Nous tenons à remercier les membres du laboratoire Skok, surtout Susannah Hewitt, de discussions et de commentaires. Ce travail est soutenu par l&#39;Institut national de la santé subventions R01GM086852, RC1CA145746 (JAS). JAS est une leucémie et érudit Lymphoma Society. JC est un Fellow Irvington Institut de la recherche sur le cancer Institut. MM est soutenu par une éducation National Science Foundation Grant universitaire intégré et des stages de recherche (NSF IGERT 0333389).

1. Étiquetage sonde d&#39;ADN avec des fluorophores: Nick Translation (~ 6 h) <ol><li> Propre ADN de BAC (préparé par maxi-prep) ou des plasmides ou des produits de PCR, tous remis en suspension dans H 2 O, peut être utilisé pour le marquage. Notez que pour un signal FISH robuste, sondes doivent couvrir au moins 10 kb. </li><li> Incuber ADN dans RNase A pendant 30 min à 37 ° C (Tous les réactifs sont énumérées dans le tableau 1). </li><li> Incuber la réaction translation de coupure pendant 2 heures à 16 ° C (voir les tableaux 2 et 3). D&#39;autres méthodes de marquage direct peut être utilisé (Exemple: Tag FISH, Invitrogen). </li><li> Inactiver la réaction pendant une heure à -80 ° C ou une nuit à -20 ° C. </li><li> Déterminer la taille de la sonde sur un gel d&#39;agarose à 2%. Le frottis doit être comprise entre 100 et 1000 pb, avec la majorité, à environ 300-500 pb (Notez que le frottis de Cy5-sondes n&#39;est pas visible). Si l&#39;ADN est digéré pas assez, plus l&#39;ADN Pol I etDNase I peut être ajouté au mélange réactionnel et on incube pendant deux heures plus à 16 ° C. </li><li> Purifier sondes sur 0,025 mm de filtres deux béchers litres remplis de H 2 0 pendant deux heures dans l&#39;obscurité. </li><li> Ajouter facteurs de blocage des sondes comme suit: 10 pg d&#39;ADN Cot-1, 10 pg d&#39;ADN Hybloc et 100 pg de sperme de saumon pour 10 pg de sondes d&#39;ADN. Des sondes d&#39;ADN conserver à -20 ° C. </li></ol> 2. Sonde de précipitation / dénaturation / pré-recuit (h 3-4) <ol><li> Entre 0,3 pg et 1 pg de sonde d&#39;ADN est utilisé par lamelle. Sondes mélanger avec 0,1 volume de 3M NaAc (pH 5,2) et 2,5 volumes d&#39;éthanol à 100%, incuber pendant une heure à -80 ° C ou une nuit à -20 ° C et centrifuger à 13000 rpm à 4 ° C pendant 30 min. A noter que la quantité de sonde d&#39;ADN peut être ajustée en fonction de la qualité de l&#39;ADN et la région nucléaire de l&#39;hybridation. D&#39;autres méthodes de marquage direct peut permettre l&#39;utilisation de quantités réduites desonde. Pour la détection de multiples signaux FISH ADN sur une diapositive, les différentes sondes peuvent être précipités ensemble (à l&#39;exception des sondes qui ne doit pas être pré-recuit, comme des séquences répétées). Sondes pour plusieurs expériences réalisées dans le même temps peut également être précipité en même temps. Pellets doivent être légèrement colorés selon les fluorophores utilisés (si de petites quantités de sondes sont précipités, le culot peut ne pas être visible). </li><li> Granulés secs et les remettre en suspension dans 15 ul de tampon d&#39;hybridation (voir tableau 4) par lamelle avec agitation (à l&#39;aide d&#39;un thermomixer Eppendorf) dans l&#39;obscurité à 37-45 ° C (pendant environ 20 mn). </li><li> Sondes dénaturer pendant 5 min à 75-95 ° C. </li><li> Pré-recuit sondes à 37 ° C pendant 30-60 min. Longueur de pré-recuit peut être ajustée en fonction de la complexité et de la qualité des sondes. </li><li> Appliquer des sondes pour les lamelles d&#39;hybridation pendant la nuit (voir la section 3). </li></ol> 3. 3Dimensions FISH ADN - Premier Jour (~ 3 h) <ol><li> Les cellules non adhérentes sont concentrés dans un petit volume de PBS 1x (~ 2x10 5 cellules à 5-10 pl de PBS 1x par lamelle) et tombe sur le centre d&#39;une lamelle couvre-poly-L-lysine enrobée. Les cellules adhérentes doivent être cultivées sur des lamelles pendant au moins 24 heures (~ 70% de confluence) (lamelles peuvent être revêtus de gélatine à 0,1%). Lamelles carrées 18x18 mm à 24-24 sont placées dans des plaques 6 puits, et tout au long du protocole, deux ml de chaque solution est utilisée par puits (alternativement rondes 1,5 mm lamelles peuvent être placés dans des plaques 12/24-well). </li><li> Fixer les cellules dans du paraformaldéhyde à 2% / PBS 1x, pH 7 à 7,4, pendant 10 min à température ambiante (4% des stocks PFA peut être aliquotés, stocké à -20 ° C). Paraformaldéhyde peuvent être achetés en solution (16%), ou des solutions mères 4% peut être préparé à partir de poudre / granulés. Paraformaldéhyde en poudre est dissoute dans du PBS 1x à&gt; 60 ° C (pH peut être augmenté à 8-9 pour faciliter la dissolution), refroidie sur la glace, réglezà pH 7 à 7,4 ed, filtré, aliquoté dans des faucons et stockées pendant des semaines à -20 ° C. </li><li> Après trois rinçages dans PBS 1x, perméabiliser les cellules de glace-froid 0,4% de Triton-X-100/1 x PBS pendant 5 min sur la glace. Longueur de perméabilisation peut être ajustée en fonction de la cellule de type NB:. Si FISH ADN est combiné avec l&#39;immunofluorescence, l&#39;immunomarquage doit être effectuée à ce stade (voir la section 4). </li><li> Après trois rinçages dans PBS 1x, incuber les cellules avec 0,1 ug / ul RNase A en 1x PBS pendant une heure à 37 ° C. Lamelles sont placées côté cellule vers le bas sur une baisse de 100 pi de solution sur du parafilm ou une diapositive dans une chambre humide. Lamelles sont ensuite soigneusement retiré avec une pince. Si une résistance est rencontrée, lamelles doivent être inondé de 1x PBS afin d&#39;éviter d&#39;endommager les cellules. </li><li> Après trois rinçages dans PBS 1x, perméabiliser les cellules de glace-froid 0,7% de Triton-X-100 HCl / 0,1 M pendant 10 min sur la glace. </li><li> Après trois rinçages in 1x PBS, les cellules dénaturer dans HCl 1,9 M pendant 30 min à température ambiante. Alternativement, les cellules peuvent être dénaturées dans 50% de formamide / 2x SSC à 75-80 ° C pendant au moins 30 min. Noter que la longueur d&#39;hybridation (et de la température) peut être optimisée en fonction de la cellule-type. </li><li> Après trois rinçages dans de la glace-froid 1x PBS, les cellules s&#39;hybrider avec des sondes nuit à 37 ° C dans une chambre sombre et humide. Lamelles sont placées côté cellule vers le bas sur une baisse de 15 pl de sonde sur une diapositive, et scellé avec du ciment de caoutchouc. </li></ol> 4. 3-dimensionnelle d&#39;immuno-FISH - Premier jour (~ 6-7 h) <ol><li> Pour combiner immunofluorescence / DNA FISH, l&#39;immuno-marquage doit être effectué après la perméabilisation de 0,4% de Triton-X-100 (étape 3.3). </li><li> Incuber les cellules dans une solution de blocage pendant 30 min à température ambiante (2,5% de sérumalbumine bovine (BSA), sérum de chèvre normal à 10%, 0,1% Tween-20). La solution de blocage est filtré, aliquoté dans eppendorfs de 1,5 ml et stocké pour mois à -20 ° C. </li><li> Incuber les cellules avec l&#39;anticorps primaire dirigé contre la protéine ou la modification d&#39;histone d&#39;intérêt dilué dans une solution de blocage, pendant une heure à température ambiante en chambre humide. Ici, nous montrons l&#39;exemple d&#39;un anticorps contre phosphorylés sérine-139 de H2AX (γ-H2AX, Millipore, voir le tableau 5 pour plus de détails). Lamelles sont placées côté cellule vers le bas sur une baisse de 100 pi de solution sur du parafilm ou une diapositive dans une chambre humide. Lamelles sont ensuite soigneusement retiré avec une pince (inondé de PBS 1x, si nécessaire). Notez que la dilution et la durée d&#39;incubation peut être ajustée en fonction de la qualité de l&#39;anticorps et de cellules-types. </li><li> Laver les cellules dans 0,2% de BSA / 0,1% Tween-20 / PBS 1x, trois fois 5 min à température ambiante sous agitation. </li><li> Incuber les cellules avec le cas échéant un fluorophore conjugué anticorps secondaire dilué dans une solution de blocage pendant une heure à température ambiante dans une chambre sombre et humide. Ici, nous montrons un exemple de détection d&#39;unsecondaire de chèvre anti-anticorps de souris (Alexa Fluor 488 ou 555, Invitrogen; Voir le tableau 5 pour plus de détails). Haptène-anticorps secondaires conjugués (biotine, la digoxigénine, etc) peuvent également être utilisés. Dans ce cas, une étape supplémentaire pour la détection approprié (streptavidine, anti-dig, etc) peut être effectuée avant ou après pendant la nuit ADN-FISH hybridation. </li><li> Rincer les cellules dans 0,1% de Tween-20 / PBS 1x, trois fois 5 min à température ambiante sous agitation dans l&#39;obscurité. </li><li> Post-fix cellules dans du paraformaldéhyde à 2% / PBS 1x pendant 10 min à température ambiante dans l&#39;obscurité. </li><li> Continuer FISH ADN comme ci-dessus à partir d&#39;incubation de la RNase A (étape 3.4). </li></ol> 5. 3-dimensions ADN FISH / Immuno-FISH - Deuxième jour (~ 2 h) <ol><li> Retirez délicatement la colle de caoutchouc, des lamelles crues avec 2x SSC, retirer délicatement avec une pince et placez-les dans des puits contenant la solution de lavage. </li><li> Laver les cellules dans du SSC 2X pendant 30 min à 37 ° C dans l&#39;obscurité sous agitation.</li><li> Laver les cellules dans du SSC 2X pendant 30 min à température ambiante dans l&#39;obscurité sous agitation. </li><li> Laver les cellules en 1x SSC pendant 30 min à température ambiante dans l&#39;obscurité sous agitation à noter que dans le cas de la dénaturation de formamide, lavages doit être remplacé par le texte suivant:. Lavage 3 en lavages formamide / 2x SSC et 3 50% en 2x SSC, 5 min chacun, à 37 ° C. </li><li> Monter les cellules dans ProLong moyen de montage d&#39;or contenant 1,5 mg / ml DAPI (4,6-diamidino-2-phénylindole) pour la contre de l&#39;ADN total. Lamelles sont placées côté cellule vers le bas sur une baisse de 10-15 ul de milieu de montage sur une lame et scellé avec du vernis à ongles. Les lames sont conservées pendant plusieurs mois à -20 ° C. </li></ol> 6. Microscopie 3D et d&#39;analyse <ol><li> Images en 3D peuvent être acquises avec des systèmes différents microscope. Dans nos expériences, des sections optiques séparées par 0,3 um sont recueillies sur un système Leica SP5 AOBS confocale (acousto-optique Beam Splitter). Notez que la séparation entre opticaavions l peut être réglée en fonction du type d&#39;analyse. </li><li> Piles d&#39;images 3D peuvent être analysées à l&#39;aide du logiciel et des outils différents. Nous utilisons le logiciel Image J pour évaluer les mesures de distance entre les loci d&#39;intérêt et d&#39;analyser les différents types d&#39;associations des loci d&#39;intérêt avec des sous-compartiments nucléaires ou des protéines. </li><li> Toutes les analyses statistiques sont effectuées pour comparer les deux (ou plus) différentes conditions biologiques de paires évaluation (s) d&#39;importance: comparaison entre les différents types de cellules ou de stades, la comparaison entre les différents loci d&#39;intérêt. Dans tous les tests statistiques, les valeurs P ≤ 5,00 E-2 (a = 0,05) sont considérées comme significatives (1,00 E-2 ≤ P ≤ 5,00 E-2 * significatif; 1.00E-3 ≤ P ≤ 1,00 E-2 * * très significative, p &lt;1,00 E-3 *** très important). </li></ol> L&#39;analyse statistique des distributions entières de distances entre deux allèles. Nous avons d&#39;abord construct cumulatifs courbes de fréquence de distribution sur toute la plage de distances mesurées entre les deux alleles.To évaluer l&#39;importance des différences entre les distributions empiriques des inter-distances alléliques nous utilisons le test non paramétrique de deux échantillons de Kolmogorov-Smirnov (KS) 13,14 essai. L&#39;analyse statistique de près association (association par exemple) à l&#39;aide de deux allèles à une distance optimale de coupure. Afin d&#39;identifier la gamme de la plupart des différences dans les distances robustes entre deux allèles ou loci, nous utilisons une série de deux-tail test exact de Fisher 15 s. Plus précisément, à chaque distance mesurée nous tester si une condition est nettement surreprésentés à des distances plus courtes entre les deux échantillons. Le minimum de la distribution des valeurs de p indique la plage de distances qui doivent être considérées comme une coupure de près association (c.-à-appariement) des deux allèles. Par la suite le test de Fisher bilatéral exact est utilisé to évaluer l&#39;importance de l&#39;appariement de deux allèles identifiés à la valeur seuil 15. Corrections de tests multiples sont appliqués pour tenir compte du nombre total de tests de Fisher effectué 16. L&#39;analyse statistique de l&#39;association du locus d&#39;intérêt avec des sous-compartiments nucléaires ou des protéines. Le test bilatéral exact de Fisher-est utilisée pour analyser l&#39;importance de l&#39;association du locus d&#39;intérêt avec différents compartiments ou des protéines 15.

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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAG-1+and+ATM+coordinate+monoallelic+recombination+and+nuclear+positioning+of+immunoglobulin+loci.">RAG-1 and ATM coordinate monoallelic recombination and nuclear positioning of immunoglobulin loci.</a> Nature immunology. 10, 655-664 (2009).</li><li>Deriano, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RAG2+C+terminus+suppresses+genomic+instability+and+lymphomagenesis.">The RAG2 C terminus suppresses genomic instability and lymphomagenesis.</a> Nature. 471, 119-123 (2011).</li><li>Brown, K. E., Baxter, J., Graf, D., Merkenschlager, M., Fisher, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+repositioning+of+genes+in+the+nucleus+of+lymphocytes+preparing+for+cell+division.">Dynamic repositioning of genes in the nucleus of lymphocytes preparing for cell division.</a> Molecular cell. 3, 207-217 (1999).</li><li>Fernandez-Capetillo, O., Lee, A., Nussenzweig, M., Nussenzweig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H2AX:+the+histone+guardian+of+the+genome.">H2AX: the histone guardian of the genome.</a> DNA repair. 3, 959-967 (2004).</li><li>Croft, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+the+localization+and+morphology+of+chromosomes+in+the+human+nucleus.">Differences in the localization and morphology of chromosomes in the human nucleus.</a> The Journal of cell biology. 145, 1119-1131 (1999).</li><li>Chaumeil, J., Le Baccon, P., Wutz, A., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+role+for+Xist+RNA+in+the+formation+of+a+repressive+nuclear+compartment+into+which+genes+are+recruited+when+silenced.">A novel role for Xist RNA in the formation of a repressive nuclear compartment into which genes are recruited when silenced.</a> Genes Dev. 20, 2223-2237 (2006).</li><li>Walter, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+many+colors+in+FISH+on+3D-preserved+interphase+nuclei.">Towards many colors in FISH on 3D-preserved interphase nuclei.</a> Cytogenetic and genome research. 114, 367-378 (2006).</li><li>Toomre, D., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+wave+of+cellular+imaging.">A new wave of cellular imaging.</a> Annual review of cell and developmental biology. 26, 285-314 (2010).</li><li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy.">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> The Journal of cell biology. 190, 165-175 (2010).</li><li>Dobbie, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OMX:+a+new+platform+for+multimodal,+multichannel+wide-field+imaging.">OMX: a new platform for multimodal, multichannel wide-field imaging.</a> Cold Spring Harbor protocols. , 899-909 (2011).</li><li>Boyle, S., Rodesch, M. J., Halvensleben, H. A., Jeddeloh, J. A., Bickmore, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization+with+high-complexity+repeat-free+oligonucleotide+probes+generated+by+massively+parallel+synthesis.">Fluorescence in situ hybridization with high-complexity repeat-free oligonucleotide probes generated by massively parallel synthesis.</a> Chromosome research : an international journal on the molecular, supramolecular and evolutionary aspects of chromosome biology. 19, 901-909 (2011).</li></ol>

Les auteurs déclarent n&#39;avoir aucun conflit d&#39;intérêts financiers.

Les techniques décrites ci-dessus ont été utilisées dans notre laboratoire pour analyser la réglementation de V (D) J de l&#39;immunoglobuline et TCRA / j loci dans le développement des lymphocytes 30,31. Nous sommes convaincus que cette technique peut être adaptée pour la détection de diverses protéines nucléaires, des compartiments nucléaires et les lieux, dans différents types cellulaires. Modifications du protocole peut être nécessaire, et dans ce cas les étapes majeures ...

Épigénétique mise en place de mécanismes de déclenchement et l&#39;héritage de développement et d&#39;un type de cellule spécifique profils transcriptionnels. À un certain niveau, cela implique la modulation de empaquetage de la chromatine qui définit des régions génomiques actifs ou silencieux. À plus grande échelle, l&#39;organisation mondiale de la 3D et de l&#39;architecture du génome nucléaire jouent également un rôle dans le contrôle des motifs de la transcription. Ainsi, la dissection de ces caractéristiques épigénomiques est essentielle pour une compréhension complète de la façon dont les gènes sont régulés 6-11. Combiné FISH ADN immunofluorescence et 3D offrent une occasion unique de compléter les analyses moléculaires et biochimiques en évaluant les interactions spécifiques / associations de séquences d&#39;ADN et / ou de protéines dans le noyau. En outre, alors que l&#39;ensemble du génome techniques à haut débit tels que immunoprécipitation de la chromatine (ChIP-seq) ou la conformation de capture chromosome couplé avec le séquençage profond (4C-seq, 5C, Salut-C) fournir dat mondialeun sur 12 populations de cellules, les techniques d&#39;immunofluorescence POISSON / ADN permettre des analyses au niveau de la cellule unique. Nous décrivons ici un protocole pour la détection simultanée des modifications des histones par des séquences d&#39;ADN immunofluorescence et par FISH ADN suivies par microscopie 3D et des analyses (3D immuno-FISH). L&#39;avantage de ce protocole est la visualisation combinée de l&#39;ADN et la préservation de la structure des protéines. Notre expérience dans ce domaine nous a permis d&#39;améliorer et de simplifier les protocoles existants. Bien que nous ayons utilisé ce protocole pour détecter l&#39;ADN des cassures double brin dans les lymphocytes subissent une recombinaison, cette méthode peut être appliquée à d&#39;autres protéines et d&#39;autres types de cellules.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom de réactif / Matériel </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> H 2 O </td><td> Pêcheur </td><td> # BP2470 </td><td></td></tr><tr><td> RNase A </td><td> Sigma </td><td> # R4642 </td><td></td></tr><tr><td> dNTP </td><td> Sigma </td><td> # DNTP100 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa dUTP </td><td> Invitrogen </td><td> # C11397 à C-11401 </td><td></td></tr><tr><td> Cy3 ou Cy5 dUTP </td><td> Pêcheur </td><td> # 45-001-xxx </td><td></td></tr><tr><td> DNase I </td><td> Roche </td><td> # 04536282001 </td><td></td></tr><tr><td> ADN Pol I </td><td> Biolabs </td><td> # M0209 </td><td></td></tr><tr><td> 0.025 filtres pm </td><td> Millipore </td><td> # VSWP02500 </td><td></td></tr><tr><td> ADN Cot-1 1 mg / ml </td><td> Invitrogen </td><td> # 18440 </td><td></td></tr><tr><td> Hybloc ADN 1 mg / ml </td><td> Applied Genetics </td><td> # MHB </td><td></td></tr><tr><td> De sperme de saumon </td><td> Sigma </td><td> # D1626 </td><td> poudre pour être remises en suspension à 10 mg / ml dans du H 2 O </td></tr><tr><td> NaAc (acétate de sodium, pH 5,2, solution tampon) </td><td> Sigma </td><td> # S7899 </td><td></td></tr><tr><td> Ficoll 400 (Mol Biol grade) </td><td> Pêcheur </td><td> N ° 525 </td><td></td></tr><tr><td> Polyvinylpyrrolidone (Mol Biol grade) </td><td> Pêcheur </td><td> # BP431 </td><td></td></tr><tr><td> Poudre de sulfate de dextrane </td><td> Sigma </td><td> # D8906 </td><td></td></tr><tr><td> PESS (Saline-phosphate de sodium-EDTA) solution 20x </td&gt; <td> Pêcheur </td><td> # BP1328 </td><td></td></tr><tr><td> Formamide </td><td> Pêcheur </td><td> # BP227 </td><td></td></tr><tr><td> Lamelles de </td><td> Pêcheur </td><td> N ° 12-548-B </td><td></td></tr><tr><td> Diapositives </td><td> Pêcheur </td><td> # 12-550 </td><td></td></tr><tr><td> Plaques de 6 puits </td><td> Pêcheur </td><td> # 0720080 </td><td></td></tr><tr><td> PBS, 10x </td><td> Pêcheur </td><td> # MT-46-013-CM </td><td></td></tr><tr><td> La poly-L-lysine solution </td><td> Sigma </td><td> # P8920 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldéhyde, granulés, 95% </td><td> Sigma </td><td> # 441244 </td><td></td></tr><tr><td> Triton-X-100, Mol Biol qualité </td><td> Sigma </td><td> # T8787 </td><td></td></tr><tr><td> Fraction BSA (Bovine Serum Albumin) V </td><td> Pêcheur </td><td> # BP 1600 </td><td></td></tr><tr><td> Sérum normal de chèvre </td><td> Vector Labs </td><td> # S-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Tween-20, Mol Biol qualité </td><td> Sigma </td><td> # P9416 </td><td></td></tr><tr><td> SSC (citrate de sodium salin) 20x solution </td><td> Pêcheur </td><td> # BP1325 </td><td></td></tr><tr><td> ProLong réactif antifade Or </td><td> Invitrogen </td><td> # P36930 </td><td></td></tr><tr><td> DAPI (4 &#39;,6-diamidino-2-phénylindole) </td><td> Sigma </td><td> # D9542 </td><td></td></tr><tr><td> Meilleur essai un ciment enveloppe en caoutchouc </td><td> Magasins de fournitures d&#39;art ou de bureau </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tableau 1. Réactifs spécifiques et du petit matériel. </td></tr></tbody></table>

combined immunofluorescence and dna fish on 3d-preserved interphase nuclei to study changes in 3d nuclear organization

Hybridation fluorescente in situ utilisant des sondes ADN sur le 3-dimensions noyaux conservés suivie par microscopie confocale 3D (FISH ADN 3D) représente le moyen le plus direct pour visualiser l&#39;emplacement des loci de gènes, chromosomes sous-régions ou des territoires entiers dans des cellules individuelles. Ce type d&#39;analyse permet de mieux comprendre l&#39;architecture globale du noyau ainsi que le comportement des loci génomiques spécifiques et des régions dans l&#39;espace nucléaire. Immunofluorescence, d&#39;autre part, permet la détection des protéines nucléaires (histones modifiées, variants d&#39;histones et des modificateurs, des machines et des facteurs de transcription nucléaires, sous-compartiments, etc.) Le problème majeur en combinant FISH ADN immunofluorescence et 3D est, d&#39;une part, de préserver l&#39;épitope détecté par l&#39;anticorps, ainsi que l&#39;architecture 3D du noyau, et d&#39;autre part, pour permettre la pénétration de la sonde d&#39;ADN pour détecter loci chromosomiques ou territoires 1-5. Ici, nous fournissons un protocole qui combine la visualisation des modifications de la chromatine avec loci génomiques conservées dans les noyaux 3D.

ADN et immuno-FISH sont utilisés dans le laboratoire Skok pour étudier les changements dans l&#39;organisation nucléaire associés au processus de V (D) J du locus récepteurs des antigènes au cours du développement des lymphocytes B et T. Les techniques décrites ci-dessus nous permettent de mesurer des distances i) entre les deux extrémités d&#39;un locus (contraction) ii) mesurer les distances entre les allèles ou loci (appariement), iii) analyser l&#39;endommagement de l&#39;ADN survenant dans les lieux, iv)...

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Combined Immunofluorescence and DNA FISH on 3D-preserved Interphase Nuclei to Study Changes in 3D Nuclear Organization

Nous décrivons ici un protocole pour la détection simultanée des modifications des histones par des séquences d&#39;ADN immunofluorescence et par FISH ADN suivies par microscopie 3D (3D et des analyses immuno-FISH ADN).

Immunofluorescence combinés et FISH ADN sur 3D préservé noyaux en interphase pour étudier les changements dans l&#39;organisation nucléaire 3D

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes  on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA  FISH) represents the ...

combined-immunofluorescence-dna-fish-on-3d-preserved-interphase

Research

JoVE Journal

Biology

18.2K vues.  New York University School of Medicine. Nous décrivons ici un protocole pour la détection simultanée des modifications des histones par des séquences d'ADN immunofluorescence et par FISH ADN suivies par microscopie 3D (3D et des analyses immuno-FISH ADN).

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Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

Test sensibilité visuelle à la vitesse et la direction du mouvement chez les lézards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Recherche

Biologie

DNA-based Fish Species Identification Protocol

We have developed a fast, simple, and accurate DNA-based screening method to identify the fish species present in fresh and processed seafood samples. This versatile method employs PCR amplification of genomic DNA extracted from fish samples, followed by restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis to generate fragment patterns that can be resolved on the Agilent 2100 Bioanalyzer and matched to the correct species using RFLP pattern matching software.
The fish identification method uses a simple, reliable, spin column- based protocol to isolate DNA from fish samples. The samples are treated with proteinase K to release the nucleic acids into solution. DNA is then isolated by suspending the sample in binding buffer and loading onto a micro- spin cup containing a silica- based fiber matrix. The nucleic acids in the sample bind to the fiber matrix. The immobilized nucleic acids are washed to remove contaminants, and total DNA is recovered in a final volume of 100 &mu;l. The isolated DNA is ready for PCR amplification with the provided primers that bind to sequences found in all fish genomes. The PCR products are then digested with three different restriction enzymes and resolved on the Agilent 2100 Bioanalyzer. The fragment lengths produced in the digestion reactions can be used to determine the species of fish from which the DNA sample was prepared, using the RFLP pattern matching software containing a database of experimentally- derived RFLP patterns from commercially relevant fish species.

This publication describes how to use the Agilent Fish Species Identification System to identify the species of a fish by extracting DNA and performing PCR and RFLP analysis.

Basées sur l&#39;ADN des espèces de poissons protocole d&#39;identification

We have developed a fast, simple, and accurate DNA-based screening method to identify the fish species present in fresh and processed seafood samples. ...

Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

3D DNA FISH has become a major tool for analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations of the technique have been published. In this article we describe a protocol which has been optimized for robustness, reproducibility, and ease of use. Brightly fluorescent directly labeled probes are generated by nick-translation with amino-allyldUTP followed by chemical coupling of the dye. 3D DNA FISH is performed using a freeze-thaw step for cell permeabilization and a heating step for simultaneous denaturation of probe and nuclear DNA. The protocol is applicable to a range of cell types and a variety of probes (BACs, plasmids, fosmids, or Whole Chromosome Paints) and allows for high-throughput automated imaging. With this method we routinely investigate nuclear localization of up to three chromosomal regions.

We describe a robust and versatile protocol for analyzing nuclear architecture by 3D DNA FISH using directly labeled fluorescent probes.

Robuste FISH 3D DNA Utilisation des sondes directement marquées

3D DNA FISH has become a major tool for  analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations  of the technique have been ...

Assessing Species-specific Contributions To Craniofacial Development Using Quail-duck Chimeras

The generation of chimeric embryos is a widespread and powerful approach to study cell fates, tissue interactions, and species-specific contributions to the histological and morphological development of vertebrate embryos. In particular, the use of chimeric embryos has established the importance of neural crest in directing the species-specific morphology of the craniofacial complex. The method described herein utilizes two avian species, duck and quail, with remarkably different craniofacial morphology. This method greatly facilitates the investigation of molecular and cellular regulation of species-specific pattern in the craniofacial complex.&#160;Experiments in quail and duck chimeric embryos have already revealed neural crest-mediated tissue interactions and cell-autonomous behaviors that regulate species-specific pattern in the craniofacial skeleton, musculature, and integument. The great diversity of neural crest derivatives suggests significant potential for future applications of the quail-duck chimeric system to understanding vertebrate development, disease, and evolution.

This article describes a method to generate chimeric embryos that are&#160;designed to test the species-specific contributions of neural crest and/or other tissues to craniofacial development.

Évaluation des contributions spécifiques aux espèces Vers développement cranio-facial Utilisation chimères caille-canard

The generation of chimeric embryos is a widespread and powerful approach to study cell fates, tissue interactions, and species-specific contributions to ...

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization (FISH) to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in cytogenetics and cancer diagnostics, and can detect aberrations of the genome, which often has important clinical implications. RNA FISH can be used to detect RNA molecules in cells and has provided important insights in regulation of gene expression. Combining DNA and RNA FISH within the same cell is technically challenging, as conditions suitable for DNA FISH might be too harsh for fragile, single stranded RNA molecules. We here present an easily applicable protocol which enables the combined, simultaneous detection of Xist RNA and DNA encoded by the X chromosomes. This combined DNA-RNA FISH protocol can likely be applied to other systems where both RNA and DNA need to be detected.

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization FISH to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluorescent in situ hybridization (FISH) allows the detection of nucleic acids in their native environment within cells. We here describe a protocol for the combined, simultaneous detection of RNA and DNA by means of FISH, which can be used to study X chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells.

ADN-ARN combiné Fluorescent<em&gt; In situ</em&gt; Hybridation (FISH) à étudier inactivation du chromosome X dans différencié Femme Souris cellules souches embryonnaires

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in ...

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

Low dose radiation exposure may produce a variety of biological effects that are different in quantity and quality from the effects produced by high radiation doses. Addressing questions related to environmental, occupational and public health safety in a proper and scientifically justified manner heavily relies on the ability to accurately measure the biological effects of low dose pollutants, such as ionizing radiation and chemical substances. DNA damage and repair are the most important early indicators of health risks due to their potential long term consequences, such as cancer. Here we describe a protocol to study the effect of chronic in vivo exposure to low doses of &#947;- and &#946;-radiation on DNA damage and repair in mouse spleen cells. Using a commonly accepted marker of DNA double-strand breaks, phosphorylated histone H2AX called &#947;H2AX, we demonstrate how it can be used to evaluate not only the levels of DNA damage, but also changes in the DNA repair capacity potentially produced by low dose in vivo exposures. Flow cytometry allows fast, accurate and reliable measurement of immunofluorescently labeled &#947;H2AX in a large number of samples. DNA double-strand break repair can be evaluated by exposing extracted splenocytes to a challenging dose of 2 Gy to produce a sufficient number of DNA breaks to trigger repair and by measuring the induced (1 hr post-irradiation) and residual DNA damage (24 hrs post-irradiation). Residual DNA damage would be indicative of incomplete repair and the risk of long-term genomic instability and cancer. Combined with other assays and end-points that can easily be measured in such in vivo studies (e.g., chromosomal aberrations, micronuclei frequencies in bone marrow reticulocytes, gene expression, etc.), this approach allows an accurate and contextual evaluation of the biological effects of low level stressors.

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

A protocol to evaluate changes in DNA damage levels and DNA repair capacity that may be induced by chronic in vivo low dose irradiation in mouse spleen lymphocytes, by measuring phosphorylated histone H2AX, a marker of DNA double-strand breaks, using flow cytometry is presented.

Mesure de dommages et réparation de l&#39;ADN dans les splénocytes de souris Après chronique<em&gt; In Vivo</em&gt; L&#39;exposition à de très faibles doses de bêta et gamma Rayonnement

Low dose radiation exposure may produce a variety of biological effects that are different in quantity and quality from the effects produced by high ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. To enable the non-biased identification of molecules interacting with a specific genomic region of interest, we recently developed the engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) technique. Here, we describe how to use enChIP to isolate specific genomic regions and identify the associated proteins and RNAs. First, a genomic region of interest is tagged with a transcription activator-like (TAL) protein or a clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) complex consisting of a catalytically inactive form of Cas9 and a guide RNA. Subsequently, the chromatin is crosslinked and fragmented by sonication. The tagged locus is then immunoprecipitated and the crosslinking is reversed. Finally, the proteins or RNAs that are associated with the isolated chromatin are subjected to mass spectrometric or RNA sequencing analyses, respectively. This approach allows the successful identification of proteins and RNAs associated with a genomic region of interest.

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. This protocol describes procedures to perform engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin imunoprecipitation (enChIP) for identification of proteins and RNAs associated with a specific genomic region.

Isolement des régions génomiques spécifiques et l&#39;identification des molécules associées par enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These age-associated disorders are characterized by the appearance of protein aggregates with fibrillary structure in the brains of these patients. Exactly why normally soluble proteins undergo an aggregation process remains poorly understood. The discovery that protein aggregation is not limited to disease processes and instead part of the normal aging process enables the study of the molecular and cellular mechanisms that regulate protein aggregation, without using ectopically expressed human disease-associated proteins. Here we describe methodologies to examine inherent protein aggregation in Caenorhabditis elegans through complementary approaches. First, we examine how to grow large numbers of age-synchronized C. elegans to obtain aged animals and we present the biochemical procedures to isolate highly-insoluble-large aggregates. In combination with a targeted genetic knockdown, it is possible to dissect the role of a gene of interest in promoting or preventing age-dependent protein aggregation by using either a comprehensive analysis with quantitative mass spectrometry or a candidate-based analysis with antibodies. These findings are then confirmed by in vivo analysis with transgenic animals expressing fluorescent-tagged aggregation-prone proteins. These methods should help clarify why certain proteins are prone to aggregate with age and ultimately how to keep these proteins fully functional.

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

The goal of the method presented here is to explore protein aggregation during normal aging in the model organism C. elegans. The protocol represents a powerful tool to study the highly insoluble large aggregates that form with age and to determine how changes in proteostasis impact protein aggregation.

Méthodes d’étude des changements dans l’agrégation des protéines inhérente avec l’âge chez Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Sequential Immunofluorescence and Immunohistochemistry on Cryosectioned Zebrafish Embryos

Investigation of intercellular interactions often requires discrete labeling of specific cell populations and precise protein localization. The zebrafish embryo is an excellent tool for examining such interactions with an in vivo model. Whole-mount immunohistochemical and immunofluorescence assays are frequently applied in zebrafish embryos to assess protein expression. However, it can be difficult to achieve accurate mapping of co-localized proteins in three-dimensional space. In addition, some studies may require the use of two antibodies that are not compatible with the same technique (e.g., antibody 1 is only suitable for immunohistochemistry and antibody 2 is only suitable for immunofluorescence). The purpose of the method described herein is to perform sequential immunofluorescence and/or immunohistochemistry on individual cryosections derived from early-stage zebrafish embryos. Here we describe the use of sequential rounds of immunofluorescence, imaging, immunohistochemistry, imaging for a single cryosection in order to achieve precise identification of protein expression at the single-cell level. This methodology is suitable for any study in early-stage zebrafish embryos that requires accurate identification of multiple protein targets in individual cells.

This protocol demonstrates sequential immunofluorescence and immunohistochemistry on cryosections from early-stage zebrafish embryos enabling precise colocalization analyses in specific cell populations.

Immunofluorescence séquentielle et immunohistochimie sur les embryons de poissons zèbres cryosectionnés

Investigation of intercellular interactions often requires discrete labeling of specific cell populations and precise protein localization. The zebrafish ...

Visualization of DNA Repair Proteins Interaction by Immunofluorescence

Mammalian cells are constantly exposed to chemicals, radiations, and naturally occurring metabolic by-products, which create specific types of DNA insults. Genotoxic agents can damage the DNA backbone, break it, or modify the chemical nature of individual bases. Following DNA insult, DNA damage response (DDR) pathways are activated and proteins involved in the repair are recruited. A plethora of factors are involved in sensing the type of damage and activating the appropriate repair response. Failure to correctly activate and recruit DDR factors can lead to genomic instability, which underlies many human pathologies including cancer. Studies of DDR proteins can provide insights into genotoxic drug response and cellular mechanisms of drug resistance.
There are two major ways of visualizing&#160;proteins in vivo: direct observation, by tagging the protein of interest with a fluorescent protein and following it by live imaging, or indirect immunofluorescence on fixed samples. While visualization of fluorescently tagged proteins allows precise monitoring over time, direct tagging in N- or C-terminus can interfere with the protein localization or function. Observation of proteins in their unmodified, endogenous version is preferred. When DNA repair proteins are recruited to the DNA insult, their concentration increases locally and they form groups, or &#8220;foci&#8221;, that can be visualized by indirect immunofluorescence using specific antibodies.
Although detection of protein foci does not provide a definitive proof of direct interaction, co-localization of proteins in cells indicates that they regroup to the site of damage and can inform of the sequence of events required for complex formation. Careful analysis of foci spatial overlap in cells expressing wild type or mutant versions of a protein can provide precious clues on functional domains important for DNA repair function. Last, co-localization of proteins indicates possible direct interactions that can be verified by co-immunoprecipitation in cells, or direct pulldown using purified proteins.

Following DNA damage, human cells activate essential repair pathways to restore the integrity of their genome. Here, we describe the method of indirect immunofluorescence as a means to detect DNA repair proteins, analyze their spatial and temporal recruitment, and help interrogate protein-protein interaction at the sites of DNA damage.