Name: procedure for decellularization of rat livers in an oscillating-pressure perfusion device
Uploaded: 2015-08-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Procedure for Decellularization of Rat Livers in an Oscillating-pressure Perfusion Device at JoVE.com

The authors would like to gratefully thank Steffen Lippert, Khalid Aliyev, Korinna J&#246;hrens and Katharina Struecker for their help during this project.

بقيت الحيوانات في مرفق للطب التجريبي (FEM، شاريتيه في برلين، ألمانيا)، وأعيد النظر في جميع البروتوكولات التجريبية والتي وافق عليها مكتب الدولة لشؤون الصحة والمحلية (LAGeSo، برلين، ألمانيا؛ ريج رقم O 0365 / 11). حصاد 1. الكبد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد ما قبل العمليات الجراحية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام لوحة الفلين لتثبيت. وضع الستارة الطبية على لوحة. باستخدام أربعة الإبر، وإصلاح قناع استنشاق على لوحة الفلين لاستنشاق أثناء العملية الخدر. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بترتيب مسبق من بوابة ريدي قنية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توصيل القسطرة الوريدية الطرفية (G 20) إلى محبس ثلاثي. يجب أن تقطع القسطرة الوريدية بشكل غير مباشر، ويبلغ طوله تقريبا. 1.5 سم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دي الهواء النظام باستخدام حقنة 10 مل مليئة حل قارع الأجراس. من المهم جدا أن بعناية إزالة الهواء بسبب الانسداد الغاز قد يؤثر سلبا على decellularization الارواء. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بترتيب مسبقلالشرياني قنية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام قنية فراشة وقطع إبرة يصل طولها إلى 5 ملم. تناسب 5 سم أنبوب (ID 0.58 مم؛ OD 0.96 مم) إلى 5 ملم إبرة واصلاحها مع superglue. ادخال انبوب 2 سم طويلة (ID 0.28 مم؛ OD 0.61 مم) في أنبوب أكبر واصلاحها مع superglue. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنزلق أنبوب آخر عبر هذا البناء باعتبارها الدعامة واصلاحها مع superglue. دي الهواء قنية الشرايين مع حقنة 5 مل مملوءة بمحلول قارع الأجراس. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التخدير وتسكين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حمل الخدر من الفئران في غرفة تحريض التخدير بنسبة 3.5٪ الأيزوفلورين في الأكسجين بمعدل تدفق 1.5 لتر / دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لضمان تسكين آمنة خلال العملية، وضخ metamizol (100 ملغ / كغ كتلة الجسم) وجرعة منخفضة من الكيتامين / medetomidine (10 ملغ / 0.1 ملغ لكل كيلوغرام كتلة الجسم) البريتونى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توريد 1.5٪ الأيزوفلورين في 1 لتر / دقيقة الأكسجين عبر قناع استنشاق للصيانة لاحقة من التخدير الجراحي. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترتيبات ما قبل التنفيذ &lt;رأ&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> حلق البطن تحرري مع آلة القص الكهربائية. بلل موقع شق حلق على البطن مع الايثانول 70٪ لتعقيم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الحيوان في موقف ضعيف على لوحة مستعدة، أدخل رأسه في قناع استنشاق وتحديد أطرافه بشريط طبي والدبابيس. إزالة الايثانول الزائدة والفراء مع ضغط الشاش. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقييم التخدير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقييم عمق التخدير من خلال مشاهدة معدل التنفس. عندما يبدو أن التخدير العميق بما فيه الكفاية (40-60 الأنفاس / دقيقة)، وتحقق ما إذا كان تسكين كافية من خلال محاولة لتحريك منعكس قرصة أخمص قدميه باستخدام ملقط جراحي لقرصة الجلد بين أصابع كل من أطرافه الخلفية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نهج البطن <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل شق متوسط ​​في جدار البطن الذيلية فوق المثانة. قطع من هذه النقطة إلى كل من الأقواس الجانبية الساحلية بطريقة شكل حرف V. الحرص على عدم قطع في الحجاب الحاجز. سحب جدار البطن قطع على صدره. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح الخنجري مع المشبك overholt، تسحبه cranially واصلاحها مع الشريط المطاطي. استخدام قطعة قطن مبللة لإخلاء الأمعاء. التفاف الأمعاء في ضمادة الشاش المبللة. وعلاوة على ذلك، تغطي جميع هامش البطن مع ضمادات مبللة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الكبد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح الرباط المنجلي. استخدام ضمادة الشاش المبللة لعقد فصوص الكبد وسطي وترك cranially تحت قبة الحجاب الحاجز. فضح الرباط الكبدي الإثناعشري والفص العلوي الكبد ثربية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام اثنين من microforceps ومقص الربيع لتشريح بعناية في الرباط التي تعلق على الفص العلوي ثربية حتى الفص هو المحمول. تحريك الفص باستخدام قطعة قطن مبللة تحت ضغط الشاش، وعقد الفصوص وسطي وتترك في مكان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد تعبئة العلوي الفص الكبد ثربية، تحريك المعدة إلى اليسار. إصلاح المعدة مع المشبك وتشريح الثرب طفيفة مع microforceps ومقص الربيع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعبئة أقل ثروبل الفص الكبد حتى يتم المحمول، وبعد ذلك نقل الفص الخلفي في تجويف لها. استخدام المشبك باكهاوس الإبقاء على الاثني عشر. نقل الاثني عشر إلى اليسار لتمتد وفضح الرباط الكبدي الإثناعشري. تطويق القناة الصفراوية المشتركة في الرباط الكبدي الإثناعشري تمدد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح القناة الصفراوية من الدهنية والأنسجة البنكرياس. قطع القناة الصفراوية 1.5 سم من التشعب القناة الصفراوية. تشريح الوريد البابي من الأنسجة الدهنية المحيطة بها. فضح الوريد معدي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Ligate الوريد معدي مرتين مع الحرير 6-0 وتقسيم الوريد بين الحروف المركبة 2. تشريح الجذع الاضطرابات الهضمية والشريان الكبدي شيوعا من الأنسجة المحيطة بها حتى يتم الكشف عن رامي الشرايين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحرير الشريان معدي من الأنسجة المحيطة بها. ربط الشريان معدي مرتين مع الحرير 6-0، مع علاقات بعيدة عن بعضها البعض. تشريح الشريان معدي بين الحروف المركبة 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحرير الشريان الطحالمن الأنسجة المحيطة بها. ربط الشريان الطحال مرتين مع الحرير 6-0، مع علاقات بعيدة عن بعضها البعض. تشريح الشريان الطحال بين الحروف المركبة 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحرير الشريان المعدي الأيسر من الأنسجة المحيطة بها. ربط الشريان المعدي الأيسر مرتين مع الحرير 6-0، مع علاقات بعيدة عن بعضها البعض. تشريح الشريان بين الحروف المركبة 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطويق الوريد الأجوف السفلي بين الكلية اليمنى واليسرى الفص الجانبي الكبد. تشريح الوريد من الفضاء خلف الصفاق. فضح الشريان الأورطي عن طريق اتباع الجذع الاضطرابات الهضمية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح الأنسجة الدهنية خلف الصفاق. حقن الهيبارين 1000 IE في 1 مل المالحة في الوريد الأجوف السفلي. سحب قنية وإغلاق شق مع وسادة من القطن. الانتظار 1-2 دقائق للتأثير النظامية الهيبارين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطويق الشريان الأورطي بالملقط. تشريح الشريان الأورطي ويستنزف الفئران. وعلاوة على ذلك، تشريح الوريد الأجوف السفلي بشكل أقصى من الكلى. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بوابة ريدي كيفية تركيب الكانيولا (استخدام قنية أعدت في القسم 1.2) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل شق الأسماك الفم في الوريد البابي البعيدة. فتح شق مع ملقط ويقني؛ يدخل القنية الوريد البابي. مسح الكبد مع 20 مل قارع الأجراس حل حتى decolorizes الكبد وإصلاح قنية مع الحروف المركبة (الحرير 6-0). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الشرياني كيفية تركيب الكانيولا (استخدام قنية أعدت في القسم 1.3) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح الشريان الأبهر فوق الجذع الاضطرابات الهضمية. تحرير قطاع الشريان الأورطي من الفضاء خلف الصفاق. قطع الجزء الشريان الأورطي طوليا لتوليد التصحيح الأبهر. إدراج قنية يتم بناؤه ذاتيا إلى حامل ثابت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام 2 ملقط لتنزلق التصحيح الأبهر خلال قنية. Ligate الشريان الكبدي مع الحرير 6-0 على قنية وإصلاح التصحيح في دعمة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Explantation الكبد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح الحجاب الحاجز، وجعل شق دائري وتشريح الكبد من الهياكل المحيطة بها. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ستوإعادة الكبد في العقيمة دبابة 500 مل مليئة 350 مل قارع الأجراس حل حتى الاستخدام. </li></ol></li></ol> 2. حلول منظفات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10٪ محلول تريتون X-100 الأوراق المالية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء زجاجة 1000 مل مع 900 مل ماء مقطر. وإضافة 100 مل تريتون X-100 (99،9٪). استخدام النمام بحل تريتون X-100. ملء زجاجة مع ماء مقطر. حتى بلغ حجم التداول الإجمالي ل1000 مل يتم التوصل إليه. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1٪ تريتون X-100 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 مل من محلول المخزون (10٪) لزجاجة 1000 مل. إضافة 900 مل ماء مقطر. ويهز زجاجة مرتين. تصفية 1٪ تريتون X-100 حل من خلال تصفية العقيمة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10٪ SDS محلول المخزون <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء زجاجة 1000 مل مع 900 مل ماء مقطر. وإضافة 66.99 ز SDS (99.9٪، والكثافة 0،67). استخدام النمام إلى حل SDS. ملء زجاجة مع ماء مقطر. حتى بلغ حجم التداول الإجمالي ل1000 مل يتم التوصل إليه. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1٪ SDS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 مل من محلول المخزون (10٪) لبوت 1000 ملTLE. إضافة 900 مل ماء مقطر. ويهز زجاجة مرتين. تصفية 1٪ SDS الحل من خلال تصفية العقيمة. </li></ol></li></ol> 3. Decellularization <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انشاء التروية الأجهزة <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/53029/53029fig1.jpg" /></li></ol> الشكل 1: مخطط الجهاز الإرواء عن الانتقائية الشرياني والوريدي بوابة الإرواء من أربعة الأكباد الجرذ تحت ظروف الضغط تتأرجح (. معدلة من Struecker وآخرون 14) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ربط هجرة إلى محبس ثلاثي وتمديد هايدلبيرغر لتنظيم مستوى التعبئة والتعبئة المفاعل مع 500 مل 0،9٪ كلوريد الصوديوم. <img alt="الرقم 2" src="/files/ftp_upload/53029/53029fig2.jpg" /></li></ol> الشكل 2: مخطط نضح انشاء ربط غرفة التروية (1400 سم 3) (1) إلى نهاية البعيدة (4) من فخ فقاعة (5) عن طريق وصول الوريدي البابي (2) أو عن طريق تيار الدمسيس (3). يجب أن تكون مجهزة فخ فقاعة (5) مع سد (4) في نهاية القاصي وتنفيس (6). ربط فخ فقاعة (5) على تمديد هايدلبيرغر (7). ربط تمديد هايدلبيرغر إلى الجزء مضخة (8). وعلاوة على ذلك، ربط الجزء مضخة (8) لتمديد هايدلبيرغر آخر (9). إدراج تمديد هايدلبيرغر الماضي (9) في زجاجة محلول منظف (10). توصيل جهاز التنفس الصناعي (11) إلى غرفة نضح (أو إلى الموزع الضغط في حالة perfusions متعددة). لاستنزاف السوائل المفاعل، وربط التدفقات إلى زجاجة النفايات (12). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج شريحة مضخة إلى المضخة. بدء تشغيل المضخة لملء دورة مع PBS، إغلاق نهاية البعيدة للفخ فقاعة وفتح تنفيس. عندما يتم تغطية الجزء السفلي من فقاعة آمن مع PBS (2-3 سم)، وإغلاق تنفيس وفتح النهاية البعيدة من فخ فقاعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تركيب الكبد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ربط ثلاثي محبس للقنية الوريد البابي إلى الوصول مفاعل ذات الصلة. Connect قنية الشرياني إلى الوصول الشرايين. كن حذرا لضمان عدم وجود الهواء يدخل الأنظمة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق الشروط ضغط تتأرجح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام جهاز التنفس الصناعي مع تردد من 15 نبضة في الدقيقة وسعة 26 ملي بار (دقيقة. 4 م بار، كحد أقصى. 30 مليبار). توصيل جهاز التنفس الصناعي لغرفة توزيع الضغط وربط غرفة للمفاعل. بدء تطبيق الضغط. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بروتوكول Decellularization <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنفيذ الخطوات نضح بمعدل تدفق 5 مل / دقيقة. بدء decellularization مع نضح من الكبد مع 1٪ تريتون X-100 لمدة 90 دقيقة. السماح دفق النفايات عبر تدفق الجهاز نضح للحفاظ على مستوى السوائل داخل ثابتة غرفة نضح وفوق الكبد perfused ل. بعد 90 دقيقة، وتغيير المنظفات ل1٪ SDS. <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/53029/53029fig3.jpg" /> <img alt="الجدول 1" src="/files/ftp_upload/53029/53029table1.jpg" /></li></ol></li></ol> &lt;P&gt; الشكل (3): بروتوكول الإرواء لجميع المجموعات التجريبية.

<ol>
	<li>Struecker, B., Raschzok, N., Sauer, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+support+strategies:+cutting-edge+technologies.">Liver support strategies: cutting-edge technologies.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 11, 166-176 (2014).</li><li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes.">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32, 3233-3243 (2011).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+liver+scaffolds+effectively+support+the+proliferation+and+differentiation+of+mouse+fetal+hepatic+progenitors.">Decellularized liver scaffolds effectively support the proliferation and differentiation of mouse fetal hepatic progenitors.</a> J Biomed Mater Res A. , (2013).</li><li>Uygun, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+reengineering+through+development+of+a+transplantable+recellularized+liver+graft+using+decellularized+liver+matrix.">Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix.</a> Nat Med. 16, 814-820 (2010).</li><li>Shupe, T., Williams, M., Brown, A., Willenberg, B., Petersen, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+the+decellularization+of+intact+rat+liver.">Method for the decellularization of intact rat liver.</a> Organogenesis. 6, 134-136 (2010).</li><li>Bao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+a+portal+implantable+functional+tissue-engineered+liver+using+perfusion-decellularized+matrix+and+hepatocytes+in+rats.">Construction of a portal implantable functional tissue-engineered liver using perfusion-decellularized matrix and hepatocytes in rats.</a> Cell transplantation. 20, 753-766 (2011).</li><li>Baptista, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+whole+organ+decellularization+for+the+generation+of+a+vascularized+liver+organoid.">The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid.</a> Hepatology. 53, 604-617 (2011).</li><li>Soto-Gutierrez, A., Wertheim, J. A., Ott, H. C., Gilbert, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+on+whole-organ+assembly:+moving+toward+transplantation+on+demand.">Perspectives on whole-organ assembly: moving toward transplantation on demand.</a> J Clin Invest. 122, 3817-3823 (2012).</li><li>Soto-Gutierrez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+whole-organ+regenerative+medicine+approach+for+liver+replacement.">A whole-organ regenerative medicine approach for liver replacement.</a> Tissue engineering. Part C, Methods. 17, 677-686 (2011).</li><li>De Kock, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+quick+method+for+whole-liver+decellularization:+a+novel+in+vitro+three-dimensional+bioengineering+tool.">Simple and quick method for whole-liver decellularization: a novel in vitro three-dimensional bioengineering tool.</a> Archives of toxicology. 85, 607-612 (2011).</li><li>Park, K. M., Woo, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+decellularization+for+multi-organ+scaffolds+in+rats.">Systemic decellularization for multi-organ scaffolds in rats.</a> Transplantation proceedings. 44, 1151-1154 (2012).</li><li>Shirakigawa, N., Ijima, H., Takei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+liver+as+a+practical+scaffold+with+a+vascular+network+template+for+liver+tissue+engineering.">Decellularized liver as a practical scaffold with a vascular network template for liver tissue engineering.</a> J Biosci Bioeng. , (2012).</li><li>Ren, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+two+decellularization+methods+in+the+development+of+a+whole-organ+decellularized+rat+liver+scaffold.">Evaluation of two decellularization methods in the development of a whole-organ decellularized rat liver scaffold.</a> Liver Int. 33, 448-458 (2013).</li><li>Struecker, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+rat+liver+decellularization+by+arterial+perfusion+under+oscillating+pressure+conditions.">Improved rat liver decellularization by arterial perfusion under oscillating pressure conditions.</a> J Tissue Eng Regen Med. , (2014).</li><li>Struecker, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porcine+Liver+Decellularization+Under+Oscillating+Pressure+Conditions:+A+Technical+Refinement+to+Improve+the+Homogeneity+of+the+Decellularization+Process.">Porcine Liver Decellularization Under Oscillating Pressure Conditions: A Technical Refinement to Improve the Homogeneity of the Decellularization Process.</a> Tissue engineering. Part C, Methods. , (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

على الرغم من أن هذه التقنية المقدمة للحصاد كبد الفئران وdecellularization هي استنساخه بسهولة، وهناك بعض الخطوات الحاسمة للنظر: أثناء التحضير للحصاد الكبد، فمن المهم تجنب نزيف حاد لأنه سيتم تنشيط تجلط الدم ويمكن أن يؤدي إلى تشكل جلطة دمو?...

Decellularization وrecellularization قد تمكن من توليد وظيفية، وأجهزة للزرع في المختبر 1. عن طريق إزالة الخلايا والمواد المستضدات (على سبيل المثال، DNA، الحواتم ألفا غال) من الجهاز، المصفوفة خارج الخلية غير أو أقل مناعة (ECM) ويمكن الحصول على. هذه المصفوفة تحافظ عليه التشريح المجهري ثلاثي الأبعاد للجهاز ويمكن أن تكون بمثابة بايوماتريكس مثالية لإعادة تعمير مع خلايا مختلفة، والأصل ربما xenogeneic 2. وبالتالي، يمكن إسكانها على decellularized الفئران مصفوفة الكبد بخلايا الكبد الإنسان. هذا أنسنة الكبد الجزئي يمكن أن تكون بمثابة نموذج فيفو السابقين للبحث في الأمراض (على سبيل المثال، الأمراض الاستقلابية الخلقية والأمراض الفيروسية أو الأورام الخبيثة) أو لاختبار الأدوية قبل السريرية 3. وقد تم بالفعل نشر عدة بروتوكولات مختلفة للكبد الفئران نضح decellularization 13/04. في جميع البروتوكولات، decellularوقد تحقق سعودة التي نضح من المنظفات الأيونية أو غير الأيونية القلوية عن طريق الوريد البابي مقنى. إلى حد علمنا، كنا المجموعة الأولى أن يقدم الفئران decellularization الكبد عن طريق نضح انتقائية عبر الوريد البابي و / أو الفئران الشريان الكبدي 14. تمكين نضح الانتقائي للأنظمة الأوعية الدموية المختلفة في الكبد قد تمكن النتائج decellularization أفضل وعلاوة على ذلك، يمكن أن تلعب دورا هاما في إعادة تعمير الخلوية. في دراسة مفصلة هنا، تم perfused لكبد في جهاز نضح الملكية حسب الطلب، مما نضح تحت ظروف الضغط تتأرجح. هذه الشروط ضغط تحاكي نضح الجهاز التنفسي التي تعتمد فيزيولوجي الكبد: في الوضع الطبيعي، توقف الكبد تحت حباك من الحجاب الحاجز، الذي تنقل خلال التنفس لديها تأثير مباشر على نضح الكبد. إلهام يؤدي خصيصا لتخفيض الضغط على الحجاب الحاجز والكبد، وتحسينأمراض الكبد وريدي تدفق، في حين انقضاء يؤدي إلى ارتفاع في الكبد وخفض الضغط داخل البطن لتحسين تدفق بوابة الوريدي 15. كان هدفنا لتقييم ما إذا كانت تتأرجح ظروف الضغط يكون لها تأثير على تجانس كبد الفئران نضح decellularization عن طريق محاكاة الظروف داخل البطن خارج الحي. تجانس عملية decellularization قد يكون عاملا في التقليل من نضح decellularization. جميع مواد معروفة تستخدم لdecellularization الكبد سبب تعديلات على ECM. تبقى الخلايا في المناطق ضعيفة perfused لداخل ECM، في حين أن مناطق أخرى هي بالفعل decellularized تماما. لإذابة الخلايا المتبقية، يجب أن تكون مرتفعة مدة نضح أو ضغط، مما تسبب في مزيد من التعديلات على المناطق perfused لجيدا. وبالتالي، منظفات للdecellularization ينبغي توزيع متجانس داخل الجهاز.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Self built arterial cannula</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Portex Non Sterile Polyethene Tubing</td><td>SIMS Portex</td><td>REF 800/110/100</td><td>0.28 mm ID 0.61 mm OD</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Portex Non Sterile Polyethene Tubing</td><td>SIMS Portex</td><td>REF 800/110/200</td><td>0.58 mm ID 0.96 mm OD</td></tr><tr><td>Venodrop Safe butterfly catheter</td><td>Fresenius Kabi</td><td>3275851</td><td>21 G</td></tr><tr><td colspan="4">portal vein cannula</td></tr><tr><td>Periphereal Venous Catheter</td><td>BD</td><td>393224</td><td>BD Venflon Pro 20G</td></tr><tr><td>Three-way stopcock</td><td>smiths medical</td><td>888-101RE</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">surgery</td></tr><tr><td>Cotton Sticks</td><td>Hecht-Assistent</td><td>4302</td><td></td></tr><tr><td>Cotton Pads&amp;nbsp;</td><td>Shaoxing Zhengde Surgical dressing</td><td>13H118-03</td><td></td></tr><tr><td>Gauze Bandage</td><td>Hubei Haige&amp;nbsp; Medical Instruments</td><td>14388</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Ringer Solution</td><td>Fresenius Kabi</td><td>13 HKP022</td><td>1000 ml</td></tr><tr><td>10 ml Syringe</td><td>Braun</td><td>4606108V</td><td>10 ml/ Luer Solo</td></tr><tr><td>5 ml Syringe</td><td>Braun</td><td>4606061V</td><td>5 ml /Luer Solo</td></tr><tr><td>Suture (Silk 6/0)</td><td>Resorba</td><td>H1F</td><td>LOT 105001.81</td></tr><tr><td>medical drape</td><td>Shaoxing Zhengde Surgical dressing</td><td>D0613011</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">surgical instruments</td></tr><tr><td>needle holder</td><td>Geuder</td><td>17570</td><td></td></tr><tr><td>micro-forceps</td><td>Inox-Electronic</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>micro-scissors</td><td>Martin</td><td>11-740-11</td><td></td></tr><tr><td>micro-forceps</td><td>S&amp;amp;T&amp;nbsp;</td><td>112314</td><td></td></tr><tr><td>Clamp</td><td>Aesculap</td><td>BH111R</td><td></td></tr><tr><td>scissors</td><td>F S T&amp;nbsp;</td><td>14501-14</td><td></td></tr><tr><td>surgical forceps</td><td>Aesculap</td><td>BD 557</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Decellularisation</td></tr><tr><td>Respirator</td><td>Resmed</td><td>14.24.11.0004</td><td>SmartAIR ST</td></tr><tr><td>Perfusion Device</td><td>Charite, medical engineering laboratory</td><td>custome-made device</td><td>decellularisation device</td></tr><tr><td>peristaltic pump ismatec reglo ICC</td><td>IDEX</td><td>ISM4408&amp;nbsp;</td><td>4-channel</td></tr><tr><td>heidelberger extension 75 cm&amp;nbsp;</td><td>Fresenius Kabi</td><td>2873</td><td>75 cm</td></tr><tr><td>MS/CA pump-segment</td><td>IDEX</td><td>IS 3510&amp;nbsp;</td><td>MS/CA/click&#039;n&#039;go/POM-C</td></tr><tr><td>CA 2-stopper tube</td><td>Pharmed</td><td>BPT NSF-51</td><td></td></tr><tr><td>bubble trap&amp;nbsp;</td><td></td><td>custome-made item</td><td></td></tr><tr><td>Luer Lock hose connector</td><td>Neolab</td><td>No. 02-1887</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Detergents</td></tr><tr><td>SDS pellets</td><td>Carl Roth&amp;nbsp;</td><td>CN30.4&amp;nbsp;</td><td>2.5 kg</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Carl Roth&amp;nbsp;</td><td>3051.1&amp;nbsp;</td><td>10 L</td></tr><tr><td>PBS&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td>DPBS</td></tr><tr><td colspan="4">staining</td></tr><tr><td>Eosin 1%</td><td>Morphisto</td><td>10177</td><td></td></tr><tr><td>Mayer hematoxylin</td><td>AppliChem</td><td>A4840</td><td></td></tr><tr><td>gomori staining</td><td>Morphisto</td><td>11104</td><td></td></tr><tr><td>AlcainBlue-PAS staining</td><td>Morphisto</td><td>11388</td><td></td></tr><tr><td>Direct Red 80&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>365548</td><td></td></tr></tbody></table>

procedure for decellularization of rat livers in an oscillating-pressure perfusion device

Decellularization and recellularization of parenchymal organs may enable the generation of functional organs in vitro, and several protocols for rodent liver decellularization have already been published. We aimed to improve the decellularization process by construction of a proprietary perfusion device enabling selective perfusion via the portal vein and/or the hepatic artery. Furthermore, we sought to perform perfusion under oscillating surrounding pressure conditions to improve the homogeneity of decellularization. The homogeneity of perfusion decellularization has been an underestimated factor to date. During decellularization, areas within the organ that are poorly perfused may still contain cells, whereas the extracellular matrix (ECM) in well-perfused areas may already be affected by alkaline detergents. Oscillating pressure changes can mimic the intraabdominal pressure changes that occur during respiration to optimize microperfusion inside the liver. In the study presented here, decellularized rat liver matrices were analyzed by histological staining, DNA content analysis and corrosion casting. Perfusion via the hepatic artery showed more homogenous results than portal venous perfusion did. The application of oscillating pressure conditions improved the effectiveness of perfusion decellularization. Livers perfused via the hepatic artery and under oscillating pressure conditions showed the best results. The presented techniques for liver harvesting, cannulation and perfusion using our proprietary device enable sophisticated perfusion set-ups to improve decellularization and recellularization experiments in rat livers.

تم تقييم تجانس وبالتالي فعالية بروتوكولات decellularization مختلفة عن طريق الملاحظة العيانية، التحليل النسيجي، وتحليل محتوى الحمض النووي المتبقية ضمن مصفوفات الكبد decellularized. وعلاوة على ذلك، تم إجراء التآكل الصب لتصور التشريح المجهري سليمة من كبد بعد decellularization. <p class="jove_cont...

Watch this Scientific Journal Video about Procedure for Decellularization of Rat Livers in an Oscillating-pressure Perfusion Device at JoVE.com

Procedure for Decellularization of Rat Livers in an Oscillating-pressure Perfusion Device

The presented techniques for liver harvesting, cannulation and perfusion using our proprietary device enable sophisticated perfusion set-ups to improve decellularization and recellularization experiments in rat livers.

إجراءات Decellularization من الجرذ الأكباد في تتأرجح ضغط الإرواء الأجهزة

Decellularization and recellularization of parenchymal organs may enable the generation of functional organs in vitro, and several protocols for rodent ...

procedure-for-decellularization-rat-livers-an-oscillating-pressure

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.2K Views.  Charité – Universitätsmedizin Berlin. The presented techniques for liver harvesting, cannulation and perfusion using our proprietary device enable sophisticated perfusion set-ups to improve decellularization and recellularization experiments in rat livers.

Video: Procedure for Decellularization of Rat Livers in an Oscillating-pressure Perfusion Device

Decellularization and Recellularization of Whole Livers

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to recreate or mimic the liver microstructure with grounds up approach using tissue engineering and microfabrication techniques have not been successful so far due to this design challenge. In addition, synthetic biomaterials used to create scaffolds for liver tissue engineering applications have been limited in inducing tissue regeneration and repair in large part due to the lack of specific cell binding motifs that would induce the proper cell functions2. Decellularized native tissues such blood vessels3and skin4on the other hand have found many applications in tissue engineering, and have provided a practical solution to some of the challenges. The advantage of decellularized native matrix is that it retains, to an extent, the original composition, and the microstructure, hence enhancing cell attachment and reorganization5.
In this work we describe the methods to perform perfusion-decellularization of the liver, such that an intact liver bioscaffold that retains the structure of major blood vessels is obtained. Further, we describe methods to recellularize these bioscaffolds with adult primary hepatocytes, creating a liver graft that is functional in vitro, and has the vessel access necessary for transplantation in vivo.

Perfusion decellularization is a novel technique to produce whole liver scaffolds that retains the organ's extracellular matrix composition and microarchitecture. Herein, the method of preparing whole organ scaffolds using perfusion decellularization and subsequent repopulation with hepatocytes is described. Functional and transplantable liver grafts can be generated using this technique.

وDecellularization Recellularization الأكباد من الجامعة

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to ...

Technique of Subnormothermic Ex Vivo Liver Perfusion for the Storage, Assessment, and Repair of Marginal Liver Grafts

The success of liver transplantation has resulted in a dramatic organ shortage. In most transplant regions 20-30% of patients on the waiting list for liver transplantation die without receiving an organ transplant or are delisted for disease progression. One strategy to increase the donor pool is the utilization of marginal grafts, such as fatty livers, grafts from older donors, or donation after cardiac death (DCD). The current preservation technique of cold static storage is only poorly tolerated by marginal livers resulting in significant organ damage. In addition, cold static organ storage does not allow graft assessment or repair prior to transplantation.
These shortcomings of cold static preservation have triggered an interest in warm perfused organ preservation to reduce cold ischemic injury, assess liver grafts during preservation, and explore the opportunity to repair marginal livers prior to transplantation. The optimal pressure and flow conditions, perfusion temperature, composition of the perfusion solution and the need for an oxygen carrier has been controversial in the past.
In spite of promising results in several animal studies, the complexity and the costs have prevented a broader clinical application so far. Recently, with enhanced technology and a better understanding of liver physiology during ex vivo perfusion the outcome of warm liver perfusion has improved and consistently good results can be achieved.
This paper will provide information about liver retrieval, storage techniques, and isolated liver perfusion in pigs. We will illustrate a) the requirements to ensure sufficient oxygen supply to the organ, b) technical considerations about the perfusion machine and the perfusion solution, and c) biochemical aspects of isolated organs.

Technique of Subnormothermic Ex Vivo Liver Perfusion for the Storage, Assessment, and Repair of Marginal Liver Grafts

Marginal grafts, such as fatty livers, grafts from older donors, or livers retrieved after cardiac death (DCD) tolerate conventional, cold static storage only poorly. We developed a novel model of subnormothermic ex vivo liver perfusion for preservation, assessment, and repair of marginal liver grafts prior to transplantation.

تقنية Subnormothermic<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; الكبد الإرواء للتخزين، تقييم، وإصلاح الطعوم الكبد الهامشية

The success of liver transplantation has resulted in a dramatic organ shortage. In most transplant regions 20-30% of patients on the waiting list for ...

Medicine

Normothermic Ex Vivo Liver Machine Perfusion in Mouse

This protocol presents an optimized erythrocytes-free NEVLP system using mouse livers. Ex vivo preservation of mouse livers was achieved by employing modified cannulas and techniques adapted from conventional commercial ex vivo perfusion equipment. The system was utilized to evaluate the preservation outcomes following 12 h of perfusion. C57BL/6J mice served as liver donors, and the livers were explanted by cannulating the portal vein (PV) and bile duct (BD), and subsequently flushing the organ with warm (37 &#176;C) heparinized saline. Then, the explanted livers were transferred to the perfusion chamber and subjected to normothermic oxygenated machine perfusion (NEVLP). Inlet and outlet perfusate samples were collected at 3 h intervals for perfusate analysis. Upon completion of the perfusion, liver samples were obtained for histological analysis, with morphological integrity assessed using modified Suzuki-Score through Hematoxylin-Eosin (HE) staining. The optimization experiments yielded the following findings: (1) mice weighing over 30 g were deemed more suitable for the experiment due to the larger size of their bile duct (BD). (2) a 2 Fr (outer diameter = 0.66 mm) polyurethane cannula was better suited for cannulating the portal vein (PV) when compared to a polypropylene cannula. This was attributed to the polyurethane material&#39;s enhanced grip, resulting in reduced catheter slippage during the transfer from the body to the organ chamber. (3) for cannulation of the bile duct (BD), a 1 Fr (outer diameter = 0.33 mm) polyurethane cannula was found to be more effective compared to the polypropylene UT - 03 (outer diameter = 0.30 mm) cannula. With this optimized protocol, mouse livers were successfully preserved for a duration of 12 h without significant impact on the histological structure. Hematoxylin-Eosin (HE) staining revealed a well-preserved morphological architecture of the liver, characterized by predominantly viable hepatocytes with clearly visible nuclei and mild dilation of hepatic sinusoids.

Normothermic Ex Vivo Liver Machine Perfusion in Mouse

A normothermic ex vivo liver perfusion (NEVLP) system was created for mouse livers. This system requires experience in microsurgery but allows for reproducible perfusion results. The ability to utilize mouse livers facilitates the investigation of molecular pathways to identify novel perfusate additives and enables the execution of experiments focused on organ repair.

نورموذرميك خارج الجسم الحي آلة الكبد التروية في الماوس

This protocol presents an optimized erythrocytes-free NEVLP system using mouse livers. Ex vivo preservation of mouse livers was achieved by employing ...

Engineering

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver engineering, including in vivo organ decellularization followed by repopulation, has emerged as a promising approach over ex vivo liver engineering. However, postoperative survival was not achieved. The aim of this study is to develop a novel surgical technique of in vivo selective liver lobe perfusion in rats as a prerequisite for in vivo liver engineering. We generate a circuit bypass only through the left lateral lobe. Then, the left lateral lobe is perfused with heparinized saline. The experiment is performed with 4 groups (n = 3 rats per group) based on different perfusion times of 20 min, 2 h, 3 h, and 4 h. Survival, as well as the macroscopically visible change of color and the histologically determined absence of blood cells in the portal triad and the sinusoids, is taken as an indicator for a successful model establishment. After selective perfusion of the left lateral lobe, we observe that the left lateral lobe, indeed, turned from red to faint yellow. In a histological assessment, no blood cells are visible in the branch of the portal vein, the central vein, and the sinusoids. The left lateral lobe turns red after reopening the blocked vessels. 12/12 rats survived the procedure for more than one week. We are the first to report a surgical model for in vivo single liver lobe perfusion with a long survival period of more than one week. In contrast to the previously published report, the most important advantage of the technique presented here is that perfusion of 70% of the liver is maintained throughout the whole procedure. The establishment of this technique provides a foundation for in vivo partial liver engineering in rats, including decellularization and recellularization.

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

We establish a novel surgical technique for an in vivo single liver lobe perfusion model in rat as a prerequisite for further studying in vivo partial liver engineering in the future.

رواية تقنية جراحية كأساس في فيفو جزئي الهندسة الكبد في الفئران

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver ...

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

Liver fibrosis is defined by the excessive deposition of extracellular matrix by activated myofibroblasts. There are multiple precursors of hepatic myofibroblasts, including hepatic stellate cells, portal fibroblasts and bone marrow derived fibroblasts 1. Hepatic stellate cells have been the best studied, but portal fibroblasts are increasingly recognized as important contributors to the myofibroblast pool, particularly in biliary fibrosis 2. Portal fibroblasts undergo proliferation in response to biliary epithelial injury, potentially playing a key role in the early stages of biliary scarring 3-5. A method of isolating portal fibroblasts would allow in vitro study of this cell population and lead to greater understanding of the role portal fibroblasts play in biliary fibrosis.
Portal fibroblasts have been isolated using various techniques including outgrowth 6, 7 and liver perfusion with enzymatic digestion followed by size selection 8. The advantage of the digestion and size selection technique compared to the outgrowth technique is that cells can be studied without the necessity of passage in culture. Here, we describe a modified version of the original technique described by Kruglov and Dranoff 8 for isolation of portal fibroblasts from rat liver that results in a relatively pure population of primary cells.

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

A technique for isolating portal fibroblasts from rat liver is described. Livers are perfused and digested in situ with collagenase, followed by ex vivo digestion of the liver slurry and size selection of cells. This method provides a pure population of portal fibroblasts without the need for passage in culture.

عزل الخلايا الليفية بوابة الجرذ من قبل<em&gt; في الموقع</em&gt; الكبد الإرواء

Liver fibrosis is defined  by the excessive deposition of extracellular matrix by activated  myofibroblasts. There are multiple precursors of hepatic ...

Biology

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

العزلة والثقافة الأساسي في الخلايا الكبدية الجرذ

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Procurement and Decellularization of Rat Hindlimbs Using an Ex Vivo Perfusion-Based Bioreactor for Vascularized Composite Allotransplantation

Patients with severe traumatic injuries and tissue loss require complex surgical reconstruction. Vascularized composite allotransplantation (VCA) is an evolving reconstructive avenue for transferring multiple tissues as a composite subunit. Despite the promising nature of VCA, the long-term immunosuppressive requirements are a significant limitation due to the increased risk of malignancies, end-organ toxicity, and opportunistic infections. Tissue engineering of acellular composite scaffolds is a potential alternative in reducing the need for immunosuppression. Herein, the procurement of a rat hindlimb and its subsequent decellularization using sodium dodecyl sulfate (SDS) is described. The procurement strategy presented is based upon the common femoral artery. A machine perfusion-based bioreactor system was constructed and used for ex vivo decellularization of the hindlimb. Successful perfusion decellularization was performed, resulting in a white translucent-like appearance of the hindlimb. An intact, perfusable, vascular network throughout the hindlimb was observed. Histological analyses showed the removal of nuclear contents and the preservation of tissue architecture across all tissue compartments.

Procurement and Decellularization of Rat Hindlimbs Using an Ex Vivo Perfusion-Based Bioreactor for Vascularized Composite Allotransplantation

We describe the surgical technique and decellularization process for composite rat hindlimbs. Decellularization is conducted using low-concentration sodium dodecyl sulfate through an ex vivo machine perfusion system.

شراء وإزالة الخلايا من الأطراف الخلفية للفئران باستخدام مفاعل حيوي قائم على التروية خارج الجسم الحي لزراعة الخيول المركبة الوعائية

Patients with severe traumatic injuries and tissue loss require complex surgical reconstruction. Vascularized composite allotransplantation (VCA) is an ...

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

There is a significant shortage of liver allografts available for transplantation, and in response the donor criteria have been expanded. As a result, normothermic ex vivo liver perfusion (NEVLP) has been introduced as a method to evaluate and modify organ function. NEVLP has many advantages in comparison to hypothermic and subnormothermic perfusion including reduced preservation injury, restoration of normal organ function under physiologic conditions, assessment of organ performance, and as a platform for organ repair, remodeling, and modification. Both murine and porcine NEVLP models have been described. We demonstrate a rat model of NEVLP and use this model to show one of its important applications &#8212; the use of a therapeutic molecule added to liver perfusate. Catalase is an endogenous reactive oxygen species (ROS) scavenger and has been demonstrated to decrease ischemia-reperfusion in the eye, brain, and lung. Pegylation has been shown to target catalase to the endothelium. Here, we added pegylated-catalase (PEG-CAT) to the base perfusate and demonstrated its ability to mitigate liver preservation injury. An advantage of our rodent NEVLP model is that it is inexpensive in comparison to larger animal models. A limitation of this study is that it does not currently include post-perfusion liver transplantation. Therefore, prediction of the function of the organ post-transplantation cannot be made with certainty. However, the rat liver transplant model is well established and certainly could be used in conjunction with this model. In conclusion, we have demonstrated an inexpensive, simple, easily replicable NEVLP model using rats. Applications of this model can include testing novel perfusates and perfusate additives, testing software designed for organ evaluation, and experiments designed to repair organs.

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

There is a significant liver donor shortage, and criteria for liver donors have been expanded. Normothermic ex vivo liver perfusion (NEVLP) has been developed to evaluate and modify organ function. This study demonstrates a rat model of NEVLP and tests the ability of pegylated-catalase, to mitigate liver preservation injury.

نموذج حيوانات صغيرة من نضح الكبد نورموثيرميك السابقين فيفو

There is a significant shortage of liver allografts available for transplantation, and in response the donor criteria have been expanded. As a result, ...

Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure for primary hepatocyte isolation is technically challenging, especially in portal vein cannulation. The procedure is also prone to occasional contamination and variations in perfusion conditions due to difficulties in the assembly, optimization, or maintenance of the perfusion setup. Here, a detailed protocol for an improved two-step collagenase perfusion procedure with multiparameter perfusion control is presented. Primary rat hepatocytes were successfully and reliably isolated by taking the necessary technical precautions at critical steps of the procedure, and by reducing the operational difficulty and mitigating the variability of perfusion parameters through the adoption of a special intravenous catheter, standardized sterile disposable tubing, temperature control, and real-time monitoring and alarm system. The isolated primary rat hepatocytes consistently exhibit high cell viability (85%-95%), yield (2-5 x 108 cells per 200-300 g rat) and functionality (albumin, urea and CYP activity). The procedure was complemented by an integrated perfusion system, which is compact enough to be set up in the laminar flow hood to ensure aseptic operation.

This protocol details the use of a special intravenous catheter, standardized sterile disposable tubing, temperature control complemented by real-time monitoring, and an alarm system for two-step collagenase perfusion procedure to improve the consistency in the viability, yield, and functionality of isolated primary rat hepatocytes.

عزل خلايا كبد الفئران الأولية مع التحكم في التروية متعدد المعلمات

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure ...

Evaluation of Apoptosis and Lung Injury in DCD Donor Lungs Preserved by EVLP

Establishment of a Novel Ex Vivo Lung Perfusion System for Rat Lungs After Circulatory Death

The increasing scarcity of donor lungs for transplantation has spurred significant interest in the utilization of organs procured from donors after cardiac death (DCD). However, a critical challenge remains in maximizing the number of viable lungs that meet stringent criteria for clinical use. Ex vivo lung perfusion (EVLP) emerges as a promising technology to evaluate and potentially improve the function of donated lungs. This paper describes the development of a cost-effective and reproducible small animal experimental platform specifically designed for EVLP research. This platform offers a high degree of customization, enabling researchers to tailor experimental parameters to address specific research questions within the field of EVLP. The team established a rat model to simulate DCD and implemented a two-stage preservation approach. Lungs were subjected to static cold storage using a perfusate solution at 4 &#176;C for 4 h, followed by normothermic EVLP for another 4 h. Researchers evaluated various lung function parameters, including pulmonary vascular resistance, pulmonary dynamic compliance, blood gas measurements of the perfusate, and apoptotic cell death in lung tissues. The study demonstrates that EVLP could significantly improve the functional performance of DCD lungs compared to simple cold storage at 4 &#176;C, suggesting that EVLP has the potential to mitigate ischemia-reperfusion injury and enhance graft function following circulatory death, thereby increasing the pool of transplantable lungs.

The objective is to develop a new ex vivo lung perfusion (EVLP) model in rats that can sustain consistent lung function for 4 h throughout EVLP and furnish the industry with implementation specifics that will offer a sturdy method for applying EVLP to rodent models.

The increasing scarcity of donor lungs for transplantation has spurred significant interest in the utilization of organs procured from donors after ...

إجراءات Decellularization من الجرذ الأكباد في تتأرجح ضغط الإرواء الأجهزة

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video