אנו מודים על תמיכת פיונה פולי מעבדה מצוינת וטיפול דג זברה. עבודה זו נתמכה על מלגת AHA predoctoral לGW (11PRE5730027) ומענקי NHLBI לHJY (R01HL66292) ורשות לפיתוח ירושלים (R01HL095690).

סקירה כללית של זריקות עובר דג זברת שלב ספציפיים אנטיסנס morpholino (MO), אשר נקלטת על mRNA ממוקד ולשבש ביטוי חלבון שמהתמליל, נמצאות בשימוש נרחב במציאת גן (פסד-of-פונקציה) לימודים בדג הזברה 13,14. הגדרות גנים, LLC מציעות MOS שמתויגים עם או carboxyfluorescein (פולט הירוק פלואורסצנטי) או lissamine (פולט האדום פלואורסצנטי) כדי לזהות MO בעוברים הזריקו באמצעות מיקרוסקופ ניאון. באמצעות הזרקת MO לתוך תא החלמון בשלבים שונים של פיתוח דג זברה, זה אפשרי כדי לספק את MO לתאים ספציפיים של העובר (איורי 1 א-F). MO מוזרק לתוך החלמון בין 1-4 השלבים הסלולריים (0-1 hpf) נכנס כל התאים העובריים (איורים 1 א &#39;, ד&#39;, ד &#39;) באמצעות קשרים עם החלמון שנמשכים עד השלב 32-15 התאים כדי להקל על מציאה העולמית. MO מוזרק לתוך החלמון בmidblastשלבי אולא (2.5-3 hpf) יכולים להיכנס לאבות של DFCs (האיורים 1B, E, E &#39;) הסביר דרך גשרי cytoplasmic 8 ותפקוד גן מציאה במיוחד בשושלת DFC / KV תא 12, בלי להיכנס לשושלות תאים עובריות אחרות ביותר . כשליטה חשובה לבחון האם תפקוד הגן נדרש בDFC / KV או גם בחלמון 12,16, אפשר גם להגביל את MO לתא החלמון ידי הזרקה בין שלבי epiboly כיפה-30% (~ 4.5 hpf) לאחר כל גשרי cytoplasmic נסגרו (תרשימי 1C, F, ו &#39;). זריקות אלה היו בשימוש בשילוב לנתח תפקוד גן בתאי DFC / KV 17-24. כדי להעריך את זרימת נוזל בKV, microbeads ניאון הם מוזרקים לתוך KV הלום בין 6-10 שלבי somite (12-14 hpf) ולאחר מכן צלם באופן מיידי באמצעות videomicroscopy (תרשימי 1G-J). Microbeads זמין שפולטים פלואורסצנטי אדום או ירוק (או שניהם), כך שניתן להשתמש שוניםערוצים לתמונת הניאון microbeads ומו. 1. הזרקת שלב ספציפי של Morpholinos (MO) הזרקה של MO לעוברי דג זברה כבר הוכיח בעבר 25,26. כאן, אנו מתארים בקצרה זריקות MO שלב ספציפיות. בעקבות כל הזריקות, עוברים מועברים לצלחת פטרי והודגרו ב 28.5 מעלות צלזיוס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרקת MO גלובלית: איסוף עוברים מייד לאחר הפריה ולטעון אותם לתוך צלחת הזרקה. טען MO ניאון למחט נימים ולעגן את המחט על microinjector (למשל הרווארד Apparatus PLI-90 פיקו מזרק). לשבור את קצה המחט ולהתאים את הגדרות הזרקה (לחץ ו / או שעה) כדי ליצור טיפת הזרקה שיש נפח של 1 nl כמתואר 25,26. שימוש stereomicroscope לנתח, להזריק 1 nl של MO בחלמון (איור 1 א) של ≥ 50 עוברים לניסוי. לעבוד במהירות כדי להשלים את הזריקות על ידי אייל 4-התאדואר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> DFC ממוקד הזרקת MO: איסוף עוברים מייד לאחר הפריה ולדגור על 28.5 מעלות צלזיוס כאשר העוברים הגיעו לשלב 256-התא (~ 2.5 hpf), לטעון אותם במהירות אל תוך צלחת הזרקה ואז מזריק 1 nl של הניאון MO בחלמון של ≥ 100 עוברים בין שלבי 256-תא והתא 1000 (איור 1B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זריקת חלמון ממוקד-MO: איסוף עוברים מייד לאחר הפריה ולדגור על 28.5 מעלות צלזיוס בשלב הכיפה (~ 4 hpf), לטעון את העוברים לתוך צלחת הזרקה ואז מזריק 1 nl של הניאון MO בחלמון של ≥ 100 עוברים בין הכיפה ושלבי epiboly 30% (התרשים 1C). </li></ol> 2. בחירת עוברים הזריקו לניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר הזריק MO עוברים מגיעים לשלב 75%-epiboly (8 hpf), להסיר עוברים מופרים ומתים, ואז עובר מסך חיים תחת מיקרוסקופ לנתח ניאון לחלוקת MO הניאון. אז allow נבחר עוברים להתפתח ב28.5 ° C. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לMO זריקות עולמיות, בחר עוברים שפלואורסצנטי מופצים באופן שווה לאורך כל התאים העובריים (1D איור; 2A איור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לDFC ממוקד MO זריקות, בחר עוברים בי הניאון MO יש המתפרש על פני החלמון ונראה מרוכז בשולי blastoderm הגבו (DFCs) (האיור 1E; התרשים 2B). בשלב זה, זה יכול להיות קשה לדמיין DFCs ניאון בשל פלואורסצנטי הבהיר בחלמון הבסיסי. תשמרו על עצמך שלא לכלול בעוברים שMO הניאון כבר שולב תאים עובריים שונים מDFCs או נשאר מצטבר באזור ההזרקה (האיור 2D). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלמון ממוקד MO זריקות, בחר עוברים בי MO פלואורסצנטי מופץ באופן שווה בחלמון ולא נצפה בכל תאים עובריים (האיור 1F; האיור 2C). שוב, הסר עוברים בי MO הניאון נשארמקובצת באזור ההזרקה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בין שלבי 2-4-somite (~ 11 hpf), עוברי מסך פעם שנייה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות הגדלה גבוהה יותר. לאחר מכן, הנח עוברים נבחרים להתפתח ב28.5 מעלות צלזיוס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזריקות MO הגלובליות, להבטיח עוברים נבחרים יש MO פלואורסצנטי מופץ באופן שווה KV וכל התאים העובריים (1D איור &#39;; 2E איור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לDFC ממוקד MO זריקות, בחר בקפידה עוברים שפלואורסצנטי MO רק בתאי KV והחלמון (האיור 1E &#39;). עוברים מהונדסים שמביע GFP בתאי KV, כגון Tg (Dusp6: d2EGFP) 27, יכול לסייע בזיהוי של עוברים בי MO נמסר בהצלחה לתאי KV (האיור 2F). השלך עוברים בעלי MO פלואורסצנטי בתאים עובריים שתאי KV אחרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלמון ממוקד MO זריקות, בחר עוברים שפלואורסצנטי MO באופן בלעדי בחלמון (איור 1F &#39;: איור2G). </li></ol></li></ol> 3. עוברי הרכבה לנתח את זרימת נוזל בKV <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנתח את זרימת נוזל סימטרית בKV העולמי MO, DFC הממוקד MO או חלמון במיקוד MO עוברים מוזרקים, בזהירות dechorionate ~ 20 עוברים בין 4-6 שלבי somite (~ 11-12 hpf) עם מלקחיים חדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 50 מ&quot;ל של 1% agarose נקודת התכה נמוכה וaliquot לתוך 5 מיליליטר צינורות להישמר כנוזל באמבט יבש על 42 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה עוברת אחד לשקופית זכוכית דיכאון (ציוד מדעי המאוחד, Inc) ולהסיר כמה שיותר המים ככל האפשר. לשתק את העובר על ידי ההוספה מספיק חם 1% agarose נקודת התכה נמוכה, רק כדי לכסות את העובר (יותר מדי agarose יכול להפריע להדמיה שלאחר מכן). כagarose מתמצק, להשתמש במלקחיים כדי למקם את העובר באופן שKV פונה כלפי מעלה (תצוגה הגבתה) (איור 1H). הר 10 עוברים עם עובר אחד לכל שקופית. לעבוד במהירות כדי להבטיח את כל הזריקות בשלב הבא הן Completed ידי שלב 10 somite (14 hpf). </li></ol> 4. הזרקה של microbeads פלורסנט לתוך KV <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דלל Fluoresbrite Multifuorescent 0.5 מיקרון הקוטר microspheres (Polysciences, Inc) ל1:50 במים סטריליים בצינור 1.5 מ&quot;ל אפנדורף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבב 1:50 דילול microbeads ביסודיות על ידי קשה על הצינור ולטעון 3 μl למחט נימים. שימוש באותה microinjector משמש לMO זריקות (למשל הרווארד Apparatus PLI-90 פיקו מזרק), לשבור את קצה המחט עם מלקחיים ולהתאים את הגדרות ההזרקה לייצר הקטנה ביותר האפשרית (&lt;0.5 NL) טיפת הזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מיקרוסקופ לנתח, ליישר את המחט עם לום KV של העובר המורכב הראשון. הכנס את המחט לתוך הלום ולהזריק נפח קטן (&lt;0.5 NL) של חרוזים (האיור 1G). קצה מחט קטן ונפח הזרקה קטן הם קריטיים כדי למנוע KV המזיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק את כל העוברים רכובים. ברגע שעובר כבר injecteד, ירידה של מים סטריליים ניתן להוסיף על גבי agarose כדי למנוע ממנו להתייבש. במהלך הזריקות, החרוזים לעתים קרובות לחסום את פתיחת המחט. זה דורש שובר-קצה המחט והתאמת עוצמת קול ההזרקה על ידי ויסות לחץ או הגדרת זמן של מנגנון microinjection. החלף את המחט, אם זה הופך בוטה מספיק כדי לגרום לניזק משמעותי בעת ההזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסך העוברים המוזרקים למסירה מוצלחת של חרוזים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי מתחם זקוף (למשל Zeiss AxioImager M1) באמצעות 20X אובייקטיבי. ראשית, לקבוע אם מבנה KV הוא ללא פגע באמצעות brightfield תאורה (איור 1J), ולאחר מכן להשתמש פלואורסצנטי כדי לבחון את החרוזים. בחר עוברים בי חרוזים נמצאים ונע בתוך חלל KV. השלך עוברים עם ניזק KV או אין חרוזים צפים בKV. זה קל לפספס KV ולספק חרוזים לרקמות סמוכות או חלמון הבסיסי. גם אם ייכשל, ההר anoTher 10 עוברים וחזרו על תהליך ההזרקה. </li></ol> 5. הדמיה וניתוח של זרימת נוזל KV <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל עובר שנבחר עם חרוזים בתוך KV, להוסיף טיפה של מים סטריליים כדי לכסות agarose ולאחר מכן להתבונן KV תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי המתחם הזקוף באמצעות אובייקטיבי טבילת מי 63X (איור 1 ט). לחלופין, ניתן ליישם coverslip לשימוש עם מטרות שאינן מי טבילה ו / או מיקרוסקופים הפוכים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במצלמה במהירות גבוהה רכובה על המיקרוסקופ (למשל Zeiss AxioCamHSm) כדי להקליט סרט 10 שניות. להקליט שני החרוזים באמצעות ערוץ הניאון (כ 70 מסגרות / שני) ולום KV באמצעות brightfield או לעומת פער התערבות (DIC) ערוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להמחיש את כל התנועות החרוזות לאורך זמן, לייבא את הסרט של חרוזי ניאון לImageJ תוכנה (להורדה בחינם <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">בhttp://rsb.info.nih.gov/ij/)</a>nd ליצור הקרנה מרבית של כל אותות הניאון בסרט. כדי לבצע את ההקרנה המרבית בImageJ, לחץ על &quot;תמונה → סטאקס → Z פרויקט.&quot; בחלון &quot;Z הפרויקט&quot;, יקרין כל הפרוסות עם סוג ההקרנה של &quot;מקס עצמה&quot;. תמונה זו יכולה להיות על גבי תמונת דסק KV שבחרוזים היו הדמיה (איורי 3A-B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התנועות של חרוזים בודדים ניתנות למעקב באמצעות ImageJ. תוסף (&quot;מעקב ידני&quot;) ניתן להוריד <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/track/track.html" target="_blank">בhttp://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/track/track.html.</a> פתח את סרט חרוזי הניאון בImageJ ולהפעיל את פונקציית המעקב הידנית. בחלון של מעקב ידני, לבדוק פרמטרים &quot;מופע&quot; ופרמטרי קלט ל&quot; מרווחי זמן &quot;ו&quot; כיול X / Y &quot;. בחר ידני חרוזים שנותרו במישור המוקד של הסרט ל≥ 50 מסגרות ולאחר מכן לעקוב אחר ≥ 5 חרוזים לעובר. הנתיב ואת המהירות של כל חרוז נוצר על ידי התוכנת דואר (איורים 3 תקליטורים). </li></ol>

<ol>
	<li>Sutherland, M. J., Ware, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disorders+of+left-right+asymmetry:+heterotaxy+and+situsinversus.">Disorders of left-right asymmetry: heterotaxy and situsinversus.</a> Am. J. Med. Genet. C Semin. Med. Genet. 151C (4), 307-317 (2009).</li><li>Essner, J. J., Amack, J. D., Nyholm, M. K., Harris, E. B., Yost, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kupffer's+vesicle+is+a+ciliated+organ+of+asymmetry+in+the+zebrafish+embryo+that+initiates+left-right+development+of+the+brain,+heart+and+gut.">Kupffer's vesicle is a ciliated organ of asymmetry in the zebrafish embryo that initiates left-right development of the brain, heart and gut.</a> Development. 132 (6), 1247-1260 (2005).</li><li>Nonaka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Randomization+of+left-right+asymmetry+due+to+loss+of+nodal+cilia+generating+leftward+flow+of+extraembryonic+fluid+in+mice+lacking+KIF3B+motor+protein.">Randomization of left-right asymmetry due to loss of nodal cilia generating leftward flow of extraembryonic fluid in mice lacking KIF3B motor protein.</a> Cell. 95 (6), 829-837 (1998).</li><li>Essner, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+function+for+embryonic+nodal+cilia.">Conserved function for embryonic nodal cilia.</a> Nature. 418 (6893), 37-38 (2002).</li><li>Kramer-Zucker, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cilia-driven+fluid+flow+in+the+zebrafish+pronephros,+brain+and+Kupffer's+vesicle+is+required+for+normal+organogenesis.">Cilia-driven fluid flow in the zebrafish pronephros, brain and Kupffer's vesicle is required for normal organogenesis.</a> Development. 132 (8), 1907-1921 (2005).</li><li>Schweickert, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cilia-driven+leftward+flow+determines+laterality+in+Xenopus.">Cilia-driven leftward flow determines laterality in Xenopus.</a> Curr. Biol. 17 (1), 60-66 (2007).</li><li>Tabin, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+key+to+left-right+asymmetry.">The key to left-right asymmetry.</a> Cell. 127 (1), 27-32 (2006).</li><li>Cooper, M. S., D'Amico, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cluster+of+noninvolutingendocytic+cells+at+the+margin+of+the+zebrafish+blastoderm+marks+the+site+of+embryonic+shield+formation.">A cluster of noninvolutingendocytic cells at the margin of the zebrafish blastoderm marks the site of embryonic shield formation.</a> Dev. Biol. 180 (1), 184-198 (1996).</li><li>Melby, A. E., Warga, R. M., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+cell+fates+at+the+dorsal+margin+of+the+zebrafish+gastrula.">Specification of cell fates at the dorsal margin of the zebrafish gastrula.</a> Development. 122 (7), 2225-2237 (1996).</li><li>Amack, J. D., Wang, X., Yost, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+T-box+genes+play+independent+and+cooperative+roles+to+regulate+morphogenesis+of+ciliated+Kupffer's+vesicle+in+zebrafish.">Two T-box genes play independent and cooperative roles to regulate morphogenesis of ciliated Kupffer's vesicle in zebrafish.</a> Dev. Biol. 310 (2), 196-210 (2007).</li><li>Oteiza, P., Koppen, M., Concha, M. L., Heisenberg, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+shaping+of+the+laterality+organ+in+zebrafish.">Origin and shaping of the laterality organ in zebrafish.</a> Development. 135 (16), 2807-2813 (2008).</li><li>Amack, J. D., Yost, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+T+box+transcription+factor+no+tail+in+ciliated+cells+controls+zebrafish+left-right+asymmetry.">The T box transcription factor no tail in ciliated cells controls zebrafish left-right asymmetry.</a> Curr. Biol. 14 (8), 685-690 (2004).</li><li>Nasevicius, A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+targeted+gene+'knockdown'+in+zebrafish.">Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish.</a> Nat. Genet. 26 (2), 216-220 (2000).</li><li>Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primer+for+morpholino+use+in+zebrafish.">A primer for morpholino use in zebrafish.</a> Zebrafish. 6 (1), 69-77 (2009).</li><li>Kimmel, C. B., Law, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lineage+of+zebrafish+blastomeres.+I.+Cleavage+pattern+and+cytoplasmic+bridges+between+cells.">Cell lineage of zebrafish blastomeres. I. Cleavage pattern and cytoplasmic bridges between cells.</a> Dev. Biol. 108 (1), 78-85 (1985).</li><li>Arrington, C. B., Yost, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extra-embryonic+syndecan+2+regulates+organ+primordia+migration+and+fibrillogenesis+throughout+the+zebrafish+embryo.">Extra-embryonic syndecan 2 regulates organ primordia migration and fibrillogenesis throughout the zebrafish embryo.</a> Development. 136 (18), 3143-3152 (2009).</li><li>Caron, A., Xu, X., Lin, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt/beta-catenin+signaling+directly+regulates+Foxj1+expression+and+ciliogenesis+in+zebrafish+Kupffer's+vesicle.">Wnt/beta-catenin signaling directly regulates Foxj1 expression and ciliogenesis in zebrafish Kupffer's vesicle.</a> Development. 139 (3), 514-524 (2012).</li><li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rho+kinase+Rock2b+establishes+anteroposterior+asymmetry+of+the+ciliated+Kupffer's+vesicle+in+zebrafish.">The Rho kinase Rock2b establishes anteroposterior asymmetry of the ciliated Kupffer's vesicle in zebrafish.</a> Development. 138 (1), 45-54 (2011).</li><li>Aamar, E., Dawid, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox17+and+chordin+are+required+for+formation+of+Kupffer's+vesicle+and+left-right+asymmetry+determination+in+zebrafish.">Sox17 and chordin are required for formation of Kupffer's vesicle and left-right asymmetry determination in zebrafish.</a> Dev. Dyn. 239 (11), 2980-2988 (2010).</li><li>Neugebauer, J. M., Amack, J. D., Peterson, A. G., Bisgrove, B. W., Yost, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF+signalling+during+embryo+development+regulates+cilia+length+in+diverse+epithelia.">FGF signalling during embryo development regulates cilia length in diverse epithelia.</a> Nature. 458 (7238), 651-654 (2009).</li><li>Schneider, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+Nkd1+promotes+Dvl+degradation+and+is+required+for+left-right+patterning.">Zebrafish Nkd1 promotes Dvl degradation and is required for left-right patterning.</a> Dev. Biol. 348 (1), 22-33 (2010).</li><li>Matsui, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Canopy1,+a+positive+feedback+regulator+of+FGF+signaling,+controls+progenitor+cell+clustering+during+Kupffer's+vesicle+organogenesis.">Canopy1, a positive feedback regulator of FGF signaling, controls progenitor cell clustering during Kupffer's vesicle organogenesis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (24), 9881-9886 (2011).</li><li>Shu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na,K-ATPase+alpha2+and+Ncx4a+regulate+zebrafish+left-right+patterning.">Na,K-ATPase alpha2 and Ncx4a regulate zebrafish left-right patterning.</a> Development. 134 (10), 1921-1930 (2007).</li><li>Esguerra, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ttrap+is+an+essential+modulator+of+Smad3-dependent+Nodal+signaling+during+zebrafish+gastrulation+and+left-right+axis+determination.">Ttrap is an essential modulator of Smad3-dependent Nodal signaling during zebrafish gastrulation and left-right axis determination.</a> Development. 134 (24), 4381-4393 (2007).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+Zebrafish+Embryos+to+Analyze+Gene+Function.">Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function.</a> J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).</li><li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+mRNA+and+Morpholino+Antisense+Oligonucleotides+in+Zebrafish+Embryos.">Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.</a> J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).</li><li>Molina, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+chemical+screening+reveals+an+inhibitor+of+Dusp6+that+expands+cardiac+cell+lineages.">Zebrafish chemical screening reveals an inhibitor of Dusp6 that expands cardiac cell lineages.</a> Nat. Chem. Biol. 5 (9), 680-687 (2009).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev. Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Schneider, I., Houston, D. W., Rebagliati, M. R., Slusarski, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+fluxes+in+dorsal+forerunner+cells+antagonize+beta-catenin+and+alter+left-right+patterning.">Calcium fluxes in dorsal forerunner cells antagonize beta-catenin and alter left-right patterning.</a> Development. 135 (1), 75-84 (2008).</li><li>Clement, A., Solnica-Krezel, L., Gould, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cdc14B+phosphatase+contributes+to+ciliogenesis+in+zebrafish.">The Cdc14B phosphatase contributes to ciliogenesis in zebrafish.</a> Development. 138 (2), 291-302 (2011).</li><li>Matsui, T., Bessho, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Left-right+asymmetry+in+zebrafish.">Left-right asymmetry in zebrafish.</a> Cell Mol. Life Sci. , (2012).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

שימוש בזריקות שלב ספציפיים כדי למקד MO למשפחה של תאי DFC / KV הוא גישה שימושית ללמוד תא האוטונומיה של תפקוד גן ולהימנע פנוטיפים pleiotropic נגרמים על ידי מציאת גנים העולמית. עם זאת, הזריקות האלה יכולות להיות מאתגרות מבחינה טכנית. הזרקה של MO בין שלבי 256-תא והתא 1000 עלולה לגרום לשל?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב / חומרים </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td></tr><tr><td> תקן בקרת Oligo-Lissamine מתויג </td><td> גן כלים, LLC </td><td></td></tr><tr><td> אישית Rock2b morpholino Oligo </td><td> גן כלים, LLC </td><td></td></tr><tr><td> Fluoresbrite Multifluorescent 0.5 מיקרון microspheres </td><td> Polysciences, Inc </td><td> 24054 </td></tr></tbody></table>

analysis of gene function and visualization of cilia-generated fluid flow in kupffer's vesicle

איברים פנימיים כגון לב, מוח, מעיים ולפתח סימטריות שמאל ימין (LR) כי הם קריטיים עבור הפונקציות הרגילות שלהם 1. ריסים ניעתי מעורבים בהקמת LR אסימטריה בעוברי החולייתנים, כוללים עכבר, צפרדע, ודג זברה 2-6. &quot;הריסים&quot; הללו LR לייצר זרימת נוזל סימטרית שיש צורך לעורר סימטרי קטרי משומר (TGF-β superfamily) איתות מפל במזודרם צלחת הרוחב מהשמאל, שהוא חשב לספק מידע דפוסי LR לפיתוח איברים 7. לכן, כדי להבין את המנגנונים בבסיס דפוסי LR, זה חיוני לזיהוי גנים ששולטים בארגון של תאי ריסי LR, תנועתיות ואורך ריסי LR והיכולת שלהם לייצר תזרים חזק סימטרי. בעובר דג הזברה, ריסי LR נמצאים בשלפוחית ​​של Kupffer (KV) 2,4,5. KV מורכב משכבה אחת של תאי האפיתל monociliatedשמצרפים לום מלא נוזל. מיפוי הגורל הראה כי KV נגזר מקבוצה של 20-30 ~ תאים המכונית תאי גב Forerunner (DFCs) שנודדים בשולי blastoderm הגבו במהלך שלבי epiboly 8,9. במהלך השלבים מוקדמים somite, אשכול DFCs ולהתמיין לתאי אפיתל ריסים כדי ליצור KV בtailbud של העובר 10,11. היכולת לזהות ולעקוב אחר DFCs-בשילוב עם שקיפות אופטית והתפתחות מהירה של עובר דג זברת דג הזברה KV-להפוך את מערכת מודל מצוינת ללמוד תאי ריסי LR. מעניין, אבות של המשפחה של תאי DFC / KV לשמור גשרי cytoplasmic בין תא החלמון עד 4 לאחר הפרית שעה (hpf), ואילו גשרי cytoplasmic בין תא החלמון והתאים עובריים אחרים הקרוב לאחר 2 hpf 8. ניצול של גשרי cytoplasmic אלה, פתחו אסטרטגית הזרקת שלב ספציפית, כדי לספק morpholino oligonucleotides (MO) באופן בלעדי לDFCs ומציאת הפונקציה של גן מטרה בתאים 12 אלה. טכניקה זו יוצרת עוברי chimeric שבתפקוד הגן הוא הפיל אותי בשושלת DFC / KV פיתוח בהקשר של עובר פראי מסוג. כדי לנתח את זרימת נוזל סימטרית בKV, אנחנו מזריקים microbeads ניאון לKV הלום ותנועת חרוז שיא באמצעות videomicroscopy 2. זרימת נוזל בקלות ודמיין ניתן לכמת על ידי מעקב עקירת חרוז לאורך זמן. הנה, באמצעות טכניקת במה הספציפית DFC ממוקד מציאת הגן וההזרקה של microbeads ניאון לKV לדמיין זרימה, אנו מציגים פרוטוקול המספק גישה יעילה כדי לאפיין את תפקידו של גן מסוים בזמן ההתפתחות ותפקוד KV.

זריקות MO שלב ספציפיים לספק גישה שימושית לניתוח תפקוד גן בתאים מסוימים של העובר. איור 1 מציג תרשים זרימה של אסטרטגיות ההזרקה משמשות לבדיקת תפקוד גן בתאי DFC / KV ואיך להציג את חרוזי ניאון כדי להמחיש את זרימת נוזל בKV. חלוקת MO ניאון בעוברים מוצלחים שלב ספציפיים הזר?...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Gene Function and Visualization of Cilia-Generated Fluid Flow in Kupffer's Vesicle at JoVE.com

Analysis of Gene Function and Visualization of Cilia-Generated Fluid Flow in Kupffer&#039;s Vesicle

זרימת cilia שנוצר נוזל בשלפוחיות של Kupffer (KV) שולטת דפוסים של שמאל וימין של עובר דג הזברה. כאן, אנו מתארים טכניקה לווסת תפקוד גן ספציפי בתאי KV. בנוסף, אנו מראים כיצד לספק חרוזי ניאון לKV לדמיין זרימת נוזל.

ניתוח של תפקוד גן ויזואליזציה של זרימת נוזל צילה שנוצרה בשלפוחיות של Kupffer

Internal organs such as the  heart, brain, and gut develop left-right (LR) asymmetries that are critical for  their normal functions1. Motile cilia are ...

analysis-gene-function-visualization-cilia-generated-fluid-flow

Research

JoVE Journal

Biology

Analysis of Gene Function and Visualization of Cilia-Generated Fluid Flow in Kupffer's Vesicle

14.8K Views.  Upstate Medical University. זרימת cilia שנוצר נוזל בשלפוחיות של Kupffer (KV) שולטת דפוסים של שמאל וימין של עובר דג הזברה. כאן, אנו מתארים טכניקה לווסת תפקוד גן ספציפי בתאי KV. בנוסף, אנו מראים כיצד לספק חרוזי ניאון לKV לדמיין זרימת נוזל.

Video: Analysis of Gene Function and Visualization of Cilia-Generated Fluid Flow in Kupffer's Vesicle

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Microinjection של עוברי דג הזברה לנתח פונקציה ג&#39;ין

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells. This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in oxygen (causes include insufficient blood vessel network, defective blood vessel, and anemia) or to an increased consumption of oxygen relative to the supply (caused by a sudden higher cell proliferation rate). Hypoxia can be physiologic or pathologic such as in solid cancers 1-3, rheumatoid arthritis, atherosclerosis etc&#x2026; Each tissues and cells have a different ability to adapt to this new condition. During hypoxia, hypoxia inducible factor alpha (HIF) is stabilized and regulates various genes such as those involved in angiogenesis or transport of oxygen 4. The stabilization of this protein is a hallmark of hypoxia, therefore detecting HIF is routinely used to screen for hypoxia 5-7. 
In this article, we propose two simple methods to induce hypoxia in mammalian cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of these cells.

Here we propose simple methods to induce hypoxia in cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of the cultures.

אינדוקציה ובדיקה של היפוקסיה בתרבות התא

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

Annotation of Plant Gene Function via Combined Genomics, Metabolomics and Informatics

Given the ever expanding number of model plant species for which complete genome sequences are available and the abundance of bio-resources such as knockout mutants, wild accessions and advanced breeding populations, there is a rising burden for gene functional annotation. In this protocol, annotation of plant gene function using combined co-expression gene analysis, metabolomics and informatics is provided (Figure 1). This approach is based on the theory of using target genes of known function to allow the identification of non-annotated genes likely to be involved in a certain metabolic process, with the identification of target compounds via metabolomics. Strategies are put forward for applying this information on populations generated by both forward and reverse genetics approaches in spite of none of these are effortless. By corollary this approach can also be used as an approach to characterise unknown peaks representing new or specific secondary metabolites in the limited tissues, plant species or stress treatment, which is currently the important trial to understanding plant metabolism.

Combination of genomics, co-expression gene analysis and the identification of target compounds via metabolism give gene functional annotation.

ביאור של תפקוד הגן הצמח דרך Genomics, metabolomics משולבים אינפורמטיקה

Given the ever expanding number of model plant species for which complete genome sequences are available and the abundance of bio-resources such as ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

הבידוד של הריבוזום פוליפפטידים המתהווה כרוכים<em&gt; במבחנה</em&gt; כדי לזהות אתרים השהה של תרגום לאורך ה-mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

הדמיה וניתוח של מולקולות ה-mRNA באמצעות הקרינה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה ב<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of transporters. The phosphorylation and nucleotide dependent chloride channel activity of CFTR has been frequently studied in whole cell systems and as single channels in excised membrane patches. Many Cystic Fibrosis-causing mutations have been shown to alter this activity. While a small number of purification protocols have been published, a fast reconstitution method that retains channel activity and a suitable method for studying population channel activity in a purified system have been lacking. Here rapid methods are described for purification and functional reconstitution of the full-length CFTR protein into proteoliposomes of defined lipid composition that retains activity as a regulated halide channel. This reconstitution method together with a novel flux-based assay of channel activity is a suitable system for studying the population channel properties of wild type CFTR and the disease-causing mutants F508del- and G551D-CFTR. Specifically, the method has utility in studying the direct effects of phosphorylation, nucleotides and small molecules such as potentiators and inhibitors on CFTR channel activity. The methods are also amenable to the study of other membrane channels/transporters for anionic substrates.

Described here is a rapid and effective procedure for functional reconstitution of purified wild-type and mutant CFTR protein that preserves activity for this chloride channel, which is defective in Cystic Fibrosis. Iodide efflux from reconstituted proteoliposomes mediated by CFTR allows studies of channel activity and the effects of small molecules.

מדידות הכינון פונקציונלי ופעילות הערוץ של מטוהרים wildtype וחלבון CFTR Mutant

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as well as pathological changes in endothelial phenotype and gene expression. In particular, maladaptive effects of periodic, unidirectional flow induced shear stress can trigger a variety of effects on several vascular cell types, particularly endothelial cells. While by now endothelial cells from diverse anatomic origins have been cultured, in-depth analyses of their responses to fluid shear have been hampered by the relative complexity of shear models (e.g., parallel plate flow chamber, cone and plate flow model). While these all represent excellent approaches, such models are technically complicated and suffer from drawbacks including relatively lengthy and complex setup time, low surface areas, requirements for pumps and pressurization often requiring sealants and gaskets, creating challenges to both maintenance of sterility and an inability to run multiple experiments. However, if higher throughput models of flow and shear were available, greater progress on vascular endothelial shear responses, particularly periodic shear research at the molecular level, might be more rapidly advanced. Here, we describe the construction and use of shear rings: a novel, simple-to-assemble, and inexpensive tissue culture model with a relatively large surface area that easily allows for a high number of experimental replicates in unidirectional, periodic shear stress studies on endothelial cells.

The Assembly and Application of &#039;Shear Rings&#039;: A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

Different levels and patterns of fluid shear are known to modulate endothelial gene expression, phenotype and susceptibility to disease. We discuss the assembly and use of 'shear rings': a model that produces unidirectional, periodic shear stress patterns. Shear rings are simple to assemble, economical and can produce high cell yields.

האסיפה והיישום של &#39;טבעות Shear&#39;: מודל האנדותל חדשני Orbital, חד-כיוונית תקופתית נוזלי זרימת מתח שאר

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the immune system. Perturbation of the healthy gut microbiome has been suggested to play a role in the development of inflammatory diseases, including multiple sclerosis (MS). Environmental and genetic factors can influence the composition of the microbiome; therefore, identification of microbial communities linked with a disease phenotype has become the first step towards defining the microbiome&#8217;s role in health and disease. Use of 16S rRNA metagenomic sequencing for profiling bacterial community has helped in advancing microbiome research. Despite its wide use, there is no uniform protocol for 16S rRNA-based taxonomic profiling analysis. Another limitation is the low resolution of taxonomic assignment due to technical difficulties such as smaller sequencing reads, as well as use of only forward (R1) reads in the final analysis due to low quality of reverse (R2) reads. There is need for a simplified method with high resolution to characterize bacterial diversity in a given biospecimen. Advancements in sequencing technology with the ability to sequence longer reads at high resolution have helped to overcome some of these challenges. Present sequencing technology combined with a publicly available metagenomic analysis pipeline such as R-based Divisive Amplicon Denoising Algorithm-2 (DADA2) has helped advance microbial profiling at high resolution, as DADA2 can assign sequence at the genus and species levels. Described here is a guide for performing bacterial profiling using two-step amplification of the V3-V4 region of the 16S rRNA gene, followed by analysis using freely available analysis tools (i.e., DADA2, Phyloseq, and METAGENassist). It is believed that this simple and complete workflow will serve as an excellent tool for researchers interested in performing microbiome profiling studies.

Described here is a simplified standard operating procedure for microbiome profiling using 16S rRNA metagenomic sequencing and analysis using freely available tools. This protocol will help researchers who are new to the microbiome field as well as those requiring updates on methods to achieve bacterial profiling at a higher resolution.

אנליזה microbiota באמצעות שני שלבים PCR ו-הדור הבא של 16 rRNA גן רצף

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

In situ Hybridization for Sipunculus nudus Coelomic Fluid

In situ hybridization (ISH) is a very informative technique to present cellular distribution patterns of specific genes (e.g., mRNA and ncRNA) in tissues. The sipunculid worm Sipunculus nudus is a crucial fishery resource as it has high nutritional and medicinal values. Currently, the research on the molecular biology of Sipunculus nudus is still in its infancy. The purpose of this article is to develop a sensitive method for localizing specific mRNA in Sipunculus nudus coelomic fluid. The protocol includes detailed steps of ISH, including digoxigenin-labeled antisense and sense riboprobe preparation, coelomic fluid collection and section preparation, specific riboprobe hybridization, antibody incubation, coloration and post-coloration treatments. The representative results obtained from a successful experiment using this method are demonstrated. The protocol should be applicable to other Sipuncula species as well.

In situ Hybridization for Sipunculus nudus Coelomic Fluid

This protocol describes an effective in situ hybridization approach to detect the mRNA expression levels and spatial patterns of target genes in Sipunculus nudus coelomic fluid.

באתרו היברידיזציה עבור סיפונקולוס נודוס מנוזל קואוממית

In situ hybridization (ISH) is a very informative technique to present cellular distribution patterns of specific genes (e.g., mRNA and ncRNA) in tissues. ...

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the most important post-translational modifications in eukaryotic organisms. Ubiquitylation is mediated by a sequential cascade of three enzyme classes including ubiquitin-activating enzymes (E1 enzymes), ubiquitin-conjugating enzymes (E2 enzymes), and ubiquitin ligases (E3 enzymes), and sometimes, ubiquitin-chain elongation factors (E4 enzymes). Here, in vitro protocols for ubiquitylation assays are provided, which allow the assessment of E3 ubiquitin ligase activity, the cooperation between E2-E3 pairs, and substrate selection. Cooperating E2-E3 pairs can be screened by monitoring the generation of free poly-ubiquitin chains and/or auto-ubiquitylation of the E3 ligase. Substrate ubiquitylation is defined by selective binding of the E3 ligase and can be detected by western blotting of the in vitro reaction. Furthermore, an E2~Ub discharge assay is described, which is a useful tool for the direct assessment of functional E2-E3 cooperation. Here, the E3-dependent transfer of ubiquitin is followed from the corresponding E2 enzyme onto free lysine amino acids (mimicking substrate ubiquitylation) or internal lysines of the E3 ligase itself (auto-ubiquitylation). In conclusion, three different in vitro protocols are provided that are fast and easy to perform to address E3 ligase catalytic functionality.

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The present study provides detailed in vitro ubiquitylation assay protocols for the analysis of E3 ubiquitin ligase catalytic activity. Recombinant proteins were expressed using prokaryotic systems such as Escherichia coli culture.

במבחנה ניתוח של E3 אוביקוויטין פונקציית ליגאז

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...