يتم توفير التمويل لهذا العمل من قبل الوطنية للصحة ومجلس البحوث الطبية في استراليا (NHMRC المشروع منحة ل1011352 MEC وMJC؛ المستقلة البنية التحتية معاهد البحوث خطة دعم [IRIISS] منحة لWEHI) وحكومة فيكتوريا (VESKI الابتكار زمالة لMEC؛ الفيكتوري الدولة الدعم الحكومي البنية التحتية التشغيلية لWEHI). MEC زميل الملكة اليزابيث الثانية لمجلس البحوث الأسترالية. EFXB يعترف بدعم من برنامج المنح الدراسية هيلدا نورما شوستر في جامعة ملبورن.

<ol>
	<li>Call, M. E., Chou, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+view+into+the+blind+spot:+solution+NMR+provides+new+insights+into+signal+transduction+across+the+lipid+bilayer.">A view into the blind spot: solution NMR provides new insights into signal transduction across the lipid bilayer.</a> Structure. 18, 1559-1569 (2010).</li><li>Bocharov, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+structure+of+the+dimeric+transmembrane+domain+of+the+growth+factor+receptor+ErbB2+presumably+corresponding+to+the+receptor+active+state.">Spatial structure of the dimeric transmembrane domain of the growth factor receptor ErbB2 presumably corresponding to the receptor active state.</a> The Journal of Biological Chemistry. 283, 6950-6956 (2008).</li><li>Mineev, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+structure+of+the+transmembrane+domain+heterodimer+of+ErbB1+and+ErbB2+receptor+tyrosine+kinases.">Spatial structure of the transmembrane domain heterodimer of ErbB1 and ErbB2 receptor tyrosine kinases.</a> J. Mol. Biol. 400, 231-243 (2010).</li><li>Mineev, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+structure+and+dimer--monomer+equilibrium+of+the+ErbB3+transmembrane+domain+in+DPC+micelles.">Spatial structure and dimer--monomer equilibrium of the ErbB3 transmembrane domain in DPC micelles.</a> Biochim. Biophys Acta. 1808, 2081-2088 (2011).</li><li>Lau, T. L., Kim, C., Ginsberg, M. H., Ulmer, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+integrin+alphaIIbbeta3+transmembrane+complex+explains+integrin+transmembrane+signalling.">The structure of the integrin alphaIIbbeta3 transmembrane complex explains integrin transmembrane signalling.</a> The EMBO Journal. 28, 1351-1361 (2009).</li><li>Zhu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+a+receptor+with+two+associating+transmembrane+domains+on+the+cell+surface:+integrin+alphaIIbbeta3.">The structure of a receptor with two associating transmembrane domains on the cell surface: integrin alphaIIbbeta3.</a> Molecular Cell. 34, 234-249 (2009).</li><li>Call, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+zetazeta+transmembrane+dimer+reveals+features+essential+for+its+assembly+with+the+T+cell+receptor.">The structure of the zetazeta transmembrane dimer reveals features essential for its assembly with the T cell receptor.</a> Cell. 127, 355-368 (2006).</li><li>Call, M. E., Wucherpfennig, K. W., Chou, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structural+basis+for+intramembrane+assembly+of+an+activating+immunoreceptor+complex.">The structural basis for intramembrane assembly of an activating immunoreceptor complex.</a> Nat. Immunol. 11, 1023-1029 (2010).</li><li>Diefenderfer, C., Lee, J., Mlyanarski, S., Guo, Y., Glover, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliable+expression+and+purification+of+highly+insoluble+transmembrane+domains.">Reliable expression and purification of highly insoluble transmembrane domains.</a> Anal. Biochem. 384, 274-278 (2009).</li><li>Schnell, J. R., Chou, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanism+of+the+M2+proton+channel+of+influenza+A+virus.">Structure and mechanism of the M2 proton channel of influenza A virus.</a> Nature. 451, 591-595 (2008).</li><li>Xie, X. Q., Zhao, J., Zheng, H. E. x. p. r. e. s. s. i. o. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=purification,+and+isotope+labeling+of+cannabinoid+CB2+receptor+fragment,+CB2(180-233).">purification, and isotope labeling of cannabinoid CB2 receptor fragment, CB2(180-233).</a> Protein Expr. Purif. 38, 61-68 (2004).</li><li>Miozzari, G. F., Yanofsky, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+of+the+leader+region+of+the+Escherichia+coli+tryptophan+operon.">Translation of the leader region of the Escherichia coli tryptophan operon.</a> J. Bacteriol. 133, 1457-1466 (1978).</li><li>North, C. L., Blacklow, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+independence+of+ligand-binding+modules+five+and+six+of+the+LDL+receptor.">Structural independence of ligand-binding modules five and six of the LDL receptor.</a> Biochemistry. 38, 3926-3935 (1999).</li><li>Staley, J. P., Kim, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+a+native-like+subdomain+in+a+partially+folded+intermediate+of+bovine+pancreatic+trypsin+inhibitor.">Formation of a native-like subdomain in a partially folded intermediate of bovine pancreatic trypsin inhibitor.</a> Protein Sci. 3, 1822-1832 (1994).</li><li>Narayanan, S., Sato, T., Wolfe, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+C-terminal+region+of+signal+peptide+peptidase+defines+a+functional+domain+for+intramembrane+aspartic+protease+catalysis.">A C-terminal region of signal peptide peptidase defines a functional domain for intramembrane aspartic protease catalysis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 282, 20172-20179 (2007).</li><li>Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+beta-amyloid+protein+is+covalently+modified+when+dissolved+in+formic+acid.">Alzheimer's beta-amyloid protein is covalently modified when dissolved in formic acid.</a> J. Neurochem. 54, 2050-2056 (1990).</li><li>Klunk, W. E., Xu, C. J., Pettegrew, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+identification+of+the+formic+acid-modified+residue+in+Alzheimer's+amyloid+protein.">NMR identification of the formic acid-modified residue in Alzheimer's amyloid protein.</a> J. Neurochem. 62, 349-354 (1994).</li><li>Previero, A., Coletti-Previero, M. A., Cavadore, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reversible+chemical+modification+of+the+tryptophan+residue.">A reversible chemical modification of the tryptophan residue.</a> Biochim. Biophys. Acta. 147, 453-461 (1967).</li><li>Kim, H. J., Howell, S. C., Van Horn, W. D., Jeon, Y. H., Sanders, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+Advances+in+the+Application+of+Solution+NMR+Spectroscopy+to+Multi-Span+Integral+Membrane+Proteins.">Recent Advances in the Application of Solution NMR Spectroscopy to Multi-Span Integral Membrane Proteins.</a> Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 55, 335-360 (2009).</li></ol>

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم المصالح المتنافسة المالية.

التعبير عن trpLE-TM اندماج. في تجربتنا، يتم التعبير عن سوء trpLE-TM اندماج في ثقافة المتوسط ​​الغنية في 37 ° C، والظروف الثقافة الموصوفة هنا أثبتت نجاحها لسلاسل مختلفة تحتوي على العديد من 1-4 TM المجالات مع عائدات تتراوح 50 حتي 150 ملغ / لتر من الانصهار، نقية سليمة. اندماج ترم?...

تفاصيل هذا البروتوكول إجراء ضعنا لإنتاج ثاني كبريتيد المجمعات استقرت عبر الغشاء من الببتيدات (TM) للدراسات الهيكلية باستخدام NMR الحل. الإجراء يستفيد من التعبير القوي التي يوفرها نظام الانصهار ΔtrpLE1413 (انظر أدناه)، ويسمح إنشاء المجمعات الببتيد TM تكوين المعرفة باستخدام تقنيات متطورة وضع العلامات النظائر مستقرة-NMR لتجارب حديثة متعددة الأبعاد. لقد استخدمنا هذه التقنيات لتحديد هياكل NMR عدة كشفت معلومات جديدة هامة حول كيفية تجميع الخلايا اللمفاوية-تفعيل immunoreceptors من عدة مفارز بروتين الغشاء من خلال التفاعل بين المجالات التي TM (مشاركة مؤخرا في 1). هذه التقنيات قابلة للتطبيق على العديد من أنظمة البروتين الغشاء، فضلا عن مجموعة واسعة من الأساليب التحليلية المصب بالإضافة إلى NMR الحل. في حين أن المثال المذكور هنا يستخدم بقايا السيستين الأصليلإنشاء مجمع الذي يحاكي بشكل طبيعي ثاني كبريتيد العبودي البروتين، وتصميم على ما يرام أيضا مناسبة لخلق السندات ثاني كبريتيد هندسيا لتحقيق الاستقرار في المجمعات التي تقام عادة معا عن طريق أضعف التفاعلات غير التساهمية، مثل هومو ومثنوي مغاير المجمعات TM من البشرة مستقبلات عامل النمو (EGFR) بين أفراد الأسرة أو البروتينات 2-4 heterodimeric αβ المجمعات إنتغرين 5،6. تسلسل الببتيد مسعور للغاية مثل تلك المستمدة من الدهون طبقة ثنائية، والتي تمتد أجزاء من البروتينات TM هي الموضوعات الصعبة للغاية للدراسات كيميائية حيوية والفيزيائية الحيوية. بالإضافة إلى كونها صعبة للغاية لمعالجة باستخدام البروتين القياسية وتقنيات الكيمياء الببتيد، فإنها غالبا ما تكون سامة جدا للخلايا وبالتالي فهي صعبة لإنتاج recombinantly. نحن 7،8 9-11 وغيرها كان لها كبير معربا عن نجاح هذه تسلسل الببتيد الصعب في البكتيريا كما هو الحال في الإطار كربوكسي لمحطةاندماج لنسخة معدلة من تسلسل ΔtrpLE1413 المستمدة من E. القولونية الحزب OPERON 12. يمكن أن تنتج عن ببتيد ~ 13 كيلو دالتون trpLE المشفرة بواسطة هذا التسلسل عند مستويات مرتفعة في ظل المروج T7 ويتم ترجمة تماما لإدراج الهيئات حيث يتم التحايل المشاكل المتعلقة سمية و / أو عدم الاستقرار. تعديل تسلسل إضافة محطة الأمينية 9-13 و الحامض الاميني العلامة القضاء على بقايا ميثيونين الداخلية والسيستين من تسلسل 14 trpLE يسمح trpLE الببتيد اندماج ليكون منقى من قبل اللوني تقارب المعادن ايون وهضمها باستخدام بروميد السيانوجين (CNBr ) للافراج عن تسلسل الببتيد المطلوب. وقد استخدمنا هذا النظام بنجاح للتعبير عن أكثر من اثني عشر سلاسل مختلفة مثل اندماج trpLE تمثل شظايا البروتين غشاء التي تحتوي على ما يصل إلى أربعة مجالات TM (7،8 والنتائج غير المنشورة، وانظر أيضا قسم المناقشات). الالابتكار الرئيسية في هذا البروتوكول هو تحديد الشروط التي بموجبها غير منظم وقابل للذوبان جدا سيئة trpLE-TM اندماج يمكن أن يكون بكفاءة ثاني كبريتيد-crosslinked في سياق تبسيط العمل. كما تم عدة جوانب ذات الإنتاجية العالية المناولة والتعبير وتنقية المنتجات الببتيد الأمثل بدقة، والتوصيات المقدمة هنا هي نفس القدر من الأهمية لإنتاج ثاني كبريتيد غير crosslinked-(أحادى) منتجات الببتيد TM.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم الكاشف / المواد </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> السيانوجين بروميد </td><td> ALDRICH </td><td> P.No-C91492، CAS-506-68-3 </td><td> مادة خطرة. البضائع الخطرة. السامة جدا عن طريق الإستنشاق وملامسة الجلد وإن بلع. الاتصال مع الأحماض يحرر غاز سام للغاية. شديدة السمية للكائنات المائية، قد تسبب على المدى الطويل آثار سلبية في البيئة المائية. </td></tr><tr><td> Trifluoroacetic حمض </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> P.CODE-1000984387 عدد CAS، 76-05-1 </td><td> مادة خطرة. البضائع الخطرة. وأسبابه بحروق شديدة. ضار عن طريق الإستنشاق. ضارة بالكائنات المائية، قد تسبب على المدى الطويل آثار سلبية في البيئة المائية. </td></tr><tr><td> 2-المركابتويثانول </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> P.No M7154، CAS 60-24-2 رقم </td><td> مادة خطرة. البضائع الخطرة. سامة عن طريق الإستنشاق وملامسة الجلد وإن بلع. تهيج الجلد. خطر وقوع أضرار خطيرة للعيون. قد تسبب حساسية الجلد عن طريق الاتصال شديدة السمية للكائنات المائية، قد تسبب على المدى الطويل آثار سلبية في البيئة المائية. </td></tr><tr><td> 1،1،1،3،3،3-Hexafluoro-2-بروبانول </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> رقم المنتج 52512، CAS-لا. 920-66-1 </td><td> مادة خطرة. البضائع الخطرة. ضار عن طريق الإستنشاق وإن بلع. تسبب الحروق. </td></tr><tr><td> حمض الفورميك </td><td> ميرك KGaA </td><td> K41186564 </td><td> القابلة للاشتعال السائلة وبخار. يسبب حروقا جلدية شديدة والأضرار التي تصيب العين. </td></tr><tr><td> اليوريا </td><td> UNIVAR، AJAX FINECHEM </td><td> رقم المنتج، 817، CAS-لا 57-13-6 </td><td> عند تسخينها، ديسمبرomposes إلى ثاني أكسيد الكربون والأمونيا، وإذا أحرقت، تنبعث كميات صغيرة من أكاسيد النيتروجين. يمكن أن يسبب احمرار وتهيج الجلد والعينين. </td></tr><tr><td> الجوانيدين هيدروكلوريد </td><td> Amresco </td><td> P.No-M110، CAS رقم: 50-01-1 </td><td> ضار إذا ما ابتلع، والأسباب الخطيرة تهيج العين، ويسبب تهيج الجلد، السمية الحادة عن طريق الفم، الجلد مهيجة مهيجة العين. </td></tr><tr><td> TRITON X-100 </td><td> SIGMA </td><td> عدد T8532-المنتج CAS رقم: 9002-93-1 </td><td> تريتون X-100 هي المنظفات غير أيوني، العنصر النشط 100٪، والذي يستخدم غالبا في التطبيقات الحيوية لإذابة البروتينات. تريتون X-100 لا يوجد لديه خصائص مضادة للميكروبات ويعتبر معتدل نسبيا غير يبدل طبيعة المنظفات </td></tr><tr><td> له لاختيار النيكل والانجذاب هلام </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> كتالوج-P6611 ارقام </td><td> IS-اختار جل تقارب النيكل هو معدن أيون يجمد تقارب اللوني (IMAC) المنتج. وHIS-اختار نيكش تقارب الهلام هو كلاب الملكية quadridentate على الاغاروز مطرز المكلفة النيكل التي تم تصميمها خصيصا لربط الحامض الاميني التي تحتوي على البروتينات. </td></tr><tr><td> (-)-الجلوتاثيون، تتأكسد </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> كتالوج الأسطوانات 150568 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Misonix S-3000 sonicator </td><td> QSONICA </td><td> S-3000 (توقف) </td><td> ماكس انتاج الطاقة 600 واط. 1/2-inch استبدال معلومات سرية التحقيق يأخذ 1/2-inch عالية الكثافة، نصائح كبيرة الحجم ومجموعة من كثافة عالية، وانخفاض الحجم النصائح. أقرب النماذج المتاحة حاليا من هذه الشركة هي Q500 Q700 و. </td></tr><tr><td> RP-HPLC: نظام بيولوجي اللوني DuoFlow، الإصدار 5.3 البرمجيات </td><td> بيو راد مختبرات </td><td> كتالوج ارقام 760-0047، التكوين رقم: AU500571، المسلسل: 484BR3705 </td><td> الببتيدات بربط عكس المرحلة الأعمدة HPLC في AQ عاليةومزال الطور المتحرك وueous من الأعمدة HPLC RP مع مرحلة عالية موبايل العضوية. في RP يتم فصل الببتيدات HPLC يعتمد على طابعها مسعور. ويمكن فصل الببتيدات عن طريق تشغيل الانحدار الخطي من المذيبات العضوية. </td></tr><tr><td> HT الإعدادية C3 ZORBAX العمود HPLC 300SB التحليلي، 21،2 × 150 ملم، 5 ميكرومتر حجم الجسيمات </td><td> اجيلنت </td><td> رقم المنتج: 895150-909 </td><td> عكس المرحلة HPLC كولوم </td></tr><tr><td> NuPAGE 12٪ مكرر تريس الهلام </td><td> الحياة تكنولوجيز </td><td> NP0341BOX </td><td> المواد الهلامية يلقي ظلالا من قبل لبروتين الكهربائي </td></tr><tr><td> الشريحة-A-G2 Lyzer كاسيت غسيل الكلى، 3.5K MWCO </td><td> الحرارية العلمية </td><td> رقم المنتج: 87724 </td><td> عينة غسيل الكلى </td></tr></tbody></table>

production of disulfide-stabilized transmembrane peptide complexes for structural studies

التفاعلات الجسدية بين المجالات ألفا حلزونية للدهون، بروتينات الغشاء جزءا لا يتجزأ من لعب دورا حاسما في للطي والتجمع مجمعات البروتين غشاء والعمليات الدينامية في مثل عبر الغشاء (TM) إشارات وتنظيم مستويات البروتين على سطح الخلية. فهم السمات الهيكلية قيادة رابطة تسلسل معين يتطلب تحليلات متطورة البيوكيميائية البيوفيزيائية والمجمعات الببتيد TM. ومع ذلك، فإن hydrophobicity متطرفة من المجالات TM يجعل من الصعب جدا على التعامل مع تقنيات الكيمياء باستخدام معيار الببتيد، وإنتاج المواد الدراسية مناسبة غالبا ما يثبت التحدي باهظة. تحديد الظروف التي يمكن أن الببتيدات اعتماد التشكل حلزونية الشكل مستقرة والمجمعات يضيف تلقائيا على مستوى مزيد من الصعوبة. هنا نقدم إجراء لإنتاج وطي أو مثنوي مغاير المجمعات الببتيد TM من المواد التي يتم التعبير عنها في E. مضيق بين قمتينالأول، مما يسمح بإدراج تسميات النظائر المستقرة لالرنين المغناطيسي النووي (NMR) أو غير الطبيعية الأحماض الأمينية لتطبيقات أخرى غير مكلفة نسبيا. والابتكار الرئيسي في هذا الأسلوب هو أن يتم إنتاج مجمعات TM وتنقيته والتجمعات (ثاني كبريتيد-crosslinked) المرتبطة تساهميا التي يمكن أن تشكل هياكل مستقرة، والقياس المتكافئ متجانسة عندما أعيد إلى الدهون والمنظفات أو غيرها من المواد غشاء المحاكاة. نقدم أيضا إجراءات بعناية الأمثل للتعبير وتنقية التي تنطبق على قدم المساواة سواء المنتجة أو واحدة المجالات TM المجمعات crosslinked وتقديم المشورة للتكيف هذه الأساليب لتسلسل TM الجديدة.

مستوى التعبير عن تحقيق اندماج trpLE هو متغير ويعتمد اعتمادا كبيرا على تسلسل الأحماض الأمينية من الببتيد المرفقة. ويبين الشكل 3 تحليل SDS-PAGE الحث قبل (حارة 1) وتستغرق وقتا من الحصاد (حارة 2) عينات من الثقافة التي أسفرت عن حوالي 120 ملغ من الذهب الخالص، والانصهار trpLE-DAP1...

Watch this Scientific Journal Video about Production of Disulfide-stabilized Transmembrane Peptide Complexes for Structural Studies at JoVE.com

Production of Disulfide-stabilized Transmembrane Peptide Complexes for Structural Studies

الدراسات البيوكيميائية البيوفيزيائية والتفاعلات بين المجالات بروتين الغشاء جزءا لا يتجزأ من مواجهة التحديات التقنية كثيرة، وأولها هو الحصول على المواد المناسبة الدراسة. توضح هذه المقالة بروتوكول لإنتاج وتنقية ثاني كبريتيد-استقرت المجمعات الببتيد عبر الغشاء التي هي مناسبة لتحليل الهيكلية التي كتبها صدى حل المغناطيسي النووي (NMR) والتطبيقات التحليلية الأخرى.

إنتاج ثاني كبريتيد استقرت مجمعات الببتيد عبر الغشاء الدراسات الإنشائية

Physical  interactions among the lipid-embedded alpha-helical domains of membrane  proteins play a crucial role in folding and assembly of membrane ...

production-disulfide-stabilized-transmembrane-peptide-complexes-for

Research

JoVE Journal

Chemistry

14.0K Views.  The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research. الدراسات البيوكيميائية البيوفيزيائية والتفاعلات بين المجالات بروتين الغشاء جزءا لا يتجزأ من مواجهة التحديات التقنية كثيرة، وأولها هو الحصول على المواد المناسبة الدراسة. توضح هذه المقالة بروتوكول لإنتاج وتنقية ثاني كبريتيد-استقرت المجمعات الببتيد عبر الغشاء...

Video: Production of Disulfide-stabilized Transmembrane Peptide Complexes for Structural Studies

Steady-state, Pre-steady-state, and Single-turnover Kinetic Measurement for DNA Glycosylase Activity

Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) excises the mutagenic oxidative DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) from DNA. Kinetic characterization of OGG1 is undertaken to measure the rates of 8-oxoG excision and product release. When the OGG1 concentration is lower than substrate DNA, time courses of product formation are biphasic; a rapid exponential phase (i.e. burst) of product formation is followed by a linear steady-state phase. The initial burst of product formation corresponds to the concentration of enzyme properly engaged on the substrate, and the burst amplitude depends on the concentration of enzyme. The first-order rate constant of the burst corresponds to the intrinsic rate of 8-oxoG excision and the slower steady-state rate measures the rate of product release (product DNA dissociation rate constant, koff). Here, we describe steady-state, pre-steady-state, and single-turnover approaches to isolate and measure specific steps during OGG1 catalytic cycling. A fluorescent labeled lesion-containing oligonucleotide and purified OGG1 are used to facilitate precise kinetic measurements. Since low enzyme concentrations are used to make steady-state measurements, manual mixing of reagents and quenching of the reaction can be performed to ascertain the steady-state rate (koff). Additionally, extrapolation of the steady-state rate to a point on the ordinate at zero time indicates that a burst of product formation occurred during the first turnover (i.e. y-intercept is positive). The first-order rate constant of the exponential burst phase can be measured using a rapid mixing and quenching technique that examines the amount of product formed at short time intervals (&lt;1 sec) before the steady-state phase and corresponds to the rate of 8-oxoG excision (i.e. chemistry). The chemical step can also be measured using a single-turnover approach where catalytic cycling is prevented by saturating substrate DNA with enzyme (E&gt;S). These approaches can measure elementary rate constants that influence the efficiency of removal of a DNA lesion.

Time courses for the glycosylase activity of 8-oxoguanine DNA glycosylase are biphasic exhibiting a burst of product formation and a linear steady-state phase. Utilizing quench-flow techniques, the burst and the steady-state rates can be measured, which correspond to excision of 8-oxoguanine and release of the glycosylase from the product DNA, respectively.

ثابت للدولة، قبل المطرد للدولة، واحدة دوران قياس الحركية للنشاط الحمض النووي Glycosylase

Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) excises the mutagenic oxidative DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) from DNA. Kinetic characterization ...

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox reactions. The Cu (I) complex of the peptide model of a Cu (I) binding metallochaperone protein, which includes the sequence MTCSGCSRPG (underlined is conserved), was determined in solution under inert conditions by NMR spectroscopy.
NMR is a widely accepted technique for the determination of solution structures of proteins and peptides. Due to difficulty in crystallization to provide single crystals suitable for X-ray crystallography, the NMR technique is extremely valuable, especially as it provides information on the solution state rather than the solid state. Herein we describe all steps that are required for full three-dimensional structure determinations by NMR. The protocol includes sample preparation in an NMR tube, 1D and 2D data collection and processing, peak assignment and integration, molecular mechanics calculations, and structure analysis. Importantly, the analysis was first conducted without any preset metal-ligand bonds, to assure a reliable structure determination in an unbiased manner.

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

The NMR-solution structure of a metallochaperone model peptide with Cu (I) was determined, and a detailed protocol from sample preparation and 1D and 2D data collection to a three-dimensional structure is described.

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox ...

Thin-layer Chromatographic (TLC) Separations and Bioassays of Plant Extracts to Identify Antimicrobial Compounds

A common screen for plant antimicrobial compounds consists of separating plant extracts by paper or thin-layer chromatography (PC or TLC), exposing the chromatograms to microbial suspensions (e.g. fungi or bacteria in broth or agar), allowing time for the microbes to grow in a humid environment, and visualizing zones with no microbial growth.&#160;The effectiveness of this screening method, known as bioautography, depends on both the quality of the chromatographic separation and the care taken with microbial culture conditions.&#160;This paper describes standard protocols for TLC and contact bioautography&#160;with a novel application to amino acid-fermenting bacteria. The extract is separated on flexible (aluminum-backed) silica TLC plates, and bands are visualized under ultraviolet (UV) light.&#160;Zones are cut out and incubated face down onto agar inoculated with the test microorganism.&#160;Inhibitory bands are visualized by staining the agar plates with tetrazolium red.&#160;The method is applied to the separation of red clover (Trifolium pratense cv. Kenland) phenolic compounds and their screening for activity against Clostridium sticklandii, a hyper ammonia-producing bacterium (HAB) that is native to the bovine rumen.&#160;The TLC methods apply to many types of plant extracts&#160;and other bacterial species (aerobic or anaerobic), as well as fungi, can be used as test organisms if culture conditions are modified to fit the growth requirements of the species.

Thin-layer Chromatographic TLC Separations and Bioassays of Plant Extracts to Identify Antimicrobial Compounds

Methods are described for thin-layer chromatographic (TLC) separation of plant extracts and contact bioautography to identify antibacterial metabolites. The methods are applied to the screening of red clover phenolic compounds inhibiting hyper&#160;ammonia-producing bacteria (HAB) native to the bovine rumen.

طبقة رقيقة الكروماتوجرافي (TLC) فصل واختبارات بيولوجية من المستخلصات النباتية لتحديد المركبات المضادة للميكروبات

A common screen for plant antimicrobial compounds consists of separating plant extracts by paper or thin-layer chromatography (PC or TLC), exposing the ...

Capillary Electrophoresis to Monitor Peptide Grafting onto Chitosan Films in Real Time

Free-solution capillary electrophoresis (CE) separates analytes, generally charged compounds in solution through the application of an electric field. Compared to other analytical separation techniques, such as chromatography, CE is cheap, robust and effectively requires no sample preparation (for a number of complex natural matrices or polymeric samples). CE is fast and can be used to follow the evolution of mixtures in real time (e.g., chemical reaction kinetics), as the signals observed for the separated compounds are directly proportional to their quantity in solution.
Here, the efficiency of CE is demonstrated for monitoring the covalent grafting of peptides onto chitosan films for subsequent biomedical applications. Chitosan&#39;s antimicrobial and biocompatible properties make it an attractive material for biomedical applications such as cell growth substrates. Covalently grafting the peptide RGDS (arginine - glycine - aspartic acid - serine) onto the surface of chitosan films aims at improving cell attachment. Historically, chromatography and amino acid analysis have been used to provide a direct measurement of the amount of grafted peptide. However, the fast separation and absence of sample preparation provided by CE enables equally accurate yet real-time monitoring of the peptide grafting process. CE is able to separate and quantify the different components of the reaction mixture: the (non-grafted) peptide and the chemical coupling agents. In this way the use of CE results in improved films for downstream applications.
The chitosan films were characterized through solid-state NMR (nuclear magnetic resonance) spectroscopy. This technique is more time-consuming and cannot be applied in real time, but yields a direct measurement of the peptide and thus validates the CE technique.

Free solution capillary electrophoresis is a fast, cheap and robust analytical method that enables the quantitative monitoring of chemical reactions in real time. Its utility for rapid, convenient and precise analysis is demonstrated here through analysis of covalent peptide grafting onto chitosan films for improved cell adhesion.

الشعرية الكهربائي لرصد الببتيد مسمار على الأفلام الشيتوزان في الوقت الحقيقي

Free-solution capillary electrophoresis (CE) separates analytes, generally charged compounds in solution through the application of an electric field. ...

Controlled Photoredox Ring-Opening Polymerization of O-Carboxyanhydrides Mediated by Ni/Zn Complexes

Here, we describe an effective protocol that combines photoredox Ni/Ir catalysis with the use of a Zn-alkoxide for efficient ring-opening polymerization, allowing for the synthesis of isotactic poly(&#945;-hydroxy acids) with expected molecular weights (&#62;140 kDa) and narrow molecular weight distributions (Mw/Mn &#60; 1.1). This ring-opening polymerization is mediated by Ni and Zn complexes in the presence of an alcohol initiator and a photoredox Ir catalyst, irradiated by a blue LED (400 - 500 nm). The polymerization is performed at a low temperature (-15 &#176;C) to avoid undesired side reactions. The complete monomer consumption can be achieved within 4 - 8 hours, providing a polymer close to the expected molecular weight with narrow molecular weight distribution. The resulted number-average molecular weight shows a linear correlation with the degree of polymerization up to 1000. The homodecoupling 1H NMR study confirms that the obtained polymer is isotactic without epimerization. This polymerization reported herein offers a strategy for achieving rapid, controlled O-carboxyanhydrides polymerization to prepare stereoregular poly(&#945;-hydroxy acids) and its copolymers bearing various functional side-chain groups.

Controlled Photoredox Ring-Opening Polymerization of O-Carboxyanhydrides Mediated by Ni/Zn Complexes

A protocol for the controlled photoredox ring-opening polymerization of O-carboxyanhydrides mediated by Ni/Zn complexes is presented.

التحكم في فوتوريدوكس افتتاح الدائري البلمرة من س-كاربوكسيانهيدريديس توسط مجمعات ني/الزنك

Here, we describe an effective protocol that combines photoredox Ni/Ir catalysis with the use of a Zn-alkoxide for efficient ring-opening polymerization, ...

Preparation of Stable Bicyclic Aziridinium Ions and Their Ring-Opening for the Synthesis of Azaheterocycles

Bicyclic aziridinium ions were generated by the removal of an appropriate leaving group through internal nucleophilic attack by nitrogen atom in the aziridine ring. The utility of bicyclic aziridinium ions, specifically 1-azoniabicyclo[3.1.0]hexane and 1-azoniabicyclo[4.1.0]heptane tosylate highlighted in the aziridine ring openings by the nucleophile with the release of the ring strain to yield the corresponding ring-expanded azaheterocycles such as pyrrolidine, piperidine and azepane with diverse substituents on the ring in regio- and stereospecific manner. Herein, we report a simple and convenient method for the preparation of the stable 1-azabicyclo[4.1.0]heptane tosylate followed by selective ring opening via a nucleophilic attack either at the bridge or at the bridgehead carbon to yield piperidine and azepane rings, respectively. This synthetic strategy allowed us to prepare biologically active natural products containing piperidine and azepane motif including sedamine, allosedamine, fagomine and balanol in highly efficient manner.

Bicyclic aziridinium ions such as 1-azoniabicyclo[4.1.0]heptane tosylate were generated from 2-[4-tolenesulfonyloxybutyl]aziridine, which was utilized for the preparation of substituted piperidines and azepanes via regio- and stereospecific ring-expansion with various nucleophiles. This highly efficient protocol allowed us to prepare diverse azaheterocycles including natural products such as fagomine, febrifugine analogue and balanol.

إعداد أيونات أزيريدينيوم تربين مستقرة وعلى فتح الحلقة لتوليف أزاهيتيروسيكليس

Bicyclic aziridinium ions were generated by the removal of an appropriate leaving group through internal nucleophilic attack by nitrogen atom in the ...

Novel Techniques for Observing Structural Dynamics of Photoresponsive Liquid Crystals

We discuss in this article the experimental measurements of the molecules in liquid crystal (LC) phase using the time-resolved infrared (IR) vibrational spectroscopy and time-resolved electron diffraction. Liquid crystal phase is an important state of matter that exists between the solid and liquid phases and it is common in natural systems as well as in organic electronics. Liquid crystals are orientationally ordered but loosely packed, and therefore, the internal conformations and alignments of the molecular components of LCs can be modified by external stimuli. Although advanced time-resolved diffraction techniques have revealed picosecond-scale molecular dynamics of single crystals and polycrystals, direct observations of packing structures and ultrafast dynamics of soft materials have been hampered by blurry diffraction patterns. Here, we report time-resolved IR vibrational spectroscopy and electron diffractometry to acquire ultrafast snapshots of a columnar LC material bearing a photoactive core moiety. Differential-detection analyses of the combination of time-resolved IR vibrational spectroscopy and electron diffraction are powerful tools for characterizing structures and photoinduced dynamics of soft materials.

Here, we present the protocols of differential-detection analyses of time-resolved infrared vibrational spectroscopy and electron diffraction which enable observations of the deformations of local structures around photoexcited molecules in a columnar liquid crystal, giving an atomic perspective on the relationship between the structure and the dynamics of this photoactive material.

تقنيات الرواية لمراقبة ديناميات الهيكلية من بلورات سائلة فوتوريسبونسيفي

We discuss in this article the experimental measurements of the molecules in liquid crystal (LC) phase using the time-resolved infrared (IR) vibrational ...

Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing metabolic reactions, DNA repair and replication. Therefore, a detailed understanding of these processes provides critical information on how cells function. Integrative structural MS methods offer structural and dynamical information on protein complex assembly, complex connectivity, subunit stoichiometry, protein oligomerization and ligand binding. Recent advances in integrative structural MS have allowed for the characterization of challenging biological systems including large DNA binding proteins and membrane proteins. This protocol describes how to integrate diverse MS data such as native MS and ion mobility-mass spectrometry (IM-MS) with molecular dynamics simulations to gain insights into a helicase-nuclease DNA repair protein complex. The resulting approach provides a framework for detailed studies of ligand binding to other protein complexes involved in important biological processes.

Mass spectrometry (MS) has emerged as an important tool for the investigation of structure and dynamics of macromolecular assemblies. Here, we integrate MS-based approaches to interrogate protein complex formation and ligand binding.

تحليل البروتين أبنية ومجمعات البروتين-يجند بالتكامل الهيكلي الكتلي

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing ...

Preparation of SNS Cobalt(II) Pincer Model Complexes of Liver Alcohol Dehydrogenase

Chemical model complexes are prepared to represent the active site of an enzyme. In this protocol, a family of tridentate pincer ligand precursors (each possessing two sulfur and one nitrogen donor atom functionalities (SNS) and based on bis-imidazole or bis-triazole compounds) are metallated with CoCl2&#183;6H2O to afford tridentate SNS pincer cobalt(II) complexes. Preparation of the cobalt(II) model complexes for liver alcohol dehydrogenase is facile. Based on a quick color change upon adding the CoCl2&#183;6H2O to acetonitrile solution that contains the ligand precursor, the complex forms rapidly. Formation of the metal complex is complete after allowing the solution to reflux overnight. These cobalt(II) complexes serve as models for the zinc active site in liver alcohol dehydrogenase (LADH). The complexes are characterized using single crystal X-ray diffraction, electrospray mass spectrometry, ultra-violet visible spectroscopy, and elemental analysis. To accurately determine the structure of the complex, its single crystal structure must be determined. Single crystals of the complexes that are suitable for X-ray diffraction are then grown via slow vapor diffusion of diethyl ether into an acetonitrile solution that contains the cobalt(II) complex. For high quality crystals, recrystallization typically takes place over a 1 week period, or longer. The method can be applied to the preparation of other model coordination complexes and can be used in undergraduate teaching laboratories. Finally, it is believed that others may find this recrystallization method to obtain single crystals beneficial to their research.

Preparation of SNS CobaltII Pincer Model Complexes of Liver Alcohol Dehydrogenase

The preparation of SNS pincer cobalt(II) model complexes of liver alcohol dehydrogenase is presented here. The complexes can be prepared by reacting the ligand precursor with CoCl2&#183;6H2O and can then be recrystallized by allowing diethyl ether to slowly diffuse into an acetonitrile solution that contains the cobalt complex.

إعداد SNS Cobalt (II) المجمعات نموذج بينسر من الكبد الكحول ديهيدروجيناز

Chemical model complexes are prepared to represent the active site of an enzyme. In this protocol, a family of tridentate pincer ligand precursors (each ...

Directed Assembly of Elastin-like Proteins into defined Supramolecular Structures and Cargo Encapsulation In Vitro

Tailored proteinaceous building blocks are versatile candidates for the assembly of supramolecular structures such as minimal cells, drug delivery vehicles and enzyme scaffolds. Due to their biocompatibility and tunability on the genetic level, Elastin-like proteins (ELP) are ideal building blocks for biotechnological and biomedical applications. Nevertheless, the assembly of protein based supramolecular structures with distinct physiochemical properties and good encapsulation potential remains challenging.
Here we provide two efficient protocols for guided self-assembly of amphiphilic ELPs into supramolecular protein architectures such as spherical coacervates, fibers and stable vesicles. The presented assembly protocols generate Protein Membrane-Based Compartments (PMBCs) based on ELPs with adaptable physicochemical properties. PMBCs demonstrate phase separation behavior and reveal method dependent membrane fusion and are able to encapsulate chemically diverse fluorescent cargo molecules. The resulting PMBCs have a high application potential as a drug formulation and delivery platform, artificial cell, and compartmentalized reaction space.

At the interface of organic and aqueous solvents, tailored amphiphilic elastin-like proteins assemble into complex supramolecular structures such as vesicles, fibers and coacervates triggered by environmental parameters. The described assembly protocols yield Protein Membrane-Based Compartments (PMBCs) with tunable properties, enabling the encapsulation of various cargo.