نشكر الدكتور تشارلز غرينبرغ لاستخدام PCR الوقت الحقيقي له الجهاز. ويدعم هذا العمل من قبل صندوق سرطان MUSC هولينغ بدء التشغيل مركز هولينغ مركز السرطان ACS IRG، ASCO قهر السرطان التطوير الوظيفي مؤسسة جائزة، NIH-01A1 1K08HL 103780، والمعاهد الوطنية للصحة 3P30CA138313-01S3. المحتوى هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية من المعاهد الوطنية للصحة أو وكلاء التمويل الأخرى.

1. عزل الخلايا نخاع العظم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء ذكر المانحة FVB / NJ الفئران والإناث FVB / NJ الفئران باستخدام طريقة CO 2 تليها خلع عنق الرحم. وسوف تستخدم الأنثى نخاع العظم FVB / NJ الخلايا كخلايا تنافسية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام مقص وملقط صغير، تشريح من عظام الفخذ وtibiaes من الفئران ووضعها في صحن زراعة الأنسجة 60 مم تحتوى على 6 مل RPMI1640 الجليد الباردة مع FBS المعطل الحرارة 5٪. استخدام الأنسجة kimwipe لإزالة العضلات والأنسجة الأخرى. قطع طرفي كل رمح العظام في الطبق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توصيل نهاية العظام مع إبرة حقنة سم مكعب على 23G 3، اخراج نخاع العظام مع RPMI1640 مع FBS المعطل الحرارة 5٪ في الطبق. تفصيل أنسجة النخاع العظمي من تطلعات المتكررة باستخدام إبرة واحدة. نقل التعليق الخلية إلى 15 مل أنبوب الطرد المركزي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور باستمرار لمدة 5 دقائق الخلايا في 400 XG، وإزالة طاف، إعادة تعليق الخلايا في 1 مل من درجة حرارة الغرفة العازلة تحلل الخلايا الحمراء في الدم (155 ملي عبيكربونات otassium، 10 ملي كلوريد الأمونيوم، 0.1 ملم EDTA، PH = 7.4) واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق ثم يضاف مل 5-10 من RPMI 1640 مع FBS المعطل الحرارة 5٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمر الخلايا من خلال مصفاة الخلية. جمع من خلال تدفق إلى أنبوب جديد. تدور باستمرار لمدة 5 دقائق في ز × 400. إزالة طاف، وبيليه الخلية يجب أن لا تحتوي على أي لون أحمر. غياب اللون الأحمر يشير إلى الإزالة الكاملة للخلايا الدم الحمراء. إعادة تعليق بيليه خلية في 10 مل من RPMI1640 مع FBS المعطل الحرارة 5٪. دوامة بلطف للتأكد من التعليق الخلية موحدة تماما. قسامة واتخاذ عد الخلايا في عدادة الكريات. حساب مقدار حجم الخلايا اللازمة لزرع نخاع العظم والخلايا قسامة ما يكفي من الخلايا المانحة وتخلط مع خلايا الذكور الإناث منافس في نسبة 05:02. تدور باستمرار لمدة 5 دقائق في 400 XG، وغسل مع PBS، resuspend في برنامج تلفزيوني مع تركيز النهائي من الخلايا المانحة في 5 × 10 خلايا 6 / مل ومنافس في 2 × 10 6 </suف&gt; / مل. </li></ol> 2. تنافسية زرع نقي العظم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الفئران المتلقية أشرق الإناث (8-12 أسبوعا من العمر) مع 137Cs أشعة غاما المبرد في جرعة واحدة من 4-6 ساعة قبل الزرع 11Gy نخاع العظام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الفئران الإناث المشععة في restrainer الماوس. حقن الخلايا المانحة المختلطة ومنافس عبر الوريد الذيل في 0.1 مل من الحجم الكلي بحيث يتلقى كل الماوس 5 × 10 خلايا المانحة 5 و 2 × 10 نخاع العظام والخلايا منافس 5. </li></ol> 3. عينة كوكتيل أزواج أسابيع بعد زرع نخاع العظام، وجمع عينات الدم المحيطي (~ 50 ميكرولتر) من الإناث من قبل المتلقي الماوس الرجعية المدارية نزيف تحت ظروف التخدير. يتم جمع العينات في أنابيب EDTA المغلفة. ويمكن أيضا أن تجمع عينات BM في نهاية التجربة، وعادة ما لا يقل عن 4 أشهر زرع آخر، مع إجراءات كالسابق وصف (الخطوة 1)؛ 20-40٪ عادة من1 BM الساق الخلايا ما يكفي لجعل كمية كافية من الحمض النووي. يتم جمع عينات الدم أو أيضا BM من العمر المتطابقة العادية الفئران الذكور والإناث لإعداد منحنى القياسية. 4. الجينومية DNA عزل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 4 × حجم من درجة حرارة الغرفة العازلة تحلل RBC (~ 200 ميكرولتر) إلى كل عينة الدم. تخلط جيدا واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني، وتدور ثم تراجع لإزالة معظم RBC هي lysed. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل DNA باستخدام استخراج DNA طقم الدم (الدم عدة QIAmp استخراج DNA). قبل شطف الحارة المخزن المؤقت (AE) في 37 ° C لتعزيز العائد من الحمض النووي مزال. يتم عزل الذكور والإناث السلطات الوطنية المعينة لمنحنى القياسية بالمثل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن (اختياري) يتم تنقية الحمض النووي الجيني أخرى أو باستخدام تتركز EtOH طريقة هطول الأمطار في وجود خلات الصوديوم من 3 M (الرقم الهيدروجيني = 5.5). ومعلق ثم الكريات DNA في الماء المقطر 40-50 ميكرولتر لتحليل فورا أو تخزينها في -20 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس DNA concentrأوجه مع Nanodrop ND-1000 مضواء الأطياف. وتستخدم العينات مع OD 260/280 بين 1،8-2،0 لمزيد من التحليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع DNA مع خدمة DNAase O 2 H ل4ng/μl في حجم ما مجموعه 50 ميكرولتر. </li></ol> 5. معيار إعداد منحنى تمييع DNA الحمض النووي وذكر الإناث إلى تركيز من 4 نانوغرام / ميكرولتر، وجعل الخليط DNA وفقا لTable1 <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> ٪ من الذكور في الخلفية DNA أنثى </td><td> حجم (ميكرولتر) من الحمض النووي ذكر 4ng/μl </td><td> حجم (ميكرولتر) من الإناث DNA 4ng/μl </td><td> اجمالى حجم التداول (ميكرولتر) </td></tr><tr><td> 0.2 </td><td> 1 </td><td> 499 </td><td> 500 </td></tr><tr><td> 0.5 </td><td> 1 </td><td> 199 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 2.5 </td><td> 5 </td><td> 195 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 12،5 </td><td> 25 </td><td> 175 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 100 </td><td> 100 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 87،5 </td><td> 175 </td><td> 25 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 100 </td><td> 200 </td><td> 0 </td><td> 200 </td></tr></tbody></table> إعداد جدول نموذج 1. لمنحنى القياسية. تمت التضحية الطبيعي الذكور والإناث FVB / NJ الفئران في سن 12wks-8. تم جمع الدم والخلايا BM. تم عزل الخلايا السلطات الوطنية المعينة من الذكور وخلايا الإناث وإعادة علقت-بتركيز 4ng/μl. كانت مختلطة السلطات الوطنية المعينة من الذكور والإناث في نسب مختلفة لتوليد مخاليط DNA العينة القياسية. 6. في الوقت الحقيقي PCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد لوحة PCR عن طريق خلط رد فعل SYBR كاشف supermix الأخضر مع الاشعال والحمض النووي الجيني. حجم رد الفعل (20 ميكرولتر) يحتوي على 400 نيوتن متر من كل التمهيدي و 5 ميكرولتر من الحمض النووي الجيني خلايا الدم (4ng/μl X5 = 20 نانوغرام ميكرولتر) في كل رد فعل. DNA عصيدةتم تعيين ما يصل ليه والمعايير في ثلاث نسخ. يتم عرض تسلسل الاشعال في الجدول 2. </li></ol><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم الجين </td><td> إلى الأمام </td><td> عكس </td></tr><tr><td> Bcl2 </td><td> 5&#39;-AAGCTGTCACAGAGGGGCTA </td><td> 5&#39;-CAGGCTGGAAGGAGAAGATG </td></tr><tr><td> Zfy1 </td><td> 5-TGGAGAGCCACAAGCTAACCA </td><td> 5&#39;-CCCAGCATGAGAAAGATTCTTC </td></tr></tbody></table> الجدول 2. تسلسل التمهيدي RT-PCR لBcl2 الفئران وZfy1. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء PCR تفاعل PCR باستخدام آلة Biorad iQ5 مع الشروط التالية: 95 ° C 3 دقائق، ودورات التضخيم 42 من 95 درجة مئوية لمدة 10 ثانية و 58 درجة مئوية لمدة 25 ثانية و 72 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، يليه منحنى ذوبان الخطوة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على دورة عتبة (CT) من القيم بيو راد iQ5 2.1 النظام الإصدار القياسي البصرية. حساب δCt (CT Zfy1 &lt;/ سوب&gt; Bcl2-CT) قيمة، ويحسب Zfy1 مستوى التعبير كقيمة 2-δ ط م. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء منحنيات القياسية لكل سلسلة رد فعل باستخدام 2-δCt القراءة من الخلائط ذكر / أنثى المعروفة القياسية. يتم إنشاء منحنيات القياسية من قبل المتهم بالتآمر في متوسط ​​2-δCt قيمة ثلاث مكرارت إلى DNA٪ المعروف ذكر في الخليط المناسب مع الانحدار الخطي. </li></ol>

<ol>
	<li>McCulloch, E. A., Till, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+radiation+sensitivity+of+normal+mouse+bone+marrow+cells,+determined+by+quantitative+marrow+transplantation+into+irradiated+mice.">The radiation sensitivity of normal mouse bone marrow cells, determined by quantitative marrow transplantation into irradiated mice.</a> Radiat. Res. 13, 115-125 (1960).</li><li>Xiao, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+lacking+Ott1+display+aspects+associated+with+aging+and+are+unable+to+maintain+quiescence+during+proliferative+stress.">Hematopoietic stem cells lacking Ott1 display aspects associated with aging and are unable to maintain quiescence during proliferative stress.</a> Blood. 119, 4898-4907 (2012).</li><li>Kang, Y., Chen, B. J., Deoliveira, D., Mito, J., Chao, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+enhancement+of+donor+hematopoietic+cell+engraftment+by+the+CXCR4+antagonist+AMD3100+in+a+mouse+transplantation+model.">Selective enhancement of donor hematopoietic cell engraftment by the CXCR4 antagonist AMD3100 in a mouse transplantation model.</a> PLoS One. 5, e11316 (2010).</li><li>Sadeghi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GVHD+after+chemotherapy+conditioning+in+allogeneic+transplanted+mice.">GVHD after chemotherapy conditioning in allogeneic transplanted mice.</a> Bone Marrow Transplant. 42, 807-818 (2008).</li><li>Taketo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FVB/N:+an+inbred+mouse+strain+preferable+for+transgenic+analyses.">FVB/N: an inbred mouse strain preferable for transgenic analyses.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 2065-2069 (1991).</li><li>Morisaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotypic+analysis+using+a+Y-chromosome-specific+probe+following+bone+marrow+transplantation.">Genotypic analysis using a Y-chromosome-specific probe following bone marrow transplantation.</a> Am. J. Hematol. 27, 30-33 (1988).</li><li>Lo, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+fetal+DNA+in+maternal+plasma+and+serum:+implications+for+noninvasive+prenatal+diagnosis.">Quantitative analysis of fetal DNA in maternal plasma and serum: implications for noninvasive prenatal diagnosis.</a> Am. J. Hum. Genet. 62, 768-775 (1998).</li><li>Byrne, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimerism+analysis+in+sex-mismatched+murine+transplantation+using+quantitative+real-time+PCR.">Chimerism analysis in sex-mismatched murine transplantation using quantitative real-time PCR.</a> Biotechniques. 32, 279-280 (2002).</li><li>Ma, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+recipient-derived+cells+in+allograft+neointima+formation+and+the+response+to+stent+implantation.">Contribution of recipient-derived cells in allograft neointima formation and the response to stent implantation.</a> PLoS One. 3, e1894 (2008).</li><li>Bosio, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+between+real-time+quantitative+PCR+and+DNA+hybridization+for+quantitation+of+male+DNA+following+myoblast+transplantation.">A comparison between real-time quantitative PCR and DNA hybridization for quantitation of male DNA following myoblast transplantation.</a> Cell Transplant. 13, 817-821 (2004).</li><li>Merchant, A., Joseph, G., Wang, Q., Brennan, S., Matsui, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gli1+regulates+the+proliferation+and+differentiation+of+HSCs+and+myeloid+progenitors.">Gli1 regulates the proliferation and differentiation of HSCs and myeloid progenitors.</a> Blood. 115, 2391-2396 (2010).</li><li>Nagamine, C. M., Chan, K., Hake, L. E., Lau, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+two+candidate+testis-determining+Y+genes+(Zfy-1+and+Zfy-2)+are+differentially+expressed+in+fetal+and+adult+mouse+tissues.">The two candidate testis-determining Y genes (Zfy-1 and Zfy-2) are differentially expressed in fetal and adult mouse tissues.</a> Genes &amp; development. 4, 63-74 (1990).</li><li>Grundler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+PIM+serine/threonine+kinases+in+FLT3-ITD-induced+leukemogenesis+reveals+PIM1+as+regulator+of+CXCL12-CXCR4-mediated+homing+and+migration.">Dissection of PIM serine/threonine kinases in FLT3-ITD-induced leukemogenesis reveals PIM1 as regulator of CXCL12-CXCR4-mediated homing and migration.</a> J. Exp. Med. 206, 1957-1970 (2009).</li></ol>

لقد تنافس المصالح المالية لا تكشف ل.

والهدف من دراستنا الحالية هو توفير تقنية PCR الجماهير القائم على تحديد الجهات المانحة engraftment خلية في نموذج تنافسية العظام زرع نخاع الفئران. تم الإبلاغ عن العديد من الدراسات باستخدام RT-PCR للكشف عن الخلايا المانحة في نماذج زرع 9-10. مجموعة الدكتور Schwarzenberger في تطوير أ?...

كان أول من طور نموذج الفئران العظام زرع نقي (BM) في 1960s 1. وقد تم استخدام هذا النموذج على نطاق واسع لدراسة الخلية الجذعية المكونة للدم المانحة (HSC) علم الأحياء في مجموعة الماوس المتلقي. وقد وفرت الفئران زرع نخاع العظم نموذج لنا معلومات قيمة عن وظائف HSC وتنظيمها وأمر لا غنى عنه في البحث HSC. وتستخدم خيفي زرع نخاع العظام مثل نموذج C57Bl/6J H2B-BALB / C H2d أو نموذج مسانج مشترك زرع مثل C56Bl/6J CD45.2-B6.SJL CD45.1 في العديد من المختبرات لدراسة وظيفة الجين على النشاط HSC 2، تأثير العلاج من تعاطي المخدرات على الأمراض وظيفة 3 أو زرع HSC ذات الصلة مثل الطعم ضد المضيف المرض (GVHD) 4. ويشيع استخدام علامات سطح الخلية مثل النمط الفرداني MHC أو CD45.1 للخلايا المانحة المستمدة من خلايا المتلقي المميزة ذات المصدر. C57Bl/6J H2B، CD45.2 </suف&gt;، BALB / C H2d وCD45.1 B6.SJL هي سلالات الفئران الأكثر شيوعا في زرع نخاع العظم لأنه يمكن المساهمة الخلية المانحة المقررة بسهولة عن طريق قياس التدفق الخلوي CD45.1 مقابل CD45.2 أو H2B مقابل H2d. ومع ذلك، يتم أيضا سلالات أخرى كثيرة مثل FVB / 5 و NJ C3H غالبا ما تستخدم لتوليد المعدلة وراثيا وراثيا أو الفئران خروج المغلوب. قد تكون هذه الفئران backcrossed إلى خط الفطرية والمحافظة عليها في خلفية الوراثية / MHC مختلطة. في هذه الحالات، يمكن تحديد الخلية المانحة engraftment وظيفة HSC يكون من الصعب كعلامات المانحة سطح خلايا محددة قد لا تكون متاحة. باستخدام كروموسوم Y-DNA محددة التحقيق للكشف عن الخلايا المانحة الذكور من لطخة في جنوب الجنس غير متطابقة زرع نخاع العظام كان أول من طور من قبل مجموعة الدكتور ميوا 6. ثم، تم العثور على PCR الوقت الحقيقي للY المنطقة المحدد للجنس ليكون وسيلة دقيقة ومحددة للغاية لquantitate أماهخلايا الجنين جنيه في النظام دم الأم 7. وقد تم تكييف هذا المفهوم من قبل مجموعة الدكتور Schwarzenberger لتطوير تقنية PCR في الوقت الحقيقي في نموذج الفئران زرع نخاع العظام لتحديد الخلية المانحة engraftment 8. ونحن كذلك تعديل هذه الطريقة لقياس engraftment الخلية المانحة في FVB / NJ نموذج الفأر العظام زرع نقي. حاليا تستخدم هذه الطريقة على نطاق واسع في مجموعتنا لدراسة دور Pim1 كيناز في علم الأحياء HSC.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> التعليقات (اختياري) </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Hyclone </td><td> SH30255.01 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> إينفيتروجن </td><td> 16140-017 </td><td> الحرارة المعطل </td></tr><tr><td> كلوريد الأمونيوم </td><td> MP Biomedicaals </td><td> 194806 </td><td></td></tr><tr><td> بيكربونات البوتاسيوم </td><td> الصياد </td><td> P184-500 </td><td></td></tr><tr><td> QIAamp DNA الدم minikit </td><td> QIAGEN </td><td> 51106 </td><td></td></tr><tr><td> الخلية مصفاة </td><td> العلوم البيولوجية دينار بحريني </td><td></td><td></td></tr><tr><td> معدل الذكاء SYBR الأخضر supermix </td><td> Biorad </td><td> 170-8882 </td><td></td></tr><tr><td> iQ5 الحقيقي آلة الزمن PCR </td><td> Biorad </td><td></td><td></td></tr><tr><td> أطياف مضواء </td><td> Nanodrop ND-1000 </td><td> ND-1000 </td><td></td></tr></tbody></table>

using quantitative real-time pcr to determine donor cell engraftment in a competitive murine bone marrow transplantation model

الفئران نماذج زرع نخاع العظام توفير أداة هامة في قياس الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSC) وظائف الجينات وتحديد / الجزيئات التي تنظم HSCs. في هذه النظم نموذج زرع، يتم تحديد وظيفة HSCs من قدرة هذه الخلايا على الفئران تدبر وإعادة المتلقي المشع قاتل. عادة، يتم قياس الخلية المانحة المساهمة / engraftment من الأجسام المضادة للبروتينات محددة من المانحين سطح الخلية باستخدام التدفق الخلوي. ومع ذلك، وهذه الطريقة تعتمد بشكل كبير على نوعية وقدرة الخلية علامة لتمييز سطح المانحة الخلايا المشتقة من الخلايا المتلقية ذات المصدر، والتي قد لا تكون متاحة لجميع سلالات الفئران. النظر في خلفيات مختلفة من سلالات الفئران المعدلة وراثيا في السوق، وهذا سطح الخلية / تدفق الخلوي على أساس الطريقة لها أهمية خاصة في القيود سلالات الفئران التي تفتقر إلى علامات واضحة المعالم السطحية لخلايا منفصلة عن المانحة مسانج مشترك المستفيدة مLLS. هنا، أبلغنا تقنية PCR المستندة لتحديد الخلية المانحة engraftment / مساهمة في الفئران المتلقية الزرع. نحن زرع نخاع الذكور HSCs المانحة العظام للفئران مسانج مشترك المشع قاتل النساء. تم جمع عينات الدم المحيطي في مختلف زرع وقت آخر نقطة. تم الحصول على عينات نخاع العظم في نهاية التجارب. تم عزل الحمض النووي الجيني وتضخيم الجين كروموسوم Y محددة، Zfy1، وذلك باستخدام كمية PCR الوقت الحقيقي. تم حساب engraftment من الخلايا المانحة المستمدة من الذكور في الإناث الفئران المتلقية ضد منحنى القياسية مع نسبة معروفة من السلطات الوطنية المعينة ذكر مقابل أنثى. وقد استخدم Bcl2 باسم الجينات إشارة إلى تطبيع كمية DNA الكلي. اقترح البيانات المتوفرة لدينا أن هذا النهج يحدد بشكل موثوق المانحة engraftment الخلية ويوفر طريقة مفيدة، وإن كان بسيطا في قياس المكونة للدم إعادة خلية في الفئران نماذج زرع نخاع العظام. يمكن إجراء روتيني أسلوبنا في معظم المختبرات لأنه لا يوجدمطلوب معدات مكلفة مثل التدفق الخلوي.

وأظهرت الشكل 1 و 2 أمثلة من المنحنيات القياسية تآمر مع القيم متوسط ​​δCt-2 ضد نسب الذكور DNA. الشكل 1A أظهرت درجة حرارة انصهار محددة لBcl2 وZfy1 amplicons المترجمة في 78،5 ° C و 88.5 ° C، على التوالي. يستخدم Bcl2 باسم الجينات إشارة إلى تطبيع المبلغ الإجمالي للDNA تح?...

Watch this Scientific Journal Video about Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model at JoVE.com

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

تحديد الخلية المانحة engraftment تحديا في نماذج الماوس زرع نخاع العظم التي تفتقر علامات واضحة المعالم phenotypical. صفنا منهجية لتحديد الخلية المانحة engraftment ذكر أنثى الفئران المتلقية في الزرع. ويمكن استخدام هذه الطريقة في جميع سلالات الفئران لدراسة وظائف HSC.

باستخدام الكمي في الوقت الحقيقي PCR لتحديد الجهات المانحة Engraftment خلية في التنافسية نموذج الفئران زرع نخاع العظم

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

using-quantitative-real-time-pcr-to-determine-donor-cell-engraftment

Research

JoVE Journal

Medicine

15.3K Views.  Medical University of South Carolina. تحديد الخلية المانحة engraftment تحديا في نماذج الماوس زرع نخاع العظم التي تفتقر علامات واضحة المعالم phenotypical. صفنا منهجية لتحديد الخلية المانحة engraftment ذكر أنثى الفئران المتلقية في الزرع. ويمكن استخدام هذه الطريقة في جميع سلالات الفئران لدراسة وظائف HSC.

Video: Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus. For example, in utero transplantation (IUT) of hematopoietic stem cells has been used to successfully treat patients with severe combined immunodeficiency.1,2 In several other conditions, however, IUT has been attempted without success.3 Given these mixed results, the availability of an efficient non-human model to study the biological sequelae of stem cell transplantation and gene therapy is critical to advance this field. We and others have used the mouse model of IUT to study factors affecting successful engraftment of in utero transplanted hematopoietic stem cells in both wild-type mice4-7 and those with genetic diseases.8,9 The fetal environment also offers considerable advantages for the success of in utero gene therapy. For example, the delivery of adenoviral10, adeno-associated viral10, retroviral11, and lentiviral vectors12,13 into the fetus has resulted in the transduction of multiple organs distant from the site of injection with long-term gene expression. in utero gene therapy may therefore be considered as a possible treatment strategy for single gene disorders such as muscular dystrophy or cystic fibrosis. Another potential advantage of IUT is the ability to induce immune tolerance to a specific antigen. As seen in mice with hemophilia, the introduction of Factor IX early in development results in tolerance to this protein.14 
In addition to its use in investigating potential human therapies, the mouse model of IUT can be a powerful tool to study basic questions in developmental and stem cell biology. For example, one can deliver various small molecules to induce or inhibit specific gene expression at defined gestational stages and manipulate developmental pathways. The impact of these alterations can be assessed at various timepoints after the initial transplantation. Furthermore, one can transplant pluripotent or lineage specific progenitor cells into the fetal environment to study stem cell differentiation in a non-irradiated and unperturbed host environment.
The mouse model of IUT has already provided numerous insights within the fields of immunology, and developmental and stem cell biology. In this video-based protocol, we describe a step-by-step approach to performing IUT in mouse fetuses and outline the critical steps and potential pitfalls of this technique.

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The mouse model of in utero transplantation is a versatile tool that can be used to study the potential clinical applications of stem cell transplantation and gene therapy in the fetus. In this protocol, we present a general approach to performing this technique

نموذج الفأر من في الرحم زراعة

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus.  For example, in ...

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process including development1, apoptosis2, and cell cycle regulation3. MiRNAs are estimated to regulate the expression of 30% to 90% of human genes4 by binding to their target messenger RNAs (mRNAs)5. Widespread dysregulation of miRNAs has been reported in various diseases and cancer subtypes6. Due to their prevalence and unique structure, these small molecules are likely to be the next generation of biomarkers, therapeutic agents and/or targets.
Methods used to investigate miRNA expression include SYBR green I dye- based as well as Taqman-probe based qPCR. If miRNAs are to be effectively used in the clinical setting, it is imperative that their detection in fresh and/or archived clinical samples be accurate, reproducible, and specific. qPCR has been widely used for validating expression of miRNAs in whole genome analyses such as microarray studies7. The samples used in this protocol were from patients who underwent radical prostatectomy for clinically localized prostate cancer; however other tissues and cell lines can be substituted in. Prostate specimens were snap-frozen in liquid nitrogen after resection. Clinical variables and follow-up information for each patient were collected for subsequent analysis8.
Quantification of miRNA levels in prostate tumor samples. The main steps in qPCR analysis of tumors are: Total RNA extraction, cDNA synthesis, and detection of qPCR products using miRNA-specific primers. Total RNA, which includes mRNA, miRNA, and other small RNAs were extracted from specimens using TRIzol reagent. Qiagen's miScript System was used to synthesize cDNA and perform qPCR (Figure 1). Endogenous miRNAs are not polyadenylated, therefore during the reverse transcription process, a poly(A) polymerase polyadenylates the miRNA. The miRNA is used as a template to synthesize cDNA using oligo-dT and Reverse Transcriptase. A universal tag sequence on the 5' end of oligo-dT primers facilitates the amplification of cDNA in the PCR step. PCR product amplification is detected by the level of fluorescence emitted by SYBR Green, a dye which intercalates into double stranded DNA. Specific miRNA primers, along with a Universal Primer that binds to the universal tag sequence will amplify specific miRNA sequences. 
The miScript Primer Assays are available for over a thousand human-specific miRNAs, and hundreds of murine-specific miRNAs. Relative quantification method was used here to quantify the expression of miRNAs. To correct for variability amongst different samples, expression levels of a target miRNA is normalized to the expression levels of a reference gene. The choice of a gene on which to normalize the expression of targets is critical in relative quantification method of analysis. Examples of reference genes typically used in this capacity are the small RNAs RNU6B, RNU44, and RNU48 as they are considered to be stably expressed across most samples. In this protocol, RNU6B is used as the reference gene.

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR

Quantitative Real Time polymerase chain reaction (qPCR) is a rapid and sensitive method to investigate the expression levels of various microRNA (miRNA) molecules in tumor samples. Using this method expression of hundreds of different miRNA molecules can be amplified, quantified, and analyzed from the same cDNA template.

الكشف microRNA في أورام البروستات بواسطة PCR الوقت الحقيقي الكمية (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process ...

Pre-clinical Evaluation of Tyrosine Kinase Inhibitors for Treatment of Acute Leukemia

Receptor tyrosine kinases have been implicated in the development and progression of many cancers, including both leukemia and solid tumors, and are attractive druggable therapeutic targets. Here we describe an efficient four-step strategy for pre-clinical evaluation of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in the treatment of acute leukemia. Initially, western blot analysis is used to confirm target inhibition in cultured leukemia cells. Functional activity is then evaluated using clonogenic assays in methylcellulose or soft agar cultures. Experimental compounds that demonstrate activity in cell culture assays are evaluated in vivo using NOD-SCID-gamma (NSG) mice transplanted orthotopically with human leukemia cell lines. Initial in vivo pharmacodynamic studies evaluate target inhibition in leukemic blasts isolated from the bone marrow. This approach is used to determine the dose and schedule of administration required for effective target inhibition. Subsequent studies evaluate the efficacy of the TKIs in vivo using luciferase expressing leukemia cells, thereby allowing for non-invasive bioluminescent monitoring of leukemia burden and assessment of therapeutic response using an in vivo bioluminescence imaging system. This strategy has been effective for evaluation of TKIs in vitro and in vivo and can be applied for identification of molecularly-targeted agents with therapeutic potential or for direct comparison and prioritization of multiple compounds.

Receptor tyrosine kinases are ectopically expressed in many cancers and have been identified as therapeutic targets in acute leukemia. This manuscript describes an efficient strategy for pre-clinical evaluation of tyrosine kinase inhibitors for the treatment of acute leukemia.

تقييم ما قبل السريرية من التيروزين كيناز مثبطات لعلاج اللوكيميا الحادة

Receptor tyrosine kinases have been implicated in the development and progression of many cancers, including both leukemia and solid tumors, and are ...

Murine Cervical Heart Transplantation Model Using a Modified Cuff Technique

Mouse models are of special interest in research since a wide variety of monoclonal antibodies and commercially defined inbred and knockout strains are available to perform mechanistic in vivo studies. While heart transplantation models using a suture technique were first successfully developed in rats, the translation into an equally widespread used murine equivalent was never achieved due the technical complexity of the microsurgical procedure. In contrast, non-suture cuff techniques, also developed initially in rats, were successfully adapted for use in mice1-3. This technique for revascularization involves two major steps I) everting the recipient vessel over a polyethylene cuff; II) pulling the donor vessel over the formerly everted recipient vessel and holding it in place with a circumferential tie. This ensures a continuity of the endothelial layer, short operating time and very high patency rates4.
Using this technique for vascular anastomosis we performed more than 1,000 cervical heart transplants with an overall success rate of 95%. For arterial inflow the common carotid artery and the proximal aortic arch were anastomosed resulting in a retrograde perfusion of the transplanted heart. For venous drainage the pulmonary artery of the graft was anastomosed with the external jugular vein of the recipient5.
Herein, we provide additional details of this technique to supplement the video.

The murine cervical heart transplantation model is well suited for immunological as well as ischemia reperfusion injury studies. We modified the procedure using a non-suture cuff technique and performed more than 1,000 successful transplants with this approach.
Herein, we provide additional details of this technique to supplement the video.

الفئران عنق الرحم القلب زرع نموذج باستخدام أزرار وتقنيات التعديل

Mouse models are of special interest in research since a wide variety of monoclonal antibodies and commercially defined inbred and knockout strains are ...

A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods rely on the ability of cells either to attach to a solid substratum of a tissue culture dish or to grow in suspension in liquid medium. Multiple immortal cell lines have been created and grown using such approaches, however, these methods frequently fail when primary cells need to be grown ex vivo. Such failure has been attributed to the absence of the appropriate extracellular matrix components of the tissue microenvironment from the standard systems where tissue culture plastic is used as a surface for cell growth. Extracellular matrix is an integral component of the tissue microenvironment and its presence is crucial for the maintenance of physiological functions such as cell polarization, survival, and proliferation. Here we present a 3-dimensional tissue culture method where primary bone marrow cells are grown in extracellular matrix formulated to recapitulate the microenvironment of the human bone (rBM system). Embedded in the extracellular matrix, cells are supplied with nutrients through the medium supplemented with human plasma, thus providing a comprehensive system where cell survival and proliferation can be sustained for up to 30 days while maintaining the cellular composition of the primary tissue. Using the rBM system we have successfully grown primary bone marrow cells from normal donors and patients with amyloidosis, and various hematological malignancies. The rBM system allows for direct, in-matrix real time visualization of the cell behavior and evaluation of preclinical efficacy of novel therapeutics. Moreover, cells can be isolated from the rBM and subsequently used for in vivo transplantation, cell sorting, flow cytometry, and nucleic acid and protein analysis. Taken together, the rBM method provides a reliable system for the growth of primary bone marrow cells under physiological conditions.

In standard culture methods cells are taken out of their physiological environment and grown on the plastic surface of a dish. To study the behavior of primary human bone marrow cells we created a 3-D culture system where cells are grown under conditions recapitulating the native microenvironment of the tissue.

ثقافة الأنسجة نموذج ثلاثي الأبعاد لدراسة الابتدائية نخاع العظم الإنسان والأورام الخبيثة في

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods ...

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their translational repression. Changes in miRNA expression have been shown to be involved in the development of all major complex diseases. Furthermore, recent findings showed that miRNAs can be secreted to the extracellular environment and enter the bloodstream and other body fluids where they can circulate with high stability. The function of such circulating miRNAs remains largely elusive, but systematic high throughput approaches, such as miRNA profiling arrays, have lead to the identification of miRNA signatures in several pathological conditions, including neurodegenerative disorders and several types of cancers. In this context, the identification of miRNA expression profile in the cerebrospinal fluid, as reported in our recent study, makes miRNAs attractive candidates for biomarker analysis.
There are several tools available for profiling microRNAs, such as microarrays, quantitative real-time PCR (qPCR), and deep sequencing. Here, we describe a sensitive method to profile microRNAs in cerebrospinal fluids by quantitative real-time PCR. We used the Exiqon microRNA ready-to-use PCR human panels I and II V2.R, which allows detection of 742 unique human microRNAs. We performed the arrays in triplicate runs and we processed and analyzed data using the GenEx Professional 5 software.
Using this protocol, we have successfully profiled microRNAs in various types of cell lines and primary cells, CSF, plasma, and formalin-fixed paraffin-embedded tissues.

We describe a protocol of real time PCR to profile microRNAs in the cerebrospinal fluid (CSF). With the exception of RNA extraction protocols, the procedure can be extended to RNA extracted from other body fluids, cultured cells, or tissue specimens.

النخاعي السوائل عن طريق الرنا الميكروي التنميط الكمي في الوقت الحقيقي PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

Murine Corneal Transplantation: A Model to Study the Most Common Form of Solid Organ Transplantation

Corneal transplantation is the most common form of organ transplantation in the United States with between 45,000 and 55,000 procedures performed each year. While several animal models exist for this procedure and mice are the species that is most commonly used. The reasons for using mice are the relative cost of using this species, the existence of many genetically defined strains that allow for the study of immune responses, and the existence of an extensive array of reagents that can be used to further define responses in this species. This model has been used to define factors in the cornea that are responsible for the relative immune privilege status of this tissue that enables corneal allografts to survive acute rejection in the absence of immunosuppressive therapy. It has also been used to define those factors that are most important in rejection of such allografts. Consequently, much of what we know concerning mechanisms of both corneal allograft acceptance and rejection are due to studies using a murine model of corneal transplantation. In addition to describing a model for acute corneal allograft rejection, we also present for the first time a model of late-term corneal allograft rejection.

Mice have been used as a model for studying many forms of transplantation, including corneal transplantation. We describe in this report a murine model for both acute and late-term corneal transplantation.

الفئران زرع القرنية: نموذج لدراسة الشكل الأكثر شيوعا من الصلبة زراعة الأعضاء

Corneal transplantation is the most common form of organ transplantation in the United States with between 45,000 and 55,000 procedures performed each ...

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated death 1. Common sites of metastatic spread include lung, lymph node, brain, and bone 2. Mechanisms that drive metastasis are intense areas of cancer research. Consequently, effective assays to measure metastatic burden in distant sites of metastasis are instrumental for cancer research. Evaluation of lung metastases in mammary tumor models is generally performed by gross qualitative observation of lung tissue following dissection. Quantitative methods of evaluating metastasis are currently limited to ex vivo and in vivo imaging based techniques that require user defined parameters. Many of these techniques are at the whole organism level rather than the cellular level 3-6. Although newer imaging methods utilizing multi-photon microscopy are able to evaluate metastasis at the cellular level 7, these highly elegant procedures are more suited to evaluating mechanisms of dissemination rather than quantitative assessment of metastatic burden. Here, a simple in vitro method to quantitatively assess metastasis is presented. Using quantitative Real-time PCR (QRT-PCR), tumor cell specific mRNA can be detected within the mouse lung tissue.

This protocol describes how to use quantitative Real-time PCR (QRT-PCR) to detect tumor cell specific mRNA representing metastasis within the mouse lung tissue.

تقييم الرئة الانبثاث في ماوس الثديية ورم المجموعات بواسطة الكمي في الوقت الحقيقي PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

Murine Cervical Aortic Transplantation Model using a Modified Non-Suture Cuff Technique

With the introduction of powerful immunosuppressive protocols, distinct advances are possible in the prevention and therapy of acute rejection episodes. However, only minor improvement in the long-term results of transplanted solid organs could be observed over the past decades. In this context, chronic allograft vasculopathy (CAV) still represents the leading cause of late organ failure in cardiac, renal and pulmonary transplantation.
Thus far, the underlying pathogenesis of CAV development remains unclear, explaining why effective treatment strategies are presently missing and emphasizing a need for relevant experimental models in order to study the underlying pathophysiology leading to CAV formation. The following protocol describes a murine heterotopic cervical aortic transplantation model using a modified non-suture cuff technique. In this technique, a segment of the thoracic aorta is interpositioned in the right common carotid artery. With the use of the non-suture cuff technique, an easy to learn and reproducible model can be established, minimizing the possible heterogeneity of sutured vascular micro anastomoses.

Here, we present a protocol of heterotopic aortic transplantation in mice using the non-suture cuff technique in a cervical murine model. This model can be used to study the underlying pathology of chronic allograft vasculopathy (CAV) and can help evaluate new therapeutic agents in order to prevent its formation.

نموذج زرع الشريان الاورطي لعنق الرحم من murine باستخدام تقنيه الكفة المعدلة غير الخياطة

With the introduction of powerful immunosuppressive protocols, distinct advances are possible in the prevention and therapy of acute rejection episodes. ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cell Subsets within the Murine Spleen, Bone Marrow, Lymph Nodes and Synovial Tissue in an Osteoarthritis Model

Osteoarthritis (OA) is one of the most prevalent musculoskeletal diseases, affecting patients suffering from pain and physical limitations. Recent evidence indicates a potential inflammatory component of the disease, with both T-cells and monocytes/macrophages potentially associated with the pathogenesis of OA. Further studies postulated an important role for subsets of both inflammatory cell lineages, such as Th1, Th2, Th17, and T-regulatory lymphocytes, and M1, M2, and synovium-tissue-resident macrophages. However, the interaction between the local synovial and systemic inflammatory cellular response and the structural changes in the joint is unknown. To fully understand how T-cells and monocytes/macrophages contribute towards OA, it is important to be able to quantitively identify these cells and their subsets simultaneously in synovial tissue, secondary lymphatic organs and systemically (the spleen and bone marrow). Nowadays, the different inflammatory cell subsets can be identified by a combination of cell-surface markers making multi-color flow cytometry a powerful technique in investigating these cellular processes. In this protocol, we describe detailed steps regarding the harvest of synovial tissue and secondary lymphatic organs as well as generation of single cell suspensions. Furthermore, we present both an extracellular staining assay to identify monocytes/macrophages and their subsets as well as an extra- and intra-cellular staining assay to identify T-cells and their subsets within the murine spleen, bone marrow, lymph nodes and synovial tissue. Each step of this protocol was optimized and tested, resulting in a highly reproducible assay that can be utilized for other surgical and non-surgical OA mouse models.

Here, we describe a detailed and reproducible flow cytometry protocol to identify monocyte/macrophage and T-cell subsets using both extra- and intracellular staining assays within the murine spleen, bone marrow, lymph nodes and synovial tissue, utilizing an established surgical model of murine osteoarthritis.

تحليل تدفق الخلايا الخلوية من المجموعات الفرعية الخلية المناعية داخل الطحال مورين, نخاع العظام, الغدد الليمفاوية والأنسجة الزليلي في نموذج هشاشة العظام