1. التلقيح وتنقية الفيروسات من النباتات VLPs benthamiana نيكوتيانا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توج T7-إنتاج نسخ من RNA فيروس البطاطا X (PVX) القائم على البلازميدات ناقلات تحمل MRFV البرية من نوع (وزن) والسيستئين-تحور البروتين معطف (CP) الجينات 12، باستخدام Ambion في T7-mMessage mMachine كيت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل رد فعل نص T7، تطعيم توسيع اثنين من يترك تماما N. benthamiana مع 10 ميكرولتر واحتضان ردود فعل النباتات لمدة 10 أيام في الاحتباس الحراري، في الرطوبة 60٪ لمدة 16 ساعة مع ضوء (25،000-30،000 لوكس) عند 25 درجة مئوية و 8 ساعة مظلمة في 20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصاد ر N. benthamiana الأوراق المصابة بالفيروسات 10 أيام آخر التلقيح (نقطة في البوصة)، وزن الأنسجة النباتية (50 غرام) ومكان على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجانس المواد النباتية في الخلاط بحضور 100 مل من محلول مبرد بنسبة 0.5 العازلة نا السيترات M، ودرجة الحموضة 5.5 (2 مل من استخدام المخزن المؤقت في كل غرام من الأنسجة النباتية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصفية جناسة إلى 3 طبقات من cheeseclأوراسكوم تليكوم القابضة وتوضيح بواسطة الطرد المركزي في 27000 XG لمدة 30 دقيقة. نقل طاف في اسطوانة تخرج المبردة، وقياس مستوى الصوت، ثم نقل إلى الدورق ومعقمة مبردة. تجاهل بيليه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معالجة طاف بإضافة 10٪ البولي ايثيلين جلايكول 8،000 (PEG 8،000)، يحرك المزيج لمدة 15 دقيقة في C ° 4، واحتضان ل45 دقيقة إضافية في 4 درجات مئوية لترسيب جزيئات الفيروسات مثل (VLPs)-PEG المصفوفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في العينة 27000 XG لمدة 20 دقيقة في C ° 4 و إزالة طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معالجة بيليه بإضافة 8 مل قدره 0.05 عازلة نا السيترات M، ودرجة الحموضة 5.5 تحتوي على 2٪ تريتون X-100. دوامة أجهزة الطرد المركزي أنابيب جيدا للافراج عن بيليه. نقل بيليه وعازلة لكأس معقمة مبردة. شطف الأنابيب مباشرة مع 2 مل من نفس المخزن المؤقت وإضافته إلى كوب. تحريك التعليق في 4 درجات مئوية حتى يتم حل الكريات (عموما 1 ساعة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توضيح بواسطة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 27000 XG، تجاهل بيليه، و فrocess طاف بواسطة الطرد المركزي عند 140،000 XG لمدة 2 ساعة في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تعليق بيليه في 1 مل العازلة 0،05 M نا السيترات، ودرجة الحموضة 5.5 و وضع تعليق على قمة التدرج السكروز 10-40٪ 0،05 المحرز في المخزن المؤقت نا السيترات M، ودرجة الحموضة 5.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي التدرج لمدة 3 ساعة على 140،000 XG في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسليط الضوء على الجزء العلوي من أنبوب الطرد المركزي وجمع الفرقة تشتت الضوء العلوي في 4 سم من أعلى الأنبوب، تمييع مع 0.05 عازلة نا السيترات M، ودرجة الحموضة 5.5، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 3 ساعة على 140،000 XG في 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تعليق بيليه في 0.5 مل من الماء المعقم وتخزينها في C ° 4 لمدة تصل إلى ستة أشهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Quantitate تركيز VLPs عن طريق إجراء فحص البروتين برادفورد. العائد من VLPs بين 1 و 3 ميكروغرام / غرام من الأنسجة النباتية. </li></ol> 2. فلوريسئين-5-maleimide وضع العلامات من ردود الفعل VLPs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحل 1 ملم فلوريسئين-maleimide-5 (427.37 جم / مول) في 50 ملي الفوسفاط الصوديومه العازلة، ودرجة الحموضة 7.0؛ 1 ملم EDTA. خلط باستخدام الدوامة والتحقق من حل كامل. حماية أنبوب من الضوء باستخدام رقائق الألومنيوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة فلوريسئين-5-maleimide لVLPs المنتجة في الخطوة 1 والمزيج. استخدام فائض 25-أضعاف ضرس فلوريسئين-maleimide-5 لكمية من المولي sulfhydryls. عموما، باستخدام 30 ميكرولتر من VLPs في تركيز 1 ميكروغرام / ميكرولتر و 60 ميكرولتر من محلول فلوريسئين-5-maleimide تعطي نتائج مقبولة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لمدة 2 ساعة رد فعل في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في C. ° 4 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنهاء رد فعل من خلال إضافة dithiothreitol (DTT) إلى تركيز النهائي من 50 ملي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة غير رد فعل فلوريسئين باستخدام عمود الدوران إزالة الملوحة (الحرارية العلمية شركة، IL روكفورد) والطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في XG 1500 في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لSDS-PAGE التحليل، إضافة 10 ميكرولتر من 2 × SDS-PAGE العازلة عينة Laemmli إلى 10 ميكرولتر من كل رد فعل. تخزين البروتين المسمى محمية من الضوء في C ° 4 لمدة تصل إلى شهر واحد أوفي ذات الاستخدام الواحد مأخوذة في -20 ° C مدة تصل إلى 3 أشهر. </li></ol> 3. وضع العلامات وتحديد رد الفعل التأسيس البيوتين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الأعمدة تدور تحلية (الحرارية العلمية شركة، IL روكفورد) لتنفيذ تبادل العازلة من الماء إلى الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، 7.0 درجة الحموضة من إنتاج VLPs في الخطوة 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد محلول المخزون من 20 ملي maleimide-البيوتين-PEG2 عن طريق إضافة ميكرولتر 190 من PBS في وزن لا maleimide---PEG2 البيوتين ومزيج من pipetting صعودا وهبوطا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة maleimide-PEG2-البيوتين إلى VLPs والمزيج. استخدام فائض يساوي 10-fold ضرس كاشف عن حلول VLPs ≤ 2 ملغ / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان رد الفعل في درجة حرارة الغرفة لمدة 4 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة غير رد فعل maleimide-PEG2-البيوتين باستخدام عمود الدوران تحلية (الحرارية العلمية شركة، IL روكفورد) والطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في XG 1500 في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد الشامات من البيوتين في مولات VLPs باستخدام الكمي البيوتين بيرس كيت (الحرارية العلمية) وFOالنماذج التالية تعليمات الشركة الصانعة. </li></ol> 4. عبر ربط السيستئين VLPs-2 والببتيد F <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتستخدم VLPs مما أدى إلى بقايا السيستين المتاحة للربط عبر في الخطوة 2 (2-السيستئين VLPs) في الخطوة التالية. إعداد محلول المخزون جديدة عبر ربط (28.63 ملم) عن طريق إذابة 10 ملغ من NHS-PEG4-maleimide رابط العرضي في 680 ميكرولتر من ثنائي ميثيل سلفوكسيد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل ل17 (F)-الأمينية الببتيد حمض طويلة (LLPNMOKDKEACAKAPL) في 50 ميكرولتر من العازلة اقتران (1 × PBS، ودرجة الحموضة 7.2، 1 ملم EDTA) بتركيز 0.1 ملم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 4 ميكرولتر من رابط العرضي إلى 50 ميكرولتر من حل الببتيد (البروتين NH2) في تركيز 1 انتهاء ملي (وهو الزائدة يساوي 10-fold المولي ل0.1 ملم حل الببتيد). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لمدة 2 ساعة رد فعل في C. ° 4 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنقية عبر ربط الببتيد باستخدام عمود تحلية (الحرارية العلمية شركة، IL روكفورد) معايرتها مع العازلة اقتران (1 × PBS، ودرجة الحموضة 7.2، 1 ملم EDTA) بواسطة الطرد المركزي عند 1500 XGلمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مزيج يجمع بين رد فعل VLPs (البروتين-SH) وعبر ربط الببتيد (البروتين NH2) في نسبة المولي يحدد من قبل عدد من ثيول والأمينات المشاركة في تنشيط التفاعل والفرق في الوزن الجزيئي بين VLPs والببتيد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان خليط التفاعل في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة في C. ° 4 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحليل لطخة غربية، خلط الناتج مترافق مع المنتج 01:01 عازلة Laemmli، وتغلي لمدة 10 دقيقة، والمضي قدما في SDS-PAGE على الزهر قبل 10-20٪ هلام تريس جليكاين (إينفيتروجن)، تليها الصعود إلى electroblotting غشاء النيتروسليلوز (إينفيتروجن). منع الأغشية مع 1 × PBS، ودرجة الحموضة 7.2 تحتوي على 0.05٪ توين-20 (PBS-توين) و 5٪ مسحوق الحليب الخالي من الدسم والتحقيق مع الببتيد محددة الأجسام المضادة تليها الفوسفاتيز الأجسام المضادة التي تحمل علامات الثانوية المناسبة. </li></ol>

<ol>
	<li>Barnhill, H., Reuther, R., Ferguson, P. L., Dreher, T. W., Wang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turnip+yellow+mosaic+virus+as+a+chemoaddressable+bionanoparticle.">Turnip yellow mosaic virus as a chemoaddressable bionanoparticle.</a> Bioconj. Chem. 18, 852-859 (2007).</li><li>Chapman, S., Kavanagh, T., Baulcombe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potato+virus+X+as+a+vector+for+gene+expression+in+plants.">Potato virus X as a vector for gene expression in plants.</a> Plant J. 2, 549-557 (1992).</li><li>Chen, C., Kwak, E. S., Stein, B., Kao, C. C., Dragnea, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Packaging+of+gold+particles+in+viral+capsids.">Packaging of gold particles in viral capsids.</a> J. Nanosci. Nanotechnol. 5, 2029-2033 (2005).</li><li>Fowler, C. E., Shenton, W., Stubbs, G., Mann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tobacco+mosaic+virus+liquid+crystals+as+templates+for+the+interior+design+of+silica+mesophases+and+nanoparticles.">Tobacco mosaic virus liquid crystals as templates for the interior design of silica mesophases and nanoparticles.</a> Advanced Materials. 13, 1266-1269 (2001).</li><li>Gazit, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+biomolecular+templates+for+the+fabrication+of+metal+nanowires.">Use of biomolecular templates for the fabrication of metal nanowires.</a> FEBS. J. 274, 317-322 (2007).</li><li>Gillitzer, E., Wilts, D., Young, M., Douglas, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+modification+of+a+viral+cage+for+multivalent+presentation.">Chemical modification of a viral cage for multivalent presentation.</a> Chem. Commun. , 2390-2391 (2002).</li><li>Hammond, R. W., Hammond, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maize+rayado+fino+virus+capsid+proteins+assemble+into+virus-like+particles+in+Escherichia+coli.">Maize rayado fino virus capsid proteins assemble into virus-like particles in Escherichia coli.</a> Virus Res. 147, 208-215 (2010).</li><li>Hermamson, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioconjugate techniques. , (1991).</li><li>Kaiser, C. R., Flenniken, M. L., Gillitzer, E., Harmsen, A. L., Harmsen, A. G., Jutila, M. A., Douglas, T., Young, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodistribution+studies+of+protein+cage+nanoparticles+demonstrate+broad+tissue+distribution+and+rapid+clearance+in+vivo.">Biodistribution studies of protein cage nanoparticles demonstrate broad tissue distribution and rapid clearance in vivo.</a> Int. J. Nanomed. 2, 715-733 (2007).</li><li>Knez, M., Bittner, A. M., Boes, F., Wege, C., Jeske, H., Maisse, E., Kern, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotemplate+synthesis+of+3-nm+nickel+and+cobalt+nanowires.">Biotemplate synthesis of 3-nm nickel and cobalt nanowires.</a> Nano Lett. 3, 1079-1082 (2003).</li><li>Lee, S. Y., Culver, J. N., Harris, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+CuCl2+concentration+on+the+aggregation+and+mineralization+of+Tobacco+mosaic+virus+biotemplate.">Effect of CuCl2 concentration on the aggregation and mineralization of Tobacco mosaic virus biotemplate.</a> J. Colloid. Interface. Sci. 297, 554-560 (2006).</li><li>Lvov, Y., Haas, H., Decher, G., Mohwald, H., Mikhailov, A., Mtchedlishvily, B., Morgunova, E., Vainshtein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successive+deposition+of+alternate+layers+of+polyelectrolytes+and+a+charged+virus.">Successive deposition of alternate layers of polyelectrolytes and a charged virus.</a> Langmuir. 10, 4232-4236 (1994).</li><li>Natilla, A., Hammond, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maize+rayado+fino+virus+virus-like+particles+expressed+in+tobacco+plants:+a+new+platform+for+cysteine+selective+bioconjugation+peptide+display.">Maize rayado fino virus virus-like particles expressed in tobacco plants: a new platform for cysteine selective bioconjugation peptide display.</a> J. Virol. Methods. 178, 209-215 (2011).</li><li>Rae, C. S., Khor, I. W., Wang, Q., Destito, G., Gonzalez, M. J., Singh, P., Thomas, D. M., Estrada, M. N., Powell, E., Finn, M. G., Manchester, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+trafficking+of+plant+virus+nanoparticles+in+mice+via+the+oral+route.">Systemic trafficking of plant virus nanoparticles in mice via the oral route.</a> Virology. 343, 2224-2235 (2005).</li><li>Raja, K. S., Wang, Q., Gonzalez, M. J., Manchester, M., Johnson, J. E., Finn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+virus-polymer+materials.+Synthesis+and+properties+of+PEG-decorated+Cowpea+mosaic+virus.">Hybrid virus-polymer materials. Synthesis and properties of PEG-decorated Cowpea mosaic virus.</a> Biomacromolecules. 4, 472-476 (2003).</li><li>Royston, E., Lee, S. Y., Culver, J. N., Harris, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+silica-coated+Tobacco+mosaic+virus.">Characterization of silica-coated Tobacco mosaic virus.</a> J. Colloid Interface Sci. 298, 706-712 (2006).</li><li>Schlick, T. L., Ding, Z., Kovacs, E. W., Francis, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-surface+modification+in+the+Tobacco+mosaic+virus.">Dual-surface modification in the Tobacco mosaic virus.</a> J. Am. Chem. Soc. 127, 3718-3723 (2005).</li><li>Young, M., Willits, D., Uchida, M., Douglas, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+viruses+as+biotemplates+for+materials+and+their+use+in+nanotechnology.">Plant viruses as biotemplates for materials and their use in nanotechnology.</a> Annu. Rev. Phytopathol. 46, 361-384 (2008).</li></ol>

يذكر من الأسماء التجارية للمنتجات التجارية في المنشور هو فقط لغرض توفير معلومات محددة، ولا تعني توصية أو تأييد من قبل وزارة الزراعة الأميركية.

طريقة المقدمة هنا يمكن تحليل حساسة جدا وسريعة رد الفعل cysteines موجودة على سطح VLPs التي ينتجها النبات وكذلك على مجمعات البروتين الأخرى. Maleimides هي ثيول محددة الكواشف، التي تتفاعل مع جزيئات سلفهيدريل المحتوية على حرية تشكيل السندات أثير ثيولي مستقرة. هذا الأسلوب يعتمد على ?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> Thinwall، أنابيب فائقة الوضوح </td><td> بيكمان </td><td> 344059 </td><td></td></tr><tr><td> mMESSAGE mMACHINE T7 كيت </td><td> الحياة Tecnologies </td><td> AM1344M </td><td></td></tr><tr><td> فلوريسئين-5-Maleimide </td><td> تقنيات الحرارية العلمية الحياة </td><td> 46130 F150 </td><td> 46130 هو من أجل بديل مع F150 </td></tr><tr><td> بيرس كيت البيوتين الكمي </td><td> الحرارية العلمية </td><td> 28005 </td><td></td></tr><tr><td> EZ-Maleimide لينك PEG2-البيوتين، لا وزن تنسيق </td><td> الحرارية العلمية </td><td> 21901 </td><td></td></tr><tr><td> SM (PEG) ن Crosslinkers </td><td> الحرارية العلمية </td><td> 22107 </td><td></td></tr><tr><td> 10-20٪ هلام تريس جليكاين </td><td> إينفيتروجن </td><td> EC61352 </td><td></td></tr><tr><td> Laemmli العازلة </td><td> بيو راد </td><td> 1610737 </td><td></td></tr><tr><td> تريس العازلة جليكاين SDS تشغيل </td><td> إينفيتروجن </td><td> LC2675 </td><td></td></tr><tr><td> تريس العازلة جليكاين نقل </td><td> إينفيتروجن </td><td> LC3675 </td><td></td></tr><tr><td> النيتروسليلوز ساندويتش غشاء مرشح ورقة </td><td> إينفيتروجن </td><td> LC2001 </td><td></td></tr><tr><td> الانجذاب الفوسفاتيز إعتبر تنقية جسم الأرنب لمفتش الحكومة </td><td> Kirkegaard والمختبرات بيري </td><td> 0751516 </td><td></td></tr><tr><td> NBT / BCIP الفوسفاتيز الركيزة </td><td> Kirkegaard والمختبرات بيري </td><td> 508107 </td><td></td></tr></tbody></table>

analysis of the solvent accessibility of cysteine residues on maize rayado fino virus virus-like particles produced in nicotiana benthamiana plants and cross-linking of peptides to vlps

محاكاة واستغلال الخصائص الفيزيائية والخصائص الفيروس والبدنية يبشر بالخير لتوفير حلول لبعض التحديات العالمية الأكثر إلحاحا. مجموعة الهائل وأنواع من الفيروسات بالإضافة إلى خصائصها المثيرة للاهتمام أن يحتمل فرصا لا نهاية لها لتقديم الطلبات في التكنولوجيات القائمة على الفيروس. الفيروسات لديها القدرة على الى جزيئات منفصلة مع شكل وحجم والنوعية التناظر، polyvalence، وخصائص ثابتة في مجموعة واسعة من ظروف درجة الحرارة ودرجة الحموضة الذاتي تجميع. ليس من المستغرب، مع مجموعة رائعة من هذه الخصائص، ويقترح الفيروسات للاستخدام في المواد الحيوية 9، اللقاحات 14 و 15، والمواد الالكترونية، وأدوات كيميائية، والحاويات الإلكترونية الجزيئية 4، 5، 10، 11، 16، 18، 12. للاستفادة من الفيروسات في تكنولوجيا النانو، يجب تعديلها من أشكالها الطبيعية لنقل وظائف جديدة. هذا التحدي العلاقات العامةلا يمكن أن يؤديها من خلال عدة آليات صوتك بما في ذلك التحوير الوراثي للجينوم الفيروسي وربط جزيئات أجنبية أو كيميائيا المطلوب إلى مجموعات الجسيمات المتفاعلة الفيروس 8. القدرة على تعديل فيروس يعتمد بالدرجة الأولى على خصائص الفيزيائية والمادية للفيروس. وبالإضافة إلى ذلك، والتعديلات الجينية أو الفيزيائية تحتاج إلى القيام بها دون أن يؤثر ذلك سلبا على بنية الفيروس الأصلي وظيفة الفيروس. الذرة rayado فينو فيروس البروتينات معطف (MRFV) في الإشريكية القولونية المنتجة VLPs مستقرة وخالية من التي استقرت البروتين البروتين الذاتي التجمع ويمكن استخدام التفاعلات وذلك في التطبيقات المستندة إلى تقنيات الفيروس 8. تم فحص VLPs المنتجة في مصانع التبغ بوصفها سقالة التي يمكن أن مجموعة متنوعة من الببتيدات عرض تساهميا 13. هنا، نحن تصف خطوات ل1) تحديد أي من المذيبات cysteines الوصول إليها في قفيصة الفيروسات المتاحة لmodifiالموجبة، و 2) bioconjugate الببتيدات إلى تعديل capsids. باستخدام الأصلي أو إدخال mutationally-مخلفات الأحماض الأمينية ومستوى التقنيات اقتران، تم عرض تشكيلة واسعة من المواد الموجودة على سطح من الفيروسات النباتية مثل، فيروس تبرقش بروم 3، قرنفل فيروس البرقشة 12، اللوبيا داء الاخضرار البرقشة فيروس 6، فسيفساء التبغ فيروس 17، اللفت الأصفر فيروس فسيفساء 1، وMRFV 13.

عابر التعبير عن الجينات الطافرة معطف MRFV (CP) البروتين في N. يوصف النباتات benthamiana في VLPs ناقلات القائم على إنتاج PVX في الشكل 1. يتم تضخيمه معطف MRFV معدلة الجينات البروتين بواسطة PCR ثم وضعت تحت سيطرة الترانسكربتي من المروج subgenomic CP تكرار في ناقلات القائم على ...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-

Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs

وهناك طريقة لتحليل إمكانية وصول المذيب للمجموعة ثيول من بقايا السيستين من<em&gt; الذرة rayado فينو فيروس</emيوصف&gt; (MRFV)-الفيروسات مثل الجزيئات (VLPs)، يليه رد فعل عبر ربط الببتيد. الأسلوب يستفيد من توافر عدة مجموعات كيميائية على سطح VLPs التي يمكن أن تكون أهدافا لردود فعل معينة.

تحليل إمكانية الوصول المذيبات من بقايا السيستين على<em&gt; الذرة rayado فينو فيروس</em&gt; الفيروسات مثل الجزيئات التي تنتج في<em&gt; نيكوتيانا benthamiana</em&gt; النباتات والصليب ربط-من الببتيدات لVLPs

Mimicking  and exploiting virus properties and physicochemical and physical  characteristics holds promise to provide solutions to some of  the world's ...

analysis-solvent-accessibility-cysteine-residues-on-maize-rayado-fino

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs

11.0K Views.  Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture. وهناك طريقة لتحليل إمكانية وصول المذيب للمجموعة ثيول من بقايا السيستين من الذرة rayado فينو فيروس (MRFV)-الفيروسات مثل الجزيئات (VLPs)، يليه رد فعل عبر ربط الببتيد. الأسلوب يستفيد من توافر عدة مجموعات كيميائية على سطح VLPs التي يمكن أن تكون أهدافا لردود فعل مع...

Video: Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs

Isolation and Genome Analysis of Single Virions using 'Single Virus Genomics'

Whole genome amplification and sequencing of single microbial cells enables genomic characterization without the need of cultivation 1-3. Viruses, which are ubiquitous and the most numerous entities on our planet 4 and important in all environments 5, have yet to be revealed via similar approaches. Here we describe an approach for isolating and characterizing the genomes of single virions called 'Single Virus Genomics' (SVG). SVG utilizes flow cytometry to isolate individual viruses and whole genome amplification to obtain high molecular weight genomic DNA (gDNA) that can be used in subsequent sequencing reactions.

Isolation and Genome Analysis of Single Virions using &#039;Single Virus Genomics&#039;

Single Virus Genomics (SVG) is a method to isolate and amplify the genomes of single virons. Viral suspensions of a mixed assemblage are sorted using flow cytometry onto a microscope slide with discrete wells containing agarose, thereby capturing the virion and reducing genome shearing during downstream processing. Whole genome amplification is achieved using multiple displacement amplification (MDA) resulting in genomic material that is suitable for sequencing.

العزلة وتحليل الجينوم Virions واحدة باستخدام &#39;جينوم فيروس واحد&#39;

Whole genome amplification and sequencing of single microbial cells enables genomic characterization without the need of cultivation 1-3. Viruses, which ...

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is initiated by interaction of the pathogen with intestinal epithelial cells. This interaction leads to disruption of intercellular structures such as tight junctions (TJ). TJ ensure sealing of the epithelial layer to separate host tissue from gut lumen. Recent studies provide evidence that disruption of TJ by the parasitic protein EhCPADH112 is a prerequisite for E. histolytica invasion that is accompanied by epithelial barrier dysfunction. Thus, the analysis of molecular mechanisms involved in TJ disassembly during E. histolytica invasion is of paramount importance to improve our understanding of amoebiasis pathogenesis. This article presents an easy model that allows the assessment of initial host-pathogen interactions and the parasite invasion potential. Parameters to be analyzed include transepithelial electrical resistance, interaction of EhCPADH112 with epithelial surface receptors, changes in expression and localization of epithelial junctional markers and localization of parasite molecules within epithelial cells.

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Human infection by Entamoeba histolytica leads to amoebiasis, a major cause of diarrhea in tropical countries. Infection is initiated by pathogen interactions with intestinal epithelial cells, provoking the opening of cell-cell contacts and consequently diarrhea, sometimes followed by liver infection. This article provides a model to assess the early host-pathogen interactions to improve our understanding of amoebiasis pathogenesis.

تحليل الأضرار الظهارية التي تنتجها<em&gt; المتحولة الحالة للنسج</em&gt; عدوى

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in mice. Recently, myeloid differentiation factor 88 (MyD88) signaling was shown to be important for initial T cell priming and memory T cell development during WNV NS4B-P38G mutant infection. In this study, two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and an intracellular cytokine staining (ICS) &#8211; were utilized to assess dendritic cells (DCs) and T cell functions. In the T cell priming assay, cell proliferation was analyzed by flow cytometry following co-culture of DCs from both groups of mice with carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) - labeled CD4+ T cells of OTII transgenic mice. This approach provided an accurate determination of the percentage of proliferating CD4+ T cells with significantly improved overall sensitivity than the traditional assays with radioactive reagents. A microcentrifuge tube system was used in both cell culture and cytokine staining procedures of the ICS protocol. Compared to the traditional tissue culture plate-based system, this modified procedure was easier to perform at biosafety level (BL) 3 facilities. Moreover, WNV- infected cells were treated with paraformaldehyde in both assays, which enabled further analysis outside BL3 facilities. Overall, these in vitro immunological assays can be used to efficiently assess cell-mediated immune responses during WNV infection.

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and intracellular cytokine staining were utilized to measure antigen presenting capacity of dendritic cells and antigen-specific T cell responses to a West Nile virus mutant infection in mice.

في تحليل المختبر من الاستجابة المناعية الخلوية بوساطة Myd88 لفيروس غرب النيل المسخ سلالة العدوى

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Modeling The Lifecycle Of Ebola Virus Under Biosafety Level 2 Conditions With Virus-like Particles Containing Tetracistronic Minigenomes

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or specific treatments for the disease caused by these viruses, and work with infectious Ebola viruses is restricted to biosafety level 4 laboratories, significantly limiting the research on these viruses. Lifecycle modeling systems model the virus lifecycle under biosafety level 2 conditions; however, until recently such systems have been limited to either individual aspects of the virus lifecycle, or a single infectious cycle. Tetracistronic minigenomes, which consist of Ebola virus non-coding regions, a reporter gene, and three Ebola virus genes involved in morphogenesis, budding, and entry (VP40, GP1,2, and VP24), can be used to produce replication and transcription-competent virus-like particles (trVLPs) containing these minigenomes. These trVLPs can continuously infect cells expressing the Ebola virus proteins responsible for genome replication and transcription, allowing us to safely model multiple infectious cycles under biosafety level 2 conditions. Importantly, the viral components of this systems are solely derived from Ebola virus and not from other viruses (as is, for example, the case in systems using pseudotyped viruses), and VP40, GP1,2 and VP24 are not overexpressed in this system, making it ideally suited for studying morphogenesis, budding and entry, although other aspects of the virus lifecycle such as genome replication and transcription can also be modeled with this system. Therefore, the tetracistronic trVLP assay represents the most comprehensive lifecycle modeling system available for Ebola viruses, and has tremendous potential for use in investigating the biology of Ebola viruses in future. Here, we provide detailed information on the use of this system, as well as on expected results.

Work with infectious Ebola viruses is restricted to biosafety level 4 laboratories. Tetracistronic minigenome-containing replication and transcription-competent virus like particles (trVLPs) represent a lifecycle modeling system that allows us to safely model multiple infectious cycles under biosafety level 2 conditions, relying exclusively on Ebola virus components.

نماذج دورة حياة فيروس الايبولا تحت شروط السلامة الأحيائية المستوى 2 مع جزيئات تشبه الفيروسات يحتوي على Tetracistronic Minigenomes

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

عزل وتحليل العدلة لتحديد ما دورها في الغدد اللمفاوية حساسية الخلية وكلاء العلاجية

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic self-tolerance. Tregs represent about 5 - 10% of the mature CD4+ T cell subpopulation in mice and humans, with about 1 - 2% of those Tregs circulating in the peripheral blood. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) can be differentiated into functional Tregs, which have a potential to be used for cell-based therapies of autoimmune diseases. Here, we present a method to develop antigen (Ag)-specific Tregs from iPSCs (i.e., iPSC-Tregs). The method is based on incorporating the transcription factor FoxP3 and an Ag-specific T cell receptor (TCR) into iPSCs and then differentiating on OP9 stromal cells expressing Notch ligands delta-like (DL) 1 and DL4. Following in vitro differentiation, the iPSC-Tregs express CD4, CD8, CD3, CD25, FoxP3, and Ag-specific TCR and are able to respond to Ag stimulation. This method has been successfully applied to cell-based therapy of autoimmune arthritis in a murine model. Adoptive transfer of these Ag-specific iPSC-Tregs into Ag-induced arthritis (AIA)-bearing mice has the ability to reduce joint inflammation and swelling and to prevent bone loss.

We present here a method to develop functional antigen (Ag)-specific regulatory T cells (Tregs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) for immunotherapy of autoimmune arthritis in a murine model.

تطوير المستمدة الخلية الجذعية خلايا T التنظيمية مستضد محددة ضد المناعة الذاتية

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Use of the Soft-agar Overlay Technique to Screen for Bacterially Produced Inhibitory Compounds

The soft-agar overlay technique was originally developed over 70 years ago and has been widely used in several areas of microbiological research, including work with bacteriophages and bacteriocins, proteinaceous antibacterial agents. This approach is relatively inexpensive, with minimal resource requirements. This technique consists of spotting supernatant from a donor strain (potentially harboring a toxic compound(s)) onto a solidified soft agar overlay that is seeded with a bacterial test strain (potentially sensitive to the toxic compound(s)). We utilized this technique to screen a library of Pseudomonas syringae strains for intraspecific killing. By combining this approach with a precipitation step and targeted gene deletions, multiple toxic compounds produced by the same strain can be differentiated. The two antagonistic agents commonly recovered using this technique are bacteriophages and bacteriocins. These two agents can be differentiated using two simple additional tests. Performing a serial dilution on a supernatant containing bacteriophage will result in individual plaques becoming less in number with greater dilution, whereas serial dilution of a supernatant containing bacteriocin will result a clearing zone that becomes uniformly more turbid with greater dilution. Additionally, a bacteriophage will produce a clearing zone when spotted onto a fresh soft agar overlay seeded with the same strain, whereas a bacteriocin will not produce a clearing zone when transferred to a fresh soft agar lawn, owing to the dilution of the bacteriocin.

We describe a simple method for screening bacterial cultures for the production of compounds inhibitory towards other bacteria.

استخدام تقنية تراكب لينة أجار للكشف عن المركبات المثبطة إنتاج البكتريا

The soft-agar overlay technique was originally developed over 70 years ago and has been widely used in several areas of microbiological research, ...

Combining Analysis of DNA in a Crude Virion Extraction with the Analysis of RNA from Infected Leaves to Discover New Virus Genomes

This metagenome approach is used to identify plant viruses with circular DNA genomes and their transcripts. Often plant DNA viruses that occur in low titers in their host or cannot be mechanically inoculated to another host are difficult to propagate to achieve a greater titer of infectious material. Infected leaves are ground in a mild buffer with optimal pH and ionic composition recommended for purifying most bacilliform Para retroviruses. Urea is used to break up inclusion bodies that trap virions and to dissolve cellular components. Differential centrifugation provides further separation of virions from plant contaminants. Then proteinase K treatment removes the capsids. Then the viral DNA is concentrated and used for next-generation sequencing (NGS). The NGS data are used to assemble contigs which are submitted to NCBI-BLASTn to identify a subset of virus sequences in the generated dataset. In a parallel pipeline, RNA is isolated from infected leaves using a standard column-based RNA extraction method. Then ribosome depletion is carried out to enrich for a subset of mRNA and virus transcripts. Assembled sequences derived from RNA sequencing (RNA-seq) were submitted to NCBI-BLASTn to identify a subset of virus sequences in this dataset. In our study, we identified two related full-length badnavirus genomes in the two datasets. This method is preferred to another common approach which extracts the aggregate population of small RNA sequences to reconstitute plant virus genomic sequences. This latter metagenomic pipeline recovers virus related sequences that are retro-transcribing elements inserted into the plant genome. This is coupled to biochemical or molecular assays to further discern the actively infectious agents. The approach documented in this study, recovers sequences representative of replicating viruses that likely indicate active virus infection.

Here we present a new approach to identify plant viruses with double-strand DNA genomes. We use standard methods to extract DNA and RNA from infected leaves and carry out next-generation sequencing. Bioinformatic tools assemble sequences into contigs, identify contigs representing virus genomes and assign genomes to taxonomic groups.

الجمع بين تحليل للحمض النووي في مجال استخراج النفط خام Virion بتحليل الحمض النووي الريبي من الأوراق المصابة اكتشاف جينومات الفيروس الجديد

This metagenome approach is used to identify plant viruses with circular DNA genomes and their transcripts. Often plant DNA viruses that occur in low ...

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

Virus spreading is a major cause of epidemic diseases. Thus, understanding the interaction between the virus and the host is very important to extend our knowledge of prevention and treatment of viral infection. The fruit fly Drosophila melanogaster has proven to be one of the most efficient and productive model organisms to screen for antiviral factors and investigate virus-host interaction, due to powerful genetic tools and highly conserved innate immune signaling pathways. The procedure described here demonstrates a nano-injection method to establish viral infection and induce systemic antiviral responses in adult flies. The precise control of the viral injection dose in this method enables high experimental reproducibility. Protocols described in this study include the preparation of flies and the virus, the injection method, survival rate analysis, the virus load measurement, and an antiviral pathway assessment. The influence effects of viral infection by the flies' background were mentioned here. This infection method is easy to perform and quantitatively repeatable; it can be applied to screen for host/viral factors involved in virus-host interaction and to dissect the crosstalk between innate immune signaling and other biological pathways in response to viral infection.

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

This protocol describes how to establish viral infection in vivo in Drosophila melanogaster using the nano-injection method and basic techniques to analyze virus-host interaction.

إنشاء العدوى الفيروسية، وتحليل التفاعل المضيف للفيروسات في Melanogaster المورفولوجية

Virus spreading is a major cause of epidemic diseases. Thus, understanding the interaction between the virus and the host is very important to extend our ...

Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To Fc&#947;R Cross-linking

The oxidative or respiratory burst is used to describe the rapid consumption of oxygen and generation of reactive oxygen species (ROS) by phagocytes in response to various immune stimuli. ROS generated during immune activation exerts potent antimicrobial activity primarily through the ability of ROS to damage DNA and proteins, causing death of microorganisms. Being able to measure ROS production reproducibly and with ease is necessary in order to assess the contribution of various pathways and molecules to this mechanism of host defense. In this paper, we demonstrate the use of fluorescent probes and flow cytometry to detect ROS production. Although widely used, fluorescent measurement of ROS is notoriously problematic, especially with regards to measurement of ROS induced by specific and not mitogenic stimuli. We present a detailed methodology to detect ROS generated as a result of specific Fc&#947;R stimulation beginning with macrophage generation, priming, staining, Fc&#947;R cross-linking, and ending with flow cytometric analysis.

Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To Fc&amp;#947;R Cross-linking

This study demonstrates the use of flow cytometry to detect reactive oxygen species (ROS) production resulting from activation of the Fc&#947;R. This method can be used to assess changes in the antimicrobial and redox signaling function of phagocytes in response to immune complexes, opsonized microorganisms, or direct Fc&#947;R cross-linking.

تدفق سيتوميتريك قياس الإنتاج روس في الضامة ردا على FcγR العابرة للربط

The oxidative or respiratory burst is used to describe the rapid consumption of oxygen and generation of reactive oxygen species (ROS) by phagocytes in ...