نشكر بريان Venema واريك مارتنسون لبناء جهاز electroformation. وقد تم تمويل هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للعلوم الطبية العامة من المعاهد الوطنية للصحة (R01GM100718 إلى SEG) والمعهد الوطني للعيون التابع لمعاهد الصحة القومية (R01EY017564 إلى SEG).

1. ترسب الدهون من المذيبات العضوية: بروتوكول الكلاسيكية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الدهون من التخزين عند درجة حرارة -20 ° C أو -80 ° C؛ الحارة لRT تنبيه: الدهون هي استرطابي للغاية، والعديد من حساسة للأكسجين. تغطية نسبة الدهون في الأراضي الجافة الأرجون أو غاز النيتروجين وفي جميع الخطوات تقليل التعرض للهواء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا لزم الأمر، تعلق الدهون في الكلوروفورم أو الهكسان الحلقي في ملغ / مل 1-10، علما أن تركيزات الصانع المعلنة هي عادة الاسمية فقط تحذير: ارتداء القفازات المناسبة ومعدات الحماية الشخصية الأخرى عند استخدام المذيبات العضوية. إزالة معدات الوقاية الشخصية بسرعة في حال تسرب مذيب عليها، لأن معظم المواد لا تزال قابلة للاختراق لهذه المذيبات وأنها توفر حماية مؤقتة فقط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنظيف كلا الجانبين من اثنين 25 × 37.5 ملم ITO الشرائح الزجاجية المغلفة مع الإيثانول </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج من الدهون لتحقيق نسب المولي المطلوب. لكل سم 2 من مساحة 1 من ITO ينزلق إلى أن تطلى مع شفةمعرف، مزيج ~ ميكروغرام 15-20 من الدهون. على سبيل المثال، إذا كانت كل 25 × 37.5 ملم الشرائح لتكون مغلفة بشكل كامل، فإننا عادة استخدام 30 ميكرولتر من 10 ملغ / مل خليط الدهن ملاحظة: إضافة 0.1 مول٪ تكساس الأحمر DPPE للتصوير الفلورسنت، وانظر أدناه للحصول تحذر من الأصباغ الفلورية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق من أن الجانب ITO المغلفة من الشرائح الزجاجية يواجه ما يصل عن طريق قياس مقاومة سطح مع جهاز قياس المقاومة أو المتعدد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح في نسبة الدهون في مقاومة المذيبات حقنة تنبيه: لا الغراء أو البلاستيك، وغيرها من السليكوون، يجب الاتصال المذيب العضوي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع إبرة حقنة عدم لمس السطح تماما إيتو، تطبق ببطء الدهون تحريك إبرة ذهابا وإيابا عبر الشريحة. تغطية السطح على نحو متساو، وتبحث عن &quot;قوس قزح لمعان&quot; على سطح الزجاج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الشرائح بسرعة تحت &lt;1 عربة (1 ملم زئبقي) فراغ ل0.5-1 ساعة لإزالة أي أثر المذيبات. فراغ الإفراج مع غاز خامل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق طوقا سيليكون، معطبقة رقيقة من السيليكون الشحوم فراغ في كلا الجانبين. ترك 5 مم على الأقل من الشريحة المكشوف تتعرض في نهاية واحدة من الشريحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الشروع فورا في القسم 4. </li></ol> 2. إعداد الحويصلية صغيرة للجفاف الشواهد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير خليط الدهن كما في خطوات 1،1-1،4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجفيف الدهون باستخدام تيار من غاز النيتروجين أو الأرجون في 10-15 ملم قطر الأنبوب الثقافة. للحصول على كميات صغيرة من الدهون، ≤ 0.5 ملغ، يمكن للفيلم أن يكون الناتج رطب مباشرة بعد وضعه تحت فراغ ل0.5-1 ساعة لإزالة المذيبات المتبقية؛ انتقل إلى الخطوة 2.5. كميات أكبر من الدهون تميل إلى اعتراض المذيبات العضوية في مادة هلامية سميكة، حتى في ظل فراغ، وتجفيد مستعدون بشكل أفضل، وانظر الخطوات 2،3-4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعليق الفيلم الدهون المجففة في الهكسان الحلقي، وغطاء مع الأرجون وختم مع سدادة، ووضع أنبوب في كتلة الباردة والتجميد في -80 درجة مئوية لمدة 1 ساعة الحد الأدنى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع كتلة الباردة وعينة من المادة الدهنية في نظام فراغقادرة على الوصول إلى 100 mTorr. تطبيق فراغ، بل سوف &quot;المماطلة&quot; في حوالي 1 عربة كما يبخر المذيب قبالة. وبمجرد إزالة المذيب تماما (~ 1 ساعة) فراغ تنخفض الى اقل من هذا المستوى. فراغ الإفراج مع غاز خامل وختم الأنبوب أو هيدرات فورا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حين أن الدهون هي تحت فراغ، عازلة الماء ديغا باستخدام فراغ وsparging 15-17. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هيدرات الدهون باستخدام العازلة degassed في تركيز النهائي 1-10 ملغ / مل. تسمح الدهون لترطيب ببطء. بعد 30 دقيقة، 1 ساعة، دوامة لتفتيت كتل المتبقية. الانتظار لمدة 0.5-1 ساعة إضافية للسماح لترطيب كاملة. استخدام osmoticant، مثل السوربيتول أو السكروز تصل إلى 200 ملم، لمنع الجفاف الكامل في الخطوات التالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 100-200 نانومتر الجسيمات الشحمية قطرها بواسطة البثق. انظر البروتوكول قذف الشركة المصنعة للحصول على التفاصيل. لاحظ أنه يجب أن يكون المخزن المؤقت وستكون هناك حاجة أقل من ~ 25 ملم القوة الأيونية، أو بروتوكولات الجهد electroformation خاصة في القسم 4. </li></ol> 3.ترسب الدهون بسبب الجفاف الشواهد من الليبوزومات الصغيرة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحذير: يتطلب بروتوكول لدينا الدهون إلى وضعها في حالة توازن مع حلول بخار مشبع من الملح لعدة ساعات. ونحن نوصي بشدة أداء البروتوكول في جو غاز خامل، وذلك باستخدام علبة القفازات أو الضميمة مماثلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحذير: إذا إعداد العينات التي تحتوي على البروتينات، وتجنب الجفاف الكامل. هيدرات الغلاف الجوي في أي الضميمة مع كوب من الماء الدافئ، أو المرطب على sonicator. استخدام مقياس درجة الرطوبة لضمان وجود الرطوبة النسبية 30٪ على الأقل. استخدام السوربيتول أو السكروز في المخزن المؤقت الحويصلية الصغيرة كإجراء وقائي إضافي لمنع إجمالي الجفاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد محلول الملح المشبع من الرطوبة النسبية الملائمة. الرطوبة الهدف يعتمد على الأسمولية من إعداد حويصلة. للتحضير مع الأسمولية الفسيولوجية، واستخدام 30-45٪ RH، بينما منخفض الاستعدادات حويصلة الأسمولية يمكن أن يكون المجففة بشكل كاف فيالتوازن مع 75-90٪ RH (انظر أيضا الجدول 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع محلول الملح المشبع والملح الزائد في وعاء قابل للغلق بإحكام مع الرف الداخلية. حاويات المواد الغذائية تجارية للالزبادي والجرانولا تعمل بشكل جيد جدا. استبدال الرف بعد التعبئة، وجعل السائل بالتأكيد هو 5-10 ملم تحت الرف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نظيفة ITO الشرائح المغلفة كما هو الحال في القسم 1. استخدام المتعدد لتحديد الجانب الذي هو موصل، وتسمية الجانب غير موصل مع اسم العينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بخفة الشحوم كلا الجانبين من السيليكون (USP الصف السادس) طوقا (s) مع واحد أو ثقوب متعددة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الشرائح الجانبية الموصلة حتى على مقاعد البدلاء، وتطبيق سيليكون طوقا (ق) إلى كل الشريحة التي سيتم تطبيقها الدهون، والتأكد من وجود ما لا يقل عن 5 ملم من الشريحة تتعرض في نهاية واحدة للاتصال الجهاز electroformation. تمهيد طوقا لضمان ختم جيدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع إعداد حويصلة في منطقة عازلة متسق الضغط التناضحي قليل الملح إلى ~ 1-2 ملغ / مل. نجد أن أعلى concentrations تنتج النتائج السيئة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق المادة الدهنية إلى الشريحة في قطرات ميكرولتر 1-10. قطرات أصغر تنتج عادة نتائج أفضل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الشريحة على الرف الداخلية فوق محلول الملح المشبع وختم الحاوية بإحكام. ترك في RT لمدة 3 ساعة إلى O / N. الحاوية يمكن وضعها في 4 درجات مئوية، ولكن سوف نلاحظ أنه بالنسبة لبعض الأملاح، وRH يعتمد بشدة على درجة الحرارة، وهذا البرد زيادة موازنة الوقت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قد يكون الفيلم الناتج لمعان قوس قزح طفيفة عليها، ولكن على أي حال يجب أن تظهر المجفف تقريبا. قد تكون الحلول بدءا الاسموزي للغاية من المستحيل حتى يجف تماما لفيلم الدهن، وهذا لن يؤثر سلبا على النتائج. </li></ol> 4. Electroformation من الليبوزومات العملاق <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم فكها الأفلام الدهون، وخاصة تلك التي يتم تشكيلها من الجسيمات الشحمية المجففة، وبسهولة. هيدرات بعناية كل بئر من خلال وضع 27 G إبرة حقنة على حافة طوقا وتطبيق ببطء العازلة. يمكن مخازنوتشمل المياه، ≤ 200 ملي السكروز، ≤ 1 M السوربيتول و≤ 5 HEPES ملي. أكثر من 10 ملي محلول الملح قد تتطلب بروتوكولات الجهد electroformation بديل. فعم كل طوقا بشكل جيد من قبل ~ 10٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملاحظة: بمجرد أن الدهون هي رطب، والمضي قدما بسرعة من خلال الخطوات المتبقية، منذ الأفلام الدهون تبدأ في delaminate فورا. إلى أقصى حد العائد وحجم إذا يبدأ electroformation فورا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اقتراح واحد على نحو سلس، وتطبيق الشريحة ايتو والوجه الثاني في موصل، إلى الأعلى من وحشية. تأكد من أن يكون لا يقل عن 5 ملم من عبء خارج منطقة طوقا والعكس عبء الأول. اضغط بلطف لضمان ختم جيدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنظيف يتدلى اثنين باستخدام الإيثانول والتحقق من أن الجانبين التي تواجه طوقا هي موصل مع المتعدد الخاص بك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الدائرة يمكن تأمين مزيد مع parafilm أو ضوء كليب ربيع التوتر اذا شئت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ربط غرفة electroformation إلى مصدر التيار الكهربائي من خلال تأمين الألومنيوم أو النحاس القضبان، &quot;EMI gaskوآخرون رغوة &quot;، أو شريط لاصق موصل إلى السطوح موصل من الشرائح اثنين. نحن نستخدم EMI طوقا رغوة. خطط لرقصة والمشبك وتظهر في الشكل 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق من وجود أي تماس كهربائي بين الأسماء، وأن اتصالات الاتصال بشكل صحيح إلى السطوح ايتو، وذلك باستخدام المتعدد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسخين غرفة 10 ° C فوق أعلى درجة حرارة انصهار أي من نسبة الدهون في الحاضر؛ على سبيل المثال لDPPC، والحرارة إلى 52 درجة مئوية كحد أدنى، و 10 درجة مئوية فوق درجة حرارة انصهار سلسلة من 42 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لمخازن قليل الملح، وتطبيق 10 هرتز موجة جيبية، ~ 0.7 V RMS لكل ملليمتر الفجوة بين اثنين من الأسطح المطلية إيتو، ل60-90 دقيقة. لمخازن عالية من الملح، وبروتوكولات الجهد أخرى ينبغي أن تستخدم (انظر المراجع). </li></ol> 5. التصوير واستكشاف الأخطاء وإصلاحها <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صورة الحويصلية باستخدام مجهر مقلوب مجهزة مكعب مرشح لرودامين أو الأصباغ الحمراء تكساس. يجب أن يكون الحويصلية كروية،في الغالب unilamellar بالعين، وخالية من العيوب مثل &quot;سلاسل&quot; شنقا قبالة الحويصلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كانت الجسيمات الشحمية هي صغيرة جدا، استخدام كميات أقل من الدهون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان هناك العديد من العيوب أو بعض الجسيمات الشحمية، وهذا قد يكون راجعا إلى نسبة الدهون في مراحل هلام. النظر في رفع درجة الحرارة electroformation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا قليلة أو معدومة الجسيمات الشحمية العملاقة التي تشكلت في كل من الجسيمات الشحمية الصغيرة المجففة، والحد من قوة ناضح من المخزن المؤقت الحويصلية، أو زيادة قوة ناضح من المخزن المؤقت electroformation. وتدفق من العازلة في مركزة حل العازلة الخلالي يمكن أن يسبب التبطين من الفيلم الدهون المودعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا العائد حويصلة، والجودة، أو حجم والفقراء، وأنت شملت أملاح أو مخازن درجة الحموضة في electroformation أو الحويصلية المخازن المؤقتة، والنظر في بروتوكولات الجهد electroformation البديلة. على سبيل المثال، بوت، وآخرون. 11، يوصي البروتوكول الخطوة الثالثة باستخدام 500 هرتز شركة Sinewave، ورفع الجهد من 50-1،300 بي بي / م أكثر من 30 دقيقة، وعقد لمدة 90 دقيقة، فين خفض تردد إلى 50 هرتز أكثر من 30-60 دقيقة. قد تكون هناك حاجة البلاتين أو التيتانيوم الأقطاب في هذه الحالة، ولكن هذا لن يغير كثيرا في البروتوكول. </li></ol>

<ol>
	<li>Dimova, R., Aranda, S., Bezlyepkina, N., Nikolov, V., Riske, K. A., Lipowsky, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+giant+vesicles.+Probing+the+membrane+nanoregime+via+optical+microscopy.">A practical guide to giant vesicles. Probing the membrane nanoregime via optical microscopy.</a> Journal of Physics-Condensed Matter. 18 (28), S1151-S1176 (2006).</li><li>Luisi, P. L., Walde, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Giant Vesicles. , (2000).</li><li>Riquelme, G., Lopez, E., Garcia-Segura, L. M., Ferragut, J. A., Gonzalez-Ros, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+liposomes:+a+model+system+in+which+to+obtain+patch-clamp+recordings+of+ionic+channels.">Giant liposomes: a model system in which to obtain patch-clamp recordings of ionic channels.</a> Biochemistry. 29 (51), 11215-11222 (1990).</li><li>Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+vesicles:+preparations+and+applications.">Giant vesicles: preparations and applications.</a> Chembiochem. 11 (7), 848-865 (2010).</li><li>Aimon, S., Manzi, J., Schmidt, D., Poveda Larrosa, J. A., Bassereau, P., Toombes, G. E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+reconstitution+of+a+voltage-gated+potassium+channel+in+giant+unilamellar+vesicles.">Functional reconstitution of a voltage-gated potassium channel in giant unilamellar vesicles.</a> PLoS. One. 6 (10), e25529 (2011).</li><li>Girard, P., Pecreaux, J., Lenoir, G., Falson, P., Rigaud, J. L., Bassereau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+the+reconstitution+of+membrane+proteins+into+giant+unilamellar+vesicles.">A new method for the reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles.</a> Biophys. J. 87 (1), 419-429 (2004).</li><li>Manley, S., Gordon, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+giant+unilamellar+vesicles+via+hydration+of+a+lipid+film.">Making giant unilamellar vesicles via hydration of a lipid film.</a> Curr. Protoc. Cell. Biol. 24, 1-13 (2008).</li><li>Rodriguez, N., Pincet, F., Cribier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+vesicles+formed+by+gentle+hydration+and+electroformation:+a+comparison+by+fluorescence+microscopy.">Giant vesicles formed by gentle hydration and electroformation: a comparison by fluorescence microscopy.</a> Colloids. Surf. B. Biointerfaces. 42 (2), 125-130 (2005).</li><li>Angelova, M. I., Soleau, S., Meleard, P., Faucon, J. F., Bothorel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+giant+vesicles+by+external+AC+electric+fields.+Kinetics+and+applications.">Preparation of giant vesicles by external AC electric fields. Kinetics and applications.</a> Progressin Colloid &amp; Polymer Science. 89, 127-131 (1992).</li><li>Politano, T. J., Froude, V. E., Jing, B., Zhu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AC-electric+field+dependent+electroformation+of+giant+lipid+vesicles.">AC-electric field dependent electroformation of giant lipid vesicles.</a> Colloids. Surf. B. Biointerfaces. 79 (1), 75-82 (2010).</li><li>Pott, T., Bouvrais, H., M&#233;l&#233;ard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+unilamellar+vesicle+formation+under+physiologically+relevant+conditions.">Giant unilamellar vesicle formation under physiologically relevant conditions.</a> Chem. Phys. Lip. 154 (2), 115-119 (2008).</li><li>Sens, P., Isambert, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Undulation+Instability+of+Lipid+Membranes+under+an+Electric+Field.">Undulation Instability of Lipid Membranes under an Electric Field.</a> Phys. Rev. Lett. 88 (12), (2002).</li><li>Green, N. G., Ramos, A., Gonz&#225;lez, A., Morgan, H., Castellanos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+flow+induced+by+nonuniform+ac+electric+fields+in+electrolytes+on+microelectrodes.+I.+Experimental+measurements.">Fluid flow induced by nonuniform ac electric fields in electrolytes on microelectrodes. I. Experimental measurements.</a> Phys. Rev. E. 61 (4), 4011-4018 (2000).</li><li>Baykal-Caglar, E., Hassan-Zadeh, E., Saremi, B., Huang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+giant+unilamellar+vesicles+from+damp+lipid+film+for+better+lipid+compositional+uniformity.">Preparation of giant unilamellar vesicles from damp lipid film for better lipid compositional uniformity.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1818 (11), 2598-2604 (2012).</li><li>Bakalyar, S. R., Bradley, M. P. T., Honganen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+dissolved+gases+in+high+-performance+liquid+chromatography.">The role of dissolved gases in high -performance liquid chromatography.</a> J. Chromatogr. A. 158, 277-293 (1978).</li><li>Brown, J. N., Hewins, M., Van Der Linden, J. H. M., Lynch, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solvent+degassing+and+other+factors+affecting+liquid+chromatographic+detector+stability.">Solvent degassing and other factors affecting liquid chromatographic detector stability.</a> J. Chromatogr. A. 204, 115-122 (1981).</li><li>Dolan, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobile+Phase+Degassing-Why,+When,+and+How.">Mobile Phase Degassing-Why, When, and How.</a> LC-GC. 17 (10), 909-912 (1999).</li><li>Cheng, H., Jiang, X., Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+lipid+homeostasis+of+mouse+dorsal+root+ganglia+induced+by+apolipoprotein+E+deficiency:+a+shotgun+lipidomics+study.">Alterations in lipid homeostasis of mouse dorsal root ganglia induced by apolipoprotein E deficiency: a shotgun lipidomics study.</a> J. Neurochem. 101 (1), 57-76 (2007).</li><li>Greenspan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humidity+fixed+points+of+binary+saturated+aqueous+solutions.">Humidity fixed points of binary saturated aqueous solutions.</a> J. Res. Natl. Bur. Stand. 81 (1), 89-96 (1977).</li><li>Rockland, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saturated+Salt+Solutions+for+Static+Control+of+Relative+Humidity+between+5+&#176;+and+40+&#176;C.">Saturated Salt Solutions for Static Control of Relative Humidity between 5 &#176; and 40 &#176;C.</a> Anal. Chem. 32 (10), 1375-1376 (1960).</li><li>Washburn, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> International Critical Tables of Numerical Data, Physics, Chemistry and Technology (1st Electronic Edition). , 216-249 (2003).</li><li>Estes, D. J., Mayer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+liposomes+in+physiological+buffer+using+electroformation+in+a+flow+chamber.">Giant liposomes in physiological buffer using electroformation in a flow chamber.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1712 (2), 152-160 (2005).</li><li>Ayuyan, A. G., Cohen, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+Peroxides+Promote+Large+Rafts:+Effects+of+Excitation+of+Probes+in+Fluorescence+Microscopy+and+Electrochemical+Reactions+during+Vesicle+Formation.">Lipid Peroxides Promote Large Rafts: Effects of Excitation of Probes in Fluorescence Microscopy and Electrochemical Reactions during Vesicle Formation.</a> Biophys. J. 91 (6), 2172-2183 (2006).</li><li>Morales-Penningston, N. F., Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GUV+preparation+and+imaging:+minimizing+artifacts.">GUV preparation and imaging: minimizing artifacts.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1798 (7), 1324-1332 (2010).</li><li>Grit, M., de Smidt, J. H., Struijke, A., Crommelin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrolysis+of+phosphatidylcholine+in+aqueous+liposome+dispersions.">Hydrolysis of phosphatidylcholine in aqueous liposome dispersions.</a> Int. J. Pharm. 50 (1), 1-6 (1989).</li><li>Zhou, Y., Berry, C. K., Storer, P. A., Raphael, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxidation+of+polyunsaturated+phosphatidyl-choline+lipids+during+electroformation.">Peroxidation of polyunsaturated phosphatidyl-choline lipids during electroformation.</a> Biomaterials. 28 (6), 1298-1306 (2007).</li><li>Farkas, E. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+polarization+imaging+of+steady-state+molecular+order+in+ternary+lipid+vesicles+for+the+purpose+of+lipid+phase+assignment.">Multiphoton polarization imaging of steady-state molecular order in ternary lipid vesicles for the purpose of lipid phase assignment.</a> J. Phys. Chem. B. 114 (47), 15512-15522 (2010).</li><li>Hauser, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+ultrasonic+irradiation+on+the+chemical+structure+of+egg+lecithin.">The effect of ultrasonic irradiation on the chemical structure of egg lecithin.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 45 (4), 1049-1055 (1971).</li><li>Hauser, H., Cevc, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipid+vesicles.">Phospholipid vesicles.</a> Phospholipids Handbook. , (1993).</li><li>Veatch, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electro-formation+and+fluorescence+microscopy+of+giant+vesicles+with+coexisting+liquid+phases.">Electro-formation and fluorescence microscopy of giant vesicles with coexisting liquid phases.</a> Meth. Mol. Biol. 398, 59-72 (2007).</li><li>Kim, R. S., LaBella, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+analytical+methods+for+monitoring+autoxidation+profiles+of+authentic+lipids.">Comparison of analytical methods for monitoring autoxidation profiles of authentic lipids.</a> J. Lipid. Res. 28 (9), 1110-1117 (1987).</li><li>Veatch, S. L., Leung, S. S. W., Hancock, R. E. W., Thewalt, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+probes+alter+miscibility+phase+boundaries+in+ternary+vesicles.">Fluorescent probes alter miscibility phase boundaries in ternary vesicles.</a> J. Phys. Chem. B. 111 (3), 502-504 (2007).</li><li>Juhasz, J., Davis, J. H., Sharom, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+probe+partitioning+in+GUVs+of+binary+phospholipid+mixtures:+implications+for+interpreting+phase+behavior.">Fluorescent probe partitioning in GUVs of binary phospholipid mixtures: implications for interpreting phase behavior.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1818 (1), 19-26 (2012).</li><li>Herold, C., Chwastek, G., Schwille, P., Petrov, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+electroformation+of+supergiant+unilamellar+vesicles+containing+cationic+lipids+on+ITO-coated+electrodes.">Efficient electroformation of supergiant unilamellar vesicles containing cationic lipids on ITO-coated electrodes.</a> Langmuir. 28 (13), 5518-5521 (2012).</li></ol>

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

وقد وضعت Electroformation من الجسيمات الشحمية العملاقة إلى تقنية مرنة متوافقة مع الدهون المختلفة، والأعمال التحضيرية، ومخازن. التحكم الدقيق في عملية ترسب الدهون هو الأكثر أهمية لتحقيق النجاح. لقد قدمنا ​​أدوات بسيطة لجعل ترسب الدهون رقابة من الاستعدادات الحويصلية صغيرة ?...

الجسيمات الشحمية العملاقة (غالبا ما تسمى الحويصلات unilamellar العملاقة، أو GUVs) وقد استخدمت أساسا لدراسة الفيزياء والكيمياء الفيزيائية من طبقات ثنائية الدهون، بما في ذلك دراسات من تشوه طبقة ثنائية، الوحشي مرحلة التعايش (&quot;الطوافات&quot;)، والانصهار الغشاء، الخ 1-4. لديهم بشكل صارخ مثل خلية هيكل: قذيفة كروية من الغشاء الذي يحيط الداخلية مائي والتي يمكن بسهولة أن يتم مختلفة من المخزن المؤقت المائية المحيطة بها. ، بحكم تعريفها، ≈ 1-100 ميكرون في القطر، بحيث يمكن تصويرها أنهم باستخدام مجموعة متنوعة من النهج المجهر الضوئي. يمكن أن تكون مصنوعة مشدود باستخدام التدرجات التناضحي أو التوتر تطبيقها ميكانيكيا، بحيث حين ميسرة عموما، يمكن التلاعب ممتلكاتهم لسهولة التعامل. على وجه الخصوص، والسيطرة على &quot;صلابة&quot; من الحويصلية يجعلها واضحة لتشكيل بقع &quot;الحويصلية المرفقة&quot; أو رفعه للالكهربية. في الماضي، تم إجراء إعادة ايون القناة إلى حد كبير في مستو الدهون بilayers. الآن، والقدرة على تشكيل بقع من الجسيمات الشحمية العملاقة واستخدام جعبة كبيرة من الأدوات التي وضعت لالكهربية التقليدية (المجهري مضان، micropipette الطموح، نضح السريع والتحكم في درجة الحرارة، الخ) يجعل الجسيمات الشحمية العملاقة جذابة على نحو متزايد للدراسات إعادة 5،6. وقد بذلت الجسيمات الشحمية العملاقة من قبل العديد من الاستراتيجيات. في الواقع، الجسيمات الشحمية العملاقة تشكل عفويا من خلال عملية التورم عند ممهى فيلم الدهون المجففة 4،7،8. الرغبة في إعداد أكثر بسرعة أكبر، أدى الجسيمات الشحمية أكثر اتساقا الباحثين إلى أساليب أخرى، أهمها electroformation 1،9. يعتمد Electroformation أيضا على ترطيب فيلم الدهون المجففة، ولكن تسرع هذه العملية من خلال تطبيق مجال كهربائي تتأرجح عبر فيلم الدهون. يتم تطبيق هذا المجال من خلال قطبين، إما أسلاك البلاتين أو الإنديوم-أكسيد القصدير (ITO) شرائح الزجاج المطلي، وفصلها عن طريق المياه أوالعازلة والتي تترسب على نسبة الدهون. من خلال تسريع تورم الجسيمات الشحمية، واحد يحقق عائدات أعلى من الجسيمات الشحمية أكبر. وهكذا، أصبح electroformation الأسلوب الافتراضي لإنتاج الجسيمات الشحمية العملاقة 4. آلية electroformation ليست مفهومة تماما، ويتم تطوير معظم بروتوكولات تجريبيا (على سبيل المثال 10،11). ومع ذلك، يمكننا أن نتعلم قليلا عن ما يمكن توقعه من خلال النظر في نظرية وبعض النتائج التجريبية. ويعتقد على نطاق واسع أن electroformation يحدث من قبل القيادة تدفق الكهربائية ناضح من عازلة بين طبقات ثنائية الدهون الفردية مكدسة في الفيلم الدهون المودعة 10،11. اقتران كهرباء لتقلبات الحرارية للطبقات ثنائية الدهون وربما أيضا المشاركة 12. هذه الفرضيات التنبؤ نوعيا الحدود العليا لتردد المجال الكهربائي والقوة التي يمكن استخدامها 10،12. على وجه الخصوص، فإنه من المتوقع أن الحلول عالية التوصيل ( <eم&gt; أي حلول الملح الفسيولوجية) خفض القوات electrohydrodynamic التي قد تشرع في electroformation الحويصلية 12. انخفاض معدلات تدفق Electroosmotic عموما مع زيادة تركيز الملح وكثيرا ما بلغ ذروته في بعض الكهربائية تيرة التذبذب حقل (على سبيل المثال وإن كان ذلك في الهندسة المختلفة، الأخضر وآخرون 13). وبالتالي، شدة المجال العالي وترددات أعلى معقولة عن حلول الموصلية عالية، في حدود 10. ومع ذلك، من المحتمل أن تكون غير متوافقة مع الأسلوب المعتاد لإيداع الدهون على أقطاب لهذا الإجراء electroswelling، وبالتحديد في المذيبات العضوية والتي يتم بعد ذلك تبخرت قبالة لترك فيلم الدهون رقيقة بروتينات الغشاء. هناك مسارين الرئيسي للتغلب على هذه الصعوبة: لإدراج البروتينات بعد تشكيل الحويصلية العملاقة، أو للتكيف مع الطريقة التي أودعت الدهون. نهجنا يبني على الآخرين 5،11 لإيداع الدهون وreconstituted بروتين غشاء معا من تعليق &quot;proteoliposomes&quot; صغيرة أو كبيرة. نحن تصف عملية طويلة وأكثر تحديا من إنتاج proteoliposomes من تنقية البروتين والدهون في مكان آخر (كولينز وغوردون، في الاستعراض). نحن هنا وصف بروتوكول في غياب أي بروتين، ولكنه هو نفسه عندما تم دمج بروتين، ونحن وتشمل النتائج تبين أن proteoliposomes تحتوي على قناة TRPV1 أيون يمكن أن تتحول إلى GUVs وتستخدم لالتصحيح، المشبك الكهربية. في أي نهج electroformation، الفحص البصري من العينة الدهون أثناء عملية ترسب الدهون أمر بالغ الأهمية لتحقيق النجاح. نهجنا قد تكون ذات صلة وراء تطبيق المتخصصة لايون القناة إعادة. في الوقت منذ وضعنا أول هذا البروتوكول والآن، كما تم إثبات أنه الطريقة التي تترسب الدهون على أقطاب لelectroformation يؤثر على التجانس التركيبي للGUVs الناتجة عن ذلك. Baykآل كاغلار وآخرون. أظهرت أن 14 GUVs شكلت من الجسيمات الشحمية بعناية المجففة كان 2.5 مرات أصغر التباين في امتزاج درجة حرارة التحول من GUVs تشكلت من خليط من مختلف الدهون الفوسفاتية والكوليسترول. عملهم يشير إلى أن الدهون، وخصوصا الكوليسترول، قد يعجل من خليط الدهن عندما تودع من المذيبات العضوية، مما أدى إلى التباين المكاني كبير في تكوين الفيلم الدهون المودعة. وهذا أمر مهم خاصة بالنسبة للدراسات من الدهون غشاء السلوك المرحلة، ولكن قد يكون أيضا عاملا حاسما للتجارب الكمية على وظيفة القناة الايونية. بايكال-كاغلار وآخرون. &#39;ق بروتوكول مماثل ولكن ليست متطابقة إلى منطقتنا، ونحن نشجع القراء لدراستها كذلك. هذا البروتوكول (انظر نظرة عامة، والشكل 1) هو واحد من العديد من التي يمكن استخدامها. في نجاح electroformation مبدأ يعتمد على خليط الدهون، الماء، درجة الحرارة، والمواد المذابة الأخرى (وخاصة أيونات)، وللبالطبع الجهد والتردد المستخدمة في التشكيل. كما يصبح electroformation فهم أفضل، ونحن نتوقع أن صقل بروتوكول لدينا أكثر من ذلك. وأخيرا، غالبا ما يكون هناك منحنى التعلم حاد في electroforming الجسيمات الشحمية العملاقة. نقترح اتقان بروتوكول التقليدية (الأقسام 1 و 4، وإذا لزم الأمر، القسم 5) قبل أن تعلم أن تودع الدهون من الايقاف الليبوسومال (الأقسام 2-5).

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Multimeter</td>
			<td>Agilent Technologies, <a href="http://www.agilent.com" target="_blank">www.agilent.com</a></td>
			<td>U1232A or similar</td>
			<td>Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Fluke</td>
			<td>117 or 177</td>
			<td>Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Function Generator</td>
			<td>Agilent Technologies, <a href="http://www.agilent.com" target="_blank">www.agilent.com</a></td>
			<td>33210A or similar</td>
			<td>Most function generators work for simple protocols. This programmable model is useful for advanced electroformation protocols. Make sure the generator can drive 10 V peak-to-peak into a 50 &Omega; load</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITO coated glass slides</td>
			<td>Delta Technologies, Loveland, CO <a href="http://www.delta-technologies.com" target="_blank">www.delta-technologies.com</a></td>
			<td>CB-90IN-S107 or similar</td>
			<td>Break these in half to make two slides, 25 mm x 37 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>Omega Engineering Stamford, CT <a href="http://www.omega.com" target="_blank">www.omega.com</a></td>
			<td>CNi3233 or similar</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygrometer</td>
			<td>Extech, Nashua, NH, <a href="http://www.extech.com" target="_blank">www.extech.com</a></td>
			<td>445815</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone rubber sheet</td>
			<td>McMaster-Carr Elmhurst, IL <a href="http://www.mcmaster.com" target="_blank">www.mcmaster.com</a></td>
			<td><a href="http://www.mcmaster.com/#87315K64" target="_blank">87315K64</a></td>
			<td>Use USP Grade VI silicone for its high purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMI gasket</td>
			<td>Laird Technologies <a href="http://www.lairdtech.com" target="_blank">www.lairdtech.com</a></td>
			<td>4202-PA-51H-01800 or similar</td>
			<td>Distributed by Mouser <a href="http://www.mouser.com" target="_blank">www.mouser.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TxR-DHPE</td>
			<td>Life Technologies, Carlsbad, CA <a href="http://www.lifetechnologies.com" target="_blank">www.lifetechnologies.com</a></td>
			<td>T1395MP</td>
			<td>Other fluorescently labeled lipids are available, but TxR-DHPE is one of the brightest and most photostable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPC</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL <a href="http://www.avantilipids.com" target="_blank">www.avantilipids.com</a></td>
			<td>850457P or 850457C</td>
			<td>Lipids can be ordered as powders (P) or in chloroform (C)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPS</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840034P/C</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8667</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

giant liposome preparation for imaging and patch-clamp electrophysiology

وقد تم إعادة تشكيل القنوات الأيونية في الأغشية الدهنية محددة الصفات كيميائيا لتسجيل الكهربية تقنية قوية لتحديد واستكشاف وظيفة هذه البروتينات الهامة. بيد أن الاستعدادات الكلاسيكية، مثل طبقات ثنائية مستو، والحد من التلاعب والتجارب التي يمكن القيام بها على قناة المعاد والبيئة غشاء لها. وتشبه خلية هيكل أكثر من الجسيمات الشحمية العملاقة يسمح تجارب التصحيح، المشبك التقليدية دون التضحية السيطرة على البيئة الدهون. Electroformation هو يعني كفاءة لإنتاج الجسيمات الشحمية العملاقة&gt; 10 ميكرون في القطر الذي يعتمد على تطبيق التيار الكهربائي بالتناوب إلى رقيقة، فيلم الدهون أمرت تترسب على سطح القطب. ومع ذلك، وبما أن بروتوكول الكلاسيكية يدعو إلى الدهون لتودع من المذيبات العضوية، وأنه غير متوافق مع بروتينات الغشاء أقل قوة مثل القنوات الأيونية ويجب أن يتم تعديل. في الآونة الأخيرة، والعلاقات العامةوقد وضعت otocols إلى electroform الجسيمات الشحمية العملاقة من الجسيمات الشحمية الصغيرة المجففة جزئيا، والتي تكيفنا مع الجسيمات الشحمية تحتوي على البروتين في المختبر لدينا. نقدم هنا الخلفية، ومعدات، وتقنيات، ومزالق electroformation من الجسيمات الشحمية العملاقة من التفرق الحويصلية الصغيرة. نبدأ مع بروتوكول الكلاسيكية، والتي ينبغي أن يتقن أولا قبل محاولة البروتوكولات أكثر تحديا التي تتبع. ونحن لشرح عملية جفاف جزئي للرقابة من الجسيمات الشحمية صغيرة باستخدام بخار التوازن مع حلول الملح المشبع. وأخيرا، ونحن لشرح عملية electroformation نفسها. سنقوم بشرح بسيط، تجهيزات رخيصة الثمن التي يمكن إجراؤها في المنزل لإنتاج الجسيمات الشحمية عالية الجودة، ووصف الفحص البصري للإعداد في كل مرحلة لضمان أفضل النتائج.

في الأمثلة لدينا، ونحن نستعد الجسيمات الشحمية من خليط من ما يقرب من 55٪ POPC مول (1-بالميتويل-2-oleoyl-SN-glycero-phosphocholine)، 15٪ مول الملوثات العضوية الثابتة (1-بالميتويل-2-oleoyl-SN-glycero-phosphoserine ، 30٪ مول الكوليسترول، و 0.1٪ مول تكساس الأحمر المسمى 1،2-dipalmitoyl-SN-phosphoethanolamine (TXR-DPPE)...

Watch this Scientific Journal Video about Giant Liposome Preparation for Imaging and Patch-Clamp Electrophysiology at JoVE.com

Giant Liposome Preparation for Imaging and Patch-Clamp Electrophysiology

إعادة تشكيل بروتينات الغشاء وظيفية في الجسيمات الشحمية العملاقة من تكوين المعرفة هو نهج قوية عندما يقترن الكهربية التصحيح، المشبك. ومع ذلك، قد يكون الإنتاج الحويصلية العملاقة التقليدية يتعارض مع استقرار البروتين. نحن تصف بروتوكولات لإنتاج الجسيمات الشحمية العملاقة من الدهون نقية أو الجسيمات الشحمية صغيرة تحتوي على القنوات الأيونية.

إعداد الحويصلية عملاق التصوير والتصحيح، المشبك الكهربية

The reconstitution of ion channels into chemically defined lipid membranes for electrophysiological recording has been a powerful technique to identify ...

giant-liposome-preparation-for-imaging-patch-clamp

Research

JoVE Journal

Biology

22.0K Views.  University of Washington. إعادة تشكيل بروتينات الغشاء وظيفية في الجسيمات الشحمية العملاقة من تكوين المعرفة هو نهج قوية عندما يقترن الكهربية التصحيح، المشبك. ومع ذلك، قد يكون الإنتاج الحويصلية العملاقة التقليدية يتعارض مع استقرار البروتين. نحن تصف بروتوكولات لإنتاج الجسيمات الشحمية ال...

Video: Giant Liposome Preparation for Imaging and Patch-Clamp Electrophysiology

Methods for Patch Clamp Capacitance Recordings from the Calyx

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. Electrical recordings from the presynaptic terminal allow the measurement of action potentials, calcium channel currents, vesicle fusion (exocytosis) and subsequent membrane uptake (endocytosis). The fusion of vesicles containing neurotransmitter causes the vesicle membrane to be added to the cell membrane of the calyx. This increase in the amount of cell membrane is measured as an increase in capacitance. The subsequent reduction in capacitance indicates endocytosis, the process of membrane uptake or removal from the calyx membrane. Endocytosis, is necessary to maintain the structure of the calyx and it is also necessary to form vesicles that will be filled with neurotransmitter for future exocytosis events. Capacitance recordings at the calyx of Held have made it possible to directly and rapidly measure vesicular release and subsequent endocytosis in a mammalian CNS nerve terminal. In addition, the corresponding postsynaptic activity can be simultaneously measured by using paired recordings. Thus a complete picture of the presynaptic and postsynaptic electrical activity at a central nervous system synapse is achievable using this preparation. Here, the methods for slice preparation, morphological features for identification of calyces of Held, basic patch clamping techniques, and examples of capacitance recordings to measure exocytosis and endocytosis are presented.

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal.

أساليب لتصحيح تسجيلات السعة المشبك من كاليكس

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. ...

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological measurement of single or multiple ion channels in cells. This technique can be applied to ion channels in both their native environment and expressed in heterologous cells, such as oocytes harvested from the African clawed frog, Xenopus laevis. Here, we describe the well-established technique of patch clamp recording from Xenopus oocytes. This technique is used to measure the properties of expressed ion channels either in populations (macropatch) or individually (single-channel recording). We focus on techniques to maximize the quality of oocyte preparation and seal generation. With all factors optimized, this technique gives a probability of successful seal generation over 90 percent. The process may be optimized differently by every researcher based on the factors he or she finds most important, and we present the approach that have lead to the greatest success in our hands.

This is intended as an introduction to patch clamp recording from Xenopus laevis oocytes. It covers vitelline membrane removal, formation of a gigaohm seal (gigaseal), and the optional conversion of the patch to the outside-out topology.

التصحيح تسجيل المشبك من القنوات ايون معبرا عنه البويضات القيطم

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Pressure-polishing Pipettes for Improved Patch-clamp Recording

Pressure-polishing is a method for shaping glass pipettes for patch-clamp recording. We first developed this method for fabricating pipettes suitable for recording from small (&lt;3 m) neuronal cell bodies. The basic principal is similar to glass-blowing and combines air pressure and heat to modify the shape of patch pipettes prepared by a conventional micropipette puller. It can be applied to so-called soft (soda lime) and hard (borosilicate) glasses. Generally speaking, pressure polishing can reduce pipette resistance by 25% without decreasing the diameter of the tip opening (Goodman and Lockery, 2000). It can be applied to virtually any type of glass and requires only the addition of a high-pressure valve and fitting to a microforge. This technique is essential for recording from ultrasmall cells (&lt;5 m) and can also improve single-channel recording by minimizing pipette resistance. The blunt shape is also useful for perforated-patch clamp recording since this tip shape results in a larger membrane bleb available for perforation.

This is a guide to modifying the shape of glass micropipettes. Specifically, by using heat and air pressure the taper is widened without increasing the tip opening, leading to lower pipette resistance. This is critical to obtain low noise recordings of small cells but is useful in many applications.

الضغط تلميع الماصات لتسجيل باتش تحسين المشبك

Pressure-polishing is a method for shaping glass pipettes for patch-clamp recording.  We first developed this method for fabricating pipettes suitable for ...

Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. These bilayers can be used for many different studies, such as the characterization of membrane-active peptides, the reconstitution of ion channels or investigations on how changes in lipid bilayer properties alter the function of bilayer-spanning channels.  Here, we show how to form a planar bilayer and how to isolate small patches from the bilayer, and in a second video  will also demonstrate a procedure for using gramicidin channels to determine changes in lipid bilayer elastic properties.   We also demonstrate the individual steps needed to prepare the bilayer chamber, the electrodes and how to test that the bilayer is suitable for single-channel measurements.

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. Here, we demonstrate the individual steps needed to prepare the bilayer chamber, the electrodes and how to test that the bilayer is suitable for single-channel measurements.

إعداد طبقات ثنائية الاصطناعي للتجارب الكهربية

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. These bilayers can ...

Spinal Cord Electrophysiology

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord dissection and preparation of recording bath artificial cerebrospinal fluid used for locomotor studies. Once dissected, the spinal cord ventral nerve roots can be attached to a recording electrode to record the electrophysiologic signals of the central pattern generating circuitry within the lumbar cord.

A demonstration of the isolation of neonatal mouse spinal cord for electrophysiologic studies.

الحبل الشوكي الكهربية

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

أعربت المشبك التصحيح وتقنيات الإرواء لدراسة في قنوات ايون القيطم البويضات

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

Contraction or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries determines the artery diameter and thereby controls flow of blood through the vessel and contributes to systemic blood pressure. The contraction process is regulated primarily by cytosolic calcium concentration ([Ca2+]cyt), which is in turn controlled by a variety of ion transporters and channels. Ion channels are common intermediates in signal transduction pathways activated by vasoactive hormones to effect vasoconstriction or vasodilation. And ion channels are often targeted by therapeutic agents either intentionally (e.g. calcium channel blockers used to induce vasodilation and lower blood pressure) or unintentionally (e.g. to induce unwanted cardiovascular side effects).
Kv7 (KCNQ) voltage-activated potassium channels have recently been implicated as important physiological and therapeutic targets for regulation of smooth muscle contraction. To elucidate the specific roles of Kv7 channels in both physiological signal transduction and in the actions of therapeutic agents, we need to study how their activity is modulated at the cellular level as well as evaluate their contribution in the context of the intact artery.
The rat mesenteric arteries provide a useful model system. The arteries can be easily dissected, cleaned of connective tissue, and used to prepare isolated arterial myocytes for patch clamp electrophysiology, or cannulated and pressurized for measurements of vasoconstrictor/vasodilator responses under relatively physiological conditions. Here we describe the methods used for both types of measurements and provide some examples of how the experimental design can be integrated to provide a clearer understanding of the roles of these ion channels in the regulation of vascular tone.

Measurements of Kv7 (KCNQ) potassium channel activity in isolated arterial myocytes (using patch clamp electrophysiological techniques) in parallel with measurements of constrictor/dilator responses (using pressure myography) can reveal important information about the roles of Kv7 channels in vascular smooth muscle physiology and pharmacology.

استكشاف الشرياني العضلات الملساء قناة البوتاسيوم Kv7 الدالة باستخدام المشبك التصحيح الكهربية وتخطيط العضل الضغط

Contraction  or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries  determines the artery diameter and thereby controls flow of ...

Introduction to Solid Supported Membrane Based Electrophysiology

The electrophysiological method we present is based on a solid supported membrane (SSM) composed of an octadecanethiol layer chemisorbed on a gold coated sensor chip and a phosphatidylcholine monolayer on top. This assembly is mounted into a cuvette system containing the reference electrode, a chlorinated silver wire.
After adsorption of membrane fragments or proteoliposomes containing the membrane protein of interest, a fast solution exchange is used to induce the transport activity of the membrane protein. In the single solution exchange protocol two solutions, one non-activating and one activating solution, are needed. The flow is controlled by pressurized air and a valve and tubing system within a faraday cage.
The kinetics of the electrogenic transport activity is obtained via capacitive coupling between the SSM and the proteoliposomes or membrane fragments. The method, therefore, yields only transient currents. The peak current represents the stationary transport activity. The time dependent transporter currents can be reconstructed by circuit analysis.
This method is especially suited for prokaryotic transporters or eukaryotic transporters from intracellular membranes, which cannot be investigated by patch clamp or voltage clamp methods.

Here we present an electrophysiological method based on solid supported membranes with focus on its applications for the characterization of electrogenic membrane transporters.

مقدمة إلى صلب غشاء المعتمدة واستنادا الكهربية

The electrophysiological method we present is based on a solid supported membrane (SSM) composed of an octadecanethiol layer chemisorbed on a gold coated ...

Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ring-supported hydrophilized PTFE membrane to provide structural support to both living and fixed tissue during immunohistochemical processing, which allows for the use of a variety of protocols that would otherwise cause damage to the tissue. First, this is demonstrated with bolus loading of fluorescent markers into living retinal tissue. This method allows for quick visualization of targeted structures, while the membrane support maintains tissue integrity during the injection and allows for easy transfer of the preparation for further imaging or processing.
Second, a procedure for antibody staining in tissue fixed with carbodiimide is described. Though paraformaldehyde fixation is more common, carbodiimide fixation provides a superior substrate for the visualization of synaptic proteins. A limitation of carbodiimide is that the resulting fixed tissue is relatively fragile; however, this is overcome with the use of the supporting membrane. Retinal tissue is used to demonstrate these techniques, but they may be applied to any fragile tissue.

The protocol described here is for structural assessment of a wholemount retinal preparation. This includes descriptions of tissue dissection, mounting onto a hydrophilized polytetrafluoroethylene (PTFE) membrane insert, bolus loading with fluorescent markers, and a comparison of fixation with carbodiimide and paraformaldehyde for immunohistochemical analysis of cellular and synaptic components.

بروتوكول الأمثل لإعداد Wholemount الشبكية للتصوير والمناعية

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

قناة واحدة الخلية المرفقة تسجيل التصحيح، المشبك

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...