الكتاب ممتنون جدا لبوب فيشر (LV، DIR، NIAID، المعاهد الوطنية للصحة)، الذي قام بدور الراوي، وكذلك أوستن أثمان (RTB، DIR، NIAID، NIH) وميغان مورغان (DOHS، ORS، OD، NIH) ل مساعدتهم في صنع الفيلم يرافق هذه المخطوطة. وعلاوة على ذلك، نود أن نشكر أليسون Groseth (LV، DIR، NIAID، NIH) لقراءة نقدية للمخطوطة. وأيد هذا البحث من قبل برنامج بحوث جماعية من المعاهد الوطنية للصحة، NIAID.

1. تقسيم الخلايا المنتجة للإنتاج الأولي من trVLPs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المتوسطة 80-90٪ متموجة 293 الخلايا المستزرعة في 75 سم 2 قوارير في أعلى مستوى الجلوكوز تعديل المتوسطة النسر Dulbecco ل(DMEM) مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS)، 2 مم L-الجلوتامين، و1X القلم / بكتيريا (DMEM10 ). غسل الخلايا مرتين مع 10 المالحة الفوسفات مخزنة مل (PBS)، والحرص على عدم طرد الخلايا، وإضافة 2 مل التربسين-EDTA إلى الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا في درجة حرارة الغرفة حتى تظهر خلايا التقريب كبير عندما لاحظ تحت المجهر (حوالي 30 ثانية). إزاحة الخلايا من خلال استغلال قارورة، وإضافة 8 مل DMEM10. و resuspend بدقة الخلايا عن طريق pipetting بلطف صعودا ونزولا حتى لوحظ تعليق خلية واحدة عند النظر إليها تحت المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد الخلايا باستخدام عداد خلية الآلي. تمييع الخلايا إلى 2 × 10 5 خلية لكل مليلتر في DMEM10. ماصة 2 مل من تعليق خلية لكل بئر في 6 جيدا لوحات (4 × 105 خلايا لكل بئر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحات في ترطيب حاضنة زراعة الأنسجة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2. </li></ol> 2. ترنسفكأيشن من الخلايا المنتجة للإنتاج الأولي من trVLPs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 24 ساعة بعد تقسيم الخلايا (انظر الشكل 5 لمحة عامة عن توقيت التجربة)، ماصة بلازميد الحمض النووي 15 (للمبالغ انظر الجدول 1) إلى العقيمة 2 مل cryovial باستخدام نصائح تصفيتها. إضافة 100 ميكرولتر OptiMEM لكل بئر على الحمض النووي. دوامة الخليط لفترة وجيزة وبلطف تدور باستمرار الأنابيب باستخدام microfuge. إذا عدة آبار وسيتم transfected مع البلازميدات متطابقة، يمكن إجراء mastermix لعدة آبار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لفترة وجيزة دوامة القارورة مع العابر LT1 قبل الاستخدام. إضافة 7.5 ميكرولتر العابر LT1 لكل بئر على الحمض النووي المخفف. دوامة بلطف الخليط، مع الحرص على عدم جمع السائل في غطاء cryovial، واحتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المزيج بلطف ترنسفكأيشنمجمع pipetting صعودا وهبوطا. إضافة 100 ميكرولتر من المجمعات ترنسفكأيشن قطرة قطرة إلى كل بئر. موسيقى الروك لوحة إلى الأمام / الخلف ومن جانب إلى آخر لتوزيع المجمعات ترنسفكأيشن. لا دوامة لوحة وهذا سوف يسبب متفاوتة انتشار المجمعات ترنسفكأيشن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العودة الخلايا إلى الحاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 24 ساعة، وإزالة طاف من الخلايا. إضافة 4 مل DMEM مع 5٪ FBS، 2 مم L-الجلوتامين، 1X القلم / بكتيريا (DMEM5) إلى الخلايا. ويمكن القيام بهذه الخطوة لمدة تصل إلى 3 آبار في وقت دون جفاف الآبار، على افتراض الآبار تحتوي على عينات مماثلة (وإلا، نظرا لطبيعة تضخيم الذات من trVLPs في هذا النظام، انتقال التلوث يمكن أن تصبح قضية و وينبغي أن يتم هذا خطوة جيدة في وقت واحد). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العودة الخلايا إلى الحاضنة. </li></ol> 3. إعداد الخلايا المستهدفة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 293 تقسيم الخلايا كما هو موضح في القسم 1، بذر 4 × 10 5 الخلايا في 2 مل لكل بئر DMEM10 للوحة 6 جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 24 ساعة بعد تقسيم الخلايا المستهدفة و 24 ساعة قبل العدوى، والخلايا المستهدفة بالنقل كما هو موضح في القسم 2 باستخدام الحمض النووي المبالغ في الجدول رقم 1، و 4.5 ميكرولتر العابر LT1 لكل بئر. </li></ol> 4. العدوى من الخلايا المستهدفة وحصاد الخلايا المنتج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل supernatants من الخلايا المنتجة إلى 15 مل أنابيب. إزالة وتجاهل أي طاف المتبقية باستخدام خرطوم فراغ. إضافة 250 ميكرولتر بالشبكة تحلل العازلة للخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طاف الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 800 x ج ودرجة حرارة الغرفة لمسح عينات من الحطام الخلوي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف من بئر واحدة من الخلايا المستهدفة. إضافة بعناية 3 مل من مسح طاف خلية منتجة لاستهداف الخلايا باستخدام أبطأ سرعة ماصة. pipetting لتجنب مباشرة على الخلايا من أجل تجنب تعطيل أحادي الطبقة الخلية. هذه الخطوة لابد من القيام به بشكل جيد في وقت واحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما كانت جميع العينات العابرةferred، والعودة الخلايا المستهدفة إلى حاضنة للسماح الترسيب من trVLPs وإصابة الخلايا المستهدفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 15 دقيقة من الحضانة في درجة حرارة الغرفة في المخزن المؤقت تحلل بالشبكة، resuspend الخلايا منتج في المخزن المؤقت تحلل باستخدام micropipette المقرر أن 150 ميكرولتر، ونقل العينة إلى 2 مل cryovial. عند هذه النقطة، لست] يمكن تجميد في -80 درجة مئوية، أو مباشرة قياس كما هو موضح في القسم 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 24 ساعة بعد الإصابة، وإزالة طاف من الخلايا المستهدفة. إضافة 4 مل لكل بئر DMEM5 إلى الخلايا. ويمكن القيام بهذه الخطوة لمدة تصل إلى ثلاثة آبار في كل مرة، إذا الآبار تحتوي على عينات مماثلة (وإلا، نظرا لطبيعة تضخيم الذات من trVLPs في هذا النظام، ويمكن انتقال التلوث أصبح قضية، ويجب أن تكون هذه الخطوة أحسنت واحدة في كل مرة). </li></ol> 5. حصاد الخلايا المستهدفة لدورة العدوى واحد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إلا إذا كان ينبغي تقييم دورة المعدية واحدة، في 72 ساعة بعد الإصابة إزالة رانه طاف من الخلايا المستهدفة باستخدام خرطوم فراغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حصاد الخلايا في 250 ميكرولتر بالشبكة تحلل العازلة كما هو موضح في القسم 4 للخلايا المنتجة. </li></ol> 6. حصاد الخلايا المستهدفة والركض المستمر لtrVLPs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا trVLPs أن تكون passaged بشكل مستمر، وإعداد مجموعة جديدة من الخلايا المستهدفة على النحو المبين في المادة 3 بحيث تكون جاهزة للعدوى 72 ساعة بعد إصابة أول مجموعة من الخلايا المستهدفة (انظر الشكل 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصيب مجموعة جديدة من الخلايا المستهدفة على النحو المبين في المادة 4 (باستخدام أول مجموعة من الخلايا المستهدفة في مكان الخلايا المنتجة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر هذه الخطوات كل 72 ساعة. </li></ol> تحليل 7. النشاط مراسل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا جمدت لست] خلية، منها ذوبان الجليد في درجة حرارة الغرفة. التأكد من أن العينات وصلت درجة حرارة الغرفة قبل القياس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد المبلغ المطلوب (40 ميكرولتر لكل عينة) من Renilla بالشبكة عازلة الفحص (ط المجمدة مثالين مأخوذة) في درجة حرارة الغرفة. ضمان أن المخزن المؤقت وصلت درجة حرارة الغرفة قبل القياس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1/100 حجم التاسع من Renilla بالشبكة الركيزة إلى المخزن المؤقت فحص Renilla بالشبكة للحصول على Renilla بالشبكة الكاشف، ومزيج من قبل vortexing. ماصة 40 ميكرولتر من كاشف Renilla بالشبكة البيضاء في لوحة 96 جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 40 ميكرولتر من العينة إلى الكاشف Renilla-بالشبكة. انتظر 10 دقيقة، ثم قياس العينات في luminometer باستخدام التكامل وقت من 1 ثانية. </li></ol>

<ol>
	<li>Kuhn, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+perceived+threat+differences+posed+by+filovirus+variants.">Evaluation of perceived threat differences posed by filovirus variants.</a> Biosecurity and bioterrorism : biodefense strategy, practice, and science. 9, 361-371 (2011).</li><li>Falzarano, D., Feldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possible+leap+ahead+in+filovirus+therapeutics.">Possible leap ahead in filovirus therapeutics.</a> Cell research. , (2014).</li><li>Hoenen, T., Groseth, A., Feldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+ebola+vaccines.">Current ebola vaccines.</a> Expert opinion on biological therapy. 12, 859-872 (2012).</li><li>Beniac, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+organisation+of+ebola+virus+reveals+a+capacity+for+extensive,+modular+polyploidy.">The organisation of ebola virus reveals a capacity for extensive, modular polyploidy.</a> PloS one. 7, e29608 (2012).</li><li>Basu, A., Mills, D. M., Bowlin, T. L., Enna, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+13,+Unit+13B+13,+High-throughput+screening+of+viral+entry+inhibitors+using+pseudotyped+virus.">Chapter 13, Unit 13B 13, High-throughput screening of viral entry inhibitors using pseudotyped virus.</a> Current protocols in pharmacology. , (2010).</li><li>Wong, A. C., Sandesara, R. G., Mulherkar, N., Whelan, S. P., Chandran, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+forward+genetic+strategy+reveals+destabilizing+mutations+in+the+Ebolavirus+glycoprotein+that+alter+its+protease+dependence+during+cell+entry.">A forward genetic strategy reveals destabilizing mutations in the Ebolavirus glycoprotein that alter its protease dependence during cell entry.</a> J Virol. 84, 163-175 (2010).</li><li>Muhlberger, E., Weik, M., Volchkov, V. E., Klenk, H. D., Becker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+transcription+and+replication+strategies+of+marburg+virus+and+Ebola+virus+by+using+artificial+replication+systems.">Comparison of the transcription and replication strategies of marburg virus and Ebola virus by using artificial replication systems.</a> J Virol. 73, 2333-2342 (1999).</li><li>Hoenen, T., Groseth, A., de Kok-Mercado, F., Kuhn, J. H., Wahl-Jensen, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minigenomes,+transcription+and+replication+competent+virus-like+particles+and+beyond:+reverse+genetics+systems+for+filoviruses+and+other+negative+stranded+hemorrhagic+fever+viruses.">Minigenomes, transcription and replication competent virus-like particles and beyond: reverse genetics systems for filoviruses and other negative stranded hemorrhagic fever viruses.</a> Antiviral Res. 91, 195-208 (2011).</li><li>Hoenen, T., Feldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+genetics+systems+as+tools+for+the+development+of+novel+therapies+against+filoviruses.">Reverse genetics systems as tools for the development of novel therapies against filoviruses.</a> Expert Rev Anti Inf Ther. , 1253-1263 (2014).</li><li>Hoenen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+naive+target+cells+with+virus-like+particles:+implications+for+the+function+of+ebola+virus+VP24.">Infection of naive target cells with virus-like particles: implications for the function of ebola virus VP24.</a> J Virol. 80, 7260-7264 (2006).</li><li>Watanabe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+novel+ebola+virus-like+particles+from+cDNAs:+an+alternative+to+ebola+virus+generation+by+reverse+genetics.">Production of novel ebola virus-like particles from cDNAs: an alternative to ebola virus generation by reverse genetics.</a> J Virol. 78, 999-1005 (2004).</li><li>Hoenen, T., Jung, S., Herwig, A., Groseth, A., Becker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Both+matrix+proteins+of+Ebola+virus+contribute+to+the+regulation+of+viral+genome+replication+and+transcription.">Both matrix proteins of Ebola virus contribute to the regulation of viral genome replication and transcription.</a> Virology. 403, 56-66 (2010).</li><li>Watanabe, S., Noda, T., Halfmann, P., Jasenosky, L., Kawaoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ebola+virus+(EBOV)+VP24+inhibits+transcription+and+replication+of+the+EBOV+genome.">Ebola virus (EBOV) VP24 inhibits transcription and replication of the EBOV genome.</a> J Infect Dis. 2 (196 Suppl 2), S284-S290 (2007).</li><li>Spiegelberg, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genus-specific+recruitment+of+filovirus+ribonucleoprotein+complexes+into+budding+particles.">Genus-specific recruitment of filovirus ribonucleoprotein complexes into budding particles.</a> J Gen Virol. 92, 2900-2905 (2011).</li><li>Watt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+lifecycle+modeling+system+for+Ebola+virus+shows+a+genome+length-dependent+role+of+VP24+on+virus+infectivity.">A novel lifecycle modeling system for Ebola virus shows a genome length-dependent role of VP24 on virus infectivity.</a> J Virol. , (2014).</li><li>Kondratowicz, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+immunoglobulin+and+mucin+domain+1+(TIM-1)+is+a+receptor+for+Zaire+Ebolavirus+and+Lake+Victoria+Marburgvirus.">T-cell immunoglobulin and mucin domain 1 (TIM-1) is a receptor for Zaire Ebolavirus and Lake Victoria Marburgvirus.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 8426-8431 (2011).</li><li>Hoenen, T., Groseth, A., Callison, J., Takada, A., Feldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+Ebola+virus+expressing+luciferase+allows+for+rapid+and+quantitative+testing+of+antivirals.">A novel Ebola virus expressing luciferase allows for rapid and quantitative testing of antivirals.</a> Antiviral Res. 99, 207-213 (2013).</li><li>Hoenen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inclusion+bodies+are+a+site+of+ebolavirus+replication.">Inclusion bodies are a site of ebolavirus replication.</a> J Virol. 86, 11779-11788 (2012).</li></ol>

تعلن الكتاب أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.

الفحص trVLP tetracistronic وصفها في هذه المخطوطة يسمح نمذجة دورة حياة فيروس إيبولا على مدى عدة دورات المعدية. الأهم من ذلك أن trVLPs المنتجة في هذا النظام لا تحتوي على المعلومات الوراثية للبروتينات قفيصة منواة NP، VP35، VP30، ولام، والتي تشكل معا ما يقرب من 60٪ من جينوم فيروس إيبولا والضرورية لتكاثر الفيروس. بدلا من ذلك، هذه البروتينات يجب أن تكون المقدمة في الخلايا المستهدفة في العابرة من البلازميدات التعبير، وأي عدوى الخلايا لا تعبر عن كل 4 من تلك البروتينات هو فاشل. الأهم من ذلك، لا يوجد دليل من إعادة التركيب الجيني للfiloviruses، وليس هناك أي مناطق متماثلة المشتركة بين minigenome tetracistronic والبلازميدات التعبير عن البروتينات قفيصة منواة. وبالتالي، ليس هناك أي دليل لا عمليا ولا أي أساس النظرية التي يمكن أن توفر إمكانية لتوليد كامل طول الجينوم فيروس الايبولا التي يمكن بعد ذلك أن ينتج فيإنتاج فيروسات الإيبولا المعدية، مما يجعل هذا النظام آمن للاستخدام في ظروف BSL2. هناك نوعان من الخطوات الحاسمة في trVLP فحص tetracistronic أن تتأثر الظروف التجريبية، أي إنتاج trVLPs، وإصابة الخلايا المستهدفة مع هذه trVLPs. إنتاج trVLPs يعتمد على مستويات عالية من تكرار minigenome والنسخ، وهذا بدوره يعتمد على ترنسفكأيشن كفاءة عالية. فعالية ترنسفكأيشن يمكن تقييمها بسهولة من قبل بما في ذلك السيطرة -l، حيث يتم تبادل البلازميد عن التعبير L لترميز EGFP التعبير البلازميد. معدلات ترنسفكأيشن في ظل هذه الظروف يجب أن يتجاوز 50٪ عن طريق التفتيش مع المجهر مضان 24 ساعة ترنسفكأيشن آخر. علاوة على ذلك، يجب أن تكون خلايا خالية من الميكوبلازما، لأن في تجربتنا التلوث الميكوبلازما يضعف بشكل كبير minigenome تكرار والنسخ (بيانات غير منشورة). وترجع الزيادة إلى ارتفاع 293 م transfectabilityLLS هي خط خلية من خيار لفحوصات trVLP. ومع ذلك، وهذه الخلايا هي عرضة سيئة نسبيا (وإن لم يكن الانكسار تماما) للإصابة بفيروس إيبولا 16. التعبير عن عامل مرفق مثل تيم (1) يعزز إصابة 293 الخلايا مع trVLPs حوالي 100 أضعاف، وأمر حاسم لنجاح هذا النظام على العديد من المقاطع. بينما trVLPs tetracistronic لا تتكاثر ذاتيا من تلقاء نفسها، فهي تتكاثر ذاتيا في الخلايا التي تعبر عن البروتينات قفيصة منواة. على هذا النحو، والاحتياطات يجب أن تتم لتجنب التلوث المتبادلة بين الآبار التي تحتوي على trVLPs مختلفة (على سبيل المثال، مع طفرات مختلفة في minigenome). من الناحية الفنية أكثر، وذلك بسبب الفارق الكبير بين الإشارات الإيجابية والسلبية في هذا الاختبار (حوالي 4 سجلات)، عبر الحديث بين عينات عند قياس النشاط وسيفيراز يمكن أن تكون المسألة؛ ومع ذلك، يمكن تجنبها بسهولة من خلال ترك جيدا فارغ واحد بين كل عينة في96 لوحة جيدا المستخدمة لقياس النشاط luciferase المراسل. هناك العديد من التطبيقات الممكنة لtrVLPs tetracistronic. من الواضح، فهي مناسبة تماما لدراسة دخول الجسيمات filovirus، منذ trVLPs معدية لديهم بنية تشبه موضوع نموذجي من filoviruses المعدية 14، وتحتوي على نفس المكونات الفيروسية والجسيمات filovirus. الأهم من ذلك، أنها لا تحتوي على مكونات الفيروسات الأخرى، كما هو الحال عند استخدام virions pseudotyped أو جزيئات الفيروسات مثل، مثل جزيئات الارتجاعي تحمل GP 1،2، أو المؤتلف الفيروسات، مثل فيروس التهاب الفم الحويصلي المؤتلف التعبير عن 1،2 GP . شرط العوامل المرفق عند استخدام 293 الخلايا كما الخلايا المستهدفة في هذا النظام يمكن استغلالها للكشف عن والتحقيق في دور هذه العوامل المرفق، بينما الأدوار من العوامل الخلوية الأخرى، مثل تلك المتضمنة في النسخ المتماثل الجينوم والنسخ وكذلك التشكل وبرعمدينغ، يمكن التحقيق باستخدام تكنولوجيا رني. ويمكن أيضا تأثير الطفرات في البروتينات الفيروسية على دورة حياة الفيروس أن تدرس، على الرغم من أن على المرء أن نأخذ في الاعتبار أنه في حين VP40، GP 1،2، ويتم التعبير عن VP24 بعد النسخ الفيروسي، ويتحقق التعبير عن البروتينات الفيروسية الأخرى من التعبير البلازميدات، حتى أن الآثار بسبب overexpression من هذه البروتينات يجب أن تؤخذ بعين الاعتبار. أيضا، يجب الحرص على أن الطفرات في minigenome لا يغير كثيرا من طول minigenome، لأن النشاط مراسل يتأثر مباشرة من قبل minigenome طول 15. أخيرا، منذ minigenomes tetracistronic هي نظائرها الجينوم الفيروسية التي تحمل الجينات الفيروسية، ويتم نسخ من مجمع البوليميراز الفيروسي، فإنه ينبغي أيضا أن يكون من الممكن دراسة تطور هذه الجينات في استجابة إلى حدوث طفرات في ظل ظروف BSL2. وهكذا، في حين لا تزال تحتاج إلى مزيد من الدراسات في هذا الاتجاه، فإنه ينبغي أن يكون من الممكن، على سبيل المثال، ليعرض دون المستوى الأمثلالطفرات في الجينات داخل minigenome ثم trVLPs مرور حتى ظهور الطفرات مجانية. واحد الحد من الفحص trVLP tetracistronic الذي يجب أن يوضع في الاعتبار هو حقيقة أنه في حين أن معظم نماذج دورة حياة الفيروس، ليست على غرار النسخ الأساسي في الخلايا المستهدفة من قبل هذا النظام، حيث الخلايا المستهدفة لها للتعبير عن البروتينات قفيصة منواة في العابرة من أجل أن trVLPs لتكرار. إذا النسخ الأولية لابد من تقييمها، فمن الممكن استخدام الخلايا المستهدفة ساذجة 10؛ ومع ذلك، في هذه الحالة لا تكرار الجينوم يحدث في الخلايا المستهدفة، ويتم إنتاج أي trVLPs معدية أخرى، إجهاض العدوى. هذا هو المشكلة الرئيسية التي لا يمكن التغلب عليها دون جعل trVLPs تماما تتكاثر ذاتيا، عن طريق تضمين جينات البروتينات قفيصة منواة في minigenome، التي من شأنها أن الواقع تحويلها إلى الفيروسات المعدية إيبولا المؤتلف. في الواقع، Ebolمعربا عن فيروسات تم إنشاء وسيفيراز أو صحفيين آخرين، ويمكن استخدامها لتقييم ودراسة تكرار الجينوم والنسخ 17،18. ومع ذلك، يقتصر استخدامها إلى مختبرات BSL4. أيضا، لا بد من أن يوضع في الاعتبار في حين VP40، GP 1،2، وVP24 يتم التعبير من الجينوم الفيروسي التناظرية، وضعهم في minigenome (2 الثانية، الثالثة 3 و 4 تشرين حدة النسخي) ليست مطابقة ل موقفهم في الجينوم الفيروسي (3 الثالثة، ال 4، و 6 عشر وحدة النسخي)، والتي يمكن أن تؤثر على مستويات التعبير المطلقة، وكذلك مستويات التعبير النسبية بالنسبة لبعضها البعض. عموما، يمثل trVLP فحص tetracistronic نظام النمذجة دورة حياة أشمل للفيروسات الإيبولا المتاحة حتى الآن، ويسمح للنمذجة تكرار الجينوم والنسخ، والجسيمات التشكل والناشئين، وكذلك التعلق وENمحاولة في الخلايا المستهدفة على مدى دورات متعددة المعدية. على هذا النحو، لديها إمكانات هائلة للاستخدام في التحقيق في البيولوجيا من الفيروسات فيروس إيبولا في ظل ظروف BSL2.

فيروسات الإيبولا هي العامل المسبب لحمى نزفية حادة في البشر والرئيسيات غير البشرية مع معدلات الوفيات تصل إلى 90٪ في تفشي الإنسان 1. بينما تم إحراز تقدم كبير في السنوات الأخيرة في تطوير لقاحات وكذلك علاجات محددة (استعرضت في 2،3)، لا يتم الموافقة عليها هذه للاستخدام البشري. إيبولا جزيئات الفيروس لديها مميزة مثل موضوع ظهور بطول حوالي 1 ميكرون ويبلغ قطرها 96-98 نانومتر 4. وهناك أشكال قفيصة منواة جوهر الجسيمات الفيروسية وتتكون من 1) وغير مجزأة واحد الذين تقطعت بهم السبل، بالمعنى السلبي الجينوم RNA، الذي يشفر الجينات 7 ebolavirus (الشكل 1)، 2) البروتين النووي NP، التي encapsidates الجينوم، 3 ) مجمع الفيروسي البلمرة يتألف من L البلمرة وVP35 العامل المساعد لها، و4) المنشط VP30 النسخي. بالإضافة إلى ذلك، فقد تبين مؤخرا أن VP24 بروتين يرتبط أيضا مع قفيصة منواةث 4. ويحيط قفيصة منواة من مساحة المصفوفة التي البروتين مصفوفة VP40، وهي المسؤولة عن التشكل والناشئين من virions، ويقع. ويلفها مزيد من جزيئات الفيروس، وجزءا لا يتجزأ في هذا الظرف هو بروتين السطح الوحيد GP 1،2، وهي المسؤولة عن مرفق الفيريون والدخول. العمل مع فيروسات الإيبولا المعدية لابد من القيام بها في مختبر الاحتواء الأقصى تحت مستوى السلامة الحيوية (BSL) 4 شروط، الذي يقيد هذا العمل إلى عدد قليل من المرافق في جميع أنحاء العالم. من أجل دراسة بيولوجية هذه الفيروسات أو لتطوير علاجات جديدة في ظل ظروف BSL2 والباحثين تعتمد إما على overexpression المؤتلف من فيروس إيبولا البروتينات، أو على نظم النمذجة دورة حياة، وكلاهما يمكن أن يعمل مع في غياب فيروس الايبولا المعدي. يتحقق التعبير المؤتلف من فيروس إيبولا البروتينات إما من البلازميدات التعبير أو ناقلات فيروسية. وهناك حالة خاصة لهذه الاستراتيجية هيجيل من virions أو جزيئات الفيروسات مثل الفيروسات الأخرى على أساس من فيروسات الإيبولا (الفيروسات القهقرية الأكثر شيوعا أو فيروس التهاب الفم الحويصلي) بحضور recombinantly أعرب GP 1،2، مما يؤدي إلى توليد جسيمات pseudotyped، والتي يمكن استخدامها لدراسة عملية دخول filoviruses والشاشة لمثبطات دخول 5. بدلا من ذلك، المؤتلف الفيروسات (مثل فيروس التهاب الفم الحويصلي) التي تكود فيروس إيبولا GP 1،2 بدلا من بروتين سكري الخاصة بهم يمكن توليدها واستخدامها لدراسة دخول الفيروس تحت مستوى السلامة الحيوية 2 شروط 6. نظم النمذجة دورة حياة هي أشكال من أنظمة الوراثة العكسية وشارك فيها استخدام اقتطاع نظائرها جينوم فيروس إيبولا (minigenomes)، التي يتم إنتاجها في البداية من [كدنا] ثم تكرارها ونسخها بواسطة بروتينات فيروس إيبولا في المقدمة العابرة. وقد تم تطوير نظام minigenome الأول لفيروس إيبولا منذ أكثر من 15 عاما 7، ومنذ ذلك الحين تستخدم لدراسة فيروس إيبولا تكرار الجينوم والنسخ (استعرضت في 8،9). في هذا النظام على minigenome monocistronic تتألف من الجين مراسل واحد يحيط بها من المناطق الطرفية غير الترميز من الجينوم فيروس إيبولا (دعا الزعيم ومقطورة) (الشكل 1) يتم التعبير في خلايا الثدييات (عادة عن طريق النسخ باستخدام T7 RNA البلمرة) جنبا إلى جنب مع البروتينات الفيروسية L، VP35، VP30 وNP. وencapsidated على minigenome بواسطة NP، ومن ثم تكرارها وكتب من قبل البروتينات قفيصة منواة أخرى باستخدام إشارات رابطة الدول المستقلة المفعول المحلية في الزعيم ومقطورة، مما أدى إلى النشاط الصحفي الذي يعكس هذين الجانبين من دورة حياة فيروس (الشكل 2). من أجل نمذجة خطوات إضافية من دورة حياة الفيروس، النسخ والتكرار المختصة للفيروسات مثل الجسيمات وقد وضعت أنظمة (trVLP)، والتي تقوم على أنظمة minigenome الكلاسيكية، ولكن ميزة لالتعبير dditional من البروتينات الفيروسية الأخرى VP24، VP40 وGP 1،2 من البلازميدات التعبير 10،11. وجود VP40 يؤدي إلى تشكيل trVLPs التي تتحمل GP 1،2 على سطحها، وتحمل قفيصة منواة التي تحتوي على minigenome في الداخل. هذه trVLPs يمكن استخدامها لتصيب الخلايا المستهدفة، والتي إما أن تكون قد pretransfected مع البلازميدات التعبير عن L، VP35، VP30 وNP، لتسهيل التكرار والنسخ من minigenomes جلبت الى الخلايا المستهدفة ضمن trVLPs 11، أو هي ساذجة الخلايا المستهدفة (أي دون التعبير يحركها بلازميد من فيروس إيبولا البروتينات) 10. هذه النتائج في النشاط الصحفي في الخلايا المستهدفة، وهو ما يعكس تكرار minigenomes في الخلايا المنتجة، والتشكل مهدها من trVLPs، دخولهم إلى الخلايا المستهدفة، و1) في حالة الخلايا المستهدفة pretransfected أيضا مضاعفة الجينوم والنسخ الثانوي ( أي نسخ من البروتينات الفيروسية همزuced في الخلايا المستهدفة) في الخلايا المستهدفة، أو 2) في حالة الخلايا المستهدفة ساذجة أيضا النسخ الأولية (أي النسخ من البروتينات الفيروسية جلبت الى الخلايا المستهدفة ضمن trVLPs) (الشكل 3). الأهم من ذلك، فقط قد تم استخدام هذه النظم في تصميم نموذج لدورة واحدة المعدية، والاعتماد على overexpression من جميع البروتينات الفيروسية، والتي في حالة وVP24 VP40 هو إشكالية خاصة، حيث ثبت أن هذه البروتينات المنظمين سلبية قوية من تكرار الجينوم وعندما overexpressed النسخ من البلازميدات 12،13. علاوة على ذلك، الاستعدادات trVLP المنتجة في هذه النظم تحتوي على نسبة عالية من الجسيمات غير معدية مما يشكل تحديات خطيرة لتحليل الكيمياء الحيوية من trVLPs المعدية 14. من أجل التغلب على هذه المشاكل، وقد وضعنا مؤخرا نظام minigenome tetracistronic أنه بالإضافة إلى الجين المراسل، يحتوي أيضا على الجينات التي تكود للVP40، GP 1،2 وVP24 (الشكل 1). على غرار نظام minigenome monocistronic الكلاسيكية، وهذا النظام يؤدي إلى إنتاج trVLPs التي يمكن ان تصيب الخلايا المستهدفة (الشكل 4) 15. ومع ذلك، وعلى النقيض من نظام minigenome الكلاسيكية، ويتم إنتاج VP40، GP 1،2، وVP24 بعد الجينوم الفيروسي النسخ بدلا من أن overexpressed من البلازميدات. ونتيجة لذلك، حركية ومستويات التعبير عن هذه البروتينات تقليد أكثر من ذلك بكثير عن كثب تلك التي وجدت خلال دورة الحياة الفيروسية، وبالتالي نسبة من الأمراض المعدية إلى trVLPs غير المعدية يزداد حوالي 500 أضعاف في هذا النظام 15. وعلاوة على ذلك، وذلك باستخدام هذا النظام كان من الممكن باستمرار مرور trVLPs التي تحتوي على minigenome tetracistronic، ووضع نماذج دورات المعدية متعددة. على هذا النحو، trVLPs tetracistronic حاليا نظام النمذجة دورة حياة أشمل المتاحة لدراسة فيروس إيبولا البيولوجيا في ظل ظروف BSL2. هنا، ونحن نقدم معلومات مفصلة عن استخدام سو هذا النظام، فضلا عن النتائج المتوقعة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">75cm2 cell culture flask</td>
			<td style="width:157px;">Corning&#160;</td>
			<td style="width:123px;">430641</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">DMEM</td>
			<td style="width:157px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">D6546</td>
			<td>preheat to 37&#176;C prior to use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">FBS</td>
			<td style="width:157px;">Life Technologies</td>
			<td>26140-079</td>
			<td>heat inactivate 30 min @ 56&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:157px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:123px;">25030-081</td>
			<td>100X&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Pen Strep</td>
			<td style="width:157px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:123px;">15070-063</td>
			<td>100X&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:157px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:123px;">25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:83px;width:259px;">PBS</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:239px;">8 g NaCl, 0.2g KCl, 1.44g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4, H2O ad 1 liter; autoclave and store at room temperature&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">6-well plates</td>
			<td style="width:157px;">Costar</td>
			<td style="width:123px;">3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Opti-MEM I</td>
			<td style="width:157px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:123px;">31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Transit LT1</td>
			<td style="width:157px;">Mirus</td>
			<td style="width:123px;">MIR 2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Glo lysis buffer</td>
			<td style="width:157px;">Promega</td>
			<td style="width:123px;">E2661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Renilla Glo luciferase assay system</td>
			<td style="width:157px;">Promega</td>
			<td style="width:123px;">E2720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">96-well assay plate (white)</td>
			<td style="width:157px;">Costar</td>
			<td style="width:123px;">3912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Modulus microplate luminometer</td>
			<td style="width:157px;">Turner Microsystems</td>
			<td style="width:123px;">998-9300</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling the lifecycle of ebola virus under biosafety level 2 conditions with virus-like particles containing tetracistronic minigenomes

تسبب فيروسات الإيبولا النزفية الحادة في البشر والرئيسيات غير البشرية، مع حالة معدلات الوفيات تصل إلى 90٪. لا توجد اللقاحات المعتمدة أو علاجات محددة لهذا المرض التي تسببها هذه الفيروسات، والعمل مع الفيروسات المعدية إيبولا يقتصر على مستوى السلامة الأحيائية 4 مختبرات، مما يحد بشكل كبير من البحوث حول هذه الفيروسات. نظم النمذجة دورة حياة نموذج دورة حياة الفيروس تحت مستوى السلامة الحيوية 2 شروط؛ ومع ذلك، حتى وقت قريب مثل هذه الأنظمة قد اقتصرت على الجوانب الفردية سواء من دورة حياة الفيروس، أو دورة واحدة المعدية. minigenomes Tetracistronic، والتي تتكون من مناطق فيروس إيبولا غير الترميز، الجين المراسل، وثلاثة جينات فيروس إيبولا المشاركة في التشكل، في مهدها، ودخول (VP40، GP 1،2، وVP24)، ويمكن أن تستخدم لإنتاج التكرار والنسخ الجسيمات -competent الفيروسات مثل (trVLPs) التي تحتوي على هذه minigenomes. يمكن لهذه trVLPs تصيب باستمرار الخلايا معربا عن الإيبولابروتينات الفيروس المسؤول عن تكرار الجينوم والنسخ، مما يسمح لنا نموذج بأمان دورات المعدية متعددة تحت مستوى السلامة الحيوية 2 الظروف. الأهم من ذلك، وتستمد مكونات الفيروسية من هذه الأنظمة فقط من فيروس الإيبولا وليس من الفيروسات الأخرى (كما هو، على سبيل المثال، في حالة النظم التي تستخدم الفيروسات pseudotyped) لا overexpressed، وVP40، GP 1،2 و VP24 في هذا النظام ، مما يجعلها مناسبة بشكل مثالي لدراسة التشكل، في مهدها والدخول، على الرغم من الجوانب الأخرى من دورة حياة الفيروس مثل تكرار الجينوم والنسخ ويمكن أيضا أن تكون على غرار مع هذا النظام. وبالتالي، يمثل trVLP فحص tetracistronic نظام النمذجة دورة حياة المتوفرة الأكثر شمولا لفيروسات الإيبولا، ولديه إمكانيات هائلة للاستخدام في التحقيق في البيولوجيا من الفيروسات فيروس إيبولا في المستقبل. هنا، ونحن نقدم معلومات مفصلة عن استخدام هذا النظام، فضلا عن النتائج المتوقعة.

ترنسفكأيشن من 293 خلايا منتجة مع البلازميدات التعبير ترميز فيروس الإيبولا البروتينات قفيصة منواة NP، VP35، VP30، ولام، وminigenome tetracistronic ونتائج البلمرة T7 التبعي في minigenome التكرار والنسخ والنشاط المراسل أن هو كشفها بسهولة في 72 ساعة (الشكل 6 ). الأهم من ذلك أن النشاط احظ مراسل (10 5.6 الوحدات التلألؤ النسبية (RLU)) يتجاوز ذلك من السيطرة السلبية التي حذفت التعبير بلازميد ترميز L من ترنسفكأيشن (10 RLU 3) بأكثر من 2 السجلات. هو الأكثر احتمالا لانخفاض مستوى النشاط لوحظ حتى في غياب L بسبب المروج خفي في البلازميد minigenome. الخلايا المستهدفة المصابين trVLPs من طاف للخلايا منتجة في الواقع إلى حد ما تظهر زيادة مستويات النشاط مراسل بالمقارنة مع خلايا منتجة، وقيم تصل إلى ما بين 10 و 10 6 7 RLUs، اعتمادا على مرور. في المقابل، ثالدجاجة وpassaged طاف خلايا منتجة -l السيطرة على الخلايا المستهدفة (التعبير عن البروتين قفيصة منواة، بما في ذلك L)، والنشاط الصحفي لا يتجاوز ضجيج خلفية luminometer (حوالي 10 RLU 2). وtrVLP فحص tetracistronic يمكن استخدامها لدراسة دورة حياة الفيروسات فيروس إيبولا. على سبيل المثال، والعدوى من 293 الخلايا مع trVLPs يعتمد على وجود عوامل مثل مرفق تيم-1 16، والتي لابد من توفيرها في العابرة في هذه الخلايا. وبالتالي، في trVLP فحص tetracistronic لوحظ انخفاض في النشاط الصحفي في الخلايا المستهدفة من حوالي 100 أضعاف في غياب تيم-1 (الشكل 7A). كما يمكن تقييم دور بروتينات محددة (الفيروسية أو الخلوية) في دورة حياة الفيروس باستخدام تكنولوجيا رني مع هذا النهج. كمثال، رني بوساطة أسفل تنظيم L النتائج إلى انخفاض في النشاط مراسل حوالي 100 أضعاف، الأمر الذي يعكس الدور المركزي للL فيالتكرار والنسخ (الشكل 7B) 7. وعلاوة على ذلك، فمن الممكن التلاعب مباشرة minigenome لتقييم تأثير الطفرات على دورة حياة الفيروس. وكمثال على ذلك، عندما يتم إلغاء VP24-التعبير من minigenome عن طريق إدخال 3 كودونات توقف فورا المصب من كودون بداية، والنشاط في خلايا مراسل منتج لا تتغير بشكل كبير. ومع ذلك، يتم تقليل النشاط الصحفي في الخلايا المستهدفة بنحو 20 أضعاف بعد مرور واحد، و 400 أضعاف بعد ممرين، مما يشير إلى دور VP24 في إنتاج trVLPs المعدية (الشكل 7C) 15. <img alt="الشكل 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52381/52381fig1highres.jpg" width="500" /> يتم إظهار الرقم 1. هيكل جينوم فيروس إيبولا وكذلك minigenomes monocistronic وtetracistronic. المناطق للبروتين فيروس إيبولا الترميز والحمراء (NP،VP35، VP30، وL) والأصفر (وVP40 VP24) أو الأزرق (GP 1،2) صناديق. وتظهر مناطق غير الترميز (NCRS) باللون الأخضر، مع الزعيم ومقطورة المناطق المشار إليها. يشير منخفض والتي كانت تستخدم الفيروسية NCR للانضمام إلى مناطق الترميز. يظهر المنطقة الترميز لمراسل (REP) باللون الأرجواني. <img alt="الشكل 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52381/52381fig2highres.jpg" width="500" /> و transfected الشكل 2. Monocistronic minigenome الفحص. الخلايا مع البلازميدات التعبير عن فيروس إيبولا البروتينات قفيصة منواة (NP، VP35، VP30، L)، وهو minigenome monocistronic (ملغ) والبلمرة T7. وكتب على minigenome في البداية من قبل البلمرة T7 (أ) إلى RNA minigenome unencapsidated في نفس الاتجاه كما الجينوم الفيروسي (vRNA)، والتي يتم بعد ذلك encapsidated بواسطة NP (ب). encapsidated هذا يتم نسخ vRNA عبر RNA minigenome مكملة (كرنا) intermediate (ج)، ثم كتب إلى من mRNAs مراسل (د) التي تم ترجمتها إلى البروتين مراسل (ه). <img alt="الرقم 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52381/52381fig3highres.jpg" width="500" /> الرقم 3. trVLP مقايسة مع minigenome monocistronic. و transfected الخلايا مع البلازميدات التعبير عن مكونات minigenome فحص (الإيبولا البروتينات قفيصة منواة فيروس NP، VP35، VP30، L، وهو minigenome monocistronic والبلمرة T7) وكذلك VP40، GP 1 و 2 و VP24. هذا يؤدي إلى تشكيل trVLPs التي تتضمن nucleocapsids التي تحتوي على minigenome (و). هذه trVLPs يمكن أن تصيب الخلايا المستهدفة (ز)، والتي pretransfected إما مع البلازميدات التعبير عن NP، VP35، VP30، ولام (أعلى)، مما أدى إلى تكرار والنسخ الثانوي (د) مما يؤدي إلى التعبير مراسل (ه)، أو ساذجة الخلايا المستهدفة (القاع)، مما أدى إلى النسخ الأولية من دقيقةigenomes (ح)، مما أدى أيضا إلى التعبير مراسل (ه). <img alt="الرقم 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52381/52381fig4highres.jpg" width="500" /> و transfected الشكل 4. trVLP مقايسة مع minigenome tetracistronic. الخلايا مع البلازميدات التعبير عن فيروس إيبولا البروتينات قفيصة منواة (NP، VP35، VP30، L)، وهو minigenome tetracistronic (ملغ) والبلمرة T7. النسخ الأولي (أ)، encapsidation (ب)، وتكرار الجينوم (ج) والنسخ (د) وكذلك الترجمة (ه) كما يحدث في minigenome فحص monocistronic. ومع ذلك، بالإضافة إلى مراسل مرنا، من mRNAs للVP40، وكتب GP 1،2 و VP24 أيضا من minigenome tetracistronic، مما أدى إلى تشكيل trVLPs (و). هذه trVLPs تصيب الخلايا المستهدفة التي تم pretransfected مع البلازميدات التعبير عن البروتينات قفيصة منواة NP، VP35، VP30 وL، فضلا عن فيروس إيبولا الخلويعامل مرفق تيم-1، مما أدى إلى تكرار الجينوم والنسخ، وإنتاج trVLPs التي يمكن استخدامها لتصيب الخلايا المستهدفة جديدة. <img alt="الرقم 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52381/52381fig5highres.jpg" width="500" /> الشكل 5. توقيت مقايسة trVLP tetracistronic لمدة 3 مقاطع متتالية. الأيام لبذر خلايا (ق)، بنقل العدوى إلى خلايا (ر)، وإصابة الخلايا (ط)، وتغير المتوسط ​​(ج) وحصاد الخلايا وtrVLPs (ح) هي وأشار لمدة ثلاث فقرات متتالية (المشار إليها السهام). <img alt="الرقم 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52381/52381fig6highres.jpg" width="500" /> وقد تم تنفيذ الشكل 6. مستويات النموذجية النشاط مراسل لوحظ في trVLP فحص tetracistronic وtrVLP فحص tetracistronic أكثر من 5 فقرات بعد protocرأ المبينة في هذه المخطوطة. كعنصر تحكم السلبية تم حذف التعبير بلازميد ترميز L (لام) من ترنسفكأيشن من الخلايا المنتجة P0. الخلايا المستهدفة في الممرات P1 إلى P5 و transfected مع البلازميدات التعبير لجميع البروتينات قفيصة منواة، بما في ذلك L. يشار إلى ضوضاء خلفية luminometer كخط متقطع. وتظهر الوسائل والانحرافات المعيارية من 4 مكررات البيولوجية من 3 تجارب مستقلة. <img alt="الرقم 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52381/52381fig7highres.jpg" width="500" /> الرقم 7. تقييم تأثير مختلف العوامل الفيروسية والخلوية على دورة الحياة الفيروسية باستخدام trVLPs tetracistronic. (A) تيم-1 كعامل المرفق. الخلايا المستهدفة التي تم pretransfected مع البلازميدات التعبير ترميز للبروتينات قفيصة منواة ومع أو بدون ترميز البلازميد لتيم-1 (الموصوفة في 15) كانت مصابة تيتtrVLPs racistronic. تم تحديد 72 ساعة العدوى آخر نشاط الصحفي في الخلايا المستهدفة P1. وتظهر الوسائل والانحرافات المعيارية من 4 مكررات البيولوجية من 4 تجارب مستقلة. (B) تأثير رني ضربة قاضية من L على تكرار الجينوم والنسخ. الخلايا المستهدفة التي تم pretransfected مع البلازميدات التعبير عن مكونات قفيصة منواة، تيم-1 و miRNAs الموجهة ضد L (مكافحة L) أو البروتين لا علاقة لها (مكافحة GFP) (الموصوفة في 15) كانت مصابة trVLPs tetracistronic. تم تحديد 72 ساعة العدوى آخر نشاط الصحفي في الخلايا المستهدفة P1. وتظهر الوسائل والانحرافات المعيارية من 5 مكررات البيولوجية من تجارب مستقلة 2. (C) تأثير الطفرات في minigenome على trVLP العدوى. أجري فحص trVLP tetracistronic باستخدام إما من النوع البري minigenome (4cis-WT) أو في minigenome التي أدخلت 3 كودونات توقف فورا بعد كودون بداية VP24، معربا عن إلغاء سو هذا البروتين فقط ولكن إدخال تغيرات طفيفة إلى minigenome في ما يخص طول وتكوين الحمض النووي، والهياكل الثانوية الخ النشاط مراسل في P0، P1 و P2 تم قياس 72 ساعة بعد ترنسفكأيشن / العدوى. وتظهر الوسائل والانحرافات المعيارية من 3 مكررات البيولوجية من 3 تجارب مستقلة. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr height="19"><td height="19" style="height:19px;width:115px;"></td><td style="width:127px;"> خلايا المنتج (P0) </td><td style="width:180px;"> الخلايا المستهدفة (P1 و أعلى) </td></tr><tr height="19"><td height="19" style="height:19px;"> pCAGGS-NP </td><td> 125 </td><td> 125 </td></tr><tr height="19"><td height="19" style="height:19px;"> pCAGGS-VP35 </td><td> 125 </td><td> 125 </td></tr><tr height="19"><td height="19" style="height:19px;"> pCAGGS-VP30 </td><td> 75 </td><td> 75 </td></tr><tr height="19"><td heiGHT = &quot;19&quot; على غرار = &quot;الطول: 19px؛&quot;&gt; pCAGGS-L </td><td> 1،000 </td><td> 1،000 </td></tr><tr height="19"><td height="19" style="height:19px;"> p4cis-vRNA-RLuc </td><td> 250 </td><td> - </td></tr><tr height="19"><td height="19" style="height:19px;"> pCAGGS-T7 </td><td> 250 </td><td> - </td></tr><tr height="19"><td height="19" style="height:19px;"> pCAGGS-Tim1 </td><td> - </td><td> 250 </td></tr></tbody></table> الجدول 1. DNA يرقى لترنسفكأيشن. يظهر مبلغ كل بلازميد اللازمة لترنسفكأيشن من خلايا منتج والهدف في نانوغرام لكل بئر من لوحة 6 جيدا. يتم وصف كل البلازميدات في واط وآخرون 15.

Watch this Scientific Journal Video about Modeling The Lifecycle Of Ebola Virus Under Biosafety Level 2 Conditions With Virus-like Particles Containing Tetracistronic Minigenomes at JoVE.com

Modeling The Lifecycle Of Ebola Virus Under Biosafety Level 2 Conditions With Virus-like Particles Containing Tetracistronic Minigenomes

ويقتصر عمل مع فيروسات الإيبولا المعدية لمستوى السلامة الأحيائية 4 مختبرات. تكرار وفيروس النسخ المختصة مثل الجزيئات التي تحتوي على minigenome Tetracistronic (trVLPs) تمثل نظام نمذجة دورة حياة تسمح لنا نموذج بأمان دورات المعدية متعددة تحت مستوى السلامة الحيوية 2 الظروف، والاعتماد حصرا على مكونات فيروس إيبولا.

نماذج دورة حياة فيروس الايبولا تحت شروط السلامة الأحيائية المستوى 2 مع جزيئات تشبه الفيروسات يحتوي على Tetracistronic Minigenomes

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or ...

modeling-lifecycle-ebola-virus-under-biosafety-level-2-conditions

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

35.9K Views.  National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health.  ويقتصر عمل مع فيروسات الإيبولا المعدية لمستوى السلامة الأحيائية 4 مختبرات. تكرار وفيروس النسخ المختصة مثل الجزيئات التي تحتوي على minigenome Tetracistronic (trVLPs) تمثل نظام نمذجة دورة حياة تسمح لنا نموذج بأمان دورات المعدية متعددة تحت مستوى السلامة ال?...

Video: Modeling The Lifecycle Of Ebola Virus Under Biosafety Level 2 Conditions With Virus-like Particles Containing Tetracistronic Minigenomes

Avian Influenza Surveillance with FTA  Cards: Field Methods, Biosafety, and Transportation Issues Solved

Avian Influenza Viruses (AIVs) infect many mammals, including humans1. These AIVs are diverse in their natural hosts, harboring almost all possible viral subtypes2. Human pandemics of flu originally stem from AIVs3. Many fatal human cases during the H5N1 outbreaks in recent years were reported. Lately, a new AIV related strain swept through the human population, causing the 'swine flu epidemic'4. Although human trading and transportation activity seems to be responsible for the spread of highly pathogenic strains5, dispersal can also partly be attributed to wild birds6, 7. However, the actual reservoir of all AIV strains is wild birds.
In reaction to this and in face of severe commercial losses in the poultry industry, large surveillance programs have been implemented globally to collect information on the ecology of AIVs, and to install early warning systems to detect certain highly pathogenic strains8-12. Traditional virological methods require viruses to be intact and cultivated before analysis. This necessitates strict cold chains with deep freezers and heavy biosafety procedures to be in place during transport. Long-term surveillance is therefore usually restricted to a few field stations close to well equipped laboratories. Remote areas cannot be sampled unless logistically cumbersome procedures are implemented. These problems have been recognised13, 14 and the use of alternative storage and transport strategies investigated (alcohols or guanidine)15-17. Recently, Kraus et al.18 introduced a method to collect, store and transport AIV samples, based on a special filter paper. FTA cards19 preserve RNA on a dry storage basis20 and render pathogens inactive upon contact21. This study showed that FTA cards can be used to detect AIV RNA in reverse-transcription PCR and that the resulting cDNA could be sequenced and virus genes and determined.
In the study of Kraus et al.18 a laboratory isolate of AIV was used, and samples were handled individually. In the extension presented here, faecal samples from wild birds from the duck trap at the Ottenby Bird Observatory (SE Sweden) were tested directly to illustrate the usefulness of the methods under field conditions. Catching of ducks and sample collection by cloacal swabs is demonstrated. The current protocol includes up-scaling of the work flow from single tube handling to a 96-well design. Although less sensitive than the traditional methods, the method of FTA cards provides an excellent supplement to large surveillance schemes. It allows collection and analysis of samples from anywhere in the world, without the need to maintaining a cool chain or safety regulations with respect to shipping of hazardous reagents, such as alcohol or guanidine.

A method to preserve, detect and sequence RNA from Avian Influenza Viruses was validated and extended using natural faecal samples from birds. This technique removes the necessity of maintaining a cool chain and handling of infectious viruses and can be applied in a 96-well high-throughput setup.

الطيور ترصد الأنفلونزا اتفاقية التجارة الحرة مع بطاقات : أساليب الميدانية ، الأحيائية ، وقضايا النقل محلولة

Avian Influenza Viruses (AIVs) infect many mammals, including humans1. These AIVs are diverse in their natural hosts, harboring almost all possible viral ...

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, neutrophils are the first inflammatory cells to migrate to the site of injury. Recruitment of neutrophils to an injury site is a stepwise process that includes first, dilation of blood vessels to increase blood flow; second, microvascular structural changes and escape of plasma proteins from the bloodstream; third, rolling, adhesion and transmigration of the neutrophil across the endothelium; and fourth accumulation of neutrophils at the site of injury2,3. A wide array of in vivo and in vitro methods has evolved to enable the study of these processes4. This method focuses on neutrophil transmigration across human endothelial cells.
One popular method for examining the molecular processes involved in neutrophil transmigration utilizes human neutrophils interacting with primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)5. Neutrophil isolation has been described visually elsewhere6; thus this article will show the method for isolation of HUVEC. Once isolated and grown to confluence, endothelial cells are activated resulting in the upregulation of adhesion and activation molecules. For example, activation of endothelial cells with cytokines like TNF-&alpha; results in increased E-selectin and IL-8 expression7. E-selectin mediates capture and rolling of neutrophils and IL-8 mediates activation and firm adhesion of neutrophils. After adhesion neutrophils transmigrate. Transmigration can occur paracellularly (through endothelial cell junctions) or transcellularly (through the endothelial cell itself). In most cases, these interactions occur under flow conditions found in the vasculature7,8.
The parallel plate flow chamber is a widely used system that mimics the hydrodynamic shear stresses found in vivo and enables the study of neutrophil recruitment under flow condition in vitro9,10. Several companies produce parallel plate flow chambers and each have advantages and disadvantages. If fluorescent imaging is needed, glass or an optically similar polymer needs to be used. Endothelial cells do not grow well on glass.
Here we present an easy and rapid method for phase-contrast, DIC and fluorescent imaging of neutrophil transmigration using a low volume ibidi channel slide made of a polymer that supports the rapid adhesion and growth of human endothelial cells and has optical qualities that are comparable to glass. In this method, endothelial cells were grown and stimulated in an ibidi &mu;slide. Neutrophils were introduced under flow conditions and transmigration was assessed. Fluorescent imaging of the junctions enabled real-time determination of the extent of paracellular versus transcellular transmigration.

This article first describes a procedure for isolating human endothelial cells from umbilical veins and then shows how to use these cells to examine neutrophil transmigration under flow conditions. By using a low-volume flow chamber made from a polymer with the optical characteristics of glass, live-cell fluorescent imaging of rare cell populations is also possible.

عزل خلايا الإنسان الوريد السري غشائي واستخدامها في دراسة التهجير تحت ظروف تدفق العدلات

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs

Mimicking and exploiting virus properties and physicochemical and physical characteristics holds promise to provide solutions to some of the world's most pressing challenges. The sheer range and types of viruses coupled with their intriguing properties potentially give endless opportunities for applications in virus-based technologies. Viruses have the ability to self- assemble into particles with discrete shape and size, specificity of symmetry, polyvalence, and stable properties under a wide range of temperature and pH conditions. Not surprisingly, with such a remarkable range of properties, viruses are proposed for use in biomaterials 9, vaccines 14, 15, electronic materials, chemical tools, and molecular electronic containers4, 5, 10, 11, 16, 18, 12.
In order to utilize viruses in nanotechnology, they must be modified from their natural forms to impart new functions. This challenging process can be performed through several mechanisms including genetic modification of the viral genome and chemically attaching foreign or desired molecules to the virus particle reactive groups 8. The ability to modify a virus primarily depends upon the physiochemical and physical properties of the virus. In addition, the genetic or physiochemical modifications need to be performed without adversely affecting the virus native structure and virus function. Maize rayado fino virus (MRFV) coat proteins self-assemble in Escherichia coli producing stable and empty VLPs that are stabilized by protein-protein interactions and that can be used in virus-based technologies applications 8. VLPs produced in tobacco plants were examined as a scaffold on which a variety of peptides can be covalently displayed 13. Here, we describe the steps to 1) determine which of the solvent-accessible cysteines in a virus capsid are available for modification, and 2) bioconjugate peptides to the modified capsids. By using native or mutationally-inserted amino acid residues and standard coupling technologies, a wide variety of materials have been displayed on the surface of plant viruses such as, Brome mosaic virus 3, Carnation mottle virus 12, Cowpea chlorotic mottle virus 6, Tobacco mosaic virus 17, Turnip yellow mosaic virus 1, and MRFV 13.

Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs

A method to analyze the solvent accessibility of the thiol group of cysteine residues of Maize rayado fino virus (MRFV)-virus-like particles (VLPs) followed by a peptide cross-linking reaction is described. The method takes advantage of the availability of several chemical groups on the surface of the VLPs that can be targets for specific reactions.

تحليل إمكانية الوصول المذيبات من بقايا السيستين على<em&gt; الذرة rayado فينو فيروس</em&gt; الفيروسات مثل الجزيئات التي تنتج في<em&gt; نيكوتيانا benthamiana</em&gt; النباتات والصليب ربط-من الببتيدات لVLPs

Mimicking  and exploiting virus properties and physicochemical and physical  characteristics holds promise to provide solutions to some of  the world's ...

Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 1. Biosafety Level 4 Suit Laboratory Suite Entry and Exit Procedures

Biosafety level 4 (BSL-4) suit laboratories are specifically designed to study high-consequence pathogens for which neither infection prophylaxes nor treatment options exist. The hallmarks of these laboratories are: custom-designed airtight doors, dedicated supply and exhaust airflow systems, a negative-pressure environment, and mandatory use of positive-pressure (&#8220;space&#8221;) suits. The risk for laboratory specialists working with highly pathogenic agents is minimized through rigorous training and adherence to stringent safety protocols and standard operating procedures. Researchers perform the majority of their work in BSL-2 laboratories and switch to BSL-4 suit laboratories when work with a high-consequence pathogen is required. Collaborators and scientists considering BSL-4 projects should be aware of the challenges associated with BSL-4 research both in terms of experimental technical limitations in BSL-4 laboratory space and the increased duration of such experiments. Tasks such as entering and exiting the BSL-4 suit laboratories are considerably more complex and time-consuming compared to BSL-2 and BSL-3 laboratories. The focus of this particular article is to address basic biosafety concerns and describe the entrance and exit procedures for the BSL-4 laboratory at the NIH/NIAID Integrated Research Facility at Fort Detrick. Such procedures include checking external systems that support the BSL-4 laboratory, and inspecting and donning positive-pressure suits, entering the laboratory, moving through air pressure-resistant doors, and connecting to air-supply hoses. We will also discuss moving within and exiting the BSL-4 suit laboratories, including using the chemical shower and removing and storing positive-pressure suits.

Safety Precautions and Operating Procedures in an ABSL-4 Laboratory: 1. Biosafety Level 4 Suit Laboratory Suite Entry and Exit Procedures

Although researchers are generally knowledgeable about procedures and safety precautions required for biosafety level 1 or 2 (BSL-1/2) experiments, they may not be familiar with experimental procedures in BSL-4 suit laboratories. This article provides a detailed visual demonstration of BSL-4 suit laboratory systems check, laboratory entry, movement, and exit procedures.

احتياطات السلامة وإجراءات التشغيل في (A) BSL-4 المختبر: 1. سلامة الأحيائية مستوى 4 البدلة مختبر جناح دخول وخروج إجراءات

Biosafety level 4 (BSL-4) suit laboratories are specifically designed to study high-consequence pathogens for which neither infection prophylaxes nor ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the shear stress of flowing blood.
To identify the bacterial and host factors that contribute to vascular adhesion of microorganisms, appropriate models that study these interactions under physiological shear conditions are needed. Here, we describe an in vitro flow chamber model that allows to investigate bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells, and an intravital microscopy model that was developed to directly visualize the initial adhesion of bacteria to the splanchnic circulation in vivo. These methods can be used to identify the bacterial and host factors required for the adhesion of bacteria under flow. We illustrate the relevance of shear stress and the role of von Willebrand factor for the adhesion of Staphylococcus aureus using both the in vitro and in vivo model.

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

في المختبر والمجراة نموذج لدراسة التصاق البكتيريا إلى سفينة ستريت تحت ظروف التدفق

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions of proteins with other macromolecules in a complex sample is called co-immunoprecipitation. The described co-immunoprecipitation protocol allows to demonstrate and further investigate the interaction between the antiviral myxovirus resistance protein 1 (Mx1) and one of its viral targets, the influenza A virus nucleoprotein (NP). The protocol starts with transfected mammalian cells, but it is also possible to use influenza A virus infected cells as starting material. After cell lysis, the viral NP protein is pulled-down with a specific antibody and the resulting immune-complexes are precipitated with protein G beads. The successful pull-down of NP and the co-immunoprecipitation of the antiviral Mx1 protein are subsequently revealed by western blotting. A prerequisite for successful co-immunoprecipitation of Mx1 with NP is the presence of N-ethylmaleimide (NEM) in the cell lysis buffer. NEM alkylates free thiol groups. Presumably this reaction stabilizes the weak and/or transient NP&#8211;Mx1 interaction by preserving a specific conformation of Mx1, its viral target or an unknown third component. An important limitation of co-immunoprecipitation experiments is the inadvertent pull-down of contaminating proteins, caused by nonspecific binding of proteins to the protein G beads or antibodies. Therefore, it is very important to include control settings to exclude false positive results. The described co-immunoprecipitation protocol can be used to study the interaction of Mx proteins from different vertebrate species with viral proteins, any pair of proteins, or of a protein with other macromolecules. The beneficial role of NEM to stabilize weak and/or transient interactions needs to be tested for each interaction pair individually.

This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.

شارك في مناعي من البروتين ماوس MX1 مع الأنفلونزا من الفيروسات البروتين النووي

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

تحليل الخلايا الليمفاوية التسرب باستخدام<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج من الدم في الدماغ الإنسان الحاجز

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting

The protocol aims to generate coronavirus (CoV) spike (S) fusion protein pseudotyped particles with a murine leukemia virus (MLV) core and luciferase reporter, using a simple transfection procedure of the widely available HEK-293T cell line. Once formed and released from producer cells, these pseudovirions incorporate a luciferase reporter gene. Since they only contain the heterologous coronavirus spike protein on their surface, the particles behave like their native coronavirus counterparts for entry steps. As such, they are the excellent surrogates of native virions for studying viral entry into host cells. Upon successful entry and infection into target cells, the luciferase reporter gets integrated into the host cell genome and is expressed. Using a simple luciferase assay, transduced cells can be easily quantified. An important advantage of the procedure is that it can be performed in biosafety level 2 (BSL-2) facilities instead of BSL-3 facilities required for work with highly pathogenic coronaviruses such as Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV) and severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV). Another benefit comes from its versatility as it can be applied to envelope proteins belonging to all three classes of viral fusion proteins, such as the class I influenza hemagglutinin (HA) and Ebola virus glycoprotein (GP), the class II Semliki forest virus E1 protein, or the class III vesicular stomatitis virus G glycoprotein. A limitation of the methodology is that it can only recapitulate virus entry steps mediated by the envelope protein being investigated. For studying other viral life cycle steps, other methods are required. Examples of the many applications these pseudotype particles can be used in include investigation of host cell susceptibility and tropism and testing the effects of virus entry inhibitors to dissect viral entry pathways used.

Here, we present a protocol to generate pseudotyped particles in a BSL-2 setting incorporating the spike protein of the highly pathogenic viruses Middle East respiratory syndrome and severe acute respiratory syndrome coronaviruses. These pseudotyped particles contain a luciferase reporter gene allowing quantification of virus entry into target host cells.

إنتاج جسيمات بسيودوتيبيد لدراسة كورونافيروس شديد العدوى في إعداد 2 مستوى السلامة الأحيائية

The protocol aims to generate coronavirus (CoV) spike (S) fusion protein pseudotyped particles with a murine leukemia virus (MLV) core and luciferase ...

Application of Consistent Massage-Like Perturbations on Mouse Calves and Monitoring the Resulting Intramuscular Pressure Changes

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of massage on skeletal muscles, the molecular mechanisms behind are poorly understood. We have recently developed a simple device to apply local cyclical compression (LCC), which can generate intramuscular pressure waves with varying amplitudes. Using this device, we have demonstrated that LCC modulates inflammatory responses of macrophages in situ and alleviates immobilization-induced muscle atrophy. Here, we describe protocols for the optimization and application of LCC as a massage-like intervention against immobilization-induced inflammation and atrophy of skeletal muscles of mouse hindlimbs. The protocol that we have developed can be useful for investigating the mechanism underlying beneficial effects of physical exercise and massage. Our experimental system provides a prototype of the analytical approach to elucidate the mechanical regulation of muscle homeostasis, although further development needs to be made for more comprehensive studies.

Here we describe the protocols for applying defined mechanical loads to mouse calves and for monitoring the concomitant intramuscular pressure changes. The experimental systems that we have developed can be useful for investigating the mechanism behind the beneficial effects of physical exercise and massage.

تطبيق اضطرابات متناسقة تشبه التدليك على عجول الماوس ومراقبة التغيرات الناتجة عن الضغط العضلي العضلي

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy for the Replacement, Reduction, and Refinement of the laboratory animal testing. The development of in vitro approaches is recommended at the WHO and European levels as alternatives to the NIH test for evaluating the rabies vaccine potency. At the surface of the rabies virus (RABV) particle, trimers of glycoprotein constitute the major immunogen to induce Viral Neutralizing Antibodies (VNAbs). An ELISA test, where Neutralizing Monoclonal Antibodies (mAb-D1) recognize the trimeric form of the glycoprotein, has been developed to determine the contents of the native folded trimeric glycoprotein along with the production of the vaccine batches. This in vitro potency test demonstrated a good concordance with the NIH test and has been found suitable in collaborative trials by RABV vaccine manufacturers and OMCLs. Avoidance of animal use is an achievable objective in the near future.
The method presented is based on an indirect ELISA sandwich immunocapture using the mAb-D1 which recognizes the antigenic sites III (aa 330 to 338) of the trimeric RABV glycoprotein, i.e., the immunogenic RABV antigen. mAb-D1 is used for both coating and detection of glycoprotein trimers present in the vaccine batch. Since the epitope is recognized because of its conformational properties, the potentially denatured glycoprotein (less immunogenic) cannot be captured and detected by the mAb-D1. The vaccine to be tested is incubated in a plate sensitized with the mAb-D1. Bound trimeric RABV glycoproteins are identified by adding the mAb-D1 again, labeled with peroxidase and then revealed in the presence of substrate and chromogen. Comparison of the absorbance measured for the tested vaccine and the reference vaccine allows for the determination of the immunogenic glycoprotein content.

Here we describe an indirect ELISA sandwich immunocapture to determine the immunogenic glycoprotein contents in rabies vaccines. This test uses a neutralizing Monoclonal Antibody (mAb-D1) recognizing glycoprotein trimers. It is an alternative to the in vivo NIH test to follow the consistency of vaccine potency during production.

في اختبار فيترو ELISA لتقييم قوة لقاح داء الكلب

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...