우리는 electroformation 장치 구축을위한 브라이언 Venema의 에릭 마틴 슨 감사합니다. 이 작품은 건강의 국립 연구소의 일반적인 의료 과학 국립 연구소에서 보조금 (SEG에 R01GM100718) 및 보건 국립 연구소의 국립 안과 연구소 (SEG에 R01EY017564)에 의해 재정 지원되었다.

1. 유기 용매에서 지질 증착 : 클래식 프로토콜 <ol><li> . -20 ° C 또는 -80 ° C에서 저장소에서 지질을 제거합니다 RT 따뜻한주의 : 지질은 매우 흡습성이 있으며, 많은 산소에 민감합니다. 건조한 아르곤 또는 질소 가스의 지질을 커버하고 모든 단계에서 공기에 노출을 최소화합니다. </li><li> 필요한 경우, MG / ML 1-10에 클로로포름 또는 헥산에 지질을 중단, 제조 업체의 주장 농도는주의 일반적으로 공칭 것을. 주 : 유기 용제를 사용하는 경우 적절한 장갑 및 기타 개인 보호 장비를 착용하십시오. 대부분의 물질은 여전히이 용매 투과하고 그들이 일시적 보호를 제공하기 때문에 용매, 그들에 유출되는 경우 신속하게 PPE를 제거합니다. </li><li> 에탄올로 두 개의 25 X 37.5 mm ITO 코팅 유리 슬라이드의 양쪽을 청소 </li><li> 원하는 몰비를 달성하기 위해 지질을 섞는다. 각 1cm를위한 ITO 면적의 2 입술로 코팅 할 슬라이드아이디, 믹스 ~ 지질의 15-20 μg. . 모두 25 X 37.5 mm 슬라이드가 완전히 코팅 될 것 인 경우에 예를 들어, 우리는 일반적으로 10 ㎎ / ㎖ 지질 혼합물 주 30 μL를 사용한다 : 텍사스 형광 이미징을위한 레드 DPPE, 그리고 아래 참조에 대한주의 0.1 몰 %를 추가 형광 염료. </li><li> 유리 슬라이드의 ITO 코팅면이 저항계 또는 멀티 미터의 표면 저항을 측정하여이 위를 향하고 있는지 확인하십시오. </li><li> . 용매 저항 주사기주의로 지질을 흡입 : 아니오 접착제 또는 PTFE가 아닌 플라스틱, 유기 용매에 문의해야합니다. </li><li> 주사기 바늘은 매우 ITO 표면에 닿지 않도록 함께, 천천히 슬라이드에 걸쳐 앞뒤로 바늘을 이동 지질을 적용합니다. 유리 표면에 &quot;무지개 광택&quot;을 찾고, 균등하게 표면을 커버. </li><li> 흔적 용매 제거 0.5-1 시간 동안 &lt;1 토르 (1 mmHg로) 진공 빠르게 슬라이드를 놓습니다. 불활성 가스로 진공을 해제합니다. </li><li> 와, 실리콘 가스켓을 적용양쪽에 실리콘 진공 그리스의 얇은 층. 슬라이드의 한쪽 끝에서 노출 폭로 슬라이드 5 mm 이상을 둡니다. </li><li> 제 4 즉시 진행합니다. </li></ol> 2. 제어 탈수위한 작은 리포좀 준비 <ol><li> 단계 1.1에서와 같이 1.4 지질 혼합물을 준비합니다. </li><li> 10-15 mm 직경의 문화 튜브에 아르곤의 스트림 또는 질소 가스를 사용하여 지질을 건조. 지질의 소량, ≤ 0.5 밀리그램, 그 결과 영화는 직접 잔류 용매를 제거하기 위해 0.5 시간 동안 진공 상태로 배치 한 후 수화 될 수 있으며, 2.5 단계로 진행합니다. 지질의 큰 금액도 진공 상태에서, 두꺼운 젤 유기 용매를 트랩하는 경향, 그리고 더 나은 동결 건조에 의해 준비가되어 있습니다; 단계 2.3-4를 참조하십시오. </li><li> , 시클로 헥산에 건조 지질 필름을 중단 마개 아르곤과 물개 덮개, 1 시간의 최소 -80 ° C에서 냉각 블록과 동결에 튜브를 놓습니다. </li><li> 진공 시스템의 추위 블록과 지질 샘플을 배치100 mTorr의에 도달 할 수. 진공을 적용, 그것은 용매 고상하게 오프로 약 1 토르에서 &quot;정지&quot;됩니다. 일단 용매가 완전히 (~ 1 시간) 제거 진공이 수준 이하로 떨어질 것이다. 불활성 가스로 진공을 해제하고 즉시 튜브 또는 수화물을 밀봉하십시오. </li><li> 지질은 진공 반면, 가스를 수화 버퍼는 진공을 사용하여 15-17 불어 내면. </li><li> 최종 농도가 1-10 MG / ML에서 탈기 버퍼를 사용하여 지질 수화물. 천천히 수화 지질을 허용합니다. 후 30 분 - 1 시간, 남은 덩어리를 분해하는 소용돌이. 완전한 수화를 허용하도록 추가 0.5-1 시간을 기다립니다. 다음 단계 완전 탈수를 방지하는 등 최대 200 mm까지 소르비톨 또는 자당으로, osmoticant을 사용합니다. </li><li> 압출 100-200 nm의 직경 리포좀을 준비합니다. 자세한 내용은 제조업체의 압출 프로토콜을 참조하십시오. 버퍼가 ~ 25 mM의 이온 강도 또는 특수 electroformation 전압 프로토콜보다가 4 장에서 필요한 것이 있어야합니다. </li></ol> 3.작은 리포좀의 제어 탈수에 의한 지질 증착 <ol><li> 주의 : 우리의 프로토콜은 지질이 많은 시간 동안 포화 소금 용액과 증기 평형에 배치해야합니다. 우리는 강하게 글로브 박스 또는 유사한 인클로저를 사용하여 불활성 가스 분위기에서 프로토콜을 수행하는 것이 좋습니다. </li><li> 주의 : 단백질을 포함하는 샘플을 준비하는 경우, 완전한 탈수를 방지. 수화물은 따뜻한 물 비커에있는 모든 인클로저의 분위기 나 sonicator 기반의 가습기. 적어도 30 %의 상대 습도가 있는지 확인하기 위해 습도계를 사용합니다. 총 탈수를 방지하기 위해 추가 조치로 작은 리포좀 버퍼에 소르비톨이나 자당을 사용합니다. </li><li> 적절한 상대 습도 포화 소금 용액을 준비합니다. 대상 습도 소포 준비의 삼투압에 따라 달라집니다. 낮은 삼투압의 소포 준비가에 적절하게 탈수 할 수있는 동안 생리적 삼투압과 준비를 위해, 30-45 % RH를 사용75~90% RH (표 1 참조)와 평형. </li><li> 내부 선반 단단히 밀봉 용기에 포화 소금 용액 과잉 소금을 넣어. 아주 잘 한 요구르트 작업을위한 상용 식품 용기. 작성 후 선반을 교체하고 있는지 유체가 선반 아래 5~10mm다는 것을 확인한다. </li><li> 제 1과 깨끗한 ITO 코팅 된 슬라이드. 전도성면을 확인, 샘플 이름으로 비전 도성 쪽 레이블을 멀티 미터를 사용합니다. </li><li> 그리스를 살짝 발라 하나 또는 여러 개의 구멍 실리콘 (USP 등급 VI) 가스켓 (들)의 양쪽. </li><li> 벤치에 슬라이드 전도성 측면을 놓고 electroformation 장치에 연결하기 위해 한쪽 끝에 노출 된 슬라이드 5 mm 이상이 있는지 확인하고, 지질을 적용 할 각 슬라이드에 실리콘 가스켓 (들)을 적용합니다. 좋은 물개를 보장하기 위해 가스켓을 반반하게한다. </li><li> ~ 1-2 밀리그램 / ML에 낮은 소금 isosmotic 버퍼에 소포 준비를 희석. 우리는 더 높은 concentr을 찾을 수관리 포인트 가난한 결과를 생성합니다. </li><li> 1-10 μL 방울의 슬라이드에 지질을 적용합니다. 작은 방울은 일반적으로 더 나은 결과를 생성합니다. </li><li> 포화 소금 용액 위의 내부 선반에 슬라이드를 삽입하고 단단히 밀폐한다. O / N으로 3 시간 동안 RT에서 남겨 컨테이너는 ° C 4에 배치 할 수 있지만, 일부 염을 위해 RH 온도, 그리고 추위에 강하게 의존한다는 것을 참고 평형 시간이 증가합니다. </li><li> 그 결과 영화는 거기에 약간의 무지개 광채를 가질 수 있지만, 어떤 경우에는 거의 건조 된 나타납니다. 높은 삼투압 시작 솔루션은 지질 필름이 완전히 건조하는 것이 불가능할 수 있으며,이 부정적인 결과에 영향을 미치지 않을 것이다. </li></ol> 4. 거인 리포좀의 Electroformation <ol><li> 특히 지질 필름, 탈수 리포솜에서 형성하는이 쉽게 빠질 수 있습니다.주의 수화물 각 웰은 가스켓의 ​​가장자리에 27 G 주사기 바늘을 삽입하고 천천히 버퍼를 적용하여. 버퍼 수물을 포함 ≤ 200 MM의 자당, ≤ 1 M 소르비톨 ≤ 5 MM의 HEPES. 이상 10 MM 소금 솔루션은 대체 electroformation 전압 프로토콜이 필요할 수 있습니다. ~ 10 % 잘 충진 각 가스켓. </li><li> 참고 : 지질 수화이며, 지질 필름은 즉시 얇은 층으로 갈라 시작 이후 나머지 단계를 신속하게 진행합니다. electroformation이 즉시 시작하면 수익률 및 크기는 극대화된다. </li><li> 한 번의 부드러운 동작으로, 개스킷의 상단에 두 번째 ITO 슬라이드, 전도성 얼굴을 적용합니다. 가스켓 영역 외부와의 첫 번째 오버행 반대 오버행 5 mm 이상을 가지고 있는지 확인하십시오. 좋은 물개를 보장하기 위해 살짝 누르십시오. </li><li> 에탄올을 사용하여 두 개의 돌출부를 청소하고 가스켓에 직면 측면은 멀티 미터를 가진 전도성이 있는지 확인합니다. </li><li> 원하는 경우 챔버는 더 파라 필름 (parafilm) 또는 가벼운 장력 스프링 클립으로 고정 할 수 있습니다. </li><li> , &quot;EMI gask에게 알루미늄 또는 구리 막대를 확보하여 전압 소스에 electroformation 챔버를 연결두 슬라이드의 전도성 표면에 등 거품 &quot;또는 전도성 접착 테이프. 우리는 EMI 개스킷 폼을 사용합니다. 지그 및 클램프 계획 그림 5에 표시됩니다. </li><li> 전기적 접점 사이의 짧고 연락처 멀티 미터를 사용하여 ITO 표면에 올바르게 연결하는이 없는지 확인합니다. </li><li> ° C 최소 10 ° C 42 ° C의 체인 용융 온도보다 52 열, DPPC에 대한 예를 들어, 챔버 (10) ° C 지질의 가장 높은 용융 온도 이상으로 선물을 가열 </li><li> 저염 버퍼, 60-90 분 동안 10 Hz의 사인파, 두 ITO 코팅 된 표면 사이의 각 밀리미터 격차 ~ 0.7 V RMS를 적용합니다. 높은 소금 버퍼, 다른 전압 프로토콜 (참고 문헌 참조)를 사용해야합니다. </li></ol> 5. 이미징 및 문제 해결 <ol><li> 이미지 로다 민 또는 텍사스 레드 염료에 대한 필터 큐브 장착 거꾸로 현미경을 사용하여 리포좀을. 리포좀은 구형해야한다주로 눈으로 unilamellar, 이러한 리포좀에 걸려 &quot;문자열&quot;과 같은 결함. </li><li> 리포좀이 너무 작 으면 적은 지질을 사용합니다. </li><li> 많은 결함이나 몇 리포좀가있는 경우,이 젤 상 지질 때문일 수 있습니다. electroformation 온도를 높이는 것이 좋습니다. </li><li> 거의 또는 전혀 거대한 리포좀 탈수 작은 리포좀의 모든 형성하는 경우, 리포좀 버퍼의 삼투 강도를 줄이거 나 electroformation 버퍼의 삼투 강도를 높일 수 있습니다. 농축 중간 완충 용액에 버퍼의 유입은 입금 지질 필름의 박리가 발생할 수 있습니다. </li><li> 소포 수율, 품질, 또는 크기별로, 그리고 당신이 electroformation 또는 리포좀 버퍼에있는 염분의 pH 버퍼를 포함하는 경우, 다른 electroformation 전압 프로토콜을 고려하십시오. 예를 들어, POTT, 외. 11, 90 분 개최, 50-1,300 Vpp로 / m 30 분에서 전압을 높여, 500 Hz의 정현파를 사용하여 3 단계 프로토콜을 추천합니다N 30-60 분 동안 50 Hz로 주파수를 감소. 백금 티타늄 전극이 경우에 필요할 수 있습니다, 그러나 이것은 실질적으로 프로토콜을 변경하지 않습니다. </li></ol>

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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+probe+partitioning+in+GUVs+of+binary+phospholipid+mixtures:+implications+for+interpreting+phase+behavior.">Fluorescent probe partitioning in GUVs of binary phospholipid mixtures: implications for interpreting phase behavior.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1818 (1), 19-26 (2012).</li><li>Herold, C., Chwastek, G., Schwille, P., Petrov, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+electroformation+of+supergiant+unilamellar+vesicles+containing+cationic+lipids+on+ITO-coated+electrodes.">Efficient electroformation of supergiant unilamellar vesicles containing cationic lipids on ITO-coated electrodes.</a> Langmuir. 28 (13), 5518-5521 (2012).</li></ol>

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

거대한 리포좀의 Electroformation은 다양한 지질, 준비하고, 버퍼와 호환 유연한 기술로 개발했다. 지질 증착 공정의주의 깊은 관리가 성공에 가장 중요합니다. 우리는 작은 리포좀 제제 간단한 프로세스에서 지질 조절 증착하기 위해 간단한 도구를 발표했다. 상대 습도는 초기 리포솜의 적절한 탈수 중요하며, 최적의 값은 리포좀 현탁액 용질의 초기 농도가 달라집니다. 낮은 상대 습도는 적절한 수?...

거대한 리포좀은 (종종 거대한 unilamellar 소포, 또는 GUVs 불리는) 주로 이중층 변형, 측면 상 공존 ( &quot;뗏목&quot;), 막 융합 등 1-4 연구 등의 지질 이중층의 물리학 및 물리 화학을 연구하는 데 사용되었습니다. 쉽게 주변 수성 버퍼보다​​ 다른 할 수있는 수성 내부를 둘러싼 막의 구형 쉘 : 그들은 크게 세포와 같은 구조를 가지고. 그들은 정의에 의해, 직경 ≈ 1-100 μm의, 그래서 그들은 광학 현미경의 다양한 접근 방식을 사용하여 이미지화 할 수 있습니다. 그들은 일반적으로 소프트하면서, 자신의 속성을 쉽게 처리를 위해 조작 할 수 있도록, 삼투 기울기 또는 기계적으로 적용 장력을 사용하여 팽팽하게 만들 수 있습니다. 특히, 리포좀의 &quot;강성&quot;전기 생리학에 대해 &quot;리포좀 연결&quot;또는 절제 패치를 형성하는 것이 간단하게 제어. 과거에, 이온 채널의 재구성은 크게 평면 지질 B에서 수행되었다ilayers. 이제, 거대한 리포솜에서 패치를 형성하고 기존의 전기 생리학 개발 도구의 상당한 떨림을 (형광 현미경, 마이크로 피펫 포부, 신속한 재관류 및 온도 제어 등)를 사용하는 기능을 재구성 연구 5,6를위한 거대한 리포좀은 점점 더 매력적 수 있습니다. 거대한 리포좀 많은 전략에 의해 만들어진되었습니다. 건조 지질 영화는 4,7,8을 재수 때 사실 거대한 리포좀은 붓기 프로세스에 의해 자발적으로 형성한다. 더 빨리 더 준비하는 욕망은,보다 균일 한 리포솜은 electroformation 1,9 그들 가운데 최고 다른 접근, 연구자했다. Electroformation는 건조 지질 필름의 수분에 의존하지만, 지질 막에 걸쳐 진동하는 전기장의 응용 프로그램을 통해 과정을 속도. 필드 또는 물에 의해 분리 된 두 개의 전극, 백금 와이어 하나 또는 인듐 - 주석 산화물 (ITO) 코팅 유리 슬라이드를 적용버퍼링 된에 지질이 침착되어 있습니다. 리포좀의 팽창을 가속화함으로써, 더 큰 리포솜의 높은 수율을 달성 할 수있다. 따라서, electroformation 거대한 리포솜에게 4 생산하는 기본 방법이되었다. electroformation의 메커니즘은 완전히 이해되지 않고, 프로토콜의 대부분은 (예 : 10,11) 경험적으로 개발된다. 그럼에도 불구하고, 우리는 이론과 실증적 결과를 고려하여 무엇을 기대해야하는지에 대해 조금 배울 수 있습니다. 그것은 널리 electroformation은 입금 지질막 10,11 쌓아 개별 지질 이중층 사이의 버퍼의 전기 삼투 흐름을 운전에 의해 발생하는 것으로 생각됩니다. 지질 이중층의 열 변동에 정전기 커플 링은 아마 12 참여하고있다. 이 가설은 질적 10,12 사용할 수 있습니다 전기장의 주파수와 강도에 대한 상한을 예측하고있다. 특히, 그 높은 전도성 솔루션을 예측 ( <eM&gt; 즉, 생리 식염수)는 리포좀 electroformation에게 12을 시작할 수 있습니다 전기 수력 힘을 줄일 수 있습니다. 전기 삼투 유량은 일반적으로 증가 소금 농도가 감소 자주 일부 전기장 발진 주파수 (예를 들어 다른 기하학, 녹색 등. 13이기는하지만)에 만족하고 있습니다. 따라서, 높은 전계 강도와 높은 주파수 범위 10에서, 높은 전도성 솔루션을 합리적입니다. 그러나 막 단백질은 그 얇은 지질막을 떠날 떨어져​​ 증발하는 유기 용매 즉, electroswelling 절차를 전극에 지질 증착의 일반적인 방법으로 호환되지 않을 가능성이 있습니다. 이러한 어려움의 주위에 두 가지 주요 경로가 있습니다 : 거대한 리포좀 형성 한 후 단백질을 통합하거나, 지질이 입금되는 방법을 적용 할 수 있습니다. 우리의 접근 방식은 지질 및 reconsti을 입금하는 다른 5,11에 구축작거나 큰 &quot;proteoliposomes&quot;의 현탁액에서 함께 막 단백질을 tuted. 우리는 (콜린스와 고든 검토)에서 다른 단백질과 지질을 정제에서 proteoliposomes을 생산 길고 더 도전 과정을 설명합니다. 여기에서 우리는 어떤 단백질의 부재에서 프로토콜을 설명하지만 단백질이 포함되는 경우는 동일합니다, 우리는 이온 채널 TRPV1을 포함 proteoliposomes이 GUVs로 변환 및 패치 - 클램프 전기 생리학에 사용할 수있는 것을 보여주는 결과가 있습니다. 모든 electroformation 방식에서 지질 증착 과정에서 지질 샘플을 시각적으로 검사 성공에 중요합니다. 우리의 접근 방식은 이온 채널의 재구성에 대한 전문적인 응용 프로그램 이외의 관련이있을 수 있습니다. 우리가 처음이 프로토콜을 개발하고 지금 그것은 또한 지방질이 electroformation을위한 전극에 부착되는 방법은 결과 GUVs의 조성 이질성에 미치는 영향을 보여왔다 이후 시간에. Bayk알 Caglar 등. 14주의 탈수 리포솜에서 형성 GUVs 다양한 인지질과 콜레스테롤의 혼합물에서 형성 GUVs의 혼 화성 전이 온도에서 2.5 배 작은 변화를했다고했다. 그들의 작품은 지질 혼합물의 지질, 특히 콜레스테롤, 5 월 침전물이 퇴적 지질 필름의 구성에 큰 공간적 변화의 결과로, 유기 용제에서 증착 할 때 나타냅니다. 이 지질 막 단계의 행동 연구에 특히 중요합니다,뿐만 아니라 이온 채널의 기능에 대한 정량적 실험에 중요 할 수 있습니다. 바이칼-Caglar 하였다.의 프로토콜은 비슷하지만 우리 자신과 동일하지 않고, 독자뿐만 아니라 그것을 연구하는 것이 좋습니다. 이 프로토콜은 (개요 그림 1 참조) 사용할 수있는 많은 중 하나입니다. 원리 electroformation 성공에 지질 혼합물, 수화, 온도, 다른 용질 (특히 이온), 그리고에 따라 달라집니다형성에 사용되는 과정의 전압 및 주파수. electroformation이 잘 이해됨에 따라, 우리는 우리의 프로토콜을 구체화 할 것으로 예상된다. 마지막으로, 거대한 리포좀을 전주에있는 가파른 학습 곡선이 종종있다. 우리는 리포좀 현탁액 (섹션 2-5)에서 지질을 입금 학습하기 전에 마스터에게 기존의 프로토콜 (제 1, 4, 그리고 필요한 경우 5 장) 제안합니다.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Multimeter</td>
			<td>Agilent Technologies, <a href="http://www.agilent.com" target="_blank">www.agilent.com</a></td>
			<td>U1232A or similar</td>
			<td>Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Fluke</td>
			<td>117 or 177</td>
			<td>Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Function Generator</td>
			<td>Agilent Technologies, <a href="http://www.agilent.com" target="_blank">www.agilent.com</a></td>
			<td>33210A or similar</td>
			<td>Most function generators work for simple protocols. This programmable model is useful for advanced electroformation protocols. Make sure the generator can drive 10 V peak-to-peak into a 50 &Omega; load</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITO coated glass slides</td>
			<td>Delta Technologies, Loveland, CO <a href="http://www.delta-technologies.com" target="_blank">www.delta-technologies.com</a></td>
			<td>CB-90IN-S107 or similar</td>
			<td>Break these in half to make two slides, 25 mm x 37 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>Omega Engineering Stamford, CT <a href="http://www.omega.com" target="_blank">www.omega.com</a></td>
			<td>CNi3233 or similar</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygrometer</td>
			<td>Extech, Nashua, NH, <a href="http://www.extech.com" target="_blank">www.extech.com</a></td>
			<td>445815</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone rubber sheet</td>
			<td>McMaster-Carr Elmhurst, IL <a href="http://www.mcmaster.com" target="_blank">www.mcmaster.com</a></td>
			<td><a href="http://www.mcmaster.com/#87315K64" target="_blank">87315K64</a></td>
			<td>Use USP Grade VI silicone for its high purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMI gasket</td>
			<td>Laird Technologies <a href="http://www.lairdtech.com" target="_blank">www.lairdtech.com</a></td>
			<td>4202-PA-51H-01800 or similar</td>
			<td>Distributed by Mouser <a href="http://www.mouser.com" target="_blank">www.mouser.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TxR-DHPE</td>
			<td>Life Technologies, Carlsbad, CA <a href="http://www.lifetechnologies.com" target="_blank">www.lifetechnologies.com</a></td>
			<td>T1395MP</td>
			<td>Other fluorescently labeled lipids are available, but TxR-DHPE is one of the brightest and most photostable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPC</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL <a href="http://www.avantilipids.com" target="_blank">www.avantilipids.com</a></td>
			<td>850457P or 850457C</td>
			<td>Lipids can be ordered as powders (P) or in chloroform (C)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPS</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840034P/C</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8667</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

giant liposome preparation for imaging and patch-clamp electrophysiology

전기 생리학 녹음 화학적 지질 막에 이온 채널의 재구성이 중요한 단백질의 기능을 식별하고 탐구 할 수있는 강력한 기술이다. 그러나, 평면 이중층과 같은 고전적인 준비는, 재구성 채널과의 멤브레인 환경에서 수행 할 수있는 조작과 실험을 제한 할 수 있습니다. 거대한 리포좀의 더 많은 세포와 같은 구조 지질 환경의 제어를 희생하지 않고도 기존 패치 - 클램프 실험을 허용합니다. Electroformation는 전극 표면에 증착 얇은 주문한 지질 막에 전압을 교류의 응용 프로그램에 의존 직경 거대한 리포솜에게&gt; 10 ㎛를 생성하는 효율적인 의미입니다. 고전 프로토콜은 유기 용매에서 입금 할 지질 요구 때문에 그러나, 그것은 이온 채널과 같은 덜 강력한 막 단백질과 호환되지 않으며 수정해야합니다. 최근 홍보otocols 우리가 우리의 실험실에서 단백질을 함유 리포솜에 적응 부분적으로 탈수 작은 리포좀에서 거대한 리포좀을 전주 위해 개발되었습니다. 우리는 여기서 배경, 장비, 기술 및 작은 리포좀 분산에서 거대한 리포좀의 electroformation의 함정을 제시한다. 우리는 다음에 더 도전 프로토콜을 시도하기 전에 먼저 마스터해야하는 고전적인 프로토콜로 시작합니다. 우리는 포화 소금 용액과 증기 평형을 사용하여 작은 리포좀의 제어 부분 탈수의 과정을 보여줍니다. 마지막으로, 우리는 electroformation 자체의 과정을 보여줍니다. 우리는 고품질 리포좀을 생산하고 최상의 결과를 보장하기 위해 각 단계에서 준비 육안 검사를 설명하기 위해 사내에서 할 수있는 간단한, 저렴한 장비를 설명합니다.

우리의 예제에서, 우리는 약 55 몰 % POPC (1 파르 미트-2-oleoyl-SN-팔미 - 포스 포 콜린), 15 몰 % POPS (1 파르 미트-2-oleoyl-SN-팔미-phosphoserine의 혼합물에서 리포좀을 준비 , 30 몰 % 콜레스테롤, 0.1 몰 % 텍사스 1,2 - dipalmitoyl-SN-phosphoethanolamine (TXR-DPPE) 레드 라벨.이 구성은 18 신경절 (dorsal root ganglion) 지질의 약 대표로 선택되었다. 우리는 15 몰 %가 청구주의 지질 (여기 POPS)는 (예?...

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Giant Liposome Preparation for Imaging and Patch-Clamp Electrophysiology

패치 클램프 전기 생리학과 결합 될 때 정의 된 구성의 거대한 리포좀으로 기능 막 단백질을 재구성하는 강력한 방법입니다. 그러나 기존의 거대한 리포좀 생산 단백질의 안정성과 호환되지 않을 수 있습니다. 우리는 순수 지질이나 이온 채널을 포함하는 작은 리포좀의 거대한 리포좀 생산을위한 프로토콜을 설명합니다.

이미징 및 패치 클램프 전기 생리학에 대한 거대한 리포좀 준비

The reconstitution of ion channels into chemically defined lipid membranes for electrophysiological recording has been a powerful technique to identify ...

giant-liposome-preparation-for-imaging-patch-clamp

Research

JoVE Journal

Biology

22.0K 조회수.  University of Washington. 패치 클램프 전기 생리학과 결합 될 때 정의 된 구성의 거대한 리포좀으로 기능 막 단백질을 재구성하는 강력한 방법입니다. 그러나 기존의 거대한 리포좀 생산 단백질의 안정성과 호환되지 않을 수 있습니다. 우리는 순수 지질이나 이온 채널을 포함하는 작은 리포좀의 거대한 리포좀 생산을위한 프로토콜을 설명합니다.

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Methods for Patch Clamp Capacitance Recordings from the Calyx

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. Electrical recordings from the presynaptic terminal allow the measurement of action potentials, calcium channel currents, vesicle fusion (exocytosis) and subsequent membrane uptake (endocytosis). The fusion of vesicles containing neurotransmitter causes the vesicle membrane to be added to the cell membrane of the calyx. This increase in the amount of cell membrane is measured as an increase in capacitance. The subsequent reduction in capacitance indicates endocytosis, the process of membrane uptake or removal from the calyx membrane. Endocytosis, is necessary to maintain the structure of the calyx and it is also necessary to form vesicles that will be filled with neurotransmitter for future exocytosis events. Capacitance recordings at the calyx of Held have made it possible to directly and rapidly measure vesicular release and subsequent endocytosis in a mammalian CNS nerve terminal. In addition, the corresponding postsynaptic activity can be simultaneously measured by using paired recordings. Thus a complete picture of the presynaptic and postsynaptic electrical activity at a central nervous system synapse is achievable using this preparation. Here, the methods for slice preparation, morphological features for identification of calyces of Held, basic patch clamping techniques, and examples of capacitance recordings to measure exocytosis and endocytosis are presented.

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal.

칼리에서 패치 클램프 커패시턴스 레코딩을위한 방법

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. ...

연구

생물학

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological measurement of single or multiple ion channels in cells. This technique can be applied to ion channels in both their native environment and expressed in heterologous cells, such as oocytes harvested from the African clawed frog, Xenopus laevis. Here, we describe the well-established technique of patch clamp recording from Xenopus oocytes. This technique is used to measure the properties of expressed ion channels either in populations (macropatch) or individually (single-channel recording). We focus on techniques to maximize the quality of oocyte preparation and seal generation. With all factors optimized, this technique gives a probability of successful seal generation over 90 percent. The process may be optimized differently by every researcher based on the factors he or she finds most important, and we present the approach that have lead to the greatest success in our hands.

This is intended as an introduction to patch clamp recording from Xenopus laevis oocytes. It covers vitelline membrane removal, formation of a gigaohm seal (gigaseal), and the optional conversion of the patch to the outside-out topology.

Xenopus Oocytes의 표현 이온 채널 패치 클램프 녹음

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Pressure-polishing Pipettes for Improved Patch-clamp Recording

Pressure-polishing is a method for shaping glass pipettes for patch-clamp recording. We first developed this method for fabricating pipettes suitable for recording from small (&lt;3 m) neuronal cell bodies. The basic principal is similar to glass-blowing and combines air pressure and heat to modify the shape of patch pipettes prepared by a conventional micropipette puller. It can be applied to so-called soft (soda lime) and hard (borosilicate) glasses. Generally speaking, pressure polishing can reduce pipette resistance by 25% without decreasing the diameter of the tip opening (Goodman and Lockery, 2000). It can be applied to virtually any type of glass and requires only the addition of a high-pressure valve and fitting to a microforge. This technique is essential for recording from ultrasmall cells (&lt;5 m) and can also improve single-channel recording by minimizing pipette resistance. The blunt shape is also useful for perforated-patch clamp recording since this tip shape results in a larger membrane bleb available for perforation.

This is a guide to modifying the shape of glass micropipettes. Specifically, by using heat and air pressure the taper is widened without increasing the tip opening, leading to lower pipette resistance. This is critical to obtain low noise recordings of small cells but is useful in many applications.

향상된 패치 - 클램프 녹음 압력 연마 Pipettes

Pressure-polishing is a method for shaping glass pipettes for patch-clamp recording.  We first developed this method for fabricating pipettes suitable for ...

Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. These bilayers can be used for many different studies, such as the characterization of membrane-active peptides, the reconstitution of ion channels or investigations on how changes in lipid bilayer properties alter the function of bilayer-spanning channels.  Here, we show how to form a planar bilayer and how to isolate small patches from the bilayer, and in a second video  will also demonstrate a procedure for using gramicidin channels to determine changes in lipid bilayer elastic properties.   We also demonstrate the individual steps needed to prepare the bilayer chamber, the electrodes and how to test that the bilayer is suitable for single-channel measurements.

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. Here, we demonstrate the individual steps needed to prepare the bilayer chamber, the electrodes and how to test that the bilayer is suitable for single-channel measurements.

전기 생리학 실험을위한 인공 Bilayers의 준비

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. These bilayers can ...

Spinal Cord Electrophysiology

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord dissection and preparation of recording bath artificial cerebrospinal fluid used for locomotor studies. Once dissected, the spinal cord ventral nerve roots can be attached to a recording electrode to record the electrophysiologic signals of the central pattern generating circuitry within the lumbar cord.

A demonstration of the isolation of neonatal mouse spinal cord for electrophysiologic studies.

척수 전기 생리학

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

이온 채널 유학을위한 패치 클램프 및 재관류 기법으로 표현 Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

Contraction or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries determines the artery diameter and thereby controls flow of blood through the vessel and contributes to systemic blood pressure. The contraction process is regulated primarily by cytosolic calcium concentration ([Ca2+]cyt), which is in turn controlled by a variety of ion transporters and channels. Ion channels are common intermediates in signal transduction pathways activated by vasoactive hormones to effect vasoconstriction or vasodilation. And ion channels are often targeted by therapeutic agents either intentionally (e.g. calcium channel blockers used to induce vasodilation and lower blood pressure) or unintentionally (e.g. to induce unwanted cardiovascular side effects).
Kv7 (KCNQ) voltage-activated potassium channels have recently been implicated as important physiological and therapeutic targets for regulation of smooth muscle contraction. To elucidate the specific roles of Kv7 channels in both physiological signal transduction and in the actions of therapeutic agents, we need to study how their activity is modulated at the cellular level as well as evaluate their contribution in the context of the intact artery.
The rat mesenteric arteries provide a useful model system. The arteries can be easily dissected, cleaned of connective tissue, and used to prepare isolated arterial myocytes for patch clamp electrophysiology, or cannulated and pressurized for measurements of vasoconstrictor/vasodilator responses under relatively physiological conditions. Here we describe the methods used for both types of measurements and provide some examples of how the experimental design can be integrated to provide a clearer understanding of the roles of these ion channels in the regulation of vascular tone.

Measurements of Kv7 (KCNQ) potassium channel activity in isolated arterial myocytes (using patch clamp electrophysiological techniques) in parallel with measurements of constrictor/dilator responses (using pressure myography) can reveal important information about the roles of Kv7 channels in vascular smooth muscle physiology and pharmacology.

패치 클램프 전기 생리학 및 압력 Myography를 사용하여 간선 평활근 Kv7 칼륨 채널 기능을 탐색

Contraction  or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries  determines the artery diameter and thereby controls flow of ...

Introduction to Solid Supported Membrane Based Electrophysiology

The electrophysiological method we present is based on a solid supported membrane (SSM) composed of an octadecanethiol layer chemisorbed on a gold coated sensor chip and a phosphatidylcholine monolayer on top. This assembly is mounted into a cuvette system containing the reference electrode, a chlorinated silver wire.
After adsorption of membrane fragments or proteoliposomes containing the membrane protein of interest, a fast solution exchange is used to induce the transport activity of the membrane protein. In the single solution exchange protocol two solutions, one non-activating and one activating solution, are needed. The flow is controlled by pressurized air and a valve and tubing system within a faraday cage.
The kinetics of the electrogenic transport activity is obtained via capacitive coupling between the SSM and the proteoliposomes or membrane fragments. The method, therefore, yields only transient currents. The peak current represents the stationary transport activity. The time dependent transporter currents can be reconstructed by circuit analysis.
This method is especially suited for prokaryotic transporters or eukaryotic transporters from intracellular membranes, which cannot be investigated by patch clamp or voltage clamp methods.

Here we present an electrophysiological method based on solid supported membranes with focus on its applications for the characterization of electrogenic membrane transporters.

전기 생리학을 바탕으로 솔리드 지원 막 소개

The electrophysiological method we present is based on a solid supported membrane (SSM) composed of an octadecanethiol layer chemisorbed on a gold coated ...

Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ring-supported hydrophilized PTFE membrane to provide structural support to both living and fixed tissue during immunohistochemical processing, which allows for the use of a variety of protocols that would otherwise cause damage to the tissue. First, this is demonstrated with bolus loading of fluorescent markers into living retinal tissue. This method allows for quick visualization of targeted structures, while the membrane support maintains tissue integrity during the injection and allows for easy transfer of the preparation for further imaging or processing.
Second, a procedure for antibody staining in tissue fixed with carbodiimide is described. Though paraformaldehyde fixation is more common, carbodiimide fixation provides a superior substrate for the visualization of synaptic proteins. A limitation of carbodiimide is that the resulting fixed tissue is relatively fragile; however, this is overcome with the use of the supporting membrane. Retinal tissue is used to demonstrate these techniques, but they may be applied to any fragile tissue.

The protocol described here is for structural assessment of a wholemount retinal preparation. This includes descriptions of tissue dissection, mounting onto a hydrophilized polytetrafluoroethylene (PTFE) membrane insert, bolus loading with fluorescent markers, and a comparison of fixation with carbodiimide and paraformaldehyde for immunohistochemical analysis of cellular and synaptic components.

이미징 및 면역 조직 화학에 대한 망막 Wholemount 준비를 위해 최적화 된 프로토콜

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

1 채널의 세포 부착 된 패치 클램프 녹음

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...