أشكر جيني ت. لي على الإشراف على هذا المشروع عندما كنت في مختبر لي وتايلر برويرينغ لتحرير المخطوطة. وقد تم دعم هذا العمل من قبل جائزة الباحث باسل أوكونور كاتب من مسيرة مؤسسة الدايمات ومنحة المعاهد القومية للصحة GM098605.

1.3D إعداد الشرائح
<ol><li>إعداد الكواشف التالية:<ol>
<li>CSK العازلة: 100 mM NaCl, 300 mM السكروز, 10 م م أنابيب, 3 م م م2. ضبط درجة الحموضة إلى 6.8 مع 1 M NaOH. تخزين المخزن المؤقت CSK عند 4 °C.</li>
		<li>CSK العازلة مع 0.5٪ تريتون X-100: إضافة 200 ميكرولتر من تريتون X-100 إلى 40 مل من المخزن المؤقت CSK. امزج المحلول باستخدام الستيرر المغناطيسي حتى يذوب تريتون X-100 تماما. تخزين المخزن المؤقت CSK مع 0.5٪ تريتون X-100 في 4 درجة مئوية.</li>
		<li>4٪ بارافورمالديهايد (PFA)-PBS، درجة الحموضة 7.4: حل 4 غرام من PFA في ما يقرب من 70-80 مل من الماء. من أجل تسريع عملية الذوبان، إضافة ما يقرب من 20 ميكرولتر من 4 N NaOH والحفاظ على الحل في حمام مائي عند 60 درجة مئوية حتى يذوب PFA تماما والحل شفاف. تستغرق هذه العملية حوالي ساعة واحدة. بعد PFA قد حلت تماما، إضافة 10 مل من برنامج تلفزيوني 10x. ضبط حجم النهائي إلى 100 مل مع الماء وتهدئة الحل لدرجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية). استخدم الحل الطازج لكل تجربة جديدة. ملاحظة: الحصول على إذن مؤسسي لجميع الأعمال الحيوانية والالتزام بالمبادئ التوجيهية ذات الصلة لرعاية الحيوان.</li>
	</ol>
</li>
	<li>قتل الفئران الذكور. باستخدام ملقط ومقص، استئصال الخصية من الماوس. ضع testis في برنامج تلفزيوني (أو RPMI 1640). بعد إزالة الخصية، نفذ بسرعة الخطوات التالية 1.3-1.4 من أجل منع تدهور الحمض النووي الريبي.</li>
	<li>تمزق الخصية على طبق بيتري صغيرة وإزالة albuginea تونيكا. كشف الأنابيب شبهiferous في برنامج تلفزيوني على الجليد باستخدام ملقط.</li>
	<li>باستخدام ملقط، نقل العديد من الأنابيب (عدة قطع من الأنابيب حوالي 5-10 ملم في الطول) في بئر واحد من طبق 4-جيدا تحتوي على 500 مل من العازلة CSK + 0.5٪ تريتون X-100 على الجليد، واحتضان لمدة 6 دقائق. التعرض المفرط ل CSK العازلة قد يؤدي إلى تعطيل الخلايا.</li>
	<li>باستخدام ملقط، نقل جميع الأنابيب إلى بئر واحد من طبق 4-جيدا تحتوي على 4٪ PFA-PBS الحل. يمكن أن تكون هذه الخطوة مسبقا دون مجسم، ولكن اختياريا يمكن استخدامه. حضانة لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. في نفس الوقت بدء إعداد 12 حجرة السيتوسبين خلال فترات الحضانة.</li>
	<li>باستخدام ملقط، نقل جميع الأنابيب إلى بئر واحد من طبق 4-جيدا التي تحتوي على برنامج تلفزيوني. حضانة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>على الجانب الخلفي من شريحة زجاجية، نقل جميع الأنابيب إلى 30 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني (ينبغي تجنب الجزء العلوي من الشريحة بسبب تهمة cationic). باستخدام نصائح من اثنين من ملقط، المسيل للدموع الأنابيب إلى قطع. ختم الأنابيب في اتجاه أفقي عن طريق قص الأنابيب بين نصائح من اثنين من ملقط وسحب ملقط أفقيا. تابع هذه الخطوة لمدة 10-20 ثانية تقريبا.</li>
	<li>خلط تعليق عن طريق ماصة باستخدام ماصة P20.</li>
	<li>نقل التعليق إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق، تمييع مع برنامج تلفزيوني إلى ما يقرب من 1.3 مل. تطبيق 100 ميكرولتر من التعليق على كل من 12 حجرة سيتوسبين (1.2 مل المجموع). في هذه الخطوة، لا يحتاج تركيز الخلايا إلى تحديد.</li>
	<li>Cytospin العينات في 2000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد السيتوسبينينغ، الشرائح الجافة على مقاعد البدلاء المختبر لبضع دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد السماح للشرائح بالجفاف تماما لبضع دقائق ، انتقل إلى الخطوة التالية.</li>
	<li>باستخدام جرة كوبلين التي تحتوي على برنامج تلفزيوني، وغسل الشرائح لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>نقل الشرائح إلى جرة كوبلين التي تحتوي على 70٪ الإيثانول والانتظار على الأقل 2 دقيقة قبل بدء RNA FISH. الشرائح مستقرة لبضعة أسابيع في الإيثانول 70٪ في 4 درجة مئوية. للتخزين على المدى الطويل، والشرائح المجففة باستخدام العلاج التسلسلي مع الإيثانول 80٪ و 100٪ في الجرار كوبلين لمدة 2 دقيقة لكل منهما والهواء الجاف يجفف تماما الشرائح. تخزين في -80 درجة مئوية في مربع الشريحة.</li>
</ol>2. إعداد مجس الحمض النووي Cot-1 بواسطة فتيلة عشوائية
<ol><li>إعداد الكواشف التالية:<ol>
<li>المخزن المؤقت للتهجين: امزج مكونات الإجراءات لإعداد 900 مل من مخزون المخزن المؤقت للتهجين؛ سيتم استخدام هذا الحل لتخزين المسابير. يسمح هذا المخزون العازلة التهجين لإضافة حجم 10٪ من محلول مثبطات RNase (ريبونوكليوسيد فاناديل المعقدة) قبل التهجين.<table><tbody>
<tr>
<td>مكون</td>
					<td>المبلغ (ميكرولتر)</td>
					<td>التركيز النهائي</td>
				</tr>
<tr>
<td>فورماميد</td>
					<td>500</td>
					<td>50٪ (v/v)</td>
				</tr>
<tr>
<td>50٪ ديكتران</td>
					<td>200</td>
					<td>10٪ (ث/v)</td>
				</tr>
<tr>
<td>20x SSC</td>
					<td>100</td>
					<td>2x</td>
				</tr>
<tr>
<td>1٪ بكالوريوس</td>
					<td>100</td>
					<td>0.1%</td>
				</tr>
</tbody></table>قبل التهجين، إضافة 1/10 فول من 200 mM ريبونوكليوسيد فاناديل مجمع أو الماء إلى المخزون العازلة التهجين لتتناسب مع التركيز النهائي. عند -20 درجة مئوية، هذا الخليط مستقر لأكثر من عام.</li>
		<li>20x SSC: حل 88.2 غرام من سترات الصوديوم و 175.3 غرام من NaCl في حوالي 800 مل من الماء. ضبط درجة الحموضة إلى 7.0 باستخدام بضع قطرات من 1 M HCl. إضافة الماء لضبط حجم النهائي إلى 1 L. تعقيم عن طريق الالاستعباد التلقائي. بعد التحضير، يمكن تخزين 20x SSC في درجة حرارة الغرفة.</li>
		<li>50٪ (ث/v) ديكتران: يحرك الماء ويضيف ببطء 50 غرام من كبريتات ديكتران. استمر في التحريك طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. أضف الماء لضبط الحجم النهائي إلى 100 مل. تخزين في درجة حرارة الغرفة.</li>
	</ol>
</li>
	<li>أضف المكونات التالية المذكورة أدناه إلى أنبوب PCR. باستخدام جهاز PCR، قم بمزج المحلول واحتضانه لمدة 5 دقائق عند 95 درجة مئوية.<table><tbody>
<tr>
<td>مكون</td>
				<td align="center">الكمية لكل تفاعل (ميكرولتر)</td>
				<td align="center">نهائي</td>
			</tr>
<tr>
<td>كوت-1 DNA: 1 ملغم/مل</td>
				<td align="center">1</td>
				<td align="center">1 ميكروغرام</td>
			</tr>
<tr>
<td>التمهيدي عشوائي 9mer (من عدة)</td>
				<td align="center">10</td>
				<td align="center"></td>
			</tr>
<tr>
<td>الماء</td>
				<td align="center">27</td>
				<td align="center"></td>
			</tr>
</tbody></table>
</li>
	<li>الطرد المركزي لفترة وجيزة ومكان على الجليد.</li>
	<li>إضافة المكونات التالية. مزيج واحتضان لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية باستخدام جهاز PCR. (للحصول على تفاصيل عن مجموعة تستخدم انظر الجدول من الكواشف والمعدات).<table><tbody>
<tr>
<td>مكون</td>
				<td align="center">الكمية لكل تفاعل (ميكرولتر)</td>
				<td align="center">التركيز النهائي</td>
			</tr>
<tr>
<td>خليط معد من الخطوة 2.2</td>
				<td align="center">38</td>
				<td align="center"></td>
			</tr>
<tr>
<td>5x النيوكليوتيدات العازلة (من عدة)</td>
				<td align="center">9.2</td>
				<td align="center"></td>
			</tr>
<tr>
<td>Cy3-dUTP (1 متر)</td>
				<td align="center">0.8</td>
				<td align="center">16 ميكرومتر</td>
			</tr>
<tr>
<td>كلينو (من عدة)</td>
				<td align="center">2</td>
				<td align="center"></td>
			</tr>
</tbody></table>
</li>
	<li>إضافة 2 ميكرولتر من العازلة وقف (من عدة) لوقف رد الفعل.</li>
	<li>تنقية رد الفعل توقف باستخدام أعمدة microspin.</li>
	<li>أضف 50 ميكروغرام (5 ميكرولتر) من الحمض النووي للحيوانات المنوية الرنجة (50 ضعف فائض القالب Cot-1 DNA) إلى الكسر المنقى.</li>
	<li>قياس إجمالي حجم الصوت باستخدام ماصة. أضف 0.7x حجم الإيثانول 100٪ وحجم 0.1x من خلات الصوديوم 3 M (درجة الحموضة 5.2)، مزيج جيدا، والطرد المركزي لمدة 15 دقيقة بأقصى سرعة (17،000 × غرام) باستخدام جهاز طرد مركزي صغير في 4 درجة مئوية.</li>
	<li>إزالة السائل، وإضافة 200 ميكروغرام من الإيثانول 70٪، مزيج جيدا والطرد المركزي لمدة 5 دقائق بأقصى سرعة في 4 درجة مئوية.</li>
	<li>إزالة السائل الزائد. جفف الترسب لمدة 10-30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>حل بيليه في 20 ميكرولتر من المخزون العازلة التهجين. لأن بيليه غالبا ما يكون من الصعب حل، ماصة مرارا وتكرارا. كخيار بديل، يمكن أيضا استخدام خلاط دوامة لإذابة بيليه بكفاءة. يمكن الاحتفاظ المسابير في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.</li>
</ol>3. كوت-1 RNA الأسماك
<ol><li>إضافة المكونات المذكورة أدناه إلى أنبوب PCR. باستخدام جهاز PCR، احتضان لمدة 10 دقيقة في 80 درجة مئوية، تليها خطوة ما قبل التنافر من حوالي 10-30 دقيقة في 42 درجة مئوية. ابق عند 42 درجة مئوية حتى التهجين. ريبونوكليوسيد فاناديل مجمع اختياري; يمكن استبداله بالماء.<table><tbody>
<tr>
<td>مكون</td>
				<td align="center">الكمية لكل تفاعل (ميكرولتر)</td>
				<td align="center">نهائي</td>
			</tr>
<tr>
<td>مجس الحمض النووي Cot-1 (50 نانوغرام/ميكرولتر)</td>
				<td align="center">2</td>
				<td align="center">100 نانوغرام</td>
			</tr>
<tr>
<td>مجمع فاناديل ريبونوكليوسيد (200 متر)</td>
				<td align="center">2</td>
				<td align="center">20 مليون متر</td>
			</tr>
<tr>
<td>المخزن المؤقت للتهجين</td>
				<td align="center">أضيف إلى 20</td>
				<td align="center"></td>
			</tr>
</tbody></table>
</li>
	<li>الشرائح المجففة في جرة كوبلين التي تحتوي على 80٪ الإيثانول لمدة 2 دقيقة، تليها جرة كوبلين تحتوي على الإيثانول 100٪ لمدة 2 دقيقة. الشرائح الجافة تماما على مقاعد البدلاء مختبر في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>سخني غرفة صندوق البقشيش (مليئة ب 2-3 سم من الماء) في حاضنة 42 درجة مئوية مقدما. ضع الشريحة على غرفة صندوق البقشيش. طرد مركزي لفترة وجيزة المسابير preannealed وماصة مباشرة على الشرائح المجففة. تجنب صنع الفقاعات. قم بتغطية الشريحة برفق بقسيمة غطاء.</li>
	<li>تهجين لمدة 6 ساعات إلى ليلة واحدة (14-15 ساعة) في 42 درجة مئوية.</li>
	<li>إعداد حلول الغسيل في الجرار كوبلين (اثنين من الجرار مع كل من 2X SSC و 50٪ formamide، وجرارتين مع 2x SSC). سخني على حرارة 42 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في حمام مائي.</li>
	<li>استخدم شفرة حلاقة لإزالة الغطاء من حافة الشريحة. تجنب خدش العينات. اغسل الشرائح في جرة كوبلين التي تحتوي على 2x SSC و 50٪ formamide لمدة 5 دقائق عند 45 درجة مئوية. كرر هذه الخطوة مرة واحدة.</li>
	<li>اغسل الشرائح في جرة كوبلين التي تحتوي على 2x SSC لمدة 5 دقائق عند 45 درجة مئوية. كرر هذه الخطوة مرة واحدة.</li>
	<li>أضف 20 ميكرولتر من وسائط DAPI المتصاعدة إلى الشرائح، ثم قم بتغطيتها بقسيمة غطاء. اضغط بلطف على زجاج الغطاء لإزالة وسائط التركيب الإضافية. لطخة وسائل الإعلام تصاعد اضافية مع تنظيف الأنسجة. الشرائح جاهزة لتقييم المجهر.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Peters, A. H., Plug, A. W., van Vugt, M. J., de Boer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+drying-down+technique+for+the+spreading+of+mammalian+meiocytes+from+the+male+and+female+germline.">A drying-down technique for the spreading of mammalian meiocytes from the male and female germline.</a> Chromosome Res. 5, 66-68 (1997).</li><li>Namekawa, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postmeiotic+sex+chromatin+in+the+male+germline+of+mice.">Postmeiotic sex chromatin in the male germline of mice.</a> Curr Biol. 16, 660-667 (2006).</li><li>Namekawa, S. H., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+nascent+RNA,+single-copy+DNA+and+protein+localization+by+immunoFISH+in+mouse+germ+cells+and+preimplantation+embryos.">Detection of nascent RNA, single-copy DNA and protein localization by immunoFISH in mouse germ cells and preimplantation embryos.</a> Nat Protoc. 6, 270-284 (2011).</li><li>Mahadevaiah, S. K., Costa, Y., Turner, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+RNA+FISH+to+study+gene+expression+during+mammalian+meiosis.">Using RNA FISH to study gene expression during mammalian meiosis.</a> Methods in molecular biology. 558, 433-444 (2009).</li><li>Hall, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ectopic+human+XIST+gene+can+induce+chromosome+inactivation+in+postdifferentiation+human+HT-1080+cells.">An ectopic human XIST gene can induce chromosome inactivation in postdifferentiation human HT-1080 cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 8677-8682 (2002).</li><li>Huynh, K. D., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inheritance+of+a+pre-inactivated+paternal+X+chromosome+in+early+mouse+embryos.">Inheritance of a pre-inactivated paternal X chromosome in early mouse embryos.</a> Nature. 426, 857-862 (2003).</li><li>Namekawa, S. H., VandeBerg, J. L., McCarrey, J. R., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+chromosome+silencing+in+the+marsupial+male+germ+line.">Sex chromosome silencing in the marsupial male germ line.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 9730-9735 (2007).</li><li>Namekawa, S. H., Payer, B., Huynh, K. D., Jaenisch, R., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-step+imprinted+X+inactivation:+repeat+versus+genic+silencing+in+the+mouse.">Two-step imprinted X inactivation: repeat versus genic silencing in the mouse.</a> Mol Cell Biol. 30, 3187-3205 (2010).</li><li>Ichijima, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MDC1+directs+chromosome-wide+silencing+of+the+sex+chromosomes+in+male+germ+cells.">MDC1 directs chromosome-wide silencing of the sex chromosomes in male germ cells.</a> Genes Dev. 25, 959-971 (2011).</li><li>Sin, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNF8+regulates+active+epigenetic+modifications+and+escape+gene+activation+from+inactive+sex+chromosomes+in+post-meiotic+spermatids.">RNF8 regulates active epigenetic modifications and escape gene activation from inactive sex chromosomes in post-meiotic spermatids.</a> Genes Dev. 26, 2737-2748 (2012).</li></ol>

وليس لدى صاحب البلاغ ما يكشف عنه.

في إعداد الشرائح ثلاثية الأبعاد، تسبق خطوة permeabilization خطوة التثبيت. يتم تنفيذ هذه الخطوات مباشرة على الأنابيب شبهiferous، وبالتالي الحفاظ على بنية الكروماتين ثلاثي الأبعاد. خيار بديل للحفاظ على بنية الكروماتين لسمك الحمض النووي الريبي / الحمض النووي هو تنفيذ خطوة permeabilization وخطوة التثبيت في وق?...

في الخصية، الخلايا الجرثومية تفرق من الحيوانات المنوية ثنائية الفصيلة من خلال الميوس إلى ناضجة، الحيوانات المنوية haploid. خلال هذه العملية، يتم تشكيل هيكل الكروماتين النووي للخلايا الجرثومية بشكل مستمر وديناميكي. ينتشر السطح عادة ما تستخدم للفحص الخلوي للخلايا المنوية الفردية. وهناك طريقة سائدة من ينتشر السطح يستخدم العلاج hypotonic التي تنتشر الخلايا المنوية الفردية وسويت1. هذه الشروط هي الأمثل للتحليل التفصيلي للكروموسومات المريوتيكية. الميزات الكروموسومية مثل حالة متشابك و بؤر إعادة التركيب يمكن ملاحظتها بسهولة باستخدام هذه الطريقة. ومع ذلك ، فإن العلاج تحت الحجري يعطل بنية الكروماتين دون النووية ، وبالتالي فإن هذه التقنية ليست مناسبة للتحليل الهيكلي للنوى. وبالتالي، تم تصميم طريقة محسنة للحفاظ على بنية الكروماتين ثلاثية الأبعاد للخلايا الجرثومية الخصية. وقد وصفت هذه الطريقة بأنها طريقة الشريحة ثلاثية الأبعاد (3D)(الشكل 1). وقد مكنت طريقة الشريحة 3D الكشف عن توطين الحمض النووي الريبي الوليدة في النوى لأنه تم الأمثل في البداية لفحص التعبير الجيني وحالات الكروماتين خلال تمايز الخلايا الجرثومية الخصية من قبل RNA مضان في التهجين الموقعي (FISH)2,3. هذه الطريقة ثلاثية الأبعاد تنطبق أيضا على الجمع بين الفلورة المناعية والحمض النووي والأسماك الحمض النووي الريبي. بالإضافة إلى ذلك ، ساعدت هذه الطريقة في اكتشاف كروماتين الجنس بعد ميوتيك (PMSC) ، وهي مقصورة صامتة من الكروموسومات الجنسية الموجودة في الحيوانات المنوية بعد ميوتيك2.
تم تحسين طريقة الشريحة ثلاثية الأبعاد في الأصل من خلال الجمع بين خطوتين أساسيتين لإعداد الشرائح المستخدمة عادة للتلطيخ النووي: خطوة التثبيت المصممة لإصلاح المواد النووية وخطوة الثبات التي تهدف إلى إزالة المواد السيتوبلازمية من أجل تحسين إمكانية الوصول إلى الكواشف التلطيخية ، مثل الأجسام المضادة ومسابير FISH. كما سبق وصفه في منشور آخر 3 ، فقد تقرر أن خطوة permeabilization يجب أن تسبق خطوة التثبيت من أجلالحصولعلى أفضل النتائج مع خلفية السيتوبلازمية منخفضة. في طريقة الشريحة ثلاثية الأبعاد هذه ، يتم تنفيذ خطوة permeabilization وخطوة التثبيت اللاحقة مباشرة على الأنابيب شبهiferous ويتبعها الانفصال الميكانيكي للخلايا الجرثومية مع ملقط قبل السيتوسبينينغ على الشرائح. تم تطوير طريقة بديلة لأسماك الحمض النووي الريبي من الخلايا المنوية في مختبر آخر4. في هذا الأسلوب، بما يتفق مع الأسلوب 3D، يجب أن تسبق خطوة permeabilization خطوة التثبيت من أجل الحصول على أفضل النتائج من RNA FISH.
يصف البروتوكول التالي طريقة الشريحة ثلاثية الأبعاد ويقدم مثالا على تطبيق محتمل، Cot-1 RNA FISH للكشف عن الحمض النووي النووي الريبي الناشئ. يتكون الحمض النووي ل Cot-1 من عناصر متكررة في الجينوم. هنا، يتم تهجين مسبار الحمض النووي Cot-1 إلى intron و UTR من النصوص الوليدة، وبالتالي الكشف عن المناطق النشطة نسخيا في النواة5،6. الشرائح ثلاثية الأبعاد متعددة الاستخدامات ويمكن تطبيقها على مزيج من تقنيات immunofluorescence والحمض النووي وRNA FISH من أجل الحصول على فحص مفصل للعلاقات المكانية بين هندسة الكروماتين.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="562">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Cot-1 DNA&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">18440-016</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stratagene Prime-It Fluor Fluorescence Labeling Kit</td>
			<td style="width:147px;">Agilent</td>
			<td align="right" style="width:119px;">
			300380
			</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Herring sperm DNA Solution</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td>15634-017</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol, 200 proof (absolute)</td>
			<td>Pharmco-AAPER</td>
			<td align="right">111000200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S2889</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Formamide deionized</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB00600-00500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium citrate tribasic dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C8532</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:147px;">Lifeblood Medical</td>
			<td style="width:119px;">77110-100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dextran sulfate sodium salt from Leuconostoc spp.</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D6001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A10491-01</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S0389</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">PIPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P6757</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M0250</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T8787</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">76240</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">221465</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P4417</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI</td>
			<td style="width:147px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">H1200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ribonucleoside-vanadyl complex</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">S1402S</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Illustra MicroSpin G-50 Columns</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">27-5330-01</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:147px;">Eppendorf</td>
			<td align="right" style="width:119px;">5424</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Forceps</td>
			<td style="width:147px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">300-050</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:147px;">Bioexpress</td>
			<td style="width:119px;">C-3262-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Cytospin 3</td>
			<td style="width:147px;">Shandon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Coplin jar</td>
			<td style="width:147px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">08-815</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Superfrost /Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550-15</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4-well dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-566-301</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover glass&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-544-G</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:297px;">Air incubator</td>
			<td style="width:147px;">Revolutionary Science</td>
			<td style="width:119px;">RS-IF-203</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

slide preparation method to preserve three-dimensional chromatin architecture of testicular germ cells

أثناء تمايز الخلايا الجرثومية الخصية ، يتغير هيكل الكروماتين النووي بشكل ديناميكي. يصف التالي طريقة مصممة للحفاظ على ترتيب الكروماتين ثلاثي الأبعاد للخلايا الجرثومية الخصية الموجودة في الفئران؛ تم وصف هذا الأسلوب كطريقة الشريحة ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد). في هذه الطريقة ، يتم التعامل مباشرة مع أنابيب الخصية مع خطوة permeabilization أن يزيل المواد السيتوبلازمية ، تليها خطوة التثبيت الذي يصلح المواد النووية. ثم يتم فصل الأنابيب، وتعليق الخلية هو cytospun، والخلايا تلتزم الشرائح. هذه الطريقة تحسن الحساسية تجاه الكشف عن الهياكل دون النووية وتنطبق على الفلورة المناعية والحمض النووي وفلور الحمض النووي الريبي في التهجين الموقعي (FISH) والجمع بين طرق الكشف هذه. كمثال على تطبيق محتمل لأسلوب الشريحة ثلاثية الأبعاد، يظهر جهاز COT-1 RNA FISH للكشف عن الحمض النووي الريبي الوليد. تسهل طريقة الشريحة ثلاثية الأبعاد الفحص التفصيلي للعلاقات المكانية بين بنية الكروماتين والحمض النووي والحمض النووي الريبي أثناء تمايز الخلايا الجرثومية الخصية.

تظهر نتيجة تمثيلية لشريحة ثلاثية الأبعاد في الشكل 2. في هذه التجربة، تم إجراء Cot-1 RNA FISH للكشف عن النسخ الوليد جنبا إلى جنب مع التلطخ المناعي باستخدام الأجسام المضادة CBX1 و γH2AX. للجمع بين RNA FISH و المناعة ، تم إجراء التلطخ المناعي أولا ، يليه RNA FISH كما هو موضح في3. CBX1 هو بروتين هيتير?...

Watch this Scientific Journal Video about Slide Preparation Method to Preserve Three-dimensional Chromatin Architecture of Testicular Germ Cells at JoVE.com

Slide Preparation Method to Preserve Three-dimensional Chromatin Architecture of Testicular Germ Cells

تصف المادة هنا طريقة تم تطويرها للحفاظ على بنية الكروماتين ثلاثية الأبعاد للخلايا الجرثومية الخصية. وقد أطلق على هذا الأسلوب الشريحة ثلاثية الأبعاد (3D). هذه الطريقة تحسن الحساسية للكشف عن الهياكل شبه النووية وتنطبق على الفلورة المناعية والحمض النووي وفلور الحمض النووي الريبي في التهجين الموقعي (FISH).

طريقة إعداد الشرائح للحفاظ على هندسة الكروماتين ثلاثية الأبعاد للخلايا الجرثومية الخصية

During testicular germ cell differentiation, the structure of nuclear chromatin dynamically changes. The following describes a method designed to preserve ...

slide-preparation-method-to-preserve-three-dimensional-chromatin

Research

JoVE Journal

Biology

7.3K Views.  Cincinnati Children's Hospital Medical Center. تصف المادة هنا طريقة تم تطويرها للحفاظ على بنية الكروماتين ثلاثية الأبعاد للخلايا الجرثومية الخصية. وقد أطلق على هذا الأسلوب الشريحة ثلاثية الأبعاد (3D). هذه الطريقة تحسن الحساسية للكشف عن الهياكل شبه النووية وتنطبق على الفلورة المناعية والحمض النووي وفلور الحم...

Video: Slide Preparation Method to Preserve Three-dimensional Chromatin Architecture of Testicular Germ Cells

Microfabrication of Chip-sized Scaffolds for Three-dimensional Cell cultivation

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell cultivation. These technologies offer a wide spectrum of advantages not only for manufacturing but also for different applications. The size and shape of formed cell clusters can be influenced by the exact and reproducible architecture of the microfabricated scaffold and, therefore, the diffusion path length of nutrients and gases can be controlled.1 This is unquestionably a useful tool to prevent apoptosis and necrosis of cells due to an insufficient nutrient and gas supply or removal of cellular metabolites.
Our polymer chip, called CellChip, has the outer dimensions of 2 x 2 cm with a central microstructured area. This area is subdivided into an array of up to 1156 microcontainers with a typical dimension of 300 m edge length for the cubic design (cp- or cf-chip) or of 300 m diameter and depth for the round design (r-chip).2
So far, hot embossing or micro injection moulding (in combination with subsequent laborious machining of the parts) was used for the fabrication of the microstructured chips. Basically, micro injection moulding is one of the only polymer based replication techniques that, up to now, is capable for mass production of polymer microstructures.3 However, both techniques have certain unwanted limitations due to the processing of a viscous polymer melt with the generation of very thin walls or integrated through holes. In case of the CellChip, thin bottom layers are necessary to perforate the polymer and provide small pores of defined size to supply cells with culture medium e.g. by microfluidic perfusion of the containers.
In order to overcome these limitations and to reduce the manufacturing costs we have developed a new microtechnical approach on the basis of a down-scaled thermoforming process. For the manufacturing of highly porous and thin walled polymer chips, we use a combination of heavy ion irradiation, microthermoforming and track etching. In this so called "SMART" process (Substrate Modification And Replication by Thermoforming) thin polymer films are irradiated with energetic heavy projectiles of several hundred MeV introducing so-called "latent tracks" Subsequently, the film in a rubber elastic state is formed into three dimensional parts without modifying or annealing the tracks. After the forming process, selective chemical etching finally converts the tracks into cylindrical pores of adjustable diameter.

We present two processes for the microfabrication of porous polymer chips for three-dimensional cell cultivation. The first one is hot embossing combined with a solvent vapour welding process. The second one uses a recently developed microthermoforming process combined with ion track technology leading to a significant simplification of manufacture.

التصنيع الدقيق للرقاقة الحجم السقالات لزراعة الخلايا ثلاثي الأبعاد

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell ...

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, into close spatial proximity 2-6. Deciphering the relationship between chromosome organization and genome activity will aid in understanding genomic processes, like transcription and replication. However, little is known about how chromosomes fold. Microscopy is unable to distinguish large numbers of loci simultaneously or at high resolution. To date, the detection of chromosomal interactions using chromosome conformation capture (3C) and its subsequent adaptations required the choice of a set of target loci, making genome-wide studies impossible 7-10.
We developed Hi-C, an extension of 3C that is capable of identifying long range interactions in an unbiased, genome-wide fashion. In Hi-C, cells are fixed with formaldehyde, causing interacting loci to be bound to one another by means of covalent DNA-protein cross-links. When the DNA is subsequently fragmented with a restriction enzyme, these loci remain linked. A biotinylated residue is incorporated as the 5' overhangs are filled in. Next, blunt-end ligation is performed under dilute conditions that favor ligation events between cross-linked DNA fragments. This results in a genome-wide library of ligation products, corresponding to pairs of fragments that were originally in close proximity to each other in the nucleus. Each ligation product is marked with biotin at the site of the junction. The library is sheared, and the junctions are pulled-down with streptavidin beads. The purified junctions can subsequently be analyzed using a high-throughput sequencer, resulting in a catalog of interacting fragments.
Direct analysis of the resulting contact matrix reveals numerous features of genomic organization, such as the presence of chromosome territories and the preferential association of small gene-rich chromosomes. Correlation analysis can be applied to the contact matrix, demonstrating that the human genome is segregated into two compartments: a less densely packed compartment containing open, accessible, and active chromatin and a more dense compartment containing closed, inaccessible, and inactive chromatin regions. Finally, ensemble analysis of the contact matrix, coupled with theoretical derivations and computational simulations, revealed that at the megabase scale Hi-C reveals features consistent with a fractal globule conformation.

The Hi-C method allows unbiased, genome-wide identification of chromatin interactions (1). Hi-C couples proximity ligation and massively parallel sequencing. The resulting data can be used to study genomic architecture at multiple scales: initial results identified features such as chromosome territories, segregation of open and closed chromatin, and chromatin structure at the megabase scale.

مرحبا - C : طريقة لدراسة الهندسة المعمارية ثلاثي الأبعاد للخريطة جينوم.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

Isolation of Mammary Epithelial Cells from Three-dimensional Mixed-cell Spheroid Co-culture

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work has been done using classical two-dimensional cell culture models, which allow for easy cell manipulation. It has become clear that intracellular signaling pathways are affected by extracellular forces, including dimensionality and cell surface tension3-4. Multiple approaches have been taken to develop three-dimensional models that more accurately represent biologic tissue architecture3. While these models incorporate multi-dimensionality and architectural stresses, study of the consequent effects on cells is less facile than in two-dimensional tissue culture due to the limitations of the models and the difficulty in extracting cells for subsequent analysis.
The important role of the microenvironment around tumors in tumorigenesis and tumor behavior is becoming increasingly recognized4. Tumor stroma is composed of multiple cell types and extracellular molecules. During tumor development there are bidirectional signals between tumor cells and stromal cells5. Although some factors participating in tumor-stroma co-evolution have been identified, there is still a need to develop simple techniques to systematically identify and study the full array of these signals6. Fibroblasts are the most abundant cell type in normal or tumor-associated stromal tissues, and contribute to deposition and maintenance of basement membrane and paracrine growth factors7.
Many groups have used three dimensional culture systems to study the role of fibroblasts on various cellular functions, including tumor response to therapies, recruitment of immune cells, signaling molecules, proliferation, apoptosis, angiogenesis, and invasion8-15. We have optimized a simple method for assessing the effects of mammary fibroblasts on mammary epithelial cells using a commercially available extracellular matrix model to create three-dimensional cultures of mixed cell populations (co-cultures)16-22. With continued co-culture the cells form spheroids with the fibroblasts clustering in the interior and the epithelial cells largely on the exterior of the spheroids and forming multi-cellular projections into the matrix. Manipulation of the fibroblasts that leads to altered epithelial cell invasiveness can be readily quantified by changes in numbers and length of epithelial projections23. Furthermore, we have devised a method for isolating epithelial cells out of three-dimensional co-culture that facilitates analysis of the effects of fibroblast exposure on epithelial behavior. We have found that the effects of co-culture persist for weeks after epithelial cell isolation, permitting ample time to perform multiple assays. This method is adaptable to cells of varying malignant potential and requires no specialized equipment. This technique allows for rapid evaluation of in vitro cell models under multiple conditions, and the corresponding results can be compared to in vivo animal tissue models as well as human tissue samples.

A simple method is described for analyzing effects of tissue fibroblasts on associated epithelial cells. The combination of this method and three-dimensional tissue culture can facilitate analysis of cells after isolation from 3D. The technique is applicable to cells of varying malignant potential, allowing systematic study of effects of tumor-associated stroma on tumor cells.

عزل الخلايا الظهارية الثديية من ثلاثي الأبعاد الخلايا المختلطة الجسم الشبه الكروي ثقافة المشارك

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work ...

Simple and Efficient Technique for the Preparation of Testicular Cell Suspensions

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline cells. This heterogeneity is an important drawback concerning the study of the bases of mammalian spermatogenesis, as pure or enriched cell populations in certain stages of sperm development are needed for most molecular analyses1.
 Various strategies such as Staput2,3, centrifugal elutriation1, and flow cytometry (FC)4,5 have been employed to obtain enriched or purified testicular cell populations in order to enable differential gene expression studies. 
It is required that cells are in suspension for most enrichment/ purification approaches. Ideally, the cell suspension will be representative of the original tissue, have a high proportion of viable cells and few multinucleates - which tend to form because of the syncytial nature of the seminiferous epithelium6,7 - and lack cell clumps1 . Previous reports had evidenced that testicular cell suspensions prepared by an exclusively mechanical method clumped more easily than trypsinized ones1 . On the other hand, enzymatic treatments with RNAses and/or disaggregating enzymes like trypsin and collagenase lead to specific macromolecules degradation, which is undesirable for certain downstream applications. The ideal process should be as short as possible and involve minimal manipulation, so as to achieve a good preservation of macromolecules of interest such as mRNAs. Current protocols for the preparation of cell suspensions from solid tissues are usually time-consuming, highly operator-dependent, and may selectively damage certain cell types1,8 . 
	The protocol presented here combines the advantages of a highly reproducible and extremely brief mechanical disaggregation with the absence of enzymatic treatment, leading to good quality cell suspensions that can be used for flow cytometric analysis and sorting4, and ulterior gene expression studies9 .

A novel protocol for the mechanical preparation of testicular cell suspensions from rodent material, avoiding enzymes and detergents, is described. The method is very simple, fast, reproducible, and renders good quality cell suspensions, which are suitable for flow sorting and RNA extraction.

تقنيات بسيطة وفعالة لإعداد تعليق خلية الخصية

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline ...

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the adult plant. The female SMC (megaspore mother cell, MMC) differentiates in the ovule primordium and undergoes meiosis. The selected haploid megaspore then undergoes mitosis to form the multicellular female gametophyte, which will give rise to the gametes, the egg cell and central cell, together with accessory cells. The limited accessibility of the MMC, meiocyte and female gametophyte inside the ovule is technically challenging for cytological and cytogenetic analyses at single cell level. Particularly, direct or indirect immunodetection of cellular or nuclear epitopes is impaired by poor penetration of the reagents inside the plant cell and single-cell imaging is demised by the lack of optical clarity in whole-mount tissues.
Thus, we developed an efficient method to analyze the nuclear organization and chromatin modification at high resolution of single cell in whole-mount embedded Arabidopsis ovules. It is based on dissection and embedding of fixed ovules in a thin layer of acrylamide gel on a microscopic slide. The embedded ovules are subjected to chemical and enzymatic treatments aiming at improving tissue clarity and permeability to the immunostaining reagents. Those treatments preserve cellular and chromatin organization, DNA and protein epitopes. The samples can be used for different downstream cytological analyses, including chromatin immunostaining, fluorescence in situ hybridization (FISH), and DNA staining for heterochromatin analysis. Confocal laser scanning microscopy (CLSM) imaging, with high resolution, followed by 3D reconstruction allows for quantitative measurements at single-cell resolution.

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

We provide here an efficient and reliable protocol for immunostaining, Fluorescence in&#160;situ Hybridization, DNA staining followed by quantitative, high-resolution imaging in whole-mount Arabidopsis thaliana ovules. This method was successfully used to analyze chromatin modifications and nuclear architecture.

وسيلة فعالة للالكمي، التحليل خلية واحدة من لونين تعديل والعمارة النووية في جبل لالجامع بويضات في<em&gt; نبات الأرابيدوبسيس</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly employ two-dimensional (2D) culture, which does not mimic the three-dimensional (3D) cellular microenvironment. A method to perform quenched emission FRET imaging using conventional widefield epifluorescence microscopy of cells within a 3D hydrogel environment is presented. Here an analysis method for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the probe activation range is described. Measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) levels is demonstrated in chondrocytes under forskolin stimulation using a probe for EPAC1 activation (ICUE1) and the ability to detect differences in cAMP signaling dependent on hydrogel material type, herein a photocrosslinking hydrogel (PC-gel, polyethylene glycol dimethacrylate) and a thermoresponsive hydrogel (TR-gel). Compared with 2D FRET methods, this method requires little additional work. Laboratories already utilizing FRET imaging in 2D can easily adopt this method to perform cellular studies in a 3D microenvironment. It can further be applied to high throughput drug screening in engineered 3D microtissues. Additionally, it is compatible with other forms of FRET imaging, such as anisotropy measurement and fluorescence lifetime imaging (FLIM), and with advanced microscopy platforms using confocal, pulsed, or modulated illumination.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging is a powerful tool for real-time cell biology studies. Here a method for FRET imaging cells in physiologic three-dimensional (3D) hydrogel microenvironments using conventional epifluorescence microscopy is presented. An analysis for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the activation range is described.

الحنق التصوير في الهلاميات المائية ثلاثية الأبعاد

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Three-dimensional Reconstruction of the Vascular Architecture of the Passive CLARITY-cleared Mouse Ovary

The ovary is the main organ of the female reproductive system and is essential for the production of female gametes and for controlling the endocrine system, but the complex structural relationships and three-dimensional (3D) vasculature architectures of the ovary are not well described. In order to visualize the 3D connections and architecture of blood vessels in the intact ovary, the first important step is to make the ovary optically clear. In order to avoid tissue shrinkage, we used the hydrogel fixation-based passive CLARITY (Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging/ Immunostaining/In situ-hybridization-compatible Tissue Hydrogel) protocol method to clear an intact ovary. Immunostaining, advanced multiphoton confocal microscopy, and 3D image-reconstructions were then used for the visualization of ovarian vessels and follicular capillaries. Using this approach, we showed a significant positive correlation (P &#60;0.01) between the length of the follicular capillaries and volume of the follicular wall.

Here we present an adaptation of the passive CLARITY and 3D reconstruction method for visualization of the ovarian vasculature and follicular capillaries in intact mouse ovaries.

إعادة البناء ثلاثي الأبعاد بنية الأوعية الدموية المبيض الماوس مسح الوضوح السلبي

The ovary is the main organ of the female reproductive system and is essential for the production of female gametes and for controlling the endocrine ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte precursors, immune cells, fibroblasts, blood vessels, and nerve projections. Although the molecular control of cell type specification and how these cells interact have been increasingly delineated, a more comprehensive understanding of these adipose-resident cells can be achieved by visualizing their distribution and architecture throughout the whole tissue. Existing immunohistochemistry and immunofluorescence approaches to analyze adipose histology rely on thin paraffin-embedded sections. However, thin sections capture only a small portion of tissue; as a result, the conclusions can be biased by what portion of tissue is analyzed. We have therefore developed an adipose tissue clearing technique, Adipo-Clear, to permit comprehensive three-dimensional visualization of molecular and cellular patterns in whole adipose tissues. Adipo-Clear was adapted from iDISCO/iDISCO+, with specific modifications made to completely remove the lipid stored in the tissue while preserving native tissue morphology. In combination with light-sheet fluorescence microscopy, we demonstrate here the use of the Adipo-Clear method to obtain high-resolution volumetric images&#160;of an entire adipose tissue.

Due to the high lipid content, adipose tissue has been challenging to visualize using traditional histological methods. Adipo-Clear is a tissue clearing technique that allows robust labeling and high-resolution volumetric fluorescent imaging of adipose tissue. Here, we describe the methods for sample preparation, pretreatment, staining, clearing, and mounting for imaging.

أديبو--واضحة: منديل مسح طريقة لتصوير ثلاثي الأبعاد للأنسجة الدهنية

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development and function as well as disease. Fluorescence microscopy has played a major role in characterizing their cellular composition in detail and demonstrating their similarity to the tissue they originate from. In this article, we present a comprehensive protocol for high-resolution 3D imaging of whole organoids upon immunofluorescent labeling. This method is widely applicable for imaging of organoids differing in origin, size and shape. Thus far we have applied the method to airway, colon, kidney, and liver organoids derived from healthy human tissue, as well as human breast tumor organoids and mouse mammary gland organoids. We use an optical clearing agent, FUnGI, which enables the acquisition of whole 3D organoids with the opportunity for single-cell quantification of markers. This three-day protocol from organoid harvesting to image analysis is optimized for 3D imaging using confocal microscopy.

The entire 3D structure and cellular content of organoids, as well as their phenotypic resemblance to the original tissue can be captured using the single-cell resolution 3D imaging protocol described here. This protocol can be applied to a wide range of organoids varying in origin, size and shape.

وحيد الخلية القرار التصوير ثلاثي الأبعاد من organoids سليمة

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...

Evaluating the Angiogenetic Properties of Ovarian Cancer Stem-Like Cells using the Three-Dimensional Co-Culture System, NICO-1

Cancer stem cells (CSCs) reside in a supportive niche, constituting a microenvironment comprised of adjacent stromal cells, vessels, and extracellular matrix. The ability of CSCs to participate in the development of endothelium constitutes an important characteristic that directly contributes to the general understanding of the mechanisms of tumorigenesis and tumor metastasis. The purpose of this work is to establish a reproducible methodology to investigate the tumor-initiation capability of ovarian cancer stem cells (OCSCs). Herein, we examined the neovascularization mechanism between endothelial cells and OCSCs along with the morphological changes of endothelial cells using the in vitro co-culture model NICO-1. This protocol allows visualization of the neovascularization step surrounding the OCSCs in a time course manner. The technique can provide insight regarding the angiogenetic properties of OCSCs in tumor metastasis.

Ovarian cancer stem cells (OCSC) are responsible for cancer initiation, recurrence, therapeutic resistance, and metastasis. The OCSC vascular niche is considered to promote self-renewal of OCSCs, leading to chemoresistance. This protocol provides the basis for establishing a reproducible OCSC vascular niche model in vitro.

تقييم الخصائص الوعائية الوراثية للخلايا الشبيهة بسرطان المبيض باستخدام نظام الثقافة المشتركة ثلاثي الأبعاد ، NICO-1

Cancer stem cells (CSCs) reside in a supportive niche, constituting a microenvironment comprised of adjacent stromal cells, vessels, and extracellular ...