labeled radioactive dCTP&#39;s for DNA detection and polyacrylamide gel electrophoresis for resolving the DNA ladder, this protocol offers a non-toxic time saving TRAP assay for evaluating telomerase activity in the mouse brain, demonstrating the ability to detect differences in telomerase activity in the various female and male mouse brain region.

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol TRAP Assay

Telomerase is expressed in the neonatal brain and also in distinct regions of the adult brain. We present a non-toxic time saving TRAP assay for the analysis of telomerase activity in various regions of the mouse brain and detection of differences in telomerase activity between male and female mouse brains.

نشاط التيلوميراز في مناطق مختلفة من الدماغ ماوس: التيلوميراز غير المشعة كرر بروتوكول التضخيم (TRAP) الفحص

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and ...

3D Modeling of the Lateral Ventricles and Histological Characterization of Periventricular Tissue in Humans and Mouse

The ventricular system carries and circulates cerebral spinal fluid (CSF) and facilitates clearance of solutes and toxins from the brain. The functional units of the ventricles are ciliated epithelial cells termed ependymal cells, which line the ventricles and through ciliary action are capable of generating laminar flow of CSF at the ventricle surface. This monolayer of ependymal cells also provides barrier and filtration functions that promote exchange between brain interstitial fluids (ISF) and circulating CSF. Biochemical changes in the brain are thereby reflected in the composition of the CSF and destruction of the ependyma can disrupt the delicate balance of CSF and ISF exchange. In humans there is a strong correlation between lateral ventricle expansion and aging. Age-associated ventriculomegaly can occur even in the absence of dementia or obstruction of CSF flow. The exact cause and progression of ventriculomegaly is often unknown; however, enlarged ventricles can show regional and, often, extensive loss of ependymal cell coverage with ventricle surface astrogliosis and associated periventricular edema replacing the functional ependymal cell monolayer. Using MRI scans together with postmortem human brain tissue, we describe how to prepare, image and compile 3D renderings of lateral ventricle volumes, calculate lateral ventricle volumes, and characterize periventricular tissue through immunohistochemical analysis of en face lateral ventricle wall tissue preparations. Corresponding analyses of mouse brain tissue are also presented supporting the use of mouse models as a means to evaluate changes to the lateral ventricles and periventricular tissue found in human aging and disease. Together, these protocols allow investigations into the cause and effect of ventriculomegaly and highlight techniques to study ventricular system health and its important barrier and filtration functions within the brain.

Using MRI scans (human), 3D imaging software, and immunohistological analysis, we document changes to the brain&#8217;s lateral ventricles. Longitudinal 3D mapping of lateral ventricle volume changes and characterization of periventricular cellular changes that occur in the human brain due to aging or disease are then modeled in mice.

النمذجة 3D من جانبي البطينات ونسيجية توصيف الأنسجة المحيطة بالبطين في البشر والفأر

The ventricular system carries and circulates cerebral spinal fluid (CSF) and facilitates clearance of solutes and toxins from the brain. The functional ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal cord of the majority of these fiber systems have not been thoroughly investigated in any species. Serotonergic fibers, which project to the spinal cord, have been studied in rats and opossums on histological sections and their functional significance has been deduced based on their fiber termination pattern in the spinal cord. With the development of CLARITY and CUBIC techniques, it is possible to investigate this fiber system and its distribution in the spinal cord, which is likely to reveal previously unknown features of serotonergic supraspinal pathways. Here, we provide a detailed protocol for imaging the serotonergic fibers in the mouse spinal cord using the combined CLARITY and CUBIC techniques. The method involves perfusion of a mouse with a hydrogel solution and clarification of the tissue with a combination of clearing reagents. Spinal cord tissue was cleared in just under two weeks, and the subsequent immunofluorescent staining against serotonin was completed in less than ten days. With a multi-photon fluorescent microscope, the tissue was scanned and a 3D image was reconstructed using Osirix software.

Supraspinal projections are important for pain perception and other behaviors, and serotonergic fibers are one of these fiber systems. The present study focused on the application of the combined CLARITY/CUBIC protocol to the mouse spinal cord in order to investigate the termination of these serotonergic fibers.

التصوير ألياف هرمون السيروتونين في الحبل الشوكي الماوس عن طريق وضوح / تقنية مكعب

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

تسجيل اللدونة متشابك في شرائح هيبوكامبال الحاد تحتفظ في صغيرة الحجم-إعادة التدوير، ونضح-، وغمر من نوع نظام الدائرة

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or postmitotic neurons. Later, some progenitors switch to a gliogenic fate, adding to the astrocyte and oligodendrocyte populations. Using time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cell cultures, it is possible to study the cellular and molecular mechanisms controlling the mode of cell division and cell cycle parameters of progenitor cells. Similarly, the fate of postmitotic cells can be examined using cell-specific fluorescent reporter proteins or post-imaging immunocytochemistry. More importantly, all these features can be analyzed at the single-cell level, allowing the identification of progenitors committed to the generation of specific cell types. Manipulation of gene expression can also be performed using viral-mediated transfection, allowing the study of cell-autonomous and non-cell-autonomous phenomena. Finally, the use of fusion fluorescent proteins allows the study of symmetric and asymmetric distribution of selected proteins during division and the correlation with daughter cells fate. Here, we describe the time-lapse video-microscopy method to image primary cerebral cortex murine cells for up to several days and analyze the mode of cell division, cell cycle length and fate of newly generated cells. We also describe a simple method to transfect progenitor cells, which can be applied to manipulate genes of interest or simply label cells with reporter proteins.

Live imaging is a powerful tool to study cellular behaviors in real time. Here, we describe a protocol for time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cells that allows a detailed examination of the phases enacted during the lineage progression from primary neural stem cells to differentiated neurons and glia.

يعيش تصوير خلايا قشرة الدماغ الأولية باستخدام نظام ثقافة 2D

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

Exploring Deep Space - Uncovering the Anatomy of Periventricular Structures to Reveal the Lateral Ventricles of the Human Brain

Anatomy students are typically provided with two-dimensional (2D) sections and images when studying cerebral ventricular anatomy and students find this challenging. Because the ventricles are negative spaces located deep within the brain, the only way to understand their anatomy is by appreciating their boundaries formed by related structures. Looking at a 2D representation of these spaces, in any of the cardinal planes, will not enable visualisation of all of the structures that form the boundaries of the ventricles. Thus, using 2D sections alone requires students to compute their own mental image of the 3D ventricular spaces. The aim of this study was to develop a reproducible method for dissecting the human brain to create an educational resource to enhance student understanding of the intricate relationships between the ventricles and periventricular structures. To achieve this, we created a video resource that features a step-by-step guide using a fiber dissection method to reveal the lateral and third ventricles together with the closely related limbic system and basal ganglia structures. One of the advantages of this method is that it enables delineation of the white matter tracts that are difficult to distinguish using other dissection techniques. This video is accompanied by a written protocol that provides a systematic description of the process to aid in the reproduction of the brain dissection. This package offers a valuable anatomy teaching resource for educators and students alike. By following these instructions educators can create teaching resources and students can be guided to produce their own brain dissection as a hands-on practical activity. We recommend that this video guide be incorporated into neuroanatomy teaching to enhance student understanding of the morphology and clinical relevance of the ventricles.

This paper demonstrates the effective use of a fiber dissection method to reveal the superficial white matter tracts and periventricular structures of the human brain, in three-dimensional space, to aid student comprehension of ventricular morphology.

استكشاف الفضاء السحيق-كشف تشريح لهياكل تلين للكشف عن البطينات الجانبية للدماغ البشري

Anatomy students are typically provided with two-dimensional (2D) sections and images when studying cerebral ventricular anatomy and students find this ...

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical properties, synaptic connections, and in vivo functions, but their basic functional and anatomical organization from cellular to network scale is poorly understood. Here we describe a method for the three-dimensional imaging of fluorescently-labeled neurons across large areas of the brain for the investigation of the cortical cellular organization. Specific types of neurons are labeled by the injection of fluorescent retrograde neuronal tracers or expression of fluorescent proteins in transgenic mice. Block brain samples, e.g., a hemisphere, are prepared after fixation, made transparent with tissue clearing methods, and subjected to fluorescent immunolabeling of the specific cell types. Large areas are scanned using confocal or two-photon microscopes equipped with large working distance objectives and motorized stages. This method can resolve the periodic organization of the cell type-specific microcolumn functional modules in the mouse neocortex. The procedure can be useful for the study of three-dimensional cellular architecture in the diverse brain areas and other complex tissues.

Here we describe a procedure for tissue clearing, fluorescent labeling, and large-scale imaging of mouse brain tissue which, thereby, enables visualization of the three-dimensional organization of cell types in the neocortex.