우리는 우수한 연구소 지원과 zebrafish 관리에 대한 피오나 폴리 감사드립니다. 이 작품은 GW에 AHA predoctoral 휄로 십 (11PRE5730027)와 HJY (R01HL66292)과 JDA (R01HL095690)에 NHLBI 보조금을 지원했다.

스테이지 별 Zebrafish의 배아 주사의 개요 대상 mRNA에 바인딩하고 증명서의 단백질 표현을 방해 안티센스 morpholino의 oligonucleotides (MO)는, 널리 연구 zebrafish 13,14에서 (손실) 함수 유전자 최저에 사용됩니다. 유전자 도구, LLC는 형광 현미경을 사용하여 주입 배아에 MO를 감지 할 수 carboxyfluorescein (녹색 형광을 방출) 또는 lissamine (적색 형광을 방출) 또는 태그가 수법의 살인을 제공합니다. zebrafish 개발의 여러 단계에서 난황 세포에 MO를 주입함으로써, 배아의 특정 구획 (그림 1A-F)에 MO를 제공 할 수 있습니다. MO는 1-4 세포 단계 (0-1 hpf) 32 셀 단계 15 세계 최저를 촉진하기까지 계속 노른자와 연결을 통해 모든 배아 세포를 (그림 1A, D, D &#39;) 입력 사이의 난황에 주입. MO는 midblast 동안 노른자에 주입울라 단계 (2.5-3 hpf)는 특별히 DFC / KV 세포 계보 (Lineage) 12의 다른 대부분의 배아 세포 lineages를 입력하지 않고 세포질 다리 8 최저 유전자 기능을 통해 가능성이 DFCs (인물 1B, E, E &#39;)의 progenitors을 입력 할 수 있습니다 . 유전자 기능이 DFC / KV 나 또한 난황 12,16 할 필요가 있는지 여부를 테스트하는 중요한 관리로서 한 후 돔 - 30 % epiboly 단계 (~ 4.5 hpf) 사이에 주입하여 난황 세포에 MO를 제한하는 것도 가능합니다 모든 세포질 다리 (그림 1C, F, F &#39;) 마감했습니다. 이 주사는 DFC / KV 세포 17-24에서 유전자 기능을 분석하기 위해 함께 사용되었습니다. KV의 유체 유동을 평가하기 위해, 형광등 microbeads은 6-10 체절 단계 (12-14 hpf) 후 즉시 videomicroscopy을 (도 1G-J)를 사용하여 이미징. 사이의 KV 내강에 주입 아르 Microbeads 빨간색 또는 녹색 형광 (또는 둘 다)를 방출이 가능합니다, 그래서 다른을 사용할 수 있습니다이미지 형광 microbeads와 MO에 채널. 1. Morpholinos의 스테이지 별 사출 (MO) zebrafish의 배아에 MO의 주입은 이전에 25,26 입증되었습니다. 여기 우리가 곧 무대 특정 MO 주사에 대해 설명합니다. 모든 주사 후, 배아는 배양 접시에 전송하고 28.5에서 incubated ° C. <ol><li> 글로벌 MO 주입 : 즉시 수정을 한 후 배아를 수집하고 주입 판으로로드합니다. 모세관 바늘에 형광 MO를로드하고 (예를 들면 하버드 장치 PLI-90 피코 주사기) microinjector에 바늘을 탑재합니다. 바늘 팁을 깨고 25,26 설명 제 1 NL의 볼륨이 분사 드롭을 만드는 사출 설정 (압력 및 / 또는 시간) 조정합니다. 해부 stereomicroscope를 사용하여 (그림 1A) 난황에 MO의 1 NL를 삽입 실험 당 ≥ 50 배아의. 4 셀 사슴으로 주사를 완료하는 데 신속하게 작업5. </li><li> DFC 타겟팅 MO 분사 : 28.5에서 바로 수정을 한 후 배아를 수집하여 배양 ° C. 배아는 256 세포 단계 (~ 2.5 hpf)에 도달했을 때, 빠르게 분사 판으로를로드 한 다음 (그림 256 전지 및 1,000 세포 단계 사이 ≥ 100 배아의 난황에 형광 MO의 1 NL를 삽입 1B). </li><li> 난황 타겟팅 MO 분사 : 28.5에서 바로 수정을하고 배양 한 후 배아를 수집 ° C. 돔 단계 (~ 4 hpf)에서 분사 판으로 배아를로드 한 후 돔과 30 % epiboly 단계 (그림 1C) 사이 ≥ 100 배아의 난황에 형광 MO의 1 NL를 삽입. </li></ol> 2. 분석을위한 양념을 넣은 태아를 선택 <ol><li> MO는 배아는 (8 hpf) 75%-epiboly 단계에 도달 주입하면 형광 MO의 배포 용 형광 해부 현미경 unfertilized와 죽은 태아를 제거하고 화면 생활 배아. 그런 다음여w는 배아는 28.5에서 개발 선택한 ° C. <ol><li> 글로벌 MO 주사를 들어, 골고루 모든 배아 세포 (; 그림 2A 그림 1D)를 통해에 형광 배포 한 배아를 선택합니다. </li><li> DFC 타겟팅 MO 주사를 들어, 형광 MO는 난황에 걸쳐 확산하고 등쪽의 배반 엽 마진 (DFCs) (, 그림 2B 그림 1E)에 집중 표시되는 배아를 선택합니다. 이 단계에서는 기본 난황에서 밝은 형광에 의한 형광 DFCs을 시각화하기 어려울 수 있습니다. 형광 MO는 DFCs 이외의 배아 세포에 통합하거나 남아있는 분사 사이트 (그림 2D)에서 집계 한있는 배아를 제외 조심해. </li><li> 난황 타겟팅 MO 주사를 들어, MO 형광이 고르게 난황 전체에 분산하고 배아 세포 (; 그림 2C 그림 1 층)에서 관찰되지 않은 배아를 선택합니다. 다시 말하지만, 형광 MO가 남아있는 배아를 제거사출 사이트에서 집계됩니다. </li></ol></li><li> 2-4-체절 ​​단계 (~ 11 hpf) 사이, 화면이 배아 높은 배율을 사용하여 형광 현미경으로 두 번째 시간입니다. 그런 다음 선택한 배아는 28.5에서 개발 할 수 있습니다 ° C. <ol><li> 글로벌 MO 주사를 들어, 선택된 배아는 MO 형광가 균등하게 KV 모든 배아 세포 (; 그림 2E 그림 1D &#39;)에 배포되어 있는지 확인합니다. </li><li> DFC 타겟팅 MO 주사를 들어, 신중하게 MO의 만 KV 세포에서 형광과 난황 (그림 1E &#39;을)이 배아를 선택합니다. 27 MO가 성공적으로 KV 세포 (그림 2F)로 전달되었습니다 된 배아의 식별에 도움이 수 있습니다 : 예 TG와 같은 KV 세포에 명시 GFP는 (d2EGFP Dusp6)는 유전자 변형 배아. KV 셀 다른 배아 세포에서 MO 형광이있는 배아를 폐기하십시오. </li><li> 난황 타겟팅 MO 주사를 들어, 난황 (그림 1 층 &#39;에 독점적으로 MO의 형광이 배아를 선택합니다 : 그림2G). </li></ol></li></ol> 3. KV에서 유체 흐름을 분석 할 마운트 태아 <ol><li> 글로벌 MO의 KV에 비대칭 유체 흐름을 분석하기 위해, MO 또는 난황 타겟팅 MO 주입 배아를 DFC는 타겟팅 신중하게 dechorionate ~ 날카로운 집게와 4-6 체절 단계 (~ 11-12 hpf) 사이 20 배아. </li><li> 42의 건조한 목욕탕에서 액체로 유지되어야하는 5 ML 튜브 ° C.에 1% 낮은 녹는 점 아가로 오스와 나누어지는 50 ML 준비 </li><li> 유리 우울증 슬라이드 (미국 과학 용품, 주식회사) 하나의 배아를 전송하고 가능한 한 물을 많이를 제거합니다. 단지 (너무 많은 아가로 오스는 이후 영상을 방해 할 수 있습니다) 배아를 커버하기에 충분한 따뜻한 1% 낮은 녹는 점 아가로 오스를 추가하여 배아를 고정. 아가로 오스는 굳은으로, 이러한 배아를 위치 시키도록 포셉을 사용하는 KV는 (그림 1H) (등쪽보기)를 향하고 있습니다.에게 슬라이드 당 하나의 배아로 10 배아를 탑재합니다. 다음 단계의 모든 주사는 compl을 보장하기 위해 신속하게 작업10 체절 단계 (14 hpf)에 의해 eted. </li></ol> 4. KV에 형광 Microbeads의 주입 <ol><li> 1.5 ML Eppendorf 튜브에 멸균 물에 1시 50분에 Multifuorescent 0.5 미크론 직경 마이크로을 (Polysciences 주식회사) Fluoresbrite 희석. </li><li> 튜브를 클릭하여 철저하게 microbeads의 1시 50분 희석을 섞어서 모세관 바늘로 3 μl를로드합니다. MO 주사 (예를 들면 하버드 장치 PLI-90 피코 주사기)에 사용 된 것과 같은 microinjector를 사용하여 집게로 바늘 끝을 해제하고 가장 작은 가능한 (&lt;0.5 NL) 주입 드롭을 생성하기 위해 분사 설정을 조정합니다. </li><li> 해부 현미경의 첫 번째 장착 된 배아의 KV의 루멘으로 바늘을 맞 춥니 다. 루멘에 바늘을 넣고 구슬의 작은 볼륨 (&lt;0.5 NL) (그림 1G)를 주입. 작은 바늘 끝과 작은 사출 볼륨이 손상 KV를 방지하는 것이 중요합니다. </li><li> 모든 마운트 된 배아를 삽입. 난자는 injecte되면D, 멸균 물 한 방울은 이미 건조하지 않도록 아가로 오스의 상단에 추가 할 수 있습니다. 주사의 과정 동안, 구슬은 종종 바늘 구멍을 방해합니다. 이 바늘 끝을 다시 깨고 microinjection 장치의 변조 압력 또는 시간 설정에 의해 주입 볼륨을 조정해야합니다. 이 분사 동안 상당한 손상을 일으킬 정도로 무딘 될 경우 바늘을 교체합니다. </li><li> 화면 수직 형광 복합 현미경 (예 : Zeiss AxioImager M1)에 따라 구슬을 성공적으로 배달 주입 배아는 20X 목표를 사용합니다. 첫째, KV 구조가 brightfield 조명을 (그림 1J)를 사용하여 손상 여부를 확인한 다음 구슬을 관찰하는 형광 사용합니다. 구슬이 존재하고 KV의 내강 내에 이사하는 배아를 선택합니다. KV 손상 또는 KV에없이 떠있는 구슬이있는 배아를 폐기하십시오. 이 KV를 놓치지 인근 조직 또는 기본 노른자에 구슬을 제공하는 간단합니다. 마운트 ano, 실패하는 경우10 배아를 군터 및 분사 절차를 반복하십시오. </li></ol> 5. KV의 유체 흐름의 가시화 및 분석 <ol><li> KV 내부 구슬로 선택한 각 배아를 들어, 아가로 오스를 커버 한 다음 63X 물을 찍어 목적 (그림 1I)를 사용하여 수직 형광 화합물 현미경 KV를 관찰하기 위해 멸균 물 한 방울을 추가합니다. 또는 coverslip가 아닌 물을 찍어 목표 및 / 또는 거꾸로 현미경에 사용하기 위해 적용 할 수 있습니다. </li><li> 10 초 동영상을 녹화 할 수 (예 : Zeiss AxioCamHSm) 현미경에 장착 고속 카메라를 사용합니다. brightfield 또는 차등 간섭 대비 (DIC) 채널을 사용하여 형광 채널 (약 70 프레임 / 초)와 KV의 루멘을 사용하여 구슬을 모두 기록합니다. </li><li> 시간이 지남에 따라 모든 구슬 움직임을 시각화하려면, ImageJ 소프트웨어 (에서 무료로 다운로드에 형광 구슬의 동영상을 가져 <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a> )ND는 영화의 모든 형광 신호의 최대 투영을 만듭니다. ImageJ에서 최대 투영을 수행하려면 다음 &quot;이미지 → 스택 → Z 프로젝트를.&quot; &quot;Z 프로젝트&quot;창에서 &quot;최대 강도&quot;의 프로젝션 유형으로 모든 조각 프로젝트. 이 이미지는 구슬이 (그림 3A-B) 이미지로 된의 KV의 DIC 이미지를 겹쳐 할 수 있습니다. </li><li> 개인 구슬의 움직임이 ImageJ를 사용하여 추적 할 수 있습니다. 플러그인 ( &quot;수동 추적&quot;)에서 다운로드 할 수 있습니다 <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/track/track.html" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/track/track.html</a> . ImageJ에서 형광 구슬 동영상을 열고 수동 추적 기능을 실행합니다. 수동 추적 창에서 &quot;시간 간격&quot;과 &quot;X / Y 보정&quot;에 대한 &quot;표시 매개 변수&quot;및 입력 매개 변수를 확인합니다. 수동 ≥ 50 프레임 동영상의 초점 평면에 남아있는 구슬을 선택한 다음 배아 당 ≥ 5 구슬을 추적 할 수 있습니다. 각 구슬의 경로와 속도는 일에 의해 생성되는전자 소프트웨어 (도 3 CD). </li></ol>

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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cdc14B+phosphatase+contributes+to+ciliogenesis+in+zebrafish.">The Cdc14B phosphatase contributes to ciliogenesis in zebrafish.</a> Development. 138 (2), 291-302 (2011).</li><li>Matsui, T., Bessho, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Left-right+asymmetry+in+zebrafish.">Left-right asymmetry in zebrafish.</a> Cell Mol. Life Sci. , (2012).</li></ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

DFC / KV 세포 계보 (Lineage)에 MO를 타겟팅 할 단계 별 주사를 사용하여 유전자 기능의 휴대 자율성을 연구하고 글로벌 유전자 최저로 인한 pleiotropic phenotypes을 방지 할 수있는 유용한 방법이다. 그러나, 이러한 주사는 기술적 도전이 될 수 있습니다. 256 전지 및 1,000 세포 단계 사이 MO의 주입이 세 가지 결과가 발생할 수 있습니다 : 1) MO는 난황에 걸쳐 MO의 diffuses)는 주사 사이트 2 집계 유지하고 DFC / KV ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 / 재료의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> 표준 제어 태그 oligo-Lissamine </td><td> 유전자 도구, LLC </td><td></td></tr><tr><td> 사용자 Rock2b morpholino oligo </td><td> 유전자 도구, LLC </td><td></td></tr><tr><td> Fluoresbrite Multifluorescent 0.5 미크론 마이크로 </td><td> Polysciences 주식회사 </td><td> 24,054 </td></tr></tbody></table>

analysis of gene function and visualization of cilia-generated fluid flow in kupffer's vesicle

같은 심장, 뇌, 그리고 내장 등의 내부 기관은 정상적인 기능 1 중요한 왼쪽, 오른쪽 (LR) asymmetries을 개발할 수 있습니다. 운동성 섬모가 부족해은 마우스, 개구리, 그리고 zebrafish 2-6 포함한 척추 동물의 배아에 LR을 비대칭 수립에 참여하고 있습니다. 이러한 &#39;LR의 속눈썹은&#39;장기에게 7 개발을위한 LR의 패턴 정보를 제공하는 것으로 생각되어 왼쪽 측면 판 중배엽에서 층계를 신호 보존 비대칭 결절을 (TGF-β superfamily), 실행하는 데 필요한 비대칭 유체 흐름을 생성합니다. 따라서, LR의 패턴의 근간이 메커니즘을 이해하기 위해, 그것은 LR 솜털이있는 세포의 조직, LR의 속눈썹하고 강력한 비대칭 흐름을 생성하는 능력의 운동성 및 길이를 조절 유전자를 식별하는 것이 중요합니다. zebrafish 배아에서 LR의 속눈썹은 2,4,5 Kupffer의 소포 (KV)에 위치하고 있습니다. KV는 monociliated 상피 세포의 단일 층으로 구성되어 있습니다유체 - 채워진 내강을 둘러싸 그. 운명 매핑은 KV이 epiboly 단계 8,9 동안 등쪽 배반 엽 여백에 이전 등쪽 전신 세포 (DFCs)로 알려진 ~ 20-30 셀의 그룹에서 파생되는 것으로 나타났습니다. 초기 체절 단계 동안, DFCs 클러스터와 솜털이있는 상피 세포로 분화가 배아 10,11의 tailbud에 KV를 형성합니다. 식별하고 추적 할 수있는 능력을 DFCs을의 조합 광학 투명성과 zebrafish KV LR 솜털이있는 세포를 연구 할 수있는 훌륭한 모델 시스템 배아하게되면 zebrafish의 신속한 개발. 흥미롭게도, DFC / KV 세포 계보 (Lineage)의 progenitors은 4 시간 후 수정을 (hpf)에 난황 세포 사이에 세포질 다리를 유지, 2 hpf 8 후 가까운 난황 세포와 다른 배아 세포 사이에 세포질 다리 반면. 이 세포질 다리 활용, 우리는 morpholino oligonucle를 제공​​ 할 수있는 단계 별 분사 전략을 개발DFCs 및 최저 이러한 세포 12 대상 유전자의 기능에 대한 독점적 otides (MO). 이 기술은 유전자 기능이 야생 형 배아의 맥락에서 개발 DFC / KV 혈통에 쓰러되는 키메라 배아를 생성합니다. KV에서 비대칭 유체 흐름을 분석하기 위해, 우리는 KV 루멘과 videomicroscopy 2를 사용 기록 비즈 운동으로 형광 microbeads를 삽입. 유체 흐름은 쉽게 시각화하고 시간이 지남에 따라 구슬 변위를 추적하여 정량화 할 수 있습니다. 여기 단계 별 DFC 타겟 유전자 최저 기법과 흐름을 시각화 할 수 KV에 형광 microbeads의 주입을 사용하여, 우리는 KV 개발 및 기능 중에 특정 유전자의 역할을 특성화 할 수있는 효과적인 방법을 제공하는 프로토콜을 제시한다.

스테이지 별 MO 주사는 배아의 특정 구획에서 유전자 기능을 분석 할 수있는 유용한 방법을 제공합니다. 그림 1은 유체 흐름을 시각화하는 형광 구슬을 소개하는 DFC / KV 세포와 방법에 유전자 기능을 테스트하는 데 사용되는 분사 전략의 흐름 차트를 제공 KV 인치 성공적인 단계 별 주입 배아의 형광 MO의 배포는 그림 1D-F과 그림 2에서 라이브 배아에서 개략적으로 표?...

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Analysis of Gene Function and Visualization of Cilia-Generated Fluid Flow in Kupffer&#039;s Vesicle

Kupffer의 소포에 솜털 생성 된 유체 흐름 (KV)는 zebrafish 배아의 왼쪽, 오른쪽 패턴을 제어합니다. 여기, 우리는 KV 세포에 특별히 유전자 기능을 조절하는 기술을 설명합니다. 또한, 우리는 유체 흐름을 시각화하는 KV에 형광 구슬을 전달하는 방법을 보여줍니다.

Kupffer의 소포의 유전자 기능 및 속눈썹 생성 된 유체 흐름의 시각화 분석

Internal organs such as the  heart, brain, and gut develop left-right (LR) asymmetries that are critical for  their normal functions1. Motile cilia are ...

analysis-gene-function-visualization-cilia-generated-fluid-flow

Research

JoVE Journal

Biology

Analysis of Gene Function and Visualization of Cilia-Generated Fluid Flow in Kupffer's Vesicle

14.7K 조회수.  Upstate Medical University. Kupffer의 소포에 솜털 생성 된 유체 흐름 (KV)는 zebrafish 배아의 왼쪽, 오른쪽 패턴을 제어합니다. 여기, 우리는 KV 세포에 특별히 유전자 기능을 조절하는 기술을 설명합니다. 또한, 우리는 유체 흐름을 시각화하는 KV에 형광 구슬을 전달하는 방법을 보여줍니다.

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Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

유전자 기능을 분석 Zebrafish 배아들 중 Microinjection

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

연구

생물학

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells. This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in oxygen (causes include insufficient blood vessel network, defective blood vessel, and anemia) or to an increased consumption of oxygen relative to the supply (caused by a sudden higher cell proliferation rate). Hypoxia can be physiologic or pathologic such as in solid cancers 1-3, rheumatoid arthritis, atherosclerosis etc&#x2026; Each tissues and cells have a different ability to adapt to this new condition. During hypoxia, hypoxia inducible factor alpha (HIF) is stabilized and regulates various genes such as those involved in angiogenesis or transport of oxygen 4. The stabilization of this protein is a hallmark of hypoxia, therefore detecting HIF is routinely used to screen for hypoxia 5-7. 
In this article, we propose two simple methods to induce hypoxia in mammalian cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of these cells.

Here we propose simple methods to induce hypoxia in cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of the cultures.

세포 배양의 유도와 Hypoxia의 시험

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

Annotation of Plant Gene Function via Combined Genomics, Metabolomics and Informatics

Given the ever expanding number of model plant species for which complete genome sequences are available and the abundance of bio-resources such as knockout mutants, wild accessions and advanced breeding populations, there is a rising burden for gene functional annotation. In this protocol, annotation of plant gene function using combined co-expression gene analysis, metabolomics and informatics is provided (Figure 1). This approach is based on the theory of using target genes of known function to allow the identification of non-annotated genes likely to be involved in a certain metabolic process, with the identification of target compounds via metabolomics. Strategies are put forward for applying this information on populations generated by both forward and reverse genetics approaches in spite of none of these are effortless. By corollary this approach can also be used as an approach to characterise unknown peaks representing new or specific secondary metabolites in the limited tissues, plant species or stress treatment, which is currently the important trial to understanding plant metabolism.

Combination of genomics, co-expression gene analysis and the identification of target compounds via metabolism give gene functional annotation.

결합 지노 믹스, Metabolomics와 정보학 통해 식물 유전자 기능의 주석

Given the ever expanding number of model plant species for which complete genome sequences are available and the abundance of bio-resources such as ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

Ribosome 바운드 초기 Polypeptides의 분리<em&gt; 체외에서</em&gt; mRNA 함께 Translational 일시 중지 사이트를 식별하려면

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

형광을 사용하여 mRNA의 분자의 시각화 및 분석<em&gt; 제자리에서</em에서&gt; 하이브리드<em&gt; 사카 cerevisiae의</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of transporters. The phosphorylation and nucleotide dependent chloride channel activity of CFTR has been frequently studied in whole cell systems and as single channels in excised membrane patches. Many Cystic Fibrosis-causing mutations have been shown to alter this activity. While a small number of purification protocols have been published, a fast reconstitution method that retains channel activity and a suitable method for studying population channel activity in a purified system have been lacking. Here rapid methods are described for purification and functional reconstitution of the full-length CFTR protein into proteoliposomes of defined lipid composition that retains activity as a regulated halide channel. This reconstitution method together with a novel flux-based assay of channel activity is a suitable system for studying the population channel properties of wild type CFTR and the disease-causing mutants F508del- and G551D-CFTR. Specifically, the method has utility in studying the direct effects of phosphorylation, nucleotides and small molecules such as potentiators and inhibitors on CFTR channel activity. The methods are also amenable to the study of other membrane channels/transporters for anionic substrates.

Described here is a rapid and effective procedure for functional reconstitution of purified wild-type and mutant CFTR protein that preserves activity for this chloride channel, which is defective in Cystic Fibrosis. Iodide efflux from reconstituted proteoliposomes mediated by CFTR allows studies of channel activity and the effects of small molecules.

정제 된 야생형과 돌연변이 체 CFTR 단백질의 기능의 재구성 및 채널 활동 측정

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as well as pathological changes in endothelial phenotype and gene expression. In particular, maladaptive effects of periodic, unidirectional flow induced shear stress can trigger a variety of effects on several vascular cell types, particularly endothelial cells. While by now endothelial cells from diverse anatomic origins have been cultured, in-depth analyses of their responses to fluid shear have been hampered by the relative complexity of shear models (e.g., parallel plate flow chamber, cone and plate flow model). While these all represent excellent approaches, such models are technically complicated and suffer from drawbacks including relatively lengthy and complex setup time, low surface areas, requirements for pumps and pressurization often requiring sealants and gaskets, creating challenges to both maintenance of sterility and an inability to run multiple experiments. However, if higher throughput models of flow and shear were available, greater progress on vascular endothelial shear responses, particularly periodic shear research at the molecular level, might be more rapidly advanced. Here, we describe the construction and use of shear rings: a novel, simple-to-assemble, and inexpensive tissue culture model with a relatively large surface area that easily allows for a high number of experimental replicates in unidirectional, periodic shear stress studies on endothelial cells.

The Assembly and Application of &#039;Shear Rings&#039;: A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

Different levels and patterns of fluid shear are known to modulate endothelial gene expression, phenotype and susceptibility to disease. We discuss the assembly and use of 'shear rings': a model that produces unidirectional, periodic shear stress patterns. Shear rings are simple to assemble, economical and can produce high cell yields.

총회와 &#39;전단 반지&#39;의 응용 프로그램 : 궤도, 단방향 및 정기 유체 흐름 및 전단 응력에 대한 소설 내피 모델

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the immune system. Perturbation of the healthy gut microbiome has been suggested to play a role in the development of inflammatory diseases, including multiple sclerosis (MS). Environmental and genetic factors can influence the composition of the microbiome; therefore, identification of microbial communities linked with a disease phenotype has become the first step towards defining the microbiome&#8217;s role in health and disease. Use of 16S rRNA metagenomic sequencing for profiling bacterial community has helped in advancing microbiome research. Despite its wide use, there is no uniform protocol for 16S rRNA-based taxonomic profiling analysis. Another limitation is the low resolution of taxonomic assignment due to technical difficulties such as smaller sequencing reads, as well as use of only forward (R1) reads in the final analysis due to low quality of reverse (R2) reads. There is need for a simplified method with high resolution to characterize bacterial diversity in a given biospecimen. Advancements in sequencing technology with the ability to sequence longer reads at high resolution have helped to overcome some of these challenges. Present sequencing technology combined with a publicly available metagenomic analysis pipeline such as R-based Divisive Amplicon Denoising Algorithm-2 (DADA2) has helped advance microbial profiling at high resolution, as DADA2 can assign sequence at the genus and species levels. Described here is a guide for performing bacterial profiling using two-step amplification of the V3-V4 region of the 16S rRNA gene, followed by analysis using freely available analysis tools (i.e., DADA2, Phyloseq, and METAGENassist). It is believed that this simple and complete workflow will serve as an excellent tool for researchers interested in performing microbiome profiling studies.

Described here is a simplified standard operating procedure for microbiome profiling using 16S rRNA metagenomic sequencing and analysis using freely available tools. This protocol will help researchers who are new to the microbiome field as well as those requiring updates on methods to achieve bacterial profiling at a higher resolution.

2단계 PCR 및 차세대 16S rRNA 유전자 시퀀싱을 사용한 미생물 분석

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

In situ Hybridization for Sipunculus nudus Coelomic Fluid

In situ hybridization (ISH) is a very informative technique to present cellular distribution patterns of specific genes (e.g., mRNA and ncRNA) in tissues. The sipunculid worm Sipunculus nudus is a crucial fishery resource as it has high nutritional and medicinal values. Currently, the research on the molecular biology of Sipunculus nudus is still in its infancy. The purpose of this article is to develop a sensitive method for localizing specific mRNA in Sipunculus nudus coelomic fluid. The protocol includes detailed steps of ISH, including digoxigenin-labeled antisense and sense riboprobe preparation, coelomic fluid collection and section preparation, specific riboprobe hybridization, antibody incubation, coloration and post-coloration treatments. The representative results obtained from a successful experiment using this method are demonstrated. The protocol should be applicable to other Sipuncula species as well.

In situ Hybridization for Sipunculus nudus Coelomic Fluid

This protocol describes an effective in situ hybridization approach to detect the mRNA expression levels and spatial patterns of target genes in Sipunculus nudus coelomic fluid.

시분큘러스 누두스 Coelomic 유체에 대한 시투 혼성화

In situ hybridization (ISH) is a very informative technique to present cellular distribution patterns of specific genes (e.g., mRNA and ncRNA) in tissues. ...

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the most important post-translational modifications in eukaryotic organisms. Ubiquitylation is mediated by a sequential cascade of three enzyme classes including ubiquitin-activating enzymes (E1 enzymes), ubiquitin-conjugating enzymes (E2 enzymes), and ubiquitin ligases (E3 enzymes), and sometimes, ubiquitin-chain elongation factors (E4 enzymes). Here, in vitro protocols for ubiquitylation assays are provided, which allow the assessment of E3 ubiquitin ligase activity, the cooperation between E2-E3 pairs, and substrate selection. Cooperating E2-E3 pairs can be screened by monitoring the generation of free poly-ubiquitin chains and/or auto-ubiquitylation of the E3 ligase. Substrate ubiquitylation is defined by selective binding of the E3 ligase and can be detected by western blotting of the in vitro reaction. Furthermore, an E2~Ub discharge assay is described, which is a useful tool for the direct assessment of functional E2-E3 cooperation. Here, the E3-dependent transfer of ubiquitin is followed from the corresponding E2 enzyme onto free lysine amino acids (mimicking substrate ubiquitylation) or internal lysines of the E3 ligase itself (auto-ubiquitylation). In conclusion, three different in vitro protocols are provided that are fast and easy to perform to address E3 ligase catalytic functionality.

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The present study provides detailed in vitro ubiquitylation assay protocols for the analysis of E3 ubiquitin ligase catalytic activity. Recombinant proteins were expressed using prokaryotic systems such as Escherichia coli culture.

시험관 내 E3 유비퀴틴 리가제 기능 분석

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...