1。从烟草植物的病毒接种，病毒颗粒的纯化<ol><li>生产马铃薯X病毒 （PVX）载体质粒携带的上限从T7 RNA的转录：MRFV野生型（WT）和半胱氨酸突变外壳蛋白基因（CP）12，使用Ambion公司的的T7-mMessage mMachine。 </li><li>对于每个T7转录反应，接种两个完全展开的叶片，N.本生烟用10μl反应孵育10天的植物在温室中，在湿度60％，16小时的光（25,000-30,000勒克斯），在25℃，在20℃下8小时黑暗</li><li>收割机吨本生叶病毒感染后10天接种点数（dpi），衡量植物组织（50克），置于冰上。 </li><li>均质在掺混机中在存在下，100毫升的冷冻溶液的0.5M的Na-柠檬酸盐缓冲液，pH值5.5（用2毫升缓冲液每克植物组织）中的植物材料。 </li><li>过滤匀浆通过3层cheeseclOTH和以27,000 xg离心30分钟，通过离心澄清。将上清液转移到一个冷冻量筒，测量体积，然后将其转移到冷冻无菌烧杯。弃沉淀。 </li><li>处理该上清液，加入10％聚乙二醇8000（PEG 8000），在4℃下搅拌15分钟，并孵育45分钟，在4℃沉淀的病毒样颗粒（VLPs）-PEG矩阵。 </li><li>离心样品在4℃下以27,000 xg离心20分钟，除去上清液。 </li><li>加入8毫升的0.05M的Na-柠檬酸盐缓冲液，pH 5.5，含有2％的Triton X-100处理该沉淀。涡流离心管以及释放颗粒。颗粒和缓冲器传输冷藏的无菌烧杯中。冲洗管，立即用2毫升的相同的缓冲液中，并添加至烧杯中。搅拌的悬浮液在4℃，直到颗粒被溶解（通常为1小时）。 </li><li>澄清，通过离心分离，以27,000 xg离心5分钟，弃沉淀，和process通过离心的上清液在140,000 xg离心2小时，在4℃下</li><li>将沉淀重悬于1毫升0.05M的钠 - 柠檬酸盐缓冲液，pH值为5.5，并在0.05M的Na-柠檬酸盐缓冲液，pH值5.5的10-40％的蔗糖梯度的悬浮液放置在顶部。 </li><li> 3小时梯度离心140000 XG在4°C。 </li><li>照亮一盏灯的离​​心管的顶部，并从该管的顶部收集的光散射的上部频带在4厘米，稀释的0.05M的Na-柠檬酸盐缓冲液，pH值5.5，和离心机在140,000 xg离心3小时，在4 °C。 </li><li>将沉淀重悬于0.5ml的无菌水和存储在4℃达6个月。 </li><li>执行Bradford蛋白测定，定量的病毒样颗粒浓度。的产率是在1和3之间的VLPs微克/克植物组织。 </li></ol> 2。荧光素-5 - 马来酰亚胺标记反应的VLPs <ol><li>准备1mM溶液的荧光素-5 - 马来酰亚胺（427.37克/摩尔）在50mM钠phosphatë缓冲液，pH7.0，1mM EDTA中。混合使用的旋涡，，验证完全溶解。光用铝箔保护管。 </li><li>添加到在步骤1中，混合的VLPs产生荧光素-5 - 马来酰亚胺。巯基的摩尔量，使用了25倍摩尔过量的荧光素-5 - 马来酰亚胺。一般来说，使用的浓度为1μg/μl和荧光素-5 - 马来酰亚胺的溶液的60微升30微升的VLPs产生可接受的结果。 </li><li>在4℃下孵育2小时，在室温或过夜反应</li><li>终止该反应通过添加二硫苏糖醇（DTT）至终浓度为50mM。 </li><li>移除未反应的荧光素使用脱盐离心柱（赛默飞世尔科技公司，罗克福德IL），并在室温下以1,500×g离心2分钟离心。 </li><li>对于SDS-PAGE分析，添加到每个反应的10μl的10微升的2×Laemmli样品缓冲液的SDS-PAGE。标记蛋白在4℃下避光保存长达一个月或在单次使用的等分试样在-20℃下，长达3个月。 </li></ol> 3。标记反应和生物素掺入测定<ol><li>使用脱盐离心柱（赛默飞世尔科技公司，罗克福德IL）进行缓冲液交换，从水向磷酸盐缓冲盐水（PBS），pH值为7.0，在步骤1中产生的病毒样颗粒。 </li><li>准备的马来酰亚胺-PEG2-生物素的20mM原液，通过加入190μl的PBS在No-称量马来酰亚胺-PEG2-生物素和混合通过移液向上和向下。 </li><li>马来酰亚胺-PEG2-生物素到的VLPs和组合。使用10倍摩尔过量的试剂的VLPs解决方案≤2毫克/毫升。 </li><li>温育在室温下反应4小时。 </li><li>除去非反应的马来酰亚胺-PEG2-生物素使用脱盐离心柱（赛默飞世尔科技公司，罗克福德IL），并在室温下以1,500×g离心2分钟离心。 </li><li>确定摩尔每摩尔生物素的使用，皮尔斯生物素定量试剂盒（Thermo Scientific的）和FO的VLPsllowing制造商的说明。 </li></ol> 4。交联的半胱氨酸2 - 的VLPs和F肽<ol><li>在下面的步骤中使用的VLPs导致可用的半胱氨酸残基进行交联，在步骤2（半胱氨酸2 - 的VLPs）。准备一个新的交联的原液（28.63毫摩尔）在680微升二甲亚砜中溶解10mg的NHS-PEG4-马来酰亚胺交联剂。 </li><li>溶解（F）的一个17个氨基酸长的的肽（LLPNMOKDKEACAKAPL）在50μl的共轭缓冲液（1×PBS，pH值7.2，1mM EDTA）中的浓度为0.1mM。 </li><li>将4微升交联剂添加到50微升的溶解的肽（蛋白质-NH 2）在1mM的最终浓度（这是10倍摩尔过量的肽溶液的0.1 mM的）。 </li><li>在4℃下孵育2小时的反应</li><li>使用脱盐柱（赛默飞世尔科技公司，罗克福德IL）与缀合缓冲液（1×PBS，pH值7.2，1mM EDTA）中，通过离心平衡在1,500 xg离心纯化的交联的肽在室温下的1分钟。 </li><li>设置结合的VLPs（蛋白质-SH）和交联的肽（蛋白质-NH 2）的摩尔比确定的硫醇的数量和活化胺参与的反应和VLPs和肽之间的分子量的差异的反应混合物。 </li><li>在4℃下孵育反应混合物在室温下搅拌2小时</li><li> Western blot分析，混合产生的共轭产品1:1 Laemmli缓冲液，煮沸10分钟，并进行SDS-PAGE上一个预制10-20％Tris-甘氨酸凝胶（Invitrogen公司），电泳到硝酸纤维素膜（Invitrogen公司）。阻止膜，用1×PBS，pH值为7.2，含有0.05％Tween-20的PBS（PBS-吐温）和5％脱脂奶粉和探头，然后由相应的磷酸酶标记的二次抗体的肽特异性抗体。 </li></ol>

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提到在出版的商业产品的商品名称是专为提供特定信息的目的，并不意味着美国农业部的推荐或认可者。

这里介绍的方法，使一个非常敏感的和快速的分析本植物生产的VLPs的表面上，以及对其他蛋白复合物的反应性半胱氨酸。马来酰亚胺是硫醇的特定的试剂，与自由的含巯基的分子反应以形成稳定的硫醚键。此方法绘制的马来酰亚胺与巯基反应，不参与与其它氨基酸的相互作用的特异性。保的天然结构的VLPs在整个过程中是非常重要的。在描述的应用程序中，反应是在非变性条件下进行，并在pH为7?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 的试剂的名称 </td><td> 公司 </td><td> 目录号 </td><td> 评论 </td></tr><tr><td>薄壁，超清晰的管</td><td>贝克曼</td><td> 344059 </td><td></td></tr><tr><td> mMESSAGE mMACHINE T7套装</td><td>生活Tecnologies </td><td> AM1344M </td><td></td></tr><tr><td>荧光素-5 - 马来酰亚胺</td><td>赛默飞世尔科技生命科技</td><td> 46130 F150 </td><td> 46130是为了替代F150 </td></tr><tr><td>皮尔斯生物素定量试剂盒</td><td> Thermo Scientific的</td><td> 28005 </td><td></td></tr><tr><td> EZ-Link的马来酰亚胺-PEG2-生物素，称格式</td><td> Thermo Scientific的</td><td> 21901 </td><td></td></tr><tr><td> SM（PEG）N交联剂</td><td> Thermo Scientific的</td><td> 22107 </td><td></td></tr><tr><td> 10-20％Tris-甘氨酸凝胶</td><td> Invitrogen公司</td><td> EC61352 </td><td></td></tr><tr><td> Laemmli缓冲液</td><td> Bio-Rad公司</td><td> 1610737 </td><td></td></tr><tr><td>三甘氨酸SDS电泳缓冲液</td><td> Invitrogen公司</td><td> LC2675 </td><td></td></tr><tr><td>三甘氨酸传输缓冲区</td><td> Invitrogen公司</td><td> LC3675 </td><td></td></tr><tr><td>硝酸纤维素膜滤纸三明治</td><td> Invitrogen公司</td><td> LC2001 </td><td></td></tr><tr><td>磷酸酶标记的亲和纯化的兔IgG抗体</td><td> Kirkegaard和佩里实验室</td><td> 0751516 </td><td></td></tr><tr><td> NBT / BCIP显磷酸酶底物</td><td> Kirkegaard和佩里实验室</td><td> 508107 </td><td></td></tr></tbody></table>

analysis of the solvent accessibility of cysteine residues on maize rayado fino virus virus-like particles produced in nicotiana benthamiana plants and cross-linking of peptides to vlps

病毒特性和物理化学和物理特性的模仿和开发持有世界上一些最紧迫的挑战提供解决方案的承诺。前所未有的范围和种类，加上有趣的特性的病毒可能给病毒为基础的技术的应用带来无穷的机遇。病毒有标注自组装成离散形状和大小，对称的特异性，多价，并稳定的特性在宽范围的温度和pH条件下的颗粒。毫不奇怪的是，这样一个显着的性能范围，病毒被建议使用的生物材料，疫苗，14，15，电子化学材料，工具和分子电子容器4，5，10，11，16，18，12。 为了利用纳米技术的病毒，他们必须修改其自然的形式注入新的功能。这一具有挑战性的公关ocess可以通过几种机制，包括遗传修饰的病毒基因组和化学外国或期望的分子附着到病毒颗粒的反应性基团8执行。修改病毒的能力主要取决于病毒的理化性质和物理性质。此外，在遗传或理化修改需要被执行，而不会不利地影响该病毒的天然结构和病毒的功能。 玉米rayado菲诺的病毒 （MRFV）外壳蛋白的自组装生产稳定和空的病毒样颗粒是稳定的蛋白质-蛋白质在大肠杆菌中的相互作用，这可用于在病毒为基础的技术的应用程序8。在烟草植物中产生的VLPs检查作为支架的多种肽可以通过共价键显示13。这里，我们描述的步骤1）确定的溶剂可在病毒衣壳的半胱氨酸可用于修饰的BIOCONJUGATE肽的阳离子，和2）的变形的衣壳。通过使用天然的或突变体插入的氨基酸残基和标准耦合技术，有各种各样的材料被植物如， 雀麦花叶病毒 3， 康乃馨斑驳病毒 12， 豇豆褪绿斑驳病毒 6， 烟草花叶病毒的表面上显示病毒 17， 芜菁黄花叶病毒 ，和MRFV 13。

瞬时表达的突变体MRFV的外壳蛋白（CP）基因N.在PVX基于矢量产生的VLPs benthamiana植物是图1中描述。的改性MRFV外壳蛋白基因，通过PCR扩增，然后放置在PVX基于的矢量，pP2C2S 2，（D. Baulcombe，塞恩斯伯里实验室，英格兰诺里奇礼物）的重复的亚基因组的CP启动子的转录控制下。体外 RNA转录产生的RNA转录物，然后用于接种N. benthamiana植物。在受感染的植物（...

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Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs

的方法来分析半胱氨酸残基的巯基的溶剂可及<em&gt;玉米rayado菲诺病毒</em&gt;（MRFV） - 病毒样颗粒（VLPs）随后的肽交联反应的说明。的方法，利用几个化学基团的表面上的，可以是特定的反应，目标的病毒样颗粒的可用性。

半胱氨酸残基的溶剂可及性分析<em&gt;玉米rayado菲诺病毒</em病毒样颗粒<em&gt;烟草</em植物和交联的肽类病毒颗粒

Mimicking  and exploiting virus properties and physicochemical and physical  characteristics holds promise to provide solutions to some of  the world's ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs

11.0K 次观看.  Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture. 的方法来分析半胱氨酸残基的巯基的溶剂可及玉米rayado菲诺病毒（MRFV） - 病毒样颗粒（VLPs）随后的肽交联反应的说明。的方法，利用几个化学基团的表面上的，可以是特定的反应，目标的病毒样颗粒的可用性。

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