La financiación de este trabajo es proporcionada por el Sistema Nacional de Salud y Consejo de Investigación Médica de Australia (NHMRC subvención del proyecto 1011352 al MEC y MJC, Institutos de Investigación Independiente Plan de Apoyo a la Infraestructura [IRIISS] subvención a WEHI) y el Gobierno de Victoria (Veski Innovación Becas MEC a; Apoyo del Gobierno del Estado de Victoria Operacional Infraestructura para WEHI). MEC es una reina Elizabeth II Fellow del Consejo de Investigación Australiano. EFXB reconoce el apoyo del Programa de Becas Norma Hilda Schuster de la Universidad de Melbourne.

1. Clonación y Diseño Construct Clonar las secuencias de interés en el vector de PMM-péptido (que se puede proporcionar a petición) usando HindIII y sitios de restricción BamHI (véase la Figura 1). El inserto de ADN de doble hebra deben incorporar, en el orden siguiente: un sitio HindIII; un solo codón metionina para la escisión con CNBr, la E. coli codón optimizado péptido secuencia de codificación, un codón de parada, un sitio BamHI. Todas las metioninas otros en el péptido debe ser eliminada y la secuencia de dipéptido asp-pro se debe evitar ya que también se puede escindir en condiciones ácidas. Un único residuo de cisteína debe ser introducido en cada secuencia de péptido de acuerdo con el posicionamiento deseado de la reticulación de disulfuro en el complejo final, y todas las otras cisteínas debe ser mutado a serina. El plásmido lleva un casete de resistencia a kanamicina para la selección. 2. Expresión de trpLE-Peptide Fusión <ol><li> Maquillaje y filtro estéril medio M9/Kan mínimo crecimiento (0,1 mM CaCl 2, 2 mM MgSO 4, 3 g / L KH 2 PO 4, 7,5 g / l de Na 2 HPO 4 · 2H 2 O, 0,5 g / L NaCl, 1 g / l NH 4 Cl, 4 g / L de glucosa, 50 mg / L de sulfato de kanamicina). Suplemento con Centrum completa de A a zinc para proporcionar vitaminas B y metales traza:. Disolver 1 comprimido en 40 ml de H 2 O con mezcla durante 30 min, centrifugar para eliminar el material insoluble y el sobrenadante estéril filtro naranja Tienda solución madre a 4 ° C en la oscuridad durante hasta 2 semanas y el uso de 4 ml / L en M9. NOTA: 15 N enriquecido con NH 4 Cl, C-13 glucosa enriquecido u otros precursores de isótopos estables marcados pueden ser incluidos en medio M9 que en esta etapa si se desea. </li><li> Inocular un cultivo de 100 ml de arranque recién transformado BL21 E. (DE3) cepa coli en medio M9/Kan. Crecer durante la noche a 37 ° C con agitación a 200 rpm. </li><li> A la mañana siguiente, comprobar la OD 600 del cultivo iniciador - esto debe estar en el intervalo de 2 o mayor. Diluir el cultivo de 100 ml de arranque en 1 l de volumen total de Centrum medio suplementado M9. Dividido en dos matraces de 2 L deflectores (500 ml de cultivo en cada matraz) y crecen a 37 ° C con agitación a 140 rpm hasta que la DO 600 alcanza 0,6. </li><li> Ajuste la temperatura del agitador a 18 ° C y continuar agitando durante 1 hora, permitiendo que las culturas se enfríe por completo antes de la inducción. </li><li> Tomar una muestra de pre-inducción para el análisis de SDS-PAGE (equivalente de 50 l de un cultivo a una DO de 600 = 1), a continuación, añadir IPTG a una concentración final de 0,1 mM para inducir la expresión de la fusión trpLE-péptido. Continuar creciendo a 18 º C/140 rpm durante la noche (16-20 horas) en la inducción de IPTG. </li></ol> 3. Inclusión Preparación Corporal y Encuadernación matriz de níquel <ol><li> La final OD 600 de cultivos de expresión durante la noche en medio mínimo es variable y should ser de entre 2,5 y 5,0. Tomar una muestra para análisis SDS-PAGE (equivalente de 50 l de un cultivo a una DO de 600 = 1) y recoger las células por centrifugación durante 20 min a 5.000 x g. </li><li> Resuspender el sedimento de células de cultivo L 1 en 50 ml de tampón de lisis (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 20 mM β-ME, 0,2 M NaCl). Las suspensiones celulares se puede almacenar congelado para su posterior procesamiento. </li><li> Lisar las células por sonicación en hielo a potencia máxima durante 1 min y el resto en hielo durante 5 min. Usamos un Sonicator Misonix 3000 (max 600 vatios de salida) con una punta de ½ pulgadas de alta intensidad reemplazable. Repita sonicación / refrigeración durante tres ciclos. </li><li> Recoger el cuerpo de inclusión insoluble (IB) el material por centrifugación durante 15 min a 20.000 xg y descartar el sobrenadante. Una capa suelta y fina de restos de células de color más claro puede ser visible en la parte superior de la densa pellet IB; este puede ser lavado con agua o tampón con agitación suave. Pasos 3,3 y 3,4 se puede repetir para mejorar la pureza de la fracción IB si desirojo. Las muestras de sedimento y el material sobrenadante se deben tomar para el análisis de SDS-PAGE para confirmar trpLE-TM localización fusión a los cuerpos de inclusión. </li><li> Disolver IB pellets en solución de guanidina (6 M de guanidina HCl, 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 200 mM NaCl, 1% de Triton X-100, 5 mM β-ME), con 25-50 ml por litro de cultivo procesado. Este paso requiere varias horas con agitación y sonicación suave ocasional. </li><li> Borrar el lisado IB por centrifugación durante 1 hora a 75,000-100,000 xg y 20 ° C. Decantar el sobrenadante y filtrar a través de una membrana de 0,2 micras. </li><li> Combinar el lisado aclarado IB, en un tubo cónico de 50 ml o un recipiente más grande que se puede cerrar de forma segura, con resina de afinidad de níquel que ha sido lavada con agua y se equilibra con solución de guanidina. Usar 3-4 ml de resina se establecieron por litro de cultivo procesado para las fusiones que expresan a un grado similar como trpLE-DAP12TM se muestra aquí (Figura 3, carril 2). Lotes se unen mediante la incubación de la noche a la habitación t<html> emperatura con mezcla suave. </li></ol> 4. En la columna de reticulación oxidativa <ol><li> Cargue el lisado IB / níquel suspensión de resina en una columna de desagüe vacío con soporte de lecho poroso, agregando continuamente hasta que todo el volumen fluye. Recoger y dejar a un lado la medición de flujo, que pueden contener proteína no unida fusión. </li><li> Lavar la resina de níquel mediante flujo por gravedad con 5 volúmenes de lecho de solución de urea (8 M urea, 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 200 mM NaCl) que contienen 5 mM β-ME. </li><li> Lavar la resina de níquel de nuevo con 5 volúmenes de lecho de solución de urea sin β-ME. </li><li> Lavar la resina de níquel una tercera vez con 5 volúmenes de lecho de solución de urea que se ha complementado con 20 mM CuSO 4 y 2 mM de glutatión oxidado. Después de este lavado, cerrar la salida de la columna y se incuba 30 minutos a temperatura ambiente para permitir la formación máxima de enlace disulfuro. </li></ol> 5. TFA Elución y Cuantificación contenido &quot;&gt; PRECAUCIÓN: ácido trifluoroacético (TFA) provoca graves quemaduras al entrar en contacto con la piel y los vapores son muy irritantes TFA concentrado debe utilizarse sólo en una campana de humos químicos aprobados con protección para los ojos y guantes que no contengan látex Compruebe la compatibilidad química de todos.. los materiales utilizados, el polipropileno es compatible con todos los pasos de este protocolo. <ol><li> Lavar la solución de urea oxidante con 10 volúmenes de lecho de agua y secar el lecho de la columna mediante la aplicación de una línea de vacío a la salida de la columna. </li><li> Cierre la salida de la columna y añadir 1,5 volúmenes de lecho de puro (99-100%) TFA. Se agita la resina de níquel con una pequeña espátula de garantizar una exposición al ácido y se incuba durante 5 min. Abrir la salida de la columna y recoger el eluato ácido, presurizando suavemente con una jeringa o una línea de aire comprimido, si es necesario para expulsar todo el líquido. </li><li> Repita el paso de elución ácida con otros 1,5 volúmenes de lecho de TFA puro. Trabajar rápidamente en este paso para evitar la disolución completa de la beaded matriz de agarosa. El rendimiento de proteína se puede determinar en este punto según la ecuación de Beer-Lambert y el coeficiente de extinción molar teórico de la secuencia trpLE-péptido. Se diluye una muestra del eluato TFA (1:20 a 1:50) en trifluoroetanol (TFE) y medir la absorbancia a 280 nm, utilizando TFA / TFE a la misma dilución como blanco. </li></ol> 6. La digestión con CNBr ADVERTENCIA: El bromuro de cianógeno (CNBr) es extremadamente tóxico y debe ser manejado sólo en una campana de humos químicos aprobado. PPE incluyendo gafas de seguridad, bata de laboratorio y guantes de látex no son absolutamente necesarios. CNBr es reactivo a la humedad y debe estar a temperatura ambiente antes de abrirse. Póngase en contacto con su oficina de seguridad institucional para obtener instrucciones sobre la neutralización / enajenación de CNBr contaminados con soluciones y materiales. <ol><li> Diluir el eluido ácido a la concentración de TFA 80% final de la adición gota a gota de agua mientras se mezcla suavemente. Si se forma un precipitado, unadd atrás un pequeño volumen (0,5 a 1 ml) de TFA puro hasta que se clarifique la solución, a continuación, re-correcta a 80% con agua. Tomar un 5 l pre-digestión de la muestra para el análisis de SDS-PAGE, la congelación en nitrógeno líquido y liofilizar la muestra inmediatamente. </li><li> Añadir cristales CNBr a aproximadamente 0,2 g / ml, teniendo cuidado para pesar el producto químico tóxico de forma segura en cerradas, tubos previamente pesados ​​o usando un equilibrio dentro de la campana química. Mezclar suavemente hasta su completa disolución. Enjuague y sellar el recipiente de reacción en atmósfera de gas inerte (nitrógeno o argón corriente) e incubar 3-4 horas a temperatura ambiente, protegido de la luz. </li><li> Tomar un 5 l post-digestión de la muestra para el análisis por SDS-PAGE y congelar y liofilizar inmediatamente. Transferir la reacción de digestión a un casete de diálisis de celulosa regenerada o tubería (acetato de celulosa se ​​disuelve en ácido concentrado) con un corte de peso molecular de 3,5 kDa o menos, de acuerdo con el tamaño del complejo péptido esperado. Dializar durante toda la noche a 4 L de agua en lacampana química para reducir la concentración de TFA y descomponer cualquier CNBr sin reaccionar. Deje espacio en el casete de diálisis o las tuberías para un aumento significativo en el volumen (tanto como de dos a tres veces) durante la diálisis durante la noche. </li><li> Quitar la solución de reacción dializada con precipitado suspendido de la casete de diálisis o los tubos (la mayor parte de la proteína se precipita cuando la concentración de TFA se reduce) y transferir la suspensión a tubos de 50 ml cónicos. Congelar y liofilizar para eliminar el agua y trazas de CNBr / TFA. Este paso es probable que requieren varios días. PRECAUCIÓN: Tanto la reacción dializada resumen y el agua de diálisis deben seguir siendo tratados como tóxicos y manipulados / desecharse con las precauciones adecuadas. </li><li> Muestras de cultivos procedentes de las etapas de pre-inducción y la cosecha, por cuerpos de inclusión sobrenadante y el sedimento, el eluido TFA y digerido con CNBr material puede ser analizado mediante SDS-PAGE. Preparar muestras por calentamiento a 95 ° C en Invitrogen NuPAGE LDS sample tampón. Eluato TFA y muestras de digerir deben estar preparados tanto en condiciones reductoras y no reductoras para facilitar la identificación del producto y la evaluación de la reticulación oxidativa. </li><li> Separar las muestras en un 12% NuPAGE bis-tris gel de acrilamida prefabricado utilizando MES-SDS funcionamiento de amortiguación para una resolución óptima de los productos más pequeños digerir. </li></ol> 7. HPLC de fase inversa Purificación de disulfuro reticulados complejos de péptidos <ol><li> Disolver hasta 100 mg de liofilizado productos resumidos en 2-3 ml de ácido fórmico puro y carga en un a escala preparativa (21,2 x 150 mm) de Agilent ZORBAX SB-300 C3 PrepHT columna de disolvente A (típicamente acetonitrilo 10-20% o 5 -10% de isopropanol en agua con 0,1% de TFA). </li><li> La elución de los productos de digestión en un gradiente de disolvente B (acetonitrilo o isopropanol con 0,1% TFA) durante al menos 5 volúmenes de columna. Véase la discusión para obtener sugerencias sobre la selección de las condiciones óptimas para el gradiente de secuencias de péptidos diferentes. </li><li> Tomar50-100 muestras mu l de cada fracción de HPLC para el análisis de SDS-PAGE y congelar y liofilizar inmediatamente. Eliminación de los disolventes de HPLC es rápido y debe ser completa en 1-2 horas. </li><li> Preparar muestras liofilizadas de HPLC para SDS-PAGE por calentamiento a 95 ° C en tampón de muestra de Invitrogen NuPAGE LDS sin agente reductor. Enfriar y se dividió cada muestra uniformemente en 2 tubos de microcentrífuga, añadiendo DTT 100 mM a una de ellas y brevemente re-calentamiento. </li><li> Se separan las muestras de HPLC reducidas y no reducidas en un 12% NuPAGE Bis-Tris gel de acrilamida premoldeados con MES-SDS funcionamiento de amortiguación como anteriormente. Pequeños péptidos hidrofóbicos, a menudo no toman Coomassie bien y no se puede ejecutar en sus pesos moleculares esperados. Sin embargo, la comparación de muestras reducidas y no reducidas debe facilitar la identificación de los productos peptídicos reticulados y de evaluación de la pureza. </li><li> Analizar los candidatos que contienen fracciones de péptidos por láser asistida por matriz de desorción ionización tiempo de vuelo (MALDI-AF) espectrometría de masas (ver Discusión) para identificar las especies de interés y confirme su masa esperada. </li><li> Combinar, congelar y liofilizar las fracciones de HPLC que contienen la pura, reticulado TM complejo de péptido y tener un peso en seco del producto final para determinar el rendimiento. Las fracciones con contenido de isopropanol alta no puede permanecer congelado. Si fracciones de péptidos secar hasta una película en lugar de un producto liofilizado esponjoso, volver a disolver la película completamente en un pequeño volumen de puro hexafluoroisopropanol (HFIP), congelar y liofilizar de nuevo. El producto HFIP tratados debería ser un cono pequeño y blanco que es fácil de punta a cabo y se pesa. </li></ol>

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Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto financieros.

Expresión de trpLE-TM fusiones. En nuestra experiencia, trpLE-TM fusiones se expresó mal en medio de cultivo rico a 37 ° C, y las condiciones de cultivo descritas aquí han demostrado tener éxito para muchas secuencias diferentes que contienen de uno a cuatro dominios TM con rendimientos que oscilan 50 a 150 mg / L de fusión puro, intacto. Codificación de fusiones de tres o cuatro fragmentos de TM GPCR (CCR5 humano TM1-TM3 y TM4 TM7-, respectivamente) o un fragmento de núcleo catalítico de la peptidasa ...

Este protocolo detalla un procedimiento que hemos desarrollado para producir complejos estabilizados con disulfuro de péptidos transmembrana (TM) para los estudios estructurales mediante RMN solución. El procedimiento tiene la ventaja de la expresión robusta que ofrece el sistema de fusión ΔtrpLE1413 (ver más abajo) y permite que los complejos de péptidos de TM composición definida para ser generados usando sofisticadas técnicas de isótopos estables de etiquetado para los modernos experimentos de RMN multidimensionales. Hemos empleado estas técnicas para determinar varias estructuras de RMN que revelaron nueva información importante sobre cómo linfocitos activadores de immunoreceptors se ensambla a partir de múltiples subunidades de proteínas de membrana a través de interacciones entre sus dominios TM (recientemente revisado en 1). Estas técnicas son aplicables a muchos otros sistemas de proteínas de membrana, así como una amplia gama de métodos de análisis aguas abajo, además de RMN solución. Mientras que el ejemplo dado aquí utiliza residuos de cisteína nativospara crear un complejo que imita la forma natural unido por puentes disulfuro de proteínas, el diseño es igualmente adecuado para la creación de enlaces disulfuro de ingeniería para estabilizar complejos que normalmente se mantienen juntas por más débiles, interacciones no covalentes, tales como homo-y hetero-dímeros de complejos TM receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGFR)-proteínas de la familia 2-4 o αβ heterodimeric complejos integrina 5,6. Extremadamente hidrófobos secuencias de péptidos tales como los derivados de la bicapa lipídica que abarca porciones de proteínas TM son sujetos excesivamente difícil para los estudios bioquímicos y biofísicos. Además de ser muy difícil de manipular usando proteína estándar y técnicas de química de péptidos, a menudo son muy tóxicos para las células y son por lo tanto difíciles de producir recombinantemente. Nosotros y otros 7,8 9-11 han tenido un éxito significativo expresar esas secuencias de péptidos difíciles en bacterias como en marco carboxi-terminalfusiones con una versión modificada de la secuencia ΔtrpLE1413 derivado de la E. coli trp operón 12. El polipéptido de ~ 13 kDa trpLE codificada por esta secuencia se puede producir en niveles elevados en virtud de un promotor T7 y está totalmente localizada en los cuerpos de inclusión donde los problemas relacionados con la toxicidad y / o la inestabilidad son eludidas. Modificación de la secuencia de la adición de un amino-terminal 9-histidina 13 y la eliminación de los residuos internos de metionina y cisteína de la secuencia trpLE 14 permitidos trpLE-péptido fusiones de ser purificada por metal-ion cromatografía de afinidad y digerido usando bromuro de cianógeno (CNBr ) para liberar la secuencia peptídica deseada. Hemos utilizado con éxito este sistema para expresar más de una docena de diferentes secuencias como fusiones TrpLE que representan fragmentos de proteínas de membrana que contienen hasta cuatro dominios TM (7,8 y resultados no publicados, véase también el apartado de discusión). Lainnovación clave en este protocolo es la identificación de las condiciones en las que los no estructurados y muy poco soluble en trpLE-TM fusiones pueden ser eficientemente disulfuro de reticulado en el contexto de un flujo de trabajo optimizado. Varios aspectos de alto rendimiento de expresión, la manipulación y la purificación de los productos peptídicos también se han optimizado a fondo, y las recomendaciones que aquí se presentan son igualmente relevantes para la producción de no reticulados disulfuro productos (monomérica) TM peptídicos.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo / material </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Bromuro de cianógeno </td><td> ALDRICH </td><td> P.No-C91492, CAS-506-68-3 </td><td> SUSTANCIA PELIGROSA. Mercancías peligrosas. Muy tóxico por inhalación, contacto con la piel e ingestión. El contacto con ácidos libera gases muy tóxicos. Muy tóxico para los organismos acuáticos, puede provocar a largo plazo efectos negativos en el medio ambiente acuático. </td></tr><tr><td> Ácido trifluoroacético </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> CP-1000984387, CAS 76-05-1 </td><td> SUSTANCIA PELIGROSA. MERCANCÍAS PELIGROSAS., Provoca quemaduras graves. Nocivo por inhalación. Nocivo para los organismos acuáticos, puede provocar a largo plazo efectos negativos en el medio ambiente acuático. </td></tr><tr><td> 2-mercaptoetanol </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> P.No M7154, Número CAS 60-24-2 </td><td> SUSTANCIA PELIGROSA. MERCANCÍAS PELIGROSAS. Tóxico por inhalación, contacto con la piel y por ingestión. Irrita la piel. Riesgo de lesiones oculares graves. Posibilidad de sensibilización en contacto con la piel. Muy tóxico para los organismos acuáticos, puede provocar a largo plazo efectos negativos en el medio ambiente acuático. </td></tr><tr><td> 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> Número de producto 52512, CAS-No. 920-66-1 </td><td> SUSTANCIA PELIGROSA. MERCANCÍAS PELIGROSAS. Nocivo por inhalación y por ingestión. Provoca quemaduras. </td></tr><tr><td> Ácido fórmico </td><td> Merck KGaA </td><td> K41186564 </td><td> Líquidos y vapores inflamables. Provoca quemaduras graves en la piel y lesiones oculares. </td></tr><tr><td> Urea </td><td> UNIVAR, AJAX Finechem </td><td> Número de producto, 817, N º CAS 57-13-6 </td><td> Cuando se calienta, diciembreomposes a dióxido de carbono y amoníaco, si se quema, emite pequeñas cantidades de óxidos de nitrógeno. Puede causar enrojecimiento e irritación de la piel y los ojos. </td></tr><tr><td> Hidrocloruro de guanidina </td><td> Amresco </td><td> P.No-M110, Número CAS: 50-01-1 </td><td> Nocivo si se ingiere, causa irritación ocular grave, Provoca irritación cutánea, toxicidad oral aguda, Irritante de piel, Irritante de ojos. </td></tr><tr><td> TRITON X-100 </td><td> SIGMA </td><td> Number-T8532 Producto CAS No: 9002-93-1 </td><td> Triton X-100 es un detergente no iónico, 100% de ingrediente activo, que se utiliza a menudo en aplicaciones bioquímicas para solubilizar las proteínas. Triton X-100 no tiene propiedades antimicrobianas y es considerado un comparativamente suave no desnaturalizante detergente </td></tr><tr><td> Su-Select níquel-Affinity gel </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> Catálogo Num-P6611 </td><td> ES-Select gel de afinidad de níquel es un metal inmovilizado de iones de cromatografía de afinidad (IMAC) del producto. El Nick SU-Selectel gel de afinidad es un quelato patentado quadridentate en perlas de agarosa cargada con níquel que está diseñado para unirse específicamente a las proteínas que contienen histidina. </td></tr><tr><td> (-)-Glutatión, oxidado </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> Catálogo num 150568 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Misonix S-3000 sonicador </td><td> QSONICA </td><td> S-3000 (descatalogados) </td><td> Potencia máxima de salida de 600 vatios. 1/2-inch reemplazables punta de la sonda se 1/2-pulgada de alta intensidad y consejos de gran volumen y una gama de alta intensidad y bajo volumen de consejos. Más próximos modelos actualmente disponibles de esta empresa son Q500 y Q700. </td></tr><tr><td> RP-HPLC: doble paso BioLogic sistema de cromatografía, Software Versión 5.3 </td><td> Bio-Rad Laboratories </td><td> Catálogo Num 760-0047, Config No: AU500571, n º serie: 484BR3705 </td><td> Los péptidos se une a la fase inversa HPLC en columnas de alta aqueous fase móvil y se eluyen de columnas de HPLC RP con alta fase móvil orgánica. En RP HPLC péptidos se separan en base a su carácter hidrófobo. Los péptidos pueden separarse mediante la ejecución de un gradiente lineal de disolvente orgánico. </td></tr><tr><td> Prep HT C3 ZORBAX 300SB-HPLC analítica columna, 21,2 x 150 mm, tamaño de partícula 5 micras </td><td> Agilent </td><td> No Producto: 895150-909 </td><td> HPLC de fase inversa Colum </td></tr><tr><td> NuPAGE 12% Bis-Tris geles </td><td> Life Technologies </td><td> NP0341BOX </td><td> Geles prefabricados para la electroforesis de proteínas </td></tr><tr><td> Slide-A-G2 Lyzer Cassettes diálisis, 3.5K MWCO </td><td> Thermo Scientific </td><td> No Producto: 87724 </td><td> Ejemplo de diálisis </td></tr></tbody></table>

production of disulfide-stabilized transmembrane peptide complexes for structural studies

Interacciones físicas entre las incrustados lípido-alfa-helicoidales dominios de proteínas de membrana juegan un papel crucial en el plegamiento y ensamblaje de los complejos de proteínas de membrana y en procesos dinámicos tales como transmembrana (TM) de señalización y regulación de los niveles de proteína de la superficie celular. Descripción de las características estructurales que impulsan la asociación de secuencias particulares requiere sofisticados análisis biofísicos y bioquímicos de los complejos de péptido de TM. Sin embargo, la hidrofobia extrema de dominios TM hace que sean muy difíciles de manipular utilizando técnicas estándar de la química de péptidos, y la producción de material de estudio adecuado a menudo resulta prohibitivamente difícil. La identificación de condiciones bajo las cuales los péptidos pueden adoptar conformaciones helicoidales estables y complejos se forman espontáneamente añade un nivel más de dificultad. Aquí presentamos un procedimiento para la producción de homo-o hetero-dímeros complejos de péptido de TM a partir de materiales que se expresan en E. columnai, permitiendo así la incorporación de etiquetas de isótopos estables para resonancia magnética nuclear (RMN) o no naturales de aminoácidos para otras aplicaciones relativamente económica. La innovación clave de este método es que los complejos de TM son producidos y purificados como covalentemente asociados (disulfuro de reticulado) ensamblados que pueden formar estructuras estables, estequiométrica y homogénea, cuando se reconstituye en detergente, lípidos u otros materiales miméticos de membrana. También presentamos los procedimientos cuidadosamente optimizados para la expresión y purificación que son igualmente aplicables ya sea para producir un solo TM dominios o complejos entrecruzados y proporcionar asesoramiento para adaptar estos métodos a las nuevas secuencias de TM.

El nivel de expresión logrado en las fusiones TrpLE es variable y depende en gran medida de la secuencia de aminoácidos del péptido adjunto. Figura 3 muestra el análisis SDS-PAGE de pre-inducción (pista 1) y tiempo de cosecha-(carril 2) muestras de una cultura que produjo aproximadamente 120 mg de pura e intacta trpLE-DAP12TM fusión de 1 litro de cultivo y 4 ml matriz de níquel. Todos los de la fusión trpLE-DAP12TM fue localizado en el cuerpo de inclusión de precipitado (carril 4) en lugar de s...

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Production of Disulfide-stabilized Transmembrane Peptide Complexes for Structural Studies

Estudios biofísicos y bioquímicos de las interacciones entre los dominios de la proteína de membrana integrados se enfrentan a muchos desafíos técnicos, la primera de las cuales es la de conseguir material de estudio adecuado. En este artículo se describe un protocolo para producir y purificar estabilizadas por puentes disulfuro complejos de péptidos transmembrana que son adecuados para el análisis estructural por la solución de resonancia magnética nuclear (RMN) y otras aplicaciones analíticas.

La producción de disulfuro estabilizados complejos transmembrana de péptidos de Estudios Estructurales

Physical  interactions among the lipid-embedded alpha-helical domains of membrane  proteins play a crucial role in folding and assembly of membrane ...

production-disulfide-stabilized-transmembrane-peptide-complexes-for

Research

JoVE Journal

Chemistry

14.0K vistas.  The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research. Estudios biofísicos y bioquímicos de las interacciones entre los dominios de la proteína de membrana integrados se enfrentan a muchos desafíos técnicos, la primera de las cuales es la de conseguir material de estudio adecuado. En este artículo se describe un protocolo para producir y purificar estabilizadas por puentes disulfuro complejos de péptidos transmembrana que son adecuados para el análisis estructural por la solución de resonancia magnética nuclear (RMN...

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Steady-state, Pre-steady-state, and Single-turnover Kinetic Measurement for DNA Glycosylase Activity

Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) excises the mutagenic oxidative DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) from DNA. Kinetic characterization of OGG1 is undertaken to measure the rates of 8-oxoG excision and product release. When the OGG1 concentration is lower than substrate DNA, time courses of product formation are biphasic; a rapid exponential phase (i.e. burst) of product formation is followed by a linear steady-state phase. The initial burst of product formation corresponds to the concentration of enzyme properly engaged on the substrate, and the burst amplitude depends on the concentration of enzyme. The first-order rate constant of the burst corresponds to the intrinsic rate of 8-oxoG excision and the slower steady-state rate measures the rate of product release (product DNA dissociation rate constant, koff). Here, we describe steady-state, pre-steady-state, and single-turnover approaches to isolate and measure specific steps during OGG1 catalytic cycling. A fluorescent labeled lesion-containing oligonucleotide and purified OGG1 are used to facilitate precise kinetic measurements. Since low enzyme concentrations are used to make steady-state measurements, manual mixing of reagents and quenching of the reaction can be performed to ascertain the steady-state rate (koff). Additionally, extrapolation of the steady-state rate to a point on the ordinate at zero time indicates that a burst of product formation occurred during the first turnover (i.e. y-intercept is positive). The first-order rate constant of the exponential burst phase can be measured using a rapid mixing and quenching technique that examines the amount of product formed at short time intervals (&lt;1 sec) before the steady-state phase and corresponds to the rate of 8-oxoG excision (i.e. chemistry). The chemical step can also be measured using a single-turnover approach where catalytic cycling is prevented by saturating substrate DNA with enzyme (E&gt;S). These approaches can measure elementary rate constants that influence the efficiency of removal of a DNA lesion.

Time courses for the glycosylase activity of 8-oxoguanine DNA glycosylase are biphasic exhibiting a burst of product formation and a linear steady-state phase. Utilizing quench-flow techniques, the burst and the steady-state rates can be measured, which correspond to excision of 8-oxoguanine and release of the glycosylase from the product DNA, respectively.

Medición cinética de estado estable, Pre-estado de equilibrio, y un solo volumen de negocios de ADN glicosilasa Actividad

Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) excises the mutagenic oxidative DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) from DNA. Kinetic characterization ...

Investigación

Química

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox reactions. The Cu (I) complex of the peptide model of a Cu (I) binding metallochaperone protein, which includes the sequence MTCSGCSRPG (underlined is conserved), was determined in solution under inert conditions by NMR spectroscopy.
NMR is a widely accepted technique for the determination of solution structures of proteins and peptides. Due to difficulty in crystallization to provide single crystals suitable for X-ray crystallography, the NMR technique is extremely valuable, especially as it provides information on the solution state rather than the solid state. Herein we describe all steps that are required for full three-dimensional structure determinations by NMR. The protocol includes sample preparation in an NMR tube, 1D and 2D data collection and processing, peak assignment and integration, molecular mechanics calculations, and structure analysis. Importantly, the analysis was first conducted without any preset metal-ligand bonds, to assure a reliable structure determination in an unbiased manner.

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

The NMR-solution structure of a metallochaperone model peptide with Cu (I) was determined, and a detailed protocol from sample preparation and 1D and 2D data collection to a three-dimensional structure is described.

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox ...

Thin-layer Chromatographic (TLC) Separations and Bioassays of Plant Extracts to Identify Antimicrobial Compounds

A common screen for plant antimicrobial compounds consists of separating plant extracts by paper or thin-layer chromatography (PC or TLC), exposing the chromatograms to microbial suspensions (e.g. fungi or bacteria in broth or agar), allowing time for the microbes to grow in a humid environment, and visualizing zones with no microbial growth.&#160;The effectiveness of this screening method, known as bioautography, depends on both the quality of the chromatographic separation and the care taken with microbial culture conditions.&#160;This paper describes standard protocols for TLC and contact bioautography&#160;with a novel application to amino acid-fermenting bacteria. The extract is separated on flexible (aluminum-backed) silica TLC plates, and bands are visualized under ultraviolet (UV) light.&#160;Zones are cut out and incubated face down onto agar inoculated with the test microorganism.&#160;Inhibitory bands are visualized by staining the agar plates with tetrazolium red.&#160;The method is applied to the separation of red clover (Trifolium pratense cv. Kenland) phenolic compounds and their screening for activity against Clostridium sticklandii, a hyper ammonia-producing bacterium (HAB) that is native to the bovine rumen.&#160;The TLC methods apply to many types of plant extracts&#160;and other bacterial species (aerobic or anaerobic), as well as fungi, can be used as test organisms if culture conditions are modified to fit the growth requirements of the species.

Thin-layer Chromatographic TLC Separations and Bioassays of Plant Extracts to Identify Antimicrobial Compounds

Methods are described for thin-layer chromatographic (TLC) separation of plant extracts and contact bioautography to identify antibacterial metabolites. The methods are applied to the screening of red clover phenolic compounds inhibiting hyper&#160;ammonia-producing bacteria (HAB) native to the bovine rumen.

Cromatográfico en capa fina (TLC) Separaciones y bioensayos de extractos vegetales para identificar compuestos antimicrobianos

A common screen for plant antimicrobial compounds consists of separating plant extracts by paper or thin-layer chromatography (PC or TLC), exposing the ...

Capillary Electrophoresis to Monitor Peptide Grafting onto Chitosan Films in Real Time

Free-solution capillary electrophoresis (CE) separates analytes, generally charged compounds in solution through the application of an electric field. Compared to other analytical separation techniques, such as chromatography, CE is cheap, robust and effectively requires no sample preparation (for a number of complex natural matrices or polymeric samples). CE is fast and can be used to follow the evolution of mixtures in real time (e.g., chemical reaction kinetics), as the signals observed for the separated compounds are directly proportional to their quantity in solution.
Here, the efficiency of CE is demonstrated for monitoring the covalent grafting of peptides onto chitosan films for subsequent biomedical applications. Chitosan&#39;s antimicrobial and biocompatible properties make it an attractive material for biomedical applications such as cell growth substrates. Covalently grafting the peptide RGDS (arginine - glycine - aspartic acid - serine) onto the surface of chitosan films aims at improving cell attachment. Historically, chromatography and amino acid analysis have been used to provide a direct measurement of the amount of grafted peptide. However, the fast separation and absence of sample preparation provided by CE enables equally accurate yet real-time monitoring of the peptide grafting process. CE is able to separate and quantify the different components of the reaction mixture: the (non-grafted) peptide and the chemical coupling agents. In this way the use of CE results in improved films for downstream applications.
The chitosan films were characterized through solid-state NMR (nuclear magnetic resonance) spectroscopy. This technique is more time-consuming and cannot be applied in real time, but yields a direct measurement of the peptide and thus validates the CE technique.

Free solution capillary electrophoresis is a fast, cheap and robust analytical method that enables the quantitative monitoring of chemical reactions in real time. Its utility for rapid, convenient and precise analysis is demonstrated here through analysis of covalent peptide grafting onto chitosan films for improved cell adhesion.

La electroforesis capilar para supervisar Péptido injerto sobre quitosano películas en tiempo real

Free-solution capillary electrophoresis (CE) separates analytes, generally charged compounds in solution through the application of an electric field. ...

Controlled Photoredox Ring-Opening Polymerization of O-Carboxyanhydrides Mediated by Ni/Zn Complexes

Here, we describe an effective protocol that combines photoredox Ni/Ir catalysis with the use of a Zn-alkoxide for efficient ring-opening polymerization, allowing for the synthesis of isotactic poly(&#945;-hydroxy acids) with expected molecular weights (&#62;140 kDa) and narrow molecular weight distributions (Mw/Mn &#60; 1.1). This ring-opening polymerization is mediated by Ni and Zn complexes in the presence of an alcohol initiator and a photoredox Ir catalyst, irradiated by a blue LED (400 - 500 nm). The polymerization is performed at a low temperature (-15 &#176;C) to avoid undesired side reactions. The complete monomer consumption can be achieved within 4 - 8 hours, providing a polymer close to the expected molecular weight with narrow molecular weight distribution. The resulted number-average molecular weight shows a linear correlation with the degree of polymerization up to 1000. The homodecoupling 1H NMR study confirms that the obtained polymer is isotactic without epimerization. This polymerization reported herein offers a strategy for achieving rapid, controlled O-carboxyanhydrides polymerization to prepare stereoregular poly(&#945;-hydroxy acids) and its copolymers bearing various functional side-chain groups.

Controlled Photoredox Ring-Opening Polymerization of O-Carboxyanhydrides Mediated by Ni/Zn Complexes

A protocol for the controlled photoredox ring-opening polymerization of O-carboxyanhydrides mediated by Ni/Zn complexes is presented.

Controla la polimerización de apertura de Photoredox de O- Carboxyanhydrides mediada por complejos de Ni/Zn

Here, we describe an effective protocol that combines photoredox Ni/Ir catalysis with the use of a Zn-alkoxide for efficient ring-opening polymerization, ...

Preparation of Stable Bicyclic Aziridinium Ions and Their Ring-Opening for the Synthesis of Azaheterocycles

Bicyclic aziridinium ions were generated by the removal of an appropriate leaving group through internal nucleophilic attack by nitrogen atom in the aziridine ring. The utility of bicyclic aziridinium ions, specifically 1-azoniabicyclo[3.1.0]hexane and 1-azoniabicyclo[4.1.0]heptane tosylate highlighted in the aziridine ring openings by the nucleophile with the release of the ring strain to yield the corresponding ring-expanded azaheterocycles such as pyrrolidine, piperidine and azepane with diverse substituents on the ring in regio- and stereospecific manner. Herein, we report a simple and convenient method for the preparation of the stable 1-azabicyclo[4.1.0]heptane tosylate followed by selective ring opening via a nucleophilic attack either at the bridge or at the bridgehead carbon to yield piperidine and azepane rings, respectively. This synthetic strategy allowed us to prepare biologically active natural products containing piperidine and azepane motif including sedamine, allosedamine, fagomine and balanol in highly efficient manner.

Bicyclic aziridinium ions such as 1-azoniabicyclo[4.1.0]heptane tosylate were generated from 2-[4-tolenesulfonyloxybutyl]aziridine, which was utilized for the preparation of substituted piperidines and azepanes via regio- and stereospecific ring-expansion with various nucleophiles. This highly efficient protocol allowed us to prepare diverse azaheterocycles including natural products such as fagomine, febrifugine analogue and balanol.

Preparación de iones Aziridinium bicíclica estable y su apertura para la síntesis de Azaheterocycles

Bicyclic aziridinium ions were generated by the removal of an appropriate leaving group through internal nucleophilic attack by nitrogen atom in the ...

Novel Techniques for Observing Structural Dynamics of Photoresponsive Liquid Crystals

We discuss in this article the experimental measurements of the molecules in liquid crystal (LC) phase using the time-resolved infrared (IR) vibrational spectroscopy and time-resolved electron diffraction. Liquid crystal phase is an important state of matter that exists between the solid and liquid phases and it is common in natural systems as well as in organic electronics. Liquid crystals are orientationally ordered but loosely packed, and therefore, the internal conformations and alignments of the molecular components of LCs can be modified by external stimuli. Although advanced time-resolved diffraction techniques have revealed picosecond-scale molecular dynamics of single crystals and polycrystals, direct observations of packing structures and ultrafast dynamics of soft materials have been hampered by blurry diffraction patterns. Here, we report time-resolved IR vibrational spectroscopy and electron diffractometry to acquire ultrafast snapshots of a columnar LC material bearing a photoactive core moiety. Differential-detection analyses of the combination of time-resolved IR vibrational spectroscopy and electron diffraction are powerful tools for characterizing structures and photoinduced dynamics of soft materials.

Here, we present the protocols of differential-detection analyses of time-resolved infrared vibrational spectroscopy and electron diffraction which enable observations of the deformations of local structures around photoexcited molecules in a columnar liquid crystal, giving an atomic perspective on the relationship between the structure and the dynamics of this photoactive material.

Nuevas técnicas para la observación de la dinámica estructural de los cristales líquidos Photoresponsive

We discuss in this article the experimental measurements of the molecules in liquid crystal (LC) phase using the time-resolved infrared (IR) vibrational ...

Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing metabolic reactions, DNA repair and replication. Therefore, a detailed understanding of these processes provides critical information on how cells function. Integrative structural MS methods offer structural and dynamical information on protein complex assembly, complex connectivity, subunit stoichiometry, protein oligomerization and ligand binding. Recent advances in integrative structural MS have allowed for the characterization of challenging biological systems including large DNA binding proteins and membrane proteins. This protocol describes how to integrate diverse MS data such as native MS and ion mobility-mass spectrometry (IM-MS) with molecular dynamics simulations to gain insights into a helicase-nuclease DNA repair protein complex. The resulting approach provides a framework for detailed studies of ligand binding to other protein complexes involved in important biological processes.

Mass spectrometry (MS) has emerged as an important tool for the investigation of structure and dynamics of macromolecular assemblies. Here, we integrate MS-based approaches to interrogate protein complex formation and ligand binding.

Análisis de arquitecturas de proteínas y complejos de proteína-ligando por espectrometría de masa estructural integrativo

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing ...

Preparation of SNS Cobalt(II) Pincer Model Complexes of Liver Alcohol Dehydrogenase

Chemical model complexes are prepared to represent the active site of an enzyme. In this protocol, a family of tridentate pincer ligand precursors (each possessing two sulfur and one nitrogen donor atom functionalities (SNS) and based on bis-imidazole or bis-triazole compounds) are metallated with CoCl2&#183;6H2O to afford tridentate SNS pincer cobalt(II) complexes. Preparation of the cobalt(II) model complexes for liver alcohol dehydrogenase is facile. Based on a quick color change upon adding the CoCl2&#183;6H2O to acetonitrile solution that contains the ligand precursor, the complex forms rapidly. Formation of the metal complex is complete after allowing the solution to reflux overnight. These cobalt(II) complexes serve as models for the zinc active site in liver alcohol dehydrogenase (LADH). The complexes are characterized using single crystal X-ray diffraction, electrospray mass spectrometry, ultra-violet visible spectroscopy, and elemental analysis. To accurately determine the structure of the complex, its single crystal structure must be determined. Single crystals of the complexes that are suitable for X-ray diffraction are then grown via slow vapor diffusion of diethyl ether into an acetonitrile solution that contains the cobalt(II) complex. For high quality crystals, recrystallization typically takes place over a 1 week period, or longer. The method can be applied to the preparation of other model coordination complexes and can be used in undergraduate teaching laboratories. Finally, it is believed that others may find this recrystallization method to obtain single crystals beneficial to their research.

Preparation of SNS CobaltII Pincer Model Complexes of Liver Alcohol Dehydrogenase

The preparation of SNS pincer cobalt(II) model complexes of liver alcohol dehydrogenase is presented here. The complexes can be prepared by reacting the ligand precursor with CoCl2&#183;6H2O and can then be recrystallized by allowing diethyl ether to slowly diffuse into an acetonitrile solution that contains the cobalt complex.

Preparación de SNS Cobalt(II) Pincer Model Complexes of Liver Alcohol Dehydrogenase

Chemical model complexes are prepared to represent the active site of an enzyme. In this protocol, a family of tridentate pincer ligand precursors (each ...

Directed Assembly of Elastin-like Proteins into defined Supramolecular Structures and Cargo Encapsulation In Vitro

Tailored proteinaceous building blocks are versatile candidates for the assembly of supramolecular structures such as minimal cells, drug delivery vehicles and enzyme scaffolds. Due to their biocompatibility and tunability on the genetic level, Elastin-like proteins (ELP) are ideal building blocks for biotechnological and biomedical applications. Nevertheless, the assembly of protein based supramolecular structures with distinct physiochemical properties and good encapsulation potential remains challenging.
Here we provide two efficient protocols for guided self-assembly of amphiphilic ELPs into supramolecular protein architectures such as spherical coacervates, fibers and stable vesicles. The presented assembly protocols generate Protein Membrane-Based Compartments (PMBCs) based on ELPs with adaptable physicochemical properties. PMBCs demonstrate phase separation behavior and reveal method dependent membrane fusion and are able to encapsulate chemically diverse fluorescent cargo molecules. The resulting PMBCs have a high application potential as a drug formulation and delivery platform, artificial cell, and compartmentalized reaction space.

At the interface of organic and aqueous solvents, tailored amphiphilic elastin-like proteins assemble into complex supramolecular structures such as vesicles, fibers and coacervates triggered by environmental parameters. The described assembly protocols yield Protein Membrane-Based Compartments (PMBCs) with tunable properties, enabling the encapsulation of various cargo.