نود أن نشكر أعضاء المختبر Skok، وخاصة سوزانا هيويت، لإجراء مناقشات وتعليقات. ويدعم هذا العمل من قبل المعهد الوطني للصحة منح R01GM086852، RC1CA145746 (JAS). JAS هو سرطان الدم وسرطان الغدد الليمفاوية عالم المجتمع. JC هو زميل معهد [إيرفينغتون] من معهد أبحاث السرطان. ويدعم MM من قبل الوطنية للعلوم منحة التعليم مؤسسة دراسات عليا التكاملية والبحوث التدريبية (NSF IGERT 0333389).

1. DNA وصفها دقق مع Fluorophores: نيك ترجمة (~ 6 ساعة) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن استخدام DNA نظيفة BAC (الإعدادية التي أعدتها-ماكسي) أو البلازميدات أو المنتجات PCR، كل معلق في H 2 O، لوضع العلامات. لاحظ أن إشارة قوية FISH، يجب تمتد تحقيقات لا يقل عن 10 كيلو بايت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان DNA في ريبونوكلياز A لمدة 30 دقيقة عند 37 ° C (يتم سرد كافة الكواشف في الجدول 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان رد فعل الترجمة لمدة 2 ساعة نيك عند 16 ° C (انظر الجدولين 2 و 3). ويمكن استخدام الطرق البديلة لوضع العلامات المباشر (على سبيل المثال: العلامة FISH، إينفيتروجن). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعطيل رد الفعل لمدة ساعة عند -80 درجة مئوية أو بين عشية وضحاها في -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد حجم التحقيق على هلام الاغاروز 2٪. يجب أن تكون مسحة بين 100 و BP 1،000، مع الأغلبية في حوالي 300-500 بي بي (لاحظ أن مسحة من تحقيقات-Cy5 غير مرئي). إذا لم يتم هضم ما يكفي من الحمض النووي أكثر من ذلك، وأنا بول DNAيمكن أن تضاف الدناز الأول للتفاعل وحضنت لمدة ساعة في أكثر C. ° 16 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنقية تحقيقات على 0،025 ملم في اثنين من المرشحات الأكواب لتر مليئة H 2 0 لمدة ساعة في الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة عوامل عرقلة للتحقيقات على النحو التالي: 10 ميكروغرام من الحمض النووي-1 كوت، 10 ميكروغرام من الحمض النووي Hybloc و 100 ميكروغرام من الحيوانات المنوية السلمون لمدة 10 ميكروغرام من الحمض النووي تحقيقات. تحقيقات DNA مخزن في -20 ° C. </li></ol> 2. التحقيق الأمطار / تمسخ / قبل الصلب-(HR 3-4) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويستخدم بين 0.3 ميكروغرام و 1 ميكروغرام من الحمض النووي في التحقيق ساترة. تحقيقات مزيج بنسبة 0.1 حجم NAAC 3M (الرقم الهيدروجيني 5.2) و 2.5 وحدات التخزين من الإيثانول بنسبة 100٪، لمدة ساعة احتضان -80 درجة مئوية في ليلة وضحاها أو في -20 درجة مئوية، وتدور إلى أسفل في 13000 دورة في الدقيقة في 4 لمدة 30 دقيقة C °. علما أنه يجوز تعديل كمية DNA التحقيق اعتمادا على نوعية الحمض النووي ومنطقة النووية من التهجين. قد طرق بديلة لوضع العلامات المباشرة تسمح باستخدام كميات مخفضة منالتحقيق. للكشف عن إشارات متعددة FISH DNA على شريحة واحدة، يمكن عجل تحقيقات مختلفة معا (ما عدا تحقيقات التي لا ينبغي أن يكون قبل صلب، مثل تكرار تسلسل). ويمكن أيضا للتحقيقات أجريت تجارب عدة في الوقت نفسه أن عجلت معا. وينبغي أن الكريات الملونة طفيفة وفقا لfluorophores المستخدمة (إذا عجلت كميات صغيرة من تحقيقات، وبيليه قد لا تكون مرئية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الكريات الجافة و resuspend لهم في 15 ميكرولتر العازلة التهجين (انظر الجدول 4) في ساترة مع اهتزاز (باستخدام thermomixer إيبندورف) في الظلام في 37-45 ° C (حوالي 20 دقيقة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تفسد تحقيقات لمدة 5 دقائق في 75-95 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل يصلب تحقيقات في 37 ° C لمدة 30-60 دقيقة. ويمكن تعديل طول الصلب قبل تبعا لدرجة تعقيد وجودة تحقيقات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق لتحقيقات التهجين بين عشية وضحاها لcoverslips (انظر القسم 3). </li></ol> 3. 3الأبعاد FISH DNA - اليوم الأول (~ 3 ساعة) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتتركز الخلايا غير ملتصقة في كمية صغيرة من 1X PBS (2X10 ~ 5 خلايا في 5-10 ميكرولتر 1X PBS في ساترة) والتي ألقيت على مركز ساترة بولي-L-يسين المغلفة. وينبغي مثقف الخلايا الملتصقة على coverslips مدة لا تقل عن 24 ساعة (~ التقاء 70٪) (قد تكون مغلفة coverslips بنسبة 0.1٪ الجيلاتين). توضع coverslips ملم مربع 18x18 إلى 24-24 في 6 لوحات جيدا، وطوال البروتوكول، واستخدام اثنين مل من كل حل لكل بئر (يمكن وضعها بدلا من الجولة coverslips ملم 1.5 في لوحات 12/24-well). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح الخلايا في بارافورمالدهيد 2٪ / 1X PBS، ودرجة الحموضة 7-7،4، لمدة 10 دقيقة في RT (يمكن aliquoted PFA 4٪ أسهم وتخزينها في -20 درجة مئوية). ويمكن شراء بارافورمالدهيد في حل (16٪)، أو يمكن إعداد حلول 4٪ من الأسهم مسحوق / حبيبات. يذوب مسحوق بارافورمالدهيد في برنامج تلفزيوني 1X في&gt; 60 ° C (يمكن زيادة درجة الحموضة إلى 8-9 لتسهيل الحل)، إلى أسفل المبرد على الجليد، وضبطإد لدرجة الحموضة 7-7،4 وتصفيتها، aliquoted في الصقور وتخزينها في -20 لأسابيع ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد ثلاثة يشطف في 1X PBS، permeabilize الخلايا في المثلج الباردة 0.4٪ تريتون X-100-PBS / 1X لمدة 5 دقائق على الجليد. ويمكن تعديل طول permeabilization تبعا لنوع الخلية NB: إذا اجتمع مع FISH DNA المناعي، ويجب أن يتم تنفيذ المناعية في هذه المرحلة (انظر القسم 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد ثلاثة يشطف في 1X PBS، الخلايا احتضان بنسبة 0.1 ميكروغرام / ميكرولتر ريبونوكلياز A PBS 1X في لمدة ساعة عند 37 ° C. توضع Coverslips الخلية على الجانب السلبي انخفاضا من 100 ميكرولتر من الحل على parafilm أو شريحة في غرفة رطبة. ثم يتم إزالة Coverslips بعناية مع ملقط. إذا واجهت أي مقاومة، ينبغي غمرت مع PBS 1X coverslips من أجل تجنب إتلاف الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد ثلاثة يشطف في 1X PBS، permeabilize الخلايا في المثلج الباردة 0.7٪ تريتون X-M-100 حمض الهيدروكلوريك / 0.1 لمدة 10 دقيقة على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يشطف بعد ثلاث طن 1X PBS، الخلايا تفسد في حمض الهيدروكلوريك 1.9 متر لمدة 30 دقيقة في RT. بالتناوب، يمكن التشويه والتحريف الخلايا في SSC الفورماميد / 2X 50٪ في 75-80 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 30 دقيقة. لاحظ أن طول التهجين (ودرجة الحرارة) قد يكون الأمثل اعتمادا على نوع الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد ثلاثة يشطف في برنامج تلفزيوني 1X الجليد الباردة، هجن الخلايا مع تحقيقات ليلة وضحاها في 37 درجة مئوية في غرفة مظلمة ورطبة. توضع Coverslips الخلية على الجانب السلبي انخفاضا من 15 ميكرولتر من التحقيق على شريحة، ومختومة مع الاسمنت والمطاط. </li></ol> 4. الأبعاد 3-المناعي-FISH - اليوم الأول (~ 6-7 ساعة) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وبالنسبة للأسماك المناعي / DNA مجتمعة، ينبغي أن يؤديها المناعية تلطيخ بعد permeabilization 0.4٪ تريتون في-X-100 (الخطوة 3.3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا في عرقلة الحل لمدة 30 دقيقة في RT (2.5٪ مصل الألبومين البقري (BSA)، و 10٪ مصل الماعز العادي، 0.1٪ توين-20). يتم تصفية حل حظر، aliquoted في Eppendorfs 1.5 مل وتخزينها لمonths في -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان خلايا مع الأجسام المضادة الأولية التي أثيرت ضد البروتين أو تعديل هيستون في المصالح مخففة في حل حظر، لمدة ساعة عند RT في غرفة رطبة. هنا نعرض مثال على الأجسام المضادة ضد فسفرته 139-سيرين من H2AX (γ-H2AX، ميليبور، انظر الجدول 5 للتفاصيل). توضع Coverslips الخلية على الجانب السلبي انخفاضا من 100 ميكرولتر من الحل على parafilm أو شريحة في غرفة رطبة. ثم يتم إزالة Coverslips بعناية مع ملقط (1X PBS غمرت مع إذا لزم الأمر). ملاحظة أنه يجوز تعديل تخفيف وطول الحضانة تبعا لنوعية الأجسام المضادة والخلايا أنواع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا في 0.2٪ BSA / 0.1٪ توين-20 / 1X PBS، ثلاث مرات في 5 دقائق RT مع اهتزاز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان خلايا الجسم المضاد مع fluorophore، مترافق المناسبة الثانوية مخففة في عرقلة الحل لمدة ساعة عند RT في غرفة مظلمة ورطبة. هنا نعرض مثالا للكشف معالثانوية الماعز المضادة للماوس الأجسام المضادة (اليكسا فلور 488 أو 555، إينفيتروجن، انظر الجدول 5 للتفاصيل). ويمكن أيضا ناشبة، مترافق الأجسام المضادة الثانوية (البيوتين، digoxigenin، الخ) يمكن استخدامها. في هذه الحالة، يمكن إجراء خطوة إضافية للكشف المناسب (streptavidin، ومكافحة الحفر، الخ) سواء قبل أو بعد التهجين الحمض النووي FISH أكثر من الليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف الخلايا في 0.1٪ توين-20 / 1X PBS، ثلاث مرات في 5 دقائق RT مع اهتزاز في الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الإصلاح الخلايا في بارافورمالدهيد 2٪ / 1X PBS لمدة 10 دقيقة في RT في الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تواصل FISH DNA على النحو الوارد أعلاه من الحضانة في ريبونوكلياز A (الخطوة 3.4). </li></ol> 5. الأبعاد 3-DNA FISH / المناعي FISH - اليوم الثاني (~ 2 ساعة) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بعناية الاسمنت والمطاط، وcoverslips الفيضانات مع SSC 2X، وإزالة بعناية مع ملقط ووضعها في الآبار التي تحتوي على حل الغسيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا في SSC 2X لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في الظلام مع اهتزاز.</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا في SSC 2X لمدة 30 دقيقة في RT في الظلام مع اهتزاز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا في 1X SSC لمدة 30 دقيقة في RT في الظلام مع اهتزاز لاحظ أنه في حالة تمسخ مع الفورماميد، يجب أن يتم استبدال يغسل بما يلي:. يغسل يغسل 3 في الفورماميد / 2X SSC و3 50٪ في SSC 2X، 5 دقيقة لكل منها، في 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل الخلايا في إطالة متوسط ​​تصاعد الذهب تحتوي على 1.5 ميكروغرام / مل دابي (4،6-diamidino-2-phenylindole) لcounterstaining من DNA الكلي. توضع Coverslips الخلية على الجانب السلبي تراجع من 10-15 ميكرولتر من تصاعد المتوسطة على شريحة ومختومة مع طلاء الأظافر. يتم الاحتفاظ الشرائح لعدة أشهر في -20 ° C. </li></ol> 6. 3D المجهر والتحليل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن الحصول على صور 3D مع أنظمة المجهر مختلفة. في تجاربنا، يتم جمع الأجزاء البصرية بنسبة 0.3 ميكرون فصل على نظام SP5 ايكا مبائر AOBS (صوتية الحزمة الضوئية الفاصل). لاحظ أن الفصل بين البصريويمكن تعديل الطائرات L تبعا لنوع من التحليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن تحليل الصور 3D باستخدام مداخن البرامج المختلفة والأدوات. نحن استخدام البرنامج J صورة لتقييم قياسات المسافة بين مواضع الاهتمام وتحليل أنواع مختلفة من رابطة مواضع في المصالح مع شبه حجرات النووية أو البروتينات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تنفيذ كافة التحليلات الإحصائية لمقارنة اثنين (أو أكثر) الظروف البيولوجية المختلفة مع تقييم البشرى (ق) من أهمية: مقارنة بين أنواع مختلفة من الخلايا أو مراحل، والمقارنة بين مواضع مختلفة من الاهتمام. تؤخذ في جميع الاختبارات الإحصائية، P-القيم ≤ 5.00E-2 (A = 0.05) أن تكون كبيرة (1.00E-2 ≤ ≤ P-2 * 5.00E كبيرة؛ 1.00E-3 ≤ ≤ P-2 * 1.00E * هام جدا؛ P &lt;1.00E-3 *** هامة للغاية). </li></ol> التحليل الإحصائي للتوزيعات كامل مسافات بين اثنين من الأليلات، ونحن جيم أولonstruct التراكمي منحنيات التردد على توزيع مجموعة كاملة من مسافات تقاس بين alleles.To 2 تقييم أهمية الاختلافات في توزيع المسافات بين أليلية التجريبية نستخدم اللامعلمية لمدة عينة كولموغوروف-سميرنوف (KS) اختبار 13،14. التحليل الإحصائي للارتباط وثيق (أي الاقتران) من اثنين من الأليلات باستخدام المسافة المثلى القطع. للتعرف على مجموعة من الاختلافات في المسافات أقوى بين اثنين من الأليلات أو مواضع، ونحن نستخدم سلسلة من ق 15 لمدة الذيل اختبار فيشر الدقيق. وهي، في كل مسافة قمنا بقياس اختبار ما إذا كان شرط واحد كبير ممثلة تمثيلا زائدا في أقصر المسافات بين العينتين. الحد الأدنى في توزيع القيم P-يشير إلى مجموعة من المسافات التي يجب أن تعتبر من المعالم لارتباط وثيق (أي الاقتران) من الأليلات اثنين. بعد ذلك يتم استخدام اختبار فيشر الدقيق لمدة الذيل رس تقييم أهمية الاقتران اثنين من الأليلات في قيمة قطع حددت 15. يتم تطبيق التصحيحات اختبار متعددة لحساب العدد الإجمالي للاختبارات أجريت فيشر 16. التحليل الإحصائي لرابطة موضع في المصالح مع شبه حجرات النووية أو البروتينات. يستخدم اختبار ثنائي الذيل فيشر الدقيق لتحليل أهمية رابطة موضع في المصالح مع مقصورات مختلفة أو البروتينات 15.

<ol>
	<li>Chaumeil, J., Okamoto, I., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-chromosome+inactivation+in+mouse+embryonic+stem+cells:+analysis+of+histone+modifications+and+transcriptional+activity+using+immunofluorescence+and+FISH.">X-chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells: analysis of histone modifications and transcriptional activity using immunofluorescence and FISH.</a> Methods in enzymology. , 376-405 (2004).</li><li>Cremer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+3D+fluorescence+in+situ+hybridization+for+imaging+interphase+chromosomes.">Multicolor 3D fluorescence in situ hybridization for imaging interphase chromosomes.</a> Methods Mol. Biol. 463, 205-239 (2008).</li><li>Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+immunofluorescence,+RNA+fluorescent+in+situ+hybridization,+and+DNA+fluorescent+in+situ+hybridization+to+study+chromatin+changes,+transcriptional+activity,+nuclear+organization,+and+X-chromosome+inactivation.">Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation.</a> Methods Mol. Biol. 463, 297-308 (2008).</li><li>Solovei, I., Cremer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D-FISH+on+cultured+cells+combined+with+immunostaining.">3D-FISH on cultured cells combined with immunostaining.</a> Methods Mol. Biol. 659, 117-126 (2010).</li><li>Markaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+of+3D-FISH+and+super-resolution+structured+illumination+microscopy+for+studies+of+3D+nuclear+architecture:+3D+structured+illumination+microscopy+of+defined+chromosomal+structures+visualized+by+3D+(immuno)-FISH+opens+new+perspectives+for+studies+of+nuclear+architecture.">The potential of 3D-FISH and super-resolution structured illumination microscopy for studies of 3D nuclear architecture: 3D structured illumination microscopy of defined chromosomal structures visualized by 3D (immuno)-FISH opens new perspectives for studies of nuclear architecture.</a> BioEssays : news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 34, 412-426 (2012).</li><li>Heard, E., Bickmore, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ins+and+outs+of+gene+regulation+and+chromosome+territory+organisation.">The ins and outs of gene regulation and chromosome territory organisation.</a> Current opinion in cell biology. 19, 311-316 (2007).</li><li>Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+the+sequence:+cellular+organization+of+genome+function.">Beyond the sequence: cellular organization of genome function.</a> Cell. 128, 787-800 (1016).</li><li>Fraser, P., Bickmore, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+organization+of+the+genome+and+the+potential+for+gene+regulation.">Nuclear organization of the genome and the potential for gene regulation.</a> Nature. 447, 413-417 (2007).</li><li>Cremer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+territories--a+functional+nuclear+landscape.">Chromosome territories--a functional nuclear landscape.</a> Current opinion in cell biology. 18, 307-316 (2006).</li><li>Mao, Y. S., Zhang, B., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+and+function+of+nuclear+bodies.">Biogenesis and function of nuclear bodies.</a> Trends in genetics : TIG. 27, 295-306 (2011).</li><li>Dostie, J., Bickmore, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+organization+in+the+nucleus+-+charting+new+territory+across+the+Hi-Cs.">Chromosome organization in the nucleus - charting new territory across the Hi-Cs.</a> Current opinion in genetics &amp; development. 22, 125-131 (2012).</li><li>van Steensel, B., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomics+tools+for+unraveling+chromosome+architecture.">Genomics tools for unraveling chromosome architecture.</a> Nature. 28, 1089-1095 (2010).</li><li>Massey, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Kolmogorov-Smirnov+Test+for+Goodness+of+Fit.">The Kolmogorov-Smirnov Test for Goodness of Fit.</a> Journal of the American Statistical Association. 253, 1951 (1951).</li><li>Collins, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RUNX+transcription+factor-mediated+association+of+Cd4+and+Cd8+enables+coordinate+gene+regulation.">RUNX transcription factor-mediated association of Cd4 and Cd8 enables coordinate gene regulation.</a> Immunity. 34, 303-314 (2011).</li><li>Fisher, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+interpretation+of+&#967;2+from+contingency+tables,+and+the+calculation+of+P.">On the interpretation of &#967;2 from contingency tables, and the calculation of P.</a> Journal of the Royal Statistical Society. 85, 87-94 (1922).</li><li>Benjamini, Y. H., Yosef, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+the+false+discovery+rate:+a+practical+and+powerful+approach+to+multiple+testing.">Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing.</a> Journal of the Royal Statistical Society, Series B (Methodological). 57, 125-133 (1995).</li><li>Fitzsimmons, S. P., Bernstein, R. M., Max, E. E., Skok, J. A., Shapiro, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+changes+in+accessibility,+nuclear+positioning,+recombination,+and+transcription+at+the+Igkappa+locus.">Dynamic changes in accessibility, nuclear positioning, recombination, and transcription at the Igkappa locus.</a> J. Immunol. 179, 5264-5273 (2007).</li><li>Fuxa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pax5+induces+V-to-DJ+rearrangements+and+locus+contraction+of+the+immunoglobulin+heavy-chain+gene.">Pax5 induces V-to-DJ rearrangements and locus contraction of the immunoglobulin heavy-chain gene.</a> Genes Dev. 18, 411-422 (2004).</li><li>Goldmit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+ontogeny+of+the+Igk+locus+during+B+cell+development.">Epigenetic ontogeny of the Igk locus during B cell development.</a> Nature. 6, 198-203 (2005).</li><li>Hewitt, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+between+the+Igk+and+Igh+immunoglobulin+loci+mediated+by+the+3'+Igk+enhancer+induces+'decontraction'+of+the+Igh+locus+in+pre-B+cells.">Association between the Igk and Igh immunoglobulin loci mediated by the 3' Igk enhancer induces 'decontraction' of the Igh locus in pre-B cells.</a> Nature. 9, 396-404 (2008).</li><li>Johnson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-7+Functionally+Segregates+the+Pro-B+Cell+Stage+by+Regulating+Transcription+of+Recombination+Mediators+across+Cell+Cycle.">IL-7 Functionally Segregates the Pro-B Cell Stage by Regulating Transcription of Recombination Mediators across Cell Cycle.</a> Journal of Immunology. , (2012).</li><li>Karnowski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+and+nuclear+repositioning+of+the+lambda5+gene+locus+at+the+pre-b+cell+stage+requires+Aiolos+and+OBF-1.">Silencing and nuclear repositioning of the lambda5 gene locus at the pre-b cell stage requires Aiolos and OBF-1.</a> PLoS ONE. 3, e3568 (2008).</li><li>Kosak, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subnuclear+compartmentalization+of+immunoglobulin+loci+during+lymphocyte+development.">Subnuclear compartmentalization of immunoglobulin loci during lymphocyte development.</a> Science. 296, 158-162 (2002).</li><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yin+Yang+1+is+a+critical+regulator+of+B-cell+development.">Yin Yang 1 is a critical regulator of B-cell development.</a> Genes Dev. 21, 1179-1189 (2007).</li><li>Parker, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pre-B-cell+receptor+induces+silencing+of+VpreB+and+lambda5+transcription.">The pre-B-cell receptor induces silencing of VpreB and lambda5 transcription.</a> Embo J. 24, 3895-3905 (2005).</li><li>Roldan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locus+'decontraction'+and+centromeric+recruitment+contribute+to+allelic+exclusion+of+the+immunoglobulin+heavy-chain+gene.">Locus 'decontraction' and centromeric recruitment contribute to allelic exclusion of the immunoglobulin heavy-chain gene.</a> Nature immunology. 6, 31-41 (2005).</li><li>Skok, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonequivalent+nuclear+location+of+immunoglobulin+alleles+in+B+lymphocytes.">Nonequivalent nuclear location of immunoglobulin alleles in B lymphocytes.</a> Nature. 2, 848-854 (2001).</li><li>Skok, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+contraction+by+looping+of+the+Tcra+and+Tcrb+loci+in+rearranging+thymocytes.">Reversible contraction by looping of the Tcra and Tcrb loci in rearranging thymocytes.</a> Nature immunology. 8, 378-387 (2007).</li><li>Xiang, Y., Zhou, X., Hewitt, S. L., Skok, J. A., Garrard, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multifunctional+element+in+the+mouse+Igkappa+locus+that+specifies+repertoire+and+Ig+loci+subnuclear+location.">A multifunctional element in the mouse Igkappa locus that specifies repertoire and Ig loci subnuclear location.</a> Journal of Immunology. 186, 5356-5366 (2011).</li><li>Hewitt, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAG-1+and+ATM+coordinate+monoallelic+recombination+and+nuclear+positioning+of+immunoglobulin+loci.">RAG-1 and ATM coordinate monoallelic recombination and nuclear positioning of immunoglobulin loci.</a> Nature immunology. 10, 655-664 (2009).</li><li>Deriano, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RAG2+C+terminus+suppresses+genomic+instability+and+lymphomagenesis.">The RAG2 C terminus suppresses genomic instability and lymphomagenesis.</a> Nature. 471, 119-123 (2011).</li><li>Brown, K. E., Baxter, J., Graf, D., Merkenschlager, M., Fisher, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+repositioning+of+genes+in+the+nucleus+of+lymphocytes+preparing+for+cell+division.">Dynamic repositioning of genes in the nucleus of lymphocytes preparing for cell division.</a> Molecular cell. 3, 207-217 (1999).</li><li>Fernandez-Capetillo, O., Lee, A., Nussenzweig, M., Nussenzweig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H2AX:+the+histone+guardian+of+the+genome.">H2AX: the histone guardian of the genome.</a> DNA repair. 3, 959-967 (2004).</li><li>Croft, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+the+localization+and+morphology+of+chromosomes+in+the+human+nucleus.">Differences in the localization and morphology of chromosomes in the human nucleus.</a> The Journal of cell biology. 145, 1119-1131 (1999).</li><li>Chaumeil, J., Le Baccon, P., Wutz, A., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+role+for+Xist+RNA+in+the+formation+of+a+repressive+nuclear+compartment+into+which+genes+are+recruited+when+silenced.">A novel role for Xist RNA in the formation of a repressive nuclear compartment into which genes are recruited when silenced.</a> Genes Dev. 20, 2223-2237 (2006).</li><li>Walter, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+many+colors+in+FISH+on+3D-preserved+interphase+nuclei.">Towards many colors in FISH on 3D-preserved interphase nuclei.</a> Cytogenetic and genome research. 114, 367-378 (2006).</li><li>Toomre, D., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+wave+of+cellular+imaging.">A new wave of cellular imaging.</a> Annual review of cell and developmental biology. 26, 285-314 (2010).</li><li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy.">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> The Journal of cell biology. 190, 165-175 (2010).</li><li>Dobbie, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OMX:+a+new+platform+for+multimodal,+multichannel+wide-field+imaging.">OMX: a new platform for multimodal, multichannel wide-field imaging.</a> Cold Spring Harbor protocols. , 899-909 (2011).</li><li>Boyle, S., Rodesch, M. J., Halvensleben, H. A., Jeddeloh, J. A., Bickmore, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization+with+high-complexity+repeat-free+oligonucleotide+probes+generated+by+massively+parallel+synthesis.">Fluorescence in situ hybridization with high-complexity repeat-free oligonucleotide probes generated by massively parallel synthesis.</a> Chromosome research : an international journal on the molecular, supramolecular and evolutionary aspects of chromosome biology. 19, 901-909 (2011).</li></ol>

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم المصالح المتنافسة المالية.

تم استخدام تقنيات المفصلة أعلاه في المختبر لتحليل تنظيم إعادة التركيب V J (D) من الغلوبولين المناعي ومواضع Tcra / د في تطوير الخلايا الليمفاوية 30،31. ونحن واثقون من أن يمكن تكييفها هذه التقنية للكشف عن البروتينات النووية المختلفة، مقصورات النووية ومواضع، ?...

إنشاء آليات جينية الزناد وراثة الخلية والتنموية محات من نوع النسخي محددة. في مستوى واحد وهذا ينطوي على تعديل لونين من التعبئة والتغليف التي تحدد المناطق الجينية النشطة أو الصمت. على نطاق أوسع، وتنظيم 3D العالمية للجينوم النووية والهندسة المعمارية أيضا أن تلعب دورا في السيطرة على أنماط النسخي. وهكذا، تشريح هذه الميزات epigenomic أمر ضروري لفهم كامل لكيفية الجينات وينظم 6-11. الجمع بين FISH DNA المناعي و 3D فرصة فريدة لاستكمال التحليلات الجزيئية والكيمياء الحيوية عن طريق تقييم التفاعلات محددة / جمعيات تسلسل الحمض النووي و / أو البروتينات داخل النواة. وعلاوة على ذلك، في حين الجينوم على نطاق تقنيات إنتاجية عالية مثل مناعي لونين (رقاقة يليها) أو الكروموسوم التشكل القبض على جانب التسلسل العميق (4C-يليها، 5C، مرحبا C) تقديم دات العالميةوعلى السكان الخلية 12، تقنيات FISH المناعي / DNA يمكن من إجراء تحليلات على مستوى خلية واحدة. نحن هنا وصف بروتوكول للكشف في وقت واحد من التعديلات من قبل هيستون تسلسل الحمض النووي عن طريق المناعي وFISH DNA تليها المجهري 3D والتحليلات (3D المناعية FISH). وميزة هذا البروتوكول هو التصور المشترك لDNA والحفاظ على هياكل البروتين. وقد مكن خبرتنا في هذا المجال لنا لتحسين وتبسيط البروتوكولات القائمة. على الرغم من أننا قد استخدمت هذا البروتوكول للكشف عن الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل فواصل في الخلايا الليمفاوية التي تمر إعادة التركيب، يمكن تطبيق هذه الطريقة لغيرها من البروتينات وغيرها من أنواع الخلايا.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم الكاشف / المواد </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> H 2 O </td><td> الصياد </td><td> # BP2470 </td><td></td></tr><tr><td> ريبونوكلياز A </td><td> سيجما </td><td> # R4642 </td><td></td></tr><tr><td> dNTP </td><td> سيجما </td><td> # DNTP100 </td><td></td></tr><tr><td> الكسا dUTP </td><td> إينفيتروجن </td><td> # C11397 إلى C-11401 </td><td></td></tr><tr><td> Cy3 أو Cy5 dUTP </td><td> الصياد </td><td> # 45-001-XXX </td><td></td></tr><tr><td> الدناز I </td><td> روش </td><td> # 04536282001 </td><td></td></tr><tr><td> DNA بول I </td><td> Biolabs </td><td> # M0209 </td><td></td></tr><tr><td> 0،025 ميكرون مرشحات </td><td> Milliporه </td><td> # VSWP02500 </td><td></td></tr><tr><td> سرير DNA-1 1 ملغ / مل </td><td> إينفيتروجن </td><td> # 18440 </td><td></td></tr><tr><td> Hybloc DNA 1 ملغ / مل </td><td> علم الوراثة التطبيقية </td><td> # MHB </td><td></td></tr><tr><td> سمك السلمون الحيوانات المنوية </td><td> سيجما </td><td> # D1626 </td><td> أن مسحوق معلق في 10 ملغ / مل في H 2 O </td></tr><tr><td> NAAC (خلات الصوديوم، ودرجة الحموضة 5.2، حل العازلة) </td><td> سيجما </td><td> # S7899 </td><td></td></tr><tr><td> Ficoll 400 (مول بيول الصف) </td><td> الصياد </td><td> # 525 </td><td></td></tr><tr><td> Polyvinylpyrrolidone (مول بيول الصف) </td><td> الصياد </td><td> # BP431 </td><td></td></tr><tr><td> ديكستران سلفات مسحوق </td><td> سيجما </td><td> # D8906 </td><td></td></tr><tr><td> SSPE (المالحة فوسفات الصوديوم EDTA-) 20X الحل </td&gt; <td> الصياد </td><td> # BP1328 </td><td></td></tr><tr><td> الفورماميد </td><td> الصياد </td><td> # BP227 </td><td></td></tr><tr><td> Coverslips </td><td> الصياد </td><td> # 12-548-B </td><td></td></tr><tr><td> الشرائح </td><td> الصياد </td><td> # 12-550 </td><td></td></tr><tr><td> 6 وحات جيدة </td><td> الصياد </td><td> # 0720080 </td><td></td></tr><tr><td> PBS، 10X </td><td> الصياد </td><td> # MT-46-013-CM </td><td></td></tr><tr><td> بولي-L-يسين الحل </td><td> سيجما </td><td> # P8920 </td><td></td></tr><tr><td> بارافورمالدهيد، حبيبات، 95٪ </td><td> سيجما </td><td> # 441244 </td><td></td></tr><tr><td> تريتون X-100-، مول بيول الصف </td><td> سيجما </td><td> # T8787 </td><td></td></tr><tr><td> BSA (ألبومين المصل البقري) الكسر V </td><td> الصياد </td><td> # BP 1600 </td><td></td></tr><tr><td> مصل الماعز العادي </td><td> ناقلات مختبرات </td><td> # S-1000 </td><td></td></tr><tr><td> توين-20، مول بيول الصف </td><td> سيجما </td><td> # P9416 </td><td></td></tr><tr><td> SSC (المالحة سترات الصوديوم) 20X الحل </td><td> الصياد </td><td> # BP1325 </td><td></td></tr><tr><td> إطالة الذهب كاشف antifade </td><td> إينفيتروجن </td><td> # P36930 </td><td></td></tr><tr><td> دابي (4 &#39;،6-diamidino-2-phenylindole) </td><td> سيجما </td><td> # D9542 </td><td></td></tr><tr><td> أفضل اختبار المطاط معطف 1 الأسمنت </td><td> مخازن الإمداد الفن أو المكتب </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> الجدول 1. الكواشف محددة والمعدات الصغيرة. </td></tr></tbody></table>

combined immunofluorescence and dna fish on 3d-preserved interphase nuclei to study changes in 3d nuclear organization

الفلورسنت في الموقع التهجين باستخدام مجسات DNA على نواة-3 الأبعاد الحفاظ تليها المجهري متحد البؤر 3D (3D FISH DNA) يمثل الطريق الأكثر مباشرة لتصور موقع مواضع الجينات، الكروموسومات أو الأقاليم الفرعية في جميع الأراضي الخلايا الفردية. هذا النوع من التحليل يقدم نظرة ثاقبة في الهندسة المعمارية العالمية للنواة وكذلك سلوك مواضع الجينومية ومناطق محددة في غضون النووية. المناعي، من ناحية أخرى، يسمح الكشف عن البروتينات النووية (الهستونات تعديل، ومعدلات المتغيرات هيستون، آلات النسخ والعوامل، النووية شبه مقصورات، الخ). التحدي الرئيسي في الجمع بين المناعي و 3D FISH DNA هو، من ناحية الحفاظ على حاتمة الكشف عنها بواسطة الأجسام المضادة وكذلك الهندسة المعمارية 3D للنواة، وعلى الجانب الآخر، للسماح للتغلغل التحقيق للكشف عن الحمض النووي مواضع الجينات أو الكروموسومات الأراضي 1-5. هنا نقدم البروتوكول الذي يجمع بين التصور من التعديلات لونين مع مواضع الجيني في 3D النوى الحفاظ عليها.

وتستخدم DNA والمناعية FISH في المختبر Skok لدراسة التغيرات في المؤسسة النووية المرتبطة بعملية إعادة التركيب من V J (D) من مواضع مستقبلات المستضد B والتنمية خلال T الخلايا اللمفاوية. تقنيات المفصلة أعلاه تمكننا من قياس المسافات ط) بين طرفي موضعا (انكماش) ​​الثاني) قياس المساف...

Watch this Scientific Journal Video about Combined Immunofluorescence and DNA FISH on 3D-preserved Interphase Nuclei to Study Changes in 3D Nuclear Organization at JoVE.com

Combined Immunofluorescence and DNA FISH on 3D-preserved Interphase Nuclei to Study Changes in 3D Nuclear Organization

نحن هنا وصف بروتوكول للكشف في وقت واحد من التعديلات من قبل هيستون تسلسل الحمض النووي عن طريق المناعي وFISH DNA تليها المجهري 3D والتحليلات (3D المناعية DNA FISH).

الجمع بين المناعي وFISH DNA على الحفاظ على النواة 3D-الطور البيني لدراسة التغيرات في منظمة النووية 3D

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes  on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA  FISH) represents the ...

combined-immunofluorescence-dna-fish-on-3d-preserved-interphase

Research

JoVE Journal

Biology

18.2K Views.  New York University School of Medicine. نحن هنا وصف بروتوكول للكشف في وقت واحد من التعديلات من قبل هيستون تسلسل الحمض النووي عن طريق المناعي وFISH DNA تليها المجهري 3D والتحليلات (3D المناعية DNA FISH).

Video: Combined Immunofluorescence and DNA FISH on 3D-preserved Interphase Nuclei to Study Changes in 3D Nuclear Organization

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

اختبار الحساسية البصرية للسرعة واتجاه الحركة في السحالي

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

DNA-based Fish Species Identification Protocol

We have developed a fast, simple, and accurate DNA-based screening method to identify the fish species present in fresh and processed seafood samples. This versatile method employs PCR amplification of genomic DNA extracted from fish samples, followed by restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis to generate fragment patterns that can be resolved on the Agilent 2100 Bioanalyzer and matched to the correct species using RFLP pattern matching software.
The fish identification method uses a simple, reliable, spin column- based protocol to isolate DNA from fish samples. The samples are treated with proteinase K to release the nucleic acids into solution. DNA is then isolated by suspending the sample in binding buffer and loading onto a micro- spin cup containing a silica- based fiber matrix. The nucleic acids in the sample bind to the fiber matrix. The immobilized nucleic acids are washed to remove contaminants, and total DNA is recovered in a final volume of 100 &mu;l. The isolated DNA is ready for PCR amplification with the provided primers that bind to sequences found in all fish genomes. The PCR products are then digested with three different restriction enzymes and resolved on the Agilent 2100 Bioanalyzer. The fragment lengths produced in the digestion reactions can be used to determine the species of fish from which the DNA sample was prepared, using the RFLP pattern matching software containing a database of experimentally- derived RFLP patterns from commercially relevant fish species.

This publication describes how to use the Agilent Fish Species Identification System to identify the species of a fish by extracting DNA and performing PCR and RFLP analysis.

الحمض النووي القائم على تحديد الأنواع السمكية البروتوكول

We have developed a fast, simple, and accurate DNA-based screening method to identify the fish species present in fresh and processed seafood samples. ...

Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

3D DNA FISH has become a major tool for analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations of the technique have been published. In this article we describe a protocol which has been optimized for robustness, reproducibility, and ease of use. Brightly fluorescent directly labeled probes are generated by nick-translation with amino-allyldUTP followed by chemical coupling of the dye. 3D DNA FISH is performed using a freeze-thaw step for cell permeabilization and a heating step for simultaneous denaturation of probe and nuclear DNA. The protocol is applicable to a range of cell types and a variety of probes (BACs, plasmids, fosmids, or Whole Chromosome Paints) and allows for high-throughput automated imaging. With this method we routinely investigate nuclear localization of up to three chromosomal regions.

We describe a robust and versatile protocol for analyzing nuclear architecture by 3D DNA FISH using directly labeled fluorescent probes.

قوية FISH DNA 3D استخدام مجسات إعتبر مباشرة

3D DNA FISH has become a major tool for  analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations  of the technique have been ...

Assessing Species-specific Contributions To Craniofacial Development Using Quail-duck Chimeras

The generation of chimeric embryos is a widespread and powerful approach to study cell fates, tissue interactions, and species-specific contributions to the histological and morphological development of vertebrate embryos. In particular, the use of chimeric embryos has established the importance of neural crest in directing the species-specific morphology of the craniofacial complex. The method described herein utilizes two avian species, duck and quail, with remarkably different craniofacial morphology. This method greatly facilitates the investigation of molecular and cellular regulation of species-specific pattern in the craniofacial complex.&#160;Experiments in quail and duck chimeric embryos have already revealed neural crest-mediated tissue interactions and cell-autonomous behaviors that regulate species-specific pattern in the craniofacial skeleton, musculature, and integument. The great diversity of neural crest derivatives suggests significant potential for future applications of the quail-duck chimeric system to understanding vertebrate development, disease, and evolution.

This article describes a method to generate chimeric embryos that are&#160;designed to test the species-specific contributions of neural crest and/or other tissues to craniofacial development.

تقييم مساهمات أنواع محددة لتنمية الجمجمة عن طريق الوهم السمان بطة

The generation of chimeric embryos is a widespread and powerful approach to study cell fates, tissue interactions, and species-specific contributions to ...

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization (FISH) to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in cytogenetics and cancer diagnostics, and can detect aberrations of the genome, which often has important clinical implications. RNA FISH can be used to detect RNA molecules in cells and has provided important insights in regulation of gene expression. Combining DNA and RNA FISH within the same cell is technically challenging, as conditions suitable for DNA FISH might be too harsh for fragile, single stranded RNA molecules. We here present an easily applicable protocol which enables the combined, simultaneous detection of Xist RNA and DNA encoded by the X chromosomes. This combined DNA-RNA FISH protocol can likely be applied to other systems where both RNA and DNA need to be detected.

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization FISH to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluorescent in situ hybridization (FISH) allows the detection of nucleic acids in their native environment within cells. We here describe a protocol for the combined, simultaneous detection of RNA and DNA by means of FISH, which can be used to study X chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells.

الحمض النووي RNA-مجتمعة نيون<em&gt; في الوضع الطبيعي</em&gt; التهجين (FISH) لدراسة كروموسوم X التعطيل في المتباينة أنثى الفأر الخلايا الجذعية الجنينية

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in ...

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

Low dose radiation exposure may produce a variety of biological effects that are different in quantity and quality from the effects produced by high radiation doses. Addressing questions related to environmental, occupational and public health safety in a proper and scientifically justified manner heavily relies on the ability to accurately measure the biological effects of low dose pollutants, such as ionizing radiation and chemical substances. DNA damage and repair are the most important early indicators of health risks due to their potential long term consequences, such as cancer. Here we describe a protocol to study the effect of chronic in vivo exposure to low doses of &#947;- and &#946;-radiation on DNA damage and repair in mouse spleen cells. Using a commonly accepted marker of DNA double-strand breaks, phosphorylated histone H2AX called &#947;H2AX, we demonstrate how it can be used to evaluate not only the levels of DNA damage, but also changes in the DNA repair capacity potentially produced by low dose in vivo exposures. Flow cytometry allows fast, accurate and reliable measurement of immunofluorescently labeled &#947;H2AX in a large number of samples. DNA double-strand break repair can be evaluated by exposing extracted splenocytes to a challenging dose of 2 Gy to produce a sufficient number of DNA breaks to trigger repair and by measuring the induced (1 hr post-irradiation) and residual DNA damage (24 hrs post-irradiation). Residual DNA damage would be indicative of incomplete repair and the risk of long-term genomic instability and cancer. Combined with other assays and end-points that can easily be measured in such in vivo studies (e.g., chromosomal aberrations, micronuclei frequencies in bone marrow reticulocytes, gene expression, etc.), this approach allows an accurate and contextual evaluation of the biological effects of low level stressors.

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

A protocol to evaluate changes in DNA damage levels and DNA repair capacity that may be induced by chronic in vivo low dose irradiation in mouse spleen lymphocytes, by measuring phosphorylated histone H2AX, a marker of DNA double-strand breaks, using flow cytometry is presented.

قياس الحمض النووي من التلف وإصلاح في ماوس Splenocytes بعد المزمنة<em&gt; في فيفو</em&gt; التعرض لجرعات منخفضة جدا من بيتا وغاما والأشعة السينية

Low dose radiation exposure may produce a variety of biological effects that are different in quantity and quality from the effects produced by high ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. To enable the non-biased identification of molecules interacting with a specific genomic region of interest, we recently developed the engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) technique. Here, we describe how to use enChIP to isolate specific genomic regions and identify the associated proteins and RNAs. First, a genomic region of interest is tagged with a transcription activator-like (TAL) protein or a clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) complex consisting of a catalytically inactive form of Cas9 and a guide RNA. Subsequently, the chromatin is crosslinked and fragmented by sonication. The tagged locus is then immunoprecipitated and the crosslinking is reversed. Finally, the proteins or RNAs that are associated with the isolated chromatin are subjected to mass spectrometric or RNA sequencing analyses, respectively. This approach allows the successful identification of proteins and RNAs associated with a genomic region of interest.

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. This protocol describes procedures to perform engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin imunoprecipitation (enChIP) for identification of proteins and RNAs associated with a specific genomic region.

عزل المناطق الجينوم محددة وتحديد أسوشيتد الجزيئات التي enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These age-associated disorders are characterized by the appearance of protein aggregates with fibrillary structure in the brains of these patients. Exactly why normally soluble proteins undergo an aggregation process remains poorly understood. The discovery that protein aggregation is not limited to disease processes and instead part of the normal aging process enables the study of the molecular and cellular mechanisms that regulate protein aggregation, without using ectopically expressed human disease-associated proteins. Here we describe methodologies to examine inherent protein aggregation in Caenorhabditis elegans through complementary approaches. First, we examine how to grow large numbers of age-synchronized C. elegans to obtain aged animals and we present the biochemical procedures to isolate highly-insoluble-large aggregates. In combination with a targeted genetic knockdown, it is possible to dissect the role of a gene of interest in promoting or preventing age-dependent protein aggregation by using either a comprehensive analysis with quantitative mass spectrometry or a candidate-based analysis with antibodies. These findings are then confirmed by in vivo analysis with transgenic animals expressing fluorescent-tagged aggregation-prone proteins. These methods should help clarify why certain proteins are prone to aggregate with age and ultimately how to keep these proteins fully functional.

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

The goal of the method presented here is to explore protein aggregation during normal aging in the model organism C. elegans. The protocol represents a powerful tool to study the highly insoluble large aggregates that form with age and to determine how changes in proteostasis impact protein aggregation.

أساليب "دراسة التغيرات" في "تجميع البروتين الأصيل" مع التقدم في السن في ايليجانس كاينورهابديتيس

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Sequential Immunofluorescence and Immunohistochemistry on Cryosectioned Zebrafish Embryos

Investigation of intercellular interactions often requires discrete labeling of specific cell populations and precise protein localization. The zebrafish embryo is an excellent tool for examining such interactions with an in vivo model. Whole-mount immunohistochemical and immunofluorescence assays are frequently applied in zebrafish embryos to assess protein expression. However, it can be difficult to achieve accurate mapping of co-localized proteins in three-dimensional space. In addition, some studies may require the use of two antibodies that are not compatible with the same technique (e.g., antibody 1 is only suitable for immunohistochemistry and antibody 2 is only suitable for immunofluorescence). The purpose of the method described herein is to perform sequential immunofluorescence and/or immunohistochemistry on individual cryosections derived from early-stage zebrafish embryos. Here we describe the use of sequential rounds of immunofluorescence, imaging, immunohistochemistry, imaging for a single cryosection in order to achieve precise identification of protein expression at the single-cell level. This methodology is suitable for any study in early-stage zebrafish embryos that requires accurate identification of multiple protein targets in individual cells.

This protocol demonstrates sequential immunofluorescence and immunohistochemistry on cryosections from early-stage zebrafish embryos enabling precise colocalization analyses in specific cell populations.

الفلورة المناعية المتسلسلة والكيمياء المناعية على أجنة حمار وحشي مقطعة بالتبريد

Investigation of intercellular interactions often requires discrete labeling of specific cell populations and precise protein localization. The zebrafish ...

Visualization of DNA Repair Proteins Interaction by Immunofluorescence

Mammalian cells are constantly exposed to chemicals, radiations, and naturally occurring metabolic by-products, which create specific types of DNA insults. Genotoxic agents can damage the DNA backbone, break it, or modify the chemical nature of individual bases. Following DNA insult, DNA damage response (DDR) pathways are activated and proteins involved in the repair are recruited. A plethora of factors are involved in sensing the type of damage and activating the appropriate repair response. Failure to correctly activate and recruit DDR factors can lead to genomic instability, which underlies many human pathologies including cancer. Studies of DDR proteins can provide insights into genotoxic drug response and cellular mechanisms of drug resistance.
There are two major ways of visualizing&#160;proteins in vivo: direct observation, by tagging the protein of interest with a fluorescent protein and following it by live imaging, or indirect immunofluorescence on fixed samples. While visualization of fluorescently tagged proteins allows precise monitoring over time, direct tagging in N- or C-terminus can interfere with the protein localization or function. Observation of proteins in their unmodified, endogenous version is preferred. When DNA repair proteins are recruited to the DNA insult, their concentration increases locally and they form groups, or &#8220;foci&#8221;, that can be visualized by indirect immunofluorescence using specific antibodies.
Although detection of protein foci does not provide a definitive proof of direct interaction, co-localization of proteins in cells indicates that they regroup to the site of damage and can inform of the sequence of events required for complex formation. Careful analysis of foci spatial overlap in cells expressing wild type or mutant versions of a protein can provide precious clues on functional domains important for DNA repair function. Last, co-localization of proteins indicates possible direct interactions that can be verified by co-immunoprecipitation in cells, or direct pulldown using purified proteins.

Following DNA damage, human cells activate essential repair pathways to restore the integrity of their genome. Here, we describe the method of indirect immunofluorescence as a means to detect DNA repair proteins, analyze their spatial and temporal recruitment, and help interrogate protein-protein interaction at the sites of DNA damage.