Il finanziamento per questo lavoro è fornito dal National Health and Medical Research Council of Australia (sovvenzione di progetto NHMRC 1.011.352 di MEC e MJC, Independent Research Infrastructure Istituti Support Scheme [IRIISS] sovvenzione WEHI) e il Governo del Victoria (Veski Innovazione Fellowship per MEC; Victorian State Government Supporto Operativo Infrastrutture per WEHI). MEC è una Regina Elisabetta II del Fellow Research Council australiano. EFXB riconosce il sostegno del programma di borse di studio Norma Hilda Schuster presso l&#39;Università di Melbourne.

1. Clonazione e Design Construct Clonare le sequenze di interesse nella PMM-peptide vettore (che può essere fornita su richiesta) usando i siti di restrizione HindIII e BamHI (vedi Figura 1). Il doppio filamento di DNA dovrebbe includere, nel seguente ordine: un sito HindIII, un singolo codone metionina per clivaggio CNBr, la E. coli codone ottimizzato peptide sequenza codificante, un codone di stop, un sito BamHI. Tutti gli altri metionine nel peptide dovrebbe essere eliminato e la sequenza dipeptide asp-pro dovrebbe essere evitata in quanto anche essere scisso in condizioni acide. Un residuo di cisteina unico deve essere introdotto in ciascuna sequenza peptidica secondo il posizionamento desiderato del reticolazione disolfuro nel complesso finale, e tutte le altre cisteine ​​dovrebbero essere mutato a serina. Il plasmide porta una cassetta di resistenza alla kanamicina per la selezione. 2. L&#39;espressione di trpLE-Peptide Fusion <ol><li> Make up e filtro sterile mezzo di crescita M9/Kan minimo (0,1 mM CaCl 2, 2 mM MgSO 4, 3 g / L KH 2 PO 4, 7,5 g / L di Na 2 HPO 4 · 2H 2 O, 0,5 g / L di NaCl, 1 g / L NH 4 Cl, 4 g / L di glucosio, 50 mg / L di kanamicina solfato). Supplemento con Centrum completa dalla A alla zinco per fornire vitamine del gruppo B e di metalli in tracce: sciogliere 1 compressa in 40 ml di H 2 O con miscelazione per 30 minuti, centrifuga per rimuovere il materiale insolubile e filtro sterile il surnatante arancione. Conservare la soluzione di archivio a 4 ° C al buio per un massimo di 2 settimane, e utilizzare 4 ml / L in M9. NOTA: 15 N arricchita di NH 4 Cl, 13 C-arricchito glucosio o altri precursori stabili-isotopo marcato può essere incluso nel mezzo M9 a questo punto, se desiderato. </li><li> Inoculare da 100 ml di coltura starter appena trasformato BL21 (DE3) ceppo E. coli in mezzo M9/Kan. Crescere durante la notte a 37 ° C con agitazione a 200 rpm. </li><li> La mattina dopo, controllare il OD 600 della cultura di avviamento - questo dovrebbe essere nel range di 2 o superiore. Diluire i 100 ml di coltura starter in 1 litri di volume totale di Centrum-integrato medio M9. Suddiviso in due 2 palloni L sconcertati (500 ml cultura in ogni flacone) e crescere a 37 ° C in agitazione a 140 rpm fino a quando il OD 600 raggiunge 0.6. </li><li> Impostare la temperatura shaker a 18 ° C e continuare ad agitare per 1 ora, permettendo culture raffreddare completamente prima dell&#39;induzione. </li><li> Prendere un pre-induzione campione per analisi SDS-PAGE (equivalente di 50 microlitri da una coltura a OD 600 = 1), quindi aggiungere IPTG a concentrazione 0,1 mM finale di indurre l&#39;espressione del trpLE-peptide di fusione. Continuare a crescere a 18 ° C/140 rpm per una notte (16-20 ore) in induzione IPTG. </li></ol> 3. Inclusione di preparazione del corpo e Matrix Legatura Nickel <ol><li> La finale OD 600 di culture di espressione durante la notte in terreno minimo è variabile e should essere compreso tra 2.5 e 5.0. Prelevare un campione per l&#39;analisi SDS-PAGE (equivalente di 50 microlitri da una coltura a OD 600 = 1) e raccogliere le cellule per centrifugazione per 20 min a 5000 x g. </li><li> Risospendere il pellet cellulare da 1 L cultura in 50 ml di tampone di lisi (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 20 mM β-ME, 0,2 M NaCl). Sospensioni cellulari possono essere congelati per la successiva elaborazione. </li><li> Lisare cellule mediante sonicazione in ghiaccio alla massima potenza per 1 min e riposo su ghiaccio per 5 min. Usiamo un Sonicator Misonix 3000 (max di uscita 600 watt) con un ½ pollice punta ad alta intensità sostituibile. Ripetere sonicazione / raffreddamento per tre cicli. </li><li> Raccogliere insolubile corpi inclusi (IB) materiale per centrifugazione per 15 minuti a 20.000 xg ed eliminare il surnatante. Un sciolto, sottile strato di colore più chiaro detriti cellulari possono essere visibili in cima alla densa IB pellet, questo può essere lavato via con acqua o tampone con agitazione. Passi 3.3 e 3.4 possono essere ripetuti per migliorare la purezza della frazione IB se desirosso. I campioni di pellet e materiale surnatante deve essere dato per analisi SDS-PAGE per confermare trpLE-TM localizzazione fusione corpi di inclusione. </li><li> Sciogliere IB pellets in soluzione di guanidina (6 M guanidina HCl, 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 200 mM NaCl, 1% Triton X-100, 5 mM β-ME), con 25-50 ml per litro di coltura trasformati. Questo passaggio richiede diverse ore con agitazione e occasionali sonicazione mite. </li><li> Azzerare il lisato IB mediante centrifugazione per 1 ora a 75.000-100.000 xg e 20 ° C. Decantare il surnatante e filtrare attraverso una membrana 0,2 micron. </li><li> Combinare il lisato eliminato IB, in una provetta da 50 ml o una nave più grande che può essere chiuso in modo sicuro, con resina nickel affinità che è stato lavato con acqua e soluzione equilibrata per guanidina. Utilizzare resina 3-4 ml costante per litro di coltura trattati per fusioni che esprimono in misura simile a trpLE-DAP12TM mostrato qui (Figura 3, corsia 2). Bind Batch incubando durante la notte a camera t<html> emperatura con miscelazione delicata. </li></ol> 4. In colonna ossidativo reticolazione <ol><li> Caricare il lisato / nichel sospensione resina IB in una colonna vuota a gravità con il supporto letto poroso, aggiungendo continuamente fino a quando l&#39;intero volume attraversa. Raccogliere e mettere da parte l&#39;eluato, che può ancora contenere proteina di fusione non legato. </li><li> Lavare la resina nichel flusso di gravità con 5 volumi di letto di soluzione di urea (8 M urea, 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 200 mM NaCl) contenente 5 mM β-ME. </li><li> Lavare la resina nichel di nuovo con 5 volumi del letto di soluzione di urea senza β-ME. </li><li> Lavare la resina di nichel per la terza volta con 5 il volume del letto di soluzione di urea che è stato integrato con 20 mM CuSO 4 e 2 mM glutatione ossidato. Dopo tale lavaggio, chiudere l&#39;uscita della colonna e incubare 30 minuti a temperatura ambiente per permettere la massima formazione di legame disolfuro. </li></ol> 5. TFA eluizione e quantificazione contenuto &quot;&gt; ATTENZIONE: l&#39;acido trifluoroacetico (TFA) provoca gravi ustioni a contatto con la pelle ed i vapori sono altamente irritanti concentrato TFA deve essere utilizzato solo in una cappa chimica approvato fumi con protezione per gli occhi e non guanti di lattice Verificare la compatibilità chimica di tutti.. materiali utilizzati, polipropilene è compatibile con tutte le fasi di questo protocollo. <ol><li> Lavare la soluzione di urea ossidante con 10 volumi del letto d&#39;acqua e asciugare il letto colonna applicando una linea di vuoto per l&#39;uscita della colonna. </li><li> Chiudere l&#39;uscita della colonna e aggiungere 1,5 il volume del letto pulito (99-100%) TFA. Mescolare la resina di nichel con una spatola per assicurare un&#39;esposizione ad acido e incubare per 5 min. Aprire l&#39;uscita della colonna e raccogliere l&#39;eluato acido, pressurizzazione delicatamente con una siringa o linea dell&#39;aria compressa se necessario spingere fuori tutto il liquido. </li><li> Ripetere la fase di eluizione acida con un altro 1,5 il volume del letto di TFA ordinata. Lavorare velocemente in questa fase per evitare la completa dissoluzione del Beaded agarosio matrice. Resa di proteine ​​può essere determinato a questo punto, in base al Beer-Lambert equazione e il coefficiente teorico di estinzione molare del trpLE-peptide sequenza. Diluire un campione di eluato TFA (1:20 a 1:50) in trifluoroetanolo (TFE) e misurare l&#39;assorbanza a 280 nm, usando TFA / TFE alla stessa diluizione come bianco. </li></ol> 6. CNBr Digestione ATTENZIONE: il bromuro di cianogeno (CNBr) è estremamente tossico e deve essere maneggiato solo in una cappa chimica approvato fumi. DPI compresi occhiali di sicurezza, camice da laboratorio e non in lattice guanti sono assolutamente necessari. CNBr è reattivo all&#39;umidità e deve essere portato a temperatura ambiente prima dell&#39;apertura. Contatta l&#39;ufficio istituzionale di sicurezza per le istruzioni sulla neutralizzazione / cessione di CNBr contaminate da soluzioni e materiali. <ol><li> Diluire l&#39;eluato acido al 80% di concentrazione finale TFA per aggiunta goccia a goccia di acqua mescolando delicatamente. Se si forma un precipitato, undd indietro un piccolo volume (0,5 a 1 ml) di TFA ordinata finché la soluzione chiarisce, poi ri-corretta al 80% con acqua. Prendete un 5 microlitri di pre-digerire campione per analisi SDS-PAGE, il congelamento in azoto liquido e liofilizzazione il campione immediatamente. </li><li> Aggiungi cristalli CNBr a circa 0,2 g / ml, avendo cura di pesare il prodotto chimico tossico in sicurezza in ambienti chiusi, pre-pesati tubi o utilizzando un equilibrio all&#39;interno della cappa. Mescolare delicatamente fino a completa dissoluzione. Lavare e sigillare il recipiente di reazione sotto gas inerte (azoto o argon flusso) e incubare 3-4 ore a temperatura ambiente, protetto dalla luce. </li><li> Prendete un 5 microlitri post-digest campione per analisi SDS-PAGE e congelare e liofilizzare immediatamente. Trasferire la reazione digest di una cassetta di cellulosa rigenerata dialisi o tubo (acetato di cellulosa si scioglie in acido concentrato) con un taglio di peso molecolare di 3,5 kDa o meno, a seconda delle dimensioni del complesso peptide atteso. Dializza overnight a 4 L di acqua nellacappa per ridurre la concentrazione di TFA e decomporre ogni CNBr che non ha reagito. Lasciare spazio nel cassetto dialisi o tubi per un significativo aumento del volume (fino a due-tre volte) durante la dialisi notturna. </li><li> Rimuovere la soluzione dializzata reazione con precipitato sospeso dalla cassetta dialisi o tubo (la maggior parte della proteina precipitare quando la concentrazione è ridotta TFA) e trasferire la sospensione per 50 ml provette coniche. Congelare e liofilizzare per rimuovere l&#39;acqua e tracce di CNBr / TFA. Questo passaggio può richiedere alcuni giorni. ATTENZIONE: Sia la reazione dializzato digest e l&#39;acqua di dialisi dovrebbe continuare ad essere trattati come tossici e trattati / smaltiti con le dovute precauzioni. </li><li> I campioni di colture di pre-induzione e raccolta fasi, l&#39;inclusione del corpo surnatante e pellet, eluato TFA e CNBr-digerito materiale può essere analizzati mediante SDS-PAGE. Preparare i campioni da riscaldamento a 95 ° C in Invitrogen NuPAGE LDS sample buffer. Eluato TFA e digerire campioni devono essere preparati sia in condizioni riducenti e non riducenti per facilitare l&#39;identificazione del prodotto e la valutazione di reticolazione ossidativa. </li><li> Separare i campioni su un 12% NuPAGE bis-tris pre-cast gel di acrilammide con MES-SDS tampone di corsa per la risoluzione ottimale dei più piccoli prodotti digest. </li></ol> 7. A fase inversa Purificazione HPLC di disolfuro-reticolati peptide <ol><li> Sciogliere fino a 100 mg di prodotti liofilizzati digest in 2-3 ml di acido formico pulito e carico su una scala preparativa (21.2 x 150 mm) Agilent ZORBAX SB-300 C3 colonna PrepHT nel solvente A (in genere 10-20% acetonitrile o 5 -10% di isopropanolo in acqua con 0,1% di TFA). </li><li> Eluire i prodotti digest in un gradiente di solvente B (acetonitrile o isopropanolo con 0,1% TFA) per almeno 5 volumi di colonna. Si veda la discussione per suggerimenti sulla selezione di condizioni di gradiente ottimali per sequenze peptidiche diverse. </li><li> Prendere50-100 campioni microlitri da ogni frazione HPLC per analisi SDS-PAGE e congelare e liofilizzare immediatamente. La rimozione di solventi HPLC è rapido e deve essere completa in 1-2 ore. </li><li> Preparare campioni liofilizzati HPLC per SDS-PAGE per riscaldamento a 95 ° C in tampone campione Invitrogen NuPAGE LDS senza agente riducente. Raffreddare e dividere ogni campione equamente in 2 provette da microcentrifuga, l&#39;aggiunta di 100 mM DTT a uno di loro e ri-riscaldamento brevemente. </li><li> Separare i campioni ridotti e non ridotta HPLC su un 12% NuPAGE bis-tris pre-cast gel di acrilammide con MES-SDS buffer di corsa come sopra. Piccoli, peptidi idrofobici spesso non occupano Coomassie macchia bene e non può funzionare a loro peso molecolare atteso. Tuttavia, il confronto di campioni ridotti e non ridotta deve facilitare l&#39;identificazione dei prodotti peptidici reticolati e la valutazione della purezza. </li><li> Analizzare i peptidi contenenti frazioni candidati da matrix-assisted laser ionizzazione desorbimento tempo di volo (MALDI-TOF) spettrometria di massa (vedi la discussione) per identificare le specie di interesse e confermare la sua massa prevista. </li><li> Combina, congelare e liofilizzare frazioni HPLC contenenti il ​​puro, reticolato TM complesso peptidico e prendere un peso a secco del prodotto finale per determinare i consumi. Le frazioni ad alto contenuto di isopropanolo non può rimanere congelato. Se frazioni peptidiche asciugare fino ad un film piuttosto che un prodotto liofilizzato birichino, nuovamente sciogliere completamente la pellicola in un piccolo volume di pura esafluoroisopropanolo (HFIP), congelare e liofilizzare nuovamente. Il HFIP trattato prodotto deve essere un piccolo cono bianco che può essere facilmente ribaltato e pesato. </li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere conflitto di interessi finanziari.

Espressione di trpLE-TM fusioni. Nella nostra esperienza, trpLE-TM fusioni sono scarsamente espresse in mezzo di coltura ricca a 37 ° C, e le condizioni di coltura qui descritti sono dimostrate efficaci per molte differenti sequenze contenenti 1-4 domini TM con rese variabili 50-150 mg / L di puro, fusione intatta. Codifica Fusions tre o quattro frammenti TM GPCR (umano CCR5 TM1-TM3 e TM4-TM7, rispettivamente) o un frammento di nucleo catalitico umana peptidasi peptide di segnale (quattro domini TM; vedi rif <...

Questo protocollo dettagli una procedura che abbiamo sviluppato per la produzione di complessi disolfuro-stabilizzate di transmembrana (TM) peptidi per studi strutturali mediante NMR soluzione. La procedura si avvale dell&#39;espressione robusta offerta dal sistema ΔtrpLE1413 fusione (vedi sotto) e permette complessi peptide TM di composizione definita da generare utilizzando sofisticate tecniche di isotopi stabili-etichettatura per i moderni multi-dimensionali esperimenti NMR. Abbiamo utilizzato queste tecniche per determinare le strutture NMR più importanti che hanno rivelato nuove informazioni su come linfociti-attivazione immunoreceptors sono assemblati da più subunità delle proteine ​​di membrana attraverso interazioni tra i loro domini TM (recentemente rivisto in 1). Queste tecniche sono applicabili a sistemi a membrana molte altre proteine ​​così come una vasta gamma di metodi analitici valle oltre a NMR soluzione. Mentre l&#39;esempio qui utilizza residui di cisteina nativiper creare un complesso che imita la naturale disolfuro-legato proteina, il design è adatto sia per la creazione di legami disolfuro ingegnerizzati per stabilizzare complessi che sono normalmente tenuti insieme da deboli, interazioni non covalenti quali omo-e etero-TM complessi dimerici di recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR)-familiari proteine ​​2-4 o eterodimeri αβ complessi integrine 5,6. Sequenze peptidiche estremamente idrofobi come quelli derivati ​​dal doppio strato lipidico-spanning porzioni di proteine ​​TM sono soggetti estremamente difficile per studi biochimici e biofisici. Oltre ad essere molto difficile da manipolare utilizzando proteina standard e tecniche di chimica dei peptidi, sono spesso molto tossici per le cellule e sono quindi difficili da produrre ricombinante. Noi e gli altri 7,8 9-11 hanno avuto un significativo successo esprimere tali sequenze peptidiche difficili nei batteri come in-frame carbossi-terminalefusioni di una versione modificata della sequenza ΔtrpLE1413 derivata dalla E. coli operone trp 12. Il ~ 13 kDa polipeptide codificato da trpLE questa sequenza possono essere prodotti a livelli elevati sotto un promotore T7 ed è interamente localizzato corpi di inclusione in cui sono elusione problemi di tossicità e / o instabilità. Modifica della sequenza mediante aggiunta di un amino-terminale 9-istidina 13 e eliminazione dei residui interni metionina e cisteina dalla sequenza trpLE 14 ammessi trpLE-peptide fusioni essere purificati da ioni metallo cromatografia di affinità e digerito con bromuro di cianogeno (CNBr ) per rilasciare la sequenza peptidica desiderata. Abbiamo utilizzato con successo questo sistema per esprimere più di una dozzina di sequenze differenti come fusioni trpLE che rappresentano frammenti di proteine ​​di membrana che contengono fino a quattro domini TM (7,8 e risultati non pubblicati, vedere anche la sezione DISCUSSIONE). Ilinnovazione chiave in questo protocollo è l&#39;identificazione delle condizioni in cui i non strutturati e molto poco solubile trpLE-TM fusioni possono essere efficacemente disolfuro reticolato nel contesto di un flusso di lavoro ottimizzato. Diversi aspetti di alto rendimento di espressione, la manipolazione e la purificazione dei prodotti peptidici sono stati accuratamente ottimizzati, e le raccomandazioni qui presentate sono ugualmente rilevanti per la produzione di non-disolfuro-reticolati (monomerico) TM prodotti peptidici.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente / materiale </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Bromuro di cianogeno </td><td> ALDRICH </td><td> P.No-C91492, CAS-506-68-3 </td><td> SOSTANZA PERICOLOSA. MERCI PERICOLOSE. Molto tossico per inalazione, contatto con la pelle e per ingestione. A contatto con acidi libera gas molto tossico. Altamente tossico per gli organismi acquatici, può causare effetti negativi a lungo termine per l&#39;ambiente acquatico. </td></tr><tr><td> Acido trifluoroacetico </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> CAP e-1000984387, Numero CAS 76-05-1 </td><td> SOSTANZA PERICOLOSA. MERCI PERICOLOSE., Provoca gravi ustioni. Nocivo per inalazione. Nocivo per gli organismi acquatici, può causare effetti negativi a lungo termine per l&#39;ambiente acquatico. </td></tr><tr><td> 2-Mercaptoethanol </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> P.No M7154, numero CAS 60-24-2 </td><td> SOSTANZA PERICOLOSA. MERCI PERICOLOSE. Tossico per inalazione, contatto con la pelle e per ingestione. Irritante per la pelle. Rischio di gravi lesioni oculari. Può provocare sensibilizzazione per contatto con la pelle. Altamente tossico per gli organismi acquatici, può causare effetti negativi a lungo termine per l&#39;ambiente acquatico. </td></tr><tr><td> 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanolo </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> Codice prodotto 52512, CAS. 920-66-1 </td><td> SOSTANZA PERICOLOSA. MERCI PERICOLOSE. Nocivo per inalazione e ingestione. Provoca ustioni. </td></tr><tr><td> Acido formico </td><td> Merck KGaA </td><td> K41186564 </td><td> Liquido e vapori infiammabili. Provoca gravi ustioni cutanee e gravi lesioni oculari. </td></tr><tr><td> Urea </td><td> UNIVAR, AJAX Finechem </td><td> Numero del prodotto, 817, CAS 57-13-6 </td><td> Una volta riscaldato, decomposes di biossido di carbonio e ammoniaca; se bruciato, emette piccole quantità di ossidi di azoto. Può causare arrossamento e irritazione della pelle e degli occhi. </td></tr><tr><td> Guanidina cloridrato </td><td> Amresco </td><td> P.No-M110, Numero CAS: 50-01-1 </td><td> Nocivo per ingestione, Provoca grave irritazione oculare, Provoca irritazione cutanea, Tossicità acuta per via orale, irritante per la pelle, irritante per gli occhi. </td></tr><tr><td> TRITON X-100 </td><td> SIGMA </td><td> Numero del prodotto-T8532 Numero CAS: 9002-93-1 </td><td> Triton X-100 è un detergente non ionico, 100% di principio attivo, che viene spesso utilizzato in applicazioni biochimiche per solubilizzare le proteine. Triton X-100 non ha proprietà antimicrobiche e considerato relativamente mite non denaturante detergente </td></tr><tr><td> Il suo-Select Nichel-gel di affinità </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> Catalogo Num-P6611 </td><td> IS-Select Gel Affinity Il nichel è un metallo immobilizzato agli ioni di cromatografia di affinità (IMAC) del prodotto. La HIS-Select Nickel Affinity gel è un chelato proprietaria quadridentate su perline di agarosio carica di nichel, che è progettato per legarsi specificamente istidina contenente proteine. </td></tr><tr><td> (-)-Glutatione, ossidato </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> Catalogo num 150568 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Misonix S-3000 sonicatore </td><td> QSONICA </td><td> S-3000 (fuori produzione) </td><td> Potenza massima 600 watt. 1/2-inch sostituibile-punta della sonda si 1/2-inch ad alta intensità, ad alto volume punte e una gamma di alta intensità, basso volume punte. Più vicine modelli attualmente disponibili da questa azienda sono Q500 e Q700. </td></tr><tr><td> RP-HPLC: doppio passaggio sistema biologico cromatografia, versione software 5.3 </td><td> Bio-Rad Laboratories </td><td> Catalogo Num 760-0047, Config No: AU500571, Numero di serie: 484BR3705 </td><td> Peptidi lega a fase inversa colonne HPLC in alta aqueous fase mobile e vengono eluite da RP colonne HPLC ad alta fase organica mobile. In RP HPLC peptidi sono separati in base al loro carattere idrofobo. Peptidi possono essere separati eseguendo un gradiente lineare del solvente organico. </td></tr><tr><td> Prep HT C3 ZORBAX 300SB-analitica HPLC Colonna, 21.2 x 150 mm, granulometria 5 micron </td><td> Agilent </td><td> No. del prodotto: 895150-909 </td><td> HPLC in fase inversa Colum </td></tr><tr><td> NuPAGE 12% Bis-Tris Gel </td><td> Life Technologies </td><td> NP0341BOX </td><td> Gel del cast Pre per elettroforesi delle proteine </td></tr><tr><td> Slide-A-lizzatore cassette dialisi G2, 3.5K MWCO </td><td> Thermo Scientific </td><td> No. del prodotto: 87724 </td><td> Esempio di dialisi </td></tr></tbody></table>

production of disulfide-stabilized transmembrane peptide complexes for structural studies

Interazioni fisiche tra i lipidi incorporati alfa-elica domini di proteine ​​di membrana svolgono un ruolo cruciale nel ripiegamento e assemblaggio di complessi proteici di membrana e in processi dinamici quali transmembrana (TM) di segnalazione e regolazione della superficie cellulare proteina livelli. Comprendere le caratteristiche strutturali di guida l&#39;associazione di particolari sequenze richiede sofisticate analisi biofisiche e biochimiche dei complessi peptide TM. Tuttavia, l&#39;idrofobicità estrema domini TM rende molto difficile da manipolare utilizzando tecniche standard di chimica dei peptidi, e la produzione di materiale idoneo studio dimostra spesso proibitivo impegnativo. Identificare le condizioni in base alle quali i peptidi possono adottare conformazioni elicoidali stabili e formano complessi spontaneamente aggiunge un ulteriore livello di difficoltà. Presentiamo qui un procedimento per la produzione di omo-o etero-dimeri peptide TM da materiali che sono espressi in E. coli, consentendo incorporazione di etichette isotopi stabili per risonanza magnetica nucleare (NMR) o amminoacidi non naturali per altre applicazioni relativamente a buon mercato. L&#39;innovazione principale di questo metodo è che i complessi TM vengono prodotti e purificato come covalentemente associate disolfuro (reticolato) gruppi che possono formare strutture stabili, e stechiometrica omogenea quando ricostituito in detergente, o altri lipidi di membrana-mimetici materiali. Presentiamo anche scrupolosamente alle procedure ottimizzate per l&#39;espressione e la purificazione che sono ugualmente applicabili se la produzione di singoli domini TM o complessi reticolati e fornire consigli per adeguare tali metodi per nuove sequenze TM.

Il livello di espressione ottenuto per fusioni trpLE è variabile e dipende fortemente dalla sequenza di aminoacidi del peptide allegata. Figura 3 mostra l&#39;analisi SDS-PAGE di pre-induzione (corsia 1) e il tempo di raccolta (corsia 2) campioni provenienti da una cultura che ha prodotto circa 120 mg di pura, intatta trpLE-DAP12TM fusione da 1 litro di coltura e 4 matrice di nichel ml. Tutto il trpLE-DAP12TM fusione era localizzata all&#39;inclusione corpo pellet (corsia 4) rispetto al supernatante (c...

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Production of Disulfide-stabilized Transmembrane Peptide Complexes for Structural Studies

Studi biofisici e biochimici delle interazioni tra membrane incorporate domini proteici affrontare molte sfide tecniche, di cui il primo è ottenere materiale idoneo di studio. Questo articolo descrive un protocollo per produrre e purificare disolfuro stabilizzate peptide transmembrana che sono adatti per l&#39;analisi strutturale mediante risonanza soluzione magnetica nucleare (NMR) e altre applicazioni analitiche.

Produzione di disolfuro-stabilizzati peptide transmembrana per gli studi strutturali

Physical  interactions among the lipid-embedded alpha-helical domains of membrane  proteins play a crucial role in folding and assembly of membrane ...

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Research

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Chemistry

14.0K Views.  The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research. Studi biofisici e biochimici delle interazioni tra membrane incorporate domini proteici affrontare molte sfide tecniche, di cui il primo è ottenere materiale idoneo di studio. Questo articolo descrive un protocollo per produrre e purificare disolfuro stabilizzate peptide transmembrana che sono adatti per l'analisi strutturale mediante risonanza soluzione magnetica nucleare (NMR) e altre applicazioni analitiche.