معتمدة S. Lusvarghi، J. Sztuba-Solinska، KJ Purzycka، JW RAUSCH وSFJ لو جريس من قبل برنامج بحوث جماعية للمعهد الوطني للسرطان والمعاهد الوطنية للصحة بالولايات المتحدة الأمريكية.

<ol>
	<li>Scott, W. G., Martick, M., Chi, Y. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+regulatory+RNA+elements:+ribozymes+that+regulate+gene+expression.">Structure and function of regulatory RNA elements: ribozymes that regulate gene expression.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1789, 634-641 (2009).</li><li>Moore, P. B., Steitz, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+RNA+in+the+synthesis+of+protein.">The roles of RNA in the synthesis of protein.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 3, a003780 (2011).</li><li>Wilkinson, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+SHAPE+analysis+reveals+structures+in+HIV-1+genomic+RNA+strongly+conserved+across+distinct+biological+states.">High-throughput SHAPE analysis reveals structures in HIV-1 genomic RNA strongly conserved across distinct biological states.</a> Plos Biol. 6, 883-899 (2008).</li><li>Merino, E. J., Wilkinson, K. A., Coughlan, J. L., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+structure+analysis+at+single+nucleotide+resolution+by+selective+2+'-hydroxyl+acylation+and+primer+extension+(SHAPE).">RNA structure analysis at single nucleotide resolution by selective 2 '-hydroxyl acylation and primer extension (SHAPE).</a> J. Am. Chem. Soc. 127, 4223-4231 (2005).</li><li>Watts, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+and+secondary+structure+of+an+entire+HIV-1+RNA+genome.">Architecture and secondary structure of an entire HIV-1 RNA genome.</a> Nature. 460, 711-716 (2009).</li><li>Xu, W., Bolduc, F., Hong, N., Perreault, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+a+combination+of+computer-assisted+structure+prediction+and+SHAPE+probing+to+elucidate+the+secondary+structures+of+five+viroids.">The use of a combination of computer-assisted structure prediction and SHAPE probing to elucidate the secondary structures of five viroids.</a> Mol. Plant Pathol. , (2012).</li><li>Novikova, I. V., Hennelly, S. P., Sanbonmatsu, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+architecture+of+the+human+long+non-coding+RNA,+steroid+receptor+RNA+activator.">Structural architecture of the human long non-coding RNA, steroid receptor RNA activator.</a> Nucleic Acids Res. 40, 5034-5051 (2012).</li><li>Leshin, J. A., Heselpoth, R., Belew, A. T., Dinman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+structural+analysis+of+yeast+ribosomes+using+hSHAPE.">High-throughput structural analysis of yeast ribosomes using hSHAPE.</a> RNA Biol. 8, 478-487 (2011).</li><li>Souliere, M. F., Haller, A., Rieder, R., Micura, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+powerful+approach+for+the+selection+of+2-aminopurine+substitution+sites+to+investigate+RNA+folding.">A powerful approach for the selection of 2-aminopurine substitution sites to investigate RNA folding.</a> J. Am. Chem. Soc. 133, 16161-16167 (2011).</li><li>Wilkinson, K. A., Merino, E. J., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+2+'-hydroxyl+acylation+analyzed+by+primer+extension+(SHAPE):+quantitative+RNA+structure+analysis+at+single+nucleotide+resolution.">Selective 2 '-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE): quantitative RNA structure analysis at single nucleotide resolution.</a> Nat. Protoc. 1, 1610-1616 (2006).</li><li>McGinnis, J. L., Duncan, C. D. S., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Shape+and+Hydroxyl+Radical+Analysis+of+Rna+Structure+and+Ribonucleoprotein+Assembly.">High-Throughput Shape and Hydroxyl Radical Analysis of Rna Structure and Ribonucleoprotein Assembly.</a> Method Enzymol. 468, 67-89 (2009).</li><li>Low, J. T., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHAPE-directed+RNA+secondary+structure+prediction.">SHAPE-directed RNA secondary structure prediction.</a> Methods. 52, 150-158 (2010).</li><li>Das, R., Laederach, A., Pearlman, S. M., Herschlag, D., Altman, R. B. S. A. F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semi-automated+footprinting+analysis+software+for+high-throughput+quantification+of+nucleic+acid+footprinting+experiments.">Semi-automated footprinting analysis software for high-throughput quantification of nucleic acid footprinting experiments.</a> Rna-a Publication of the Rna Society. 11, 344-354 (2005).</li><li>Kertesz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+measurement+of+RNA+secondary+structure+in+yeast.">Genome-wide measurement of RNA secondary structure in yeast.</a> Nature. 467, 103-107 (2010).</li><li>Underwood, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FragSeq:+transcriptome-wide+RNA+structure+probing+using+high-throughput+sequencing.">FragSeq: transcriptome-wide RNA structure probing using high-throughput sequencing.</a> Nat. Methods. 7, 995-1001 (2010).</li><li>Mauger, D. M., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+global+RNA+structure+analysis.">Toward global RNA structure analysis.</a> Nat. Biotechnol. 28, 1178-1179 (2010).</li><li>Lucks, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+RNA+structure+characterization+with+selective+2'-hydroxyl+acylation+analyzed+by+primer+extension+sequencing+(SHAPE-Seq).">Multiplexed RNA structure characterization with selective 2'-hydroxyl acylation analyzed by primer extension sequencing (SHAPE-Seq).</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108, 11063-11068 (2011).</li><li>Vasa, S. M., Guex, N., Wilkinson, K. A., Weeks, K. M., Giddings, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ShapeFinder:+a+software+system+for+high-throughput+quantitative+analysis+of+nucleic+acid+reactivity+information+resolved+by+capillary+electrophoresis.">ShapeFinder: a software system for high-throughput quantitative analysis of nucleic acid reactivity information resolved by capillary electrophoresis.</a> RNA. 14, 1979-1990 (2008).</li><li>Reuter, J. S., Mathews, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAstructure:+software+for+RNA+secondary+structure+prediction+and+analysis.">RNAstructure: software for RNA secondary structure prediction and analysis.</a> BMC Bioinformatics. 11, 129 (2010).</li><li>Pang, P. S., Elazar, M., Pham, E. A., Glenn, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+RNA+secondary+structure+mapping+by+automation+of+SHAPE+data+analysis.">Simplified RNA secondary structure mapping by automation of SHAPE data analysis.</a> Nucleic Acids Res. 39, e151 (2011).</li><li>Deigan, K. E., Li, T. W., Mathews, D. H., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+SHAPE-directed+RNA+structure+determination.">Accurate SHAPE-directed RNA structure determination.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 97-102 (2009).</li><li>Darty, K., Denise, A., Ponty, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VARNA:+Interactive+drawing+and+editing+of+the+RNA+secondary+structure.">VARNA: Interactive drawing and editing of the RNA secondary structure.</a> Bioinformatics. 25, 1974-1975 (2009).</li><li>Byun, Y., Han, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PseudoViewer:+web+application+and+web+service+for+visualizing+RNA+pseudoknots+and+secondary+structures.">PseudoViewer: web application and web service for visualizing RNA pseudoknots and secondary structures.</a> Nucleic Acids Res. 34, 416-422 (2006).</li><li>Brown, T., Brown, D. J. S., Eckstein, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Oligonucleotides and Analogues - A Practical Approach. , 20 (1990).</li><li>Legiewicz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA+Transport+Element+of+the+Murine+musD+Retrotransposon+Requires+Long-range+Intramolecular+Interactions+for+Function.">The RNA Transport Element of the Murine musD Retrotransposon Requires Long-range Intramolecular Interactions for Function.</a> J. Biol. Chem. 285, 42097-42104 (2010).</li><li>Steen, K., Siegfried, N. A., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syntheis+of+1-methyl-8-nitroisatoic+anhydride+(1M7).">Syntheis of 1-methyl-8-nitroisatoic anhydride (1M7).</a> Protocol Exchange. , (2011).</li><li>Mortimer, S. A., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fast-acting+reagent+for+accurate+analysis+of+RNA+secondary+and+tertiary+structure+by+SHAPE+chemistry.">A fast-acting reagent for accurate analysis of RNA secondary and tertiary structure by SHAPE chemistry.</a> J. Am. Chem. Soc. 129, 4144-4145 (2007).</li><li>Mitra, S., Shcherbakova, I. V., Altman, R. B., Brenowitz, M., Laederach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+single-nucleotide+structural+mapping+by+capillary+automated+footprinting+analysis.">High-throughput single-nucleotide structural mapping by capillary automated footprinting analysis.</a> Nucleic Acids Res. 36, e63 (2008).</li><li>Giddings, M. C., Severin, J., Westphall, M., Wu, J., Smith, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+software+system+for+data+analysis+in+automated+DNA+sequencing.">A software system for data analysis in automated DNA sequencing.</a> Genome Res. 8, 644-665 (1998).</li><li>Aviran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+and+automation+of+sequencing-based+characterization+of+RNA+structure.">Modeling and automation of sequencing-based characterization of RNA structure.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108, 11069-11074 (2011).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

نقدم هنا بروتوكول مفصلة لشكل الإنتاجية العالية، وهي تقنية تسمح تحديد هيكل الثانوي لقرار النوكليوتيدات واحد لالرنا من أي حجم. وعلاوة على ذلك، اقتران بيانات الشكل التجريبية مع خوارزميات التنبؤ هيكل ثانوي يسهل جيل من الحمض النووي الريبي نماذج 2D مع درجة أعلى من دقة مما ...

لفهم وظائف الرنا الحفاز وغير الترميز المشاركة في تنظيم الربط والترجمة وتكاثر الفيروس وسرطان، لا بد من معرفة تفصيلية للبنية الحمض النووي الريبي 1،2. للأسف، تنبؤ دقيق من الحمض النووي الريبي للطي يمثل تحديا هائلا. وكلاء التحقيق الكلاسيكية تعاني من عيوب كثيرة مثل سمية، والتغطية النوكليوتيدات غير مكتملة و / أو إنتاجية محدودة إلى 100-150 النيوكليوتيدات في التجربة. خوارزميات التنبؤ المجردة هيكل الثانوي غير ملائم وبالمثل، نظرا لعدم الدقة الناجمة عن عدم قدرتها على التمييز بين فعالية هياكل مماثلة بقوة. الرنا كبيرة على وجه الخصوص هي أيضا في كثير من الأحيان إلى صهر أساليب تحديد هيكل 3D مثل البلورات بالأشعة السينية والرنين المغناطيسي النووي (NMR) التحليل الطيفي، وذلك بسبب مرونتها ومتعلق بتكوين كميات كبيرة من عينات نقية للغاية المطلوبة لهذه التقنيات. HSHAPE IGH الإنتاجية يحل الكثير من هذه المشاكل عن طريق توفير نهج بسيطة فعالة ليحقق في هياكل الرنا كبير في قرار النوكليوتيدات واحد. وعلاوة على ذلك، والكواشف المستخدمة لشكل هي آمنة وسهلة للتعامل، وعلى النقيض من معظم الكواشف الكيميائية الأخرى التحقيق، تتفاعل مع جميع ribonucleotides أربعة. ويمكن لهذه الكواشف أيضا اختراق الأغشية الخلوية، مما يجعل من الممكن للتحقيق في الرنا في سياق الجسم الحي (ق) 3. وضعت أصلا في الأسابيع مختبر 4، وقد استخدمت SHAPE لتحليل مجموعة متنوعة واسعة من الرنا، والمثال أبرزها تقرير للهيكل الثانوي كاملة من ~ 9 KB HIV-1 الحمض النووي الريبي الجينوم 5. الإنجازات البارزة الأخرى باستخدام SHAPE تشمل توضيح لهياكل أشباه الفيروسات المعدية 6، الرناوات غير الترميز طويلة الإنسان 7، 8 ريبوسوم الخميرة، وriboswitches 9 وكذلك لتحديد مواقع الربط البروتين في الفيريون المرتبطة HIV-1 RNA 3. WHوقد نشرت إيل الاختلافات الأصلي وعالية الإنتاجية من البروتوكول SHAPE في أماكن أخرى 10-12، ويوفر هذا العمل وصفا مفصلا لتحديد الحمض النووي الريبي هيكل الثانوي بحلول SHAPE الإنتاجية العالية باستخدام [أليغنوكليوتيد الفلورسنت، وكولتر CEQ 8000 محلل الوراثية بيكمان، و SHAPEfinder وRNAStructure (V5.3) والبرمجيات. كما تشمل التفاصيل الفنية لم تنشر من قبل والمشورة استكشاف الأخطاء وإصلاحها. الاختلافات من الشكل جوهر الشكل وتنوعاتها هو التعرض من الحمض النووي الريبي في محلول مائي لالانهيدريدات بالإلكترونات التي acylate انتقائي 2&#39;-الهيدروكسيل (OH-2&#39;) مجموعات الريبوز، وتنتج adducts ضخمة في مواقع التعديل. هذا التفاعل الكيميائي يخدم كوسيلة لاستجواب ديناميات RNA المحلية الهيكلي، كما النيوكليوتيدات الذين تقطعت بهم السبل واحد هم أكثر عرضة للاعتماد التشكل مواتية لهجوم من قبل بالإلكترونات هذه الكواشف، بينما قاعدة الاقتران أو للإنشاء معمارياالنيوكليوتيدات ained أقل أو يتفاعل 10. تم الكشف عن مواقع تشكيل معقد إضافي عن طريق النسخ العكسي بدء الاشعال من fluorescently أو رديولبلد المهجنة إلى موقع معين على الحمض النووي الريبي المحورة (و&quot;(+)&quot; رد فعل الإرشاد التمهيدي). عندما يفشل الناسخ العكسي (RT) لاجتياز ribonucleotides acylated، ويتم إنتاج مجموعة من المنتجات [كدنا] الذي يتزامن مع مواقع من تعديل أطوال. A السيطرة &quot;(-)&quot; التمهيدي التمديد يتم تنفيذ رد فعل باستخدام الحمض النووي الريبي التي لم تتعرض للكاشف أيضا بحيث الإنهاء المبكر من توليف الحمض النووي (أي &quot;توقف&quot;) بسبب الحمض النووي الريبي هيكل، غير محدد RNA حبلا الكسر، وغيرها، قد. يمكن تمييزها عن التوقف التي تنتجها التعديل الكيميائي. وأخيرا، يتم استخدام اثنين من ردود الأفعال dideoxy التسلسل بدء من نفس الاشعال كعلامات لربط النيوكليوتيدات رد الفعل مع تسلسل الحمض النووي الريبي الأولية بعد الكهربائي. في التطبيق الأصلي من حالات العسر الشديدويستخدم E، وهو نفس نهاية 32 ف المسمى التمهيدي ل(+)، (-)، واثنين من التفاعلات التسلسل. يتم تحميل المنتجات من هذه التفاعلات إلى الآبار المجاورة في 5-8٪ هلام بولي أكريلاميد بلاطة، ومجزأة عن طريق تغيير طبيعة بولي أكريلاميد الكهربائي للهلام (PAGE؛ الشكل 1). التحليل الكمي من الصور هلام التي تنتجها SHAPE التقليدية يمكن القيام بها باستخدام SAFA، شبه الآلي برامج التحليل footprinting 13. في المقابل، شكل عالية الإنتاجية توظف الاشعال fluorescently المسمى والكهربائي الشعري الآلي. على وجه التحديد، لكل منطقة من الحمض النووي الريبي قيد التحقيق، مجموعة من أربعة الاشعال DNA وجود تسلسل مشتركة ولكن مختلفة 5 &#39;يجب توليفها تسميات الفلورسنت أو شراؤها. هذه أليغنوكليوتيد] بشكل مختلف المسمى تخدم لرئيس اثنين من ردود الفعل SHAPE واثنين من ردود الفعل التسلسل، والمنتجات التي يتم تجميع ومجزأة / الكشف عنها من قبل الكهربائي الشعري الآلي (CE). وهرEAS الملف الشخصى التفاعل من 100-150 NT من الحمض النووي الريبي يمكن الحصول عليها من مجموعة من أربعة تفاعلات باستخدام النهج الأصلي، وشكل عالية الإنتاجية يسمح قرار من 300-600 NT من واحدة عينة مجمعة 3. ما يصل إلى 8 مجموعات من ردود الفعل قد تكون مجزأة في وقت واحد، في حين يمكن للما يصل الى 96 عينات أعدت للتجزئة على مدى 12 أشواط متتالية CE (الشكل 2). وعلاوة على ذلك، فإن البرنامج SHAPEfinder، وضعت لمعالجة البيانات الناشئة من CEQ وتحليل وراثية أخرى وتحليلها، هو أكثر الآلي وتتطلب تدخل المستخدم أقل بكثير من SAFA 13 أو حزم هلام التحليل الأخرى. ظهرت منهجيات عالية الإنتاجية أكثر تقدما في الآونة الأخيرة مثل PARS (تحليل موازية للبنية الحمض النووي الريبي) 14 وفرج تسلسل (جزء التسلسل) 15، والتي تستخدم الإنزيمات بنية محددة بدلا من الكواشف الألكلة بالتزامن مع الجيل القادم التسلسل التقنيات للحصول على المعلومات!ن حول بنية الحمض النووي الريبي. وعلى الرغم من جاذبية هذه التقنيات، العديد من القيود الملازمة لنوكلياز التحقيق لا تزال 16. يمكن التحايل هذه المشاكل في التسلسل SHAPE (SHAPE تسلسل) 17 البروتوكول، حيث سبق التسلسل التالي جيل عن طريق التعديل الكيميائي والنسخ العكسي من الرنا بطريقة مماثلة لتلك التي يؤديها في الشكل التقليدي. في حين أن هذه الأساليب قد يمثلون مستقبل تحديد بنية الحمض النووي الريبي، من المهم أن نتذكر أن التسلسل التالي جيل مكلفة للغاية، ويبقى غير متاحة لكثير من المختبرات. تحليل بيانات الشكل يتم تقديم البيانات المنتجة في محلل الوراثية في شكل رحلاني، حيث كثافة مضان من العينة (ق) التي تتدفق من خلال كاشف الشعرية المرسومة ضد فهرس من وقت الهجرة. هذه المؤامرة تأخذ شكل آثار التداخل المقابلة لقناة مضان أربعةق المستخدمة للكشف عن fluorophores مختلفة، وحيث يتكون كل أثر للقمم المقابلة لمنتجات [كدنا] تسلسل أو الفردية. ويتم تصدير البيانات رحلاني من محلل الوراثية كملف نصي المفصول والمستوردة إلى التحول ShapeFinder وتحليل البرمجيات 18. يستخدم ShapeFinder في البداية لتنفيذ سلسلة من التحولات رياضية على البيانات لضمان أن أوقات الهجرة وأحجام الذروة تعكس بدقة الهويات وكميات من منتجات التفاعل، على التوالي. ثم يتم محاذاة قمم ومتكاملة، ونتائج جدولتها مع تسلسل الحمض النووي الريبي الأولية. يتم الحصول على &quot;لمحة تفاعل&quot; للجزء ذات الصلة من الحمض النووي الريبي من خلال طرح القيم التحكم من (+) القيم المرتبطة مع بعضها RNA النوكليوتيدات، وتطبيع البيانات كما هو موضح أدناه. يتم استيراد هذا الملف إلى RNAstructure (V5.3) البرامج 19،20، والذي يحول فال تفاعل تطبيعUES إلى القيود الزائفة الطاقة التي يتم دمجها في بنية الحمض النووي الريبي الثانوية خوارزمية قابلة للطي. الجمع بين المواد الكيميائية التحقيق وقابلة للطي الخوارزميات في هذه الطريقة بشكل كبير على تحسين دقة التنبؤ بنية مقارنة إما طريقة وحدها 12،21. إخراج RNAstructure (V5.3) يتضمن صورا لأقل الطاقة RNA الهياكل الثانوية مرمزة مع ملف SHAPE تفاعل (ق)، وكذلك نفس الهياكل في تدوين النصوص الدوت قوس. قد في وقت لاحق يتم تصديرها هذا الأخير إلى برامج مخصصة لعرض رسومية من بنية الحمض النووي الريبي الثانوية مثل فارنا 22 و 23 PseudoViewer. <img alt="الشكل 1" fo:content-width="4.8in" fo:src="/files/ftp_upload/50243/50243fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50243/50243fig1.jpg" /> الشكل 1. انسيابي من عزم هيكل الحمض النووي الريبي عبر SHAPE (4،10). (A) RNA ميمكن الحصول على AY من العينات البيولوجية أو بواسطة نسخ في المختبر. (B) اعتمادا على مصدر، يتم طي RNA أو محضرة بطريقة أخرى وتعديلها مع كاشف الشكل. (C) النسخ العكسي باستخدام بادئات fluorescently المسمى أو بالإشعاع. (D) منتجات كدنا] هي مجزأة إما عن طريق الكهربائي الشعري أو لوح المستندة إلى هلام. (E) تحليل شظية. (F) التنبؤ بنية الحمض النووي الريبي. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50243/50243fig1large.jpg" target="_blank">انقر هنا لعرض أكبر شخصية.</a> <img alt="الشكل 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50243/50243fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50243/50243fig2.jpg" /> الشكل 2. الطابع الإنتاجية العالية من الشكل القائم على CE يسمح تحليل سريع من الرنا متعددة، و / أو شرائح متعددة من نفس الحمض النووي الريبي. (A) </stرونغ&gt; يمثل كيف يمكن تقسيم على الحمض النووي الريبي إلى 300-600 أقسام NT (ونا مميزا باللون الأخضر والأزرق والأحمر) (B) يتم بحثها أقسام من الحمض النووي الريبي بشكل مستقل باستخدام مجموعات مختلفة من بادئات الفلورسنت (الأسهم السوداء) (C) مجموعة من يتم تجميع ردود الفعل وتحميلها في الآبار A1، B1، C1، الخ، على التوالي، وتوفير تغطية كاملة لل~ 3 KB RNA1. منتجات التفاعل من الرنا 2، 3، 4، وما إلى ذلك قد تكون مستعدة بالمثل لتجزيء في أشواط متتالية الكهربي. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50243/50243fig2large.jpg" target="_blank">انقر هنا لعرض أكبر شخصية.</a>

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-methylisatoic anhydride (NMIA)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>M25</td>
			<td>Dissolve in anhydrous DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-methyl-t-nitroisatoic anhydride (1M7)</td>
			<td>see ref. 22</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superscript III Reverse Transcriptase</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>18080044</td>
			<td>10,000 units</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo sequenase cycle sequencing kit</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>78500</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Materials provided by the user</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA of interest</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>6 pmol per reaction (the limit of detection will be determined by the instrument)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sets of four 5' labeled primers (Cy5, Cy5.5, WellRed D2 and WellRed D1/Licor IR800)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Primers are complementary to the RNA and are used in reverse transcription and sequencing reactions. The listed fluorophores are optimal for the Beckman Coulter 8000 CEQ. Primers may be purchased or synthesized in house.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA template</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>DNA is used for sequencing reactions, and must contain the sequence of the RNA being studied - including any 3'terminal extension, if present. Where applicable, it is often convenient to use the RNA transcription template.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x RNA renaturation buffer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>100 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 M KCl, 1 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X RNA folding buffer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>200 mM Tris-HCl pH 8.0, 25 mM MgCl2, 2.5 mM EDTA, 650 mM KCl. (This buffer might be changed depending on the case (e.g. pH, EDTA, Mg, RNase inhibitor)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5X RT mix</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>4 &mu;l 5X buffer, 1 &mu;l 100 mM DTT, 1.5 &mu;l water,1 &mu;l 10 mM dNTPs, 0.5 &mu;l SuperScript III. Note that the 5X buffer and 100 mM DTT are provided with purchase of SuperScript III (Invitrogen).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeLab Sample Loading Solution (Beckman Coulter)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Attention: Avoid multiple freeze-thaw cycles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary electrophoresis</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>CEQ8000</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>varies</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rna secondary structure prediction using high-throughput shape

فهم وظيفة الحمض النووي الريبي المشاركة في العمليات البيولوجية تتطلب معرفة وافية من بنية الحمض النووي الريبي. وتحقيقا لهذه الغاية، ومنهجية يطلق عليها اسم &quot;عالية الإنتاجية انتقائية 2 &#39;أسيلة الهيدروكسيل تحليلها من قبل التمديد التمهيدي&quot;، أو الشكل، يسمح التنبؤ من الحمض النووي الريبي هيكل الثانوي لقرار النوكليوتيدات واحد. هذا النهج يستخدم وكلاء التحقيق الكيميائية التي acylate تفضيلي المناطق الذين تقطعت بهم السبل أو مرنة واحدة من الحمض النووي الريبي في محلول مائي. تم الكشف عن مواقع التعديل الكيميائي بواسطة النسخ العكسي من الحمض النووي الريبي معدلة، والمنتجات من هذا التفاعل هي مجزأة من قبل الكهربائي الشعري الآلي (CE). منذ الناسخ العكسي مؤقتا في تلك النيوكليوتيدات RNA تعديلها من قبل الكواشف الشكل، مكتبة [كدنا] الناتجة خرائط غير مباشرة تلك ribonucleotides أن تقطعت بهم السبل واحدة في سياق RNA مطوية. باستخدام البرمجيات ShapeFinder، تتم معالجة electropherograms التي تنتجها الآلي CE وتحويلها إلى نوالجداول تفاعل cleotide التي يتم تحويلها إلى أنفسهم القيود الزائفة الطاقة المستخدمة في RNAStructure (V5.3) خوارزمية التنبؤ. وقد تم العثور على هياكل RNA ثنائي الأبعاد التي تم الحصول عليها من خلال الجمع بين SHAPE التحقيق مع الحمض النووي الريبي في سيليكون والتنبؤ هيكل ثانوي لتكون أكثر دقة من الهياكل التي تم الحصول عليها باستخدام أي من الطريقتين وحدها.

الحمض النووي الريبي التي تحتوي على فيروس نقص المناعة البشرية REV-1 عنصر استجابة (RRE) وأعدت 3 &#39;هيكل محطة راديو كاسيت 4 من البلازميد خطي من قبل في النسخ المختبر، وبعد ذلك كانت مطوية عن طريق التسخين والتبريد، والحضانة عند 37 درجة مئوية في وجود من MgCl 2. ت?...

Watch this Scientific Journal Video about RNA Secondary Structure Prediction Using High-throughput SHAPE at JoVE.com

RNA Secondary Structure Prediction Using High-throughput SHAPE

عالية الإنتاجية انتقائية 2 &#39;أسيلة الهيدروكسيل تحليلها من قبل التمديد التمهيدي (SHAPE) تستخدم مادة كيميائية رواية التحقيق التكنولوجيا، النسخ العكسي، الكهربائي الشعري والبرمجيات التنبؤ هيكل ثانوي لتحديد هياكل الرنا من عدة مئات إلى عدة آلاف من النيوكليوتيدات في قرار النوكليوتيدات واحد.

RNA تنبؤ هيكل الثانوية باستخدام الشكل عالي الإنتاجية

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed ...

rna-secondary-structure-prediction-using-high-throughput-shape

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Biology

Unit 1

Transcription: DNA to RNA

SCIENTISTS IN ACTION

31.2K Views.  Frederick National Laboratory for Cancer Research. عالية الإنتاجية انتقائية 2 'أسيلة الهيدروكسيل تحليلها من قبل التمديد التمهيدي (SHAPE) تستخدم مادة كيميائية رواية التحقيق التكنولوجيا، النسخ العكسي، الكهربائي الشعري والبرمجيات التنبؤ هيكل ثانوي لتحديد هياكل الرنا من عدة مئات إلى عدة آلاف من النيوكليوتيدات في ?...

Video: RNA Secondary Structure Prediction Using High-throughput SHAPE

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, including those with direct relevance to human disease. Because of its short generation time and well-characterized genome, a major experimental advantage of the yeast model system is the ability to perform genetic screens to identify genes and pathways that are involved in a given process. Over the last thirty years such genetic screens have been used to elucidate the cell cycle, secretory pathway, and many more highly conserved aspects of eukaryotic cell biology 1-5. In the last few years, several genomewide libraries of yeast strains and plasmids have been generated 6-10. These collections now allow for the systematic interrogation of gene function using gain- and loss-of-function approaches 11-16. Here we provide a detailed protocol for the use of a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot to perform a plasmid overexpression screen, using an arrayed library of 5,500 yeast plasmids. We have been using these screens to identify genetic modifiers of toxicity associated with the accumulation of aggregation-prone human neurodegenerative disease proteins. The methods presented here are readily adaptable to the study of other cellular phenotypes of interest.

Here we describe a plasmid overexpression screen in Saccharomyces cerevisiae, using an arrayed plasmid library and a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot.

شاشة عالية الإنتاجية الخميرة Overexpression البلازميد

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

A Protocol for Computer-Based Protein Structure and Function Prediction

Genome sequencing projects have ciphered millions of protein sequence, which require knowledge of their structure and function to improve the understanding of their biological role. Although experimental methods can provide detailed information for a small fraction of these proteins, computational modeling is needed for the majority of protein molecules which are experimentally uncharacterized. The I-TASSER server is an on-line workbench for high-resolution modeling of protein structure and function. Given a protein sequence, a typical output from the I-TASSER server includes secondary structure prediction, predicted solvent accessibility of each residue, homologous template proteins detected by threading and structure alignments, up to five full-length tertiary structural models, and structure-based functional annotations for enzyme classification, Gene Ontology terms and protein-ligand binding sites. All the predictions are tagged with a confidence score which tells how accurate the predictions are without knowing the experimental data. To facilitate the special requests of end users, the server provides channels to accept user-specified inter-residue distance and contact maps to interactively change the I-TASSER modeling; it also allows users to specify any proteins as template, or to exclude any template proteins during the structure assembly simulations. The structural information could be collected by the users based on experimental evidences or biological insights with the purpose of improving the quality of I-TASSER predictions. The server was evaluated as the best programs for protein structure and function predictions in the recent community-wide CASP experiments. There are currently &gt;20,000 registered scientists from over 100 countries who are using the on-line I-TASSER server.

Guidelines for computer based structural and functional characterization of protein using the I-TASSER pipeline is described. Starting from query protein sequence, 3D models are generated using multiple threading alignments and iterative structural assembly simulations. Functional inferences are thereafter drawn based on matches to proteins with known structure and functions.

بروتوكول لبنية البروتين القائم على الحاسوب والتنبؤات وظيفة

Genome sequencing projects have ciphered millions of protein sequence, which require knowledge of their structure and function to improve the ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

الإنتاجية العالية للبروتينات غشاء البلورة باستخدام أسلوب Bicelle Lipidic

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place over the next 5 years. For example, the sequencing of the genomes for 15 malaria mosquitospecies is currently being done using an Illumina platform3,4. This Anopheles species cluster includes both vectors and non-vectors of malaria. When the genome assemblies become available, researchers will have the unique opportunity to perform comparative analysis for inferring evolutionary changes relevant to vector ability. However, it has proven difficult to use next-generation sequencing reads to generate high-quality de novo genome assemblies5. Moreover, the existing genome assemblies for Anopheles gambiae, although obtained using the Sanger method, are gapped or fragmented4,6.
Success of comparative genomic analyses will be limited if researchers deal with numerous sequencing contigs, rather than with chromosome-based genome assemblies. Fragmented, unmapped sequences create problems for genomic analyses because: (i) unidentified gaps cause incorrect or incomplete annotation of genomic sequences; (ii) unmapped sequences lead to confusion between paralogous genes and genes from different haplotypes; and (iii) the lack of chromosome assignment and orientation of the sequencing contigs does not allow for reconstructing rearrangement phylogeny and studying chromosome evolution. Developing high-resolution physical maps for species with newly sequenced genomes is a timely and cost-effective investment that will facilitate genome annotation, evolutionary analysis, and re-sequencing of individual genomes from natural populations7,8.
Here, we present innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization (FISH), and imaging that facilitate rapid development of physical maps. Using An. gambiae as an example, we demonstrate that the development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies and, thus, the quality of genomic analyses. First, we use a high-pressure method to prepare polytene chromosome spreads. This method, originally developed for Drosophila9, allows the user to visualize more details on chromosomes than the regular squashing technique10. Second, a fully automated, front-end system for FISH is used for high-throughput physical genome mapping. The automated slide staining system runs multiple assays simultaneously and dramatically reduces hands-on time11. Third, an automatic fluorescent imaging system, which includes a motorized slide stage, automatically scans and photographs labeled chromosomes after FISH12. This system is especially useful for identifying and visualizing multiple chromosomal plates on the same slide. In addition, the scanning process captures a more uniform FISH result. Overall, the automated high-throughput physical mapping protocol is more efficient than a standard manual protocol.

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Genome assemblies based on massively parallel DNA sequencing technologies are usually highly fragmented. The development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies. Here, we demonstrate innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization, and imaging that significantly increase throughput of the physical map development.

الإنتاجية العالية لرسم الخرائط المادية للالكروموسومات باستخدام الآلي<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with Parkinson&#39;s disease. 293T cells are transiently transfected with plasmids from an arrayed ORF expression library, together with luciferase reporter plasmids, in a one-gene-per-well microplate format. Firefly luciferase activity is assayed after 48 hr to determine the effects of each library gene upon alpha-synuclein transcription, normalized to expression from an internal control construct (a hCMV promoter directing Renilla luciferase). This protocol is facilitated by a bench-top robot enclosed in a biosafety cabinet, which performs aseptic liquid handling in 96-well format. Our automated transfection protocol is readily adaptable to high-throughput lentiviral library production or other functional screening protocols requiring triple-transfections of large numbers of unique library plasmids in conjunction with a common set of helper plasmids. We also present an inexpensive and validated alternative to commercially-available, dual luciferase reagents which employs PTC124, EDTA, and pyrophosphate to suppress firefly luciferase activity prior to measurement of Renilla luciferase. Using these methods, we screened 7,670 human genes and identified 68 regulators of alpha-synuclein. This protocol is easily modifiable to target other genes of interest.

We present a rapid and inexpensive screening method for identifying transcriptional regulators using high-throughput robotic transfections and a homemade dual-glow luciferase assay. This protocol rapidly generates direct side-by-side functional data for thousands of genes and is easily modifiable to target any gene of interest.

الإنتاجية العالية فحص وظيفية باستخدام محلية الصنع ثنائي توهج luciferase الفحص

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology due to their considerable degree of genetic conservation with humans. Chemical genetics entails testing the effect that small molecules have on a biological process and is becoming a popular translational research method to identify therapeutic compounds. Zebrafish are specifically appealing to use for chemical genetics because of their ability to produce large clutches of transparent embryos, which are externally fertilized. Furthermore, zebrafish embryos can be easily drug treated by the simple addition of a compound to the embryo media. Using whole-mount in situ hybridization (WISH), mRNA expression can be clearly visualized within zebrafish embryos. Together, using chemical genetics and WISH, the zebrafish becomes a potent whole organism context in which to determine the cellular and physiological effects of small molecules. Innovative advances have been made in technologies that utilize machine-based screening procedures, however for many labs such options are not accessible or remain cost-prohibitive. The protocol described here explains how to execute a manual high-throughput chemical genetic screen that requires basic resources and can be accomplished by a single individual or small team in an efficient period of time. Thus, this protocol provides a feasible strategy that can be implemented by research groups to perform chemical genetics in zebrafish, which can be useful for gaining fundamental insights into developmental processes, disease mechanisms, and to identify novel compounds and signaling pathways that have medically relevant applications.

The zebrafish is an excellent experimental organism to study vertebrate developmental processes and model human disease. Here, we describe a protocol on how to perform a manual high-throughput chemical screen in zebrafish embryos with a whole-mount in situ hybridization (WISH) read-out.

دليل جزيء صغير شاشة تقترب عالية الإنتاجية عن طريق الزرد الأجنة

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology ...

Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide resolution. This technique captures miRNAs by attaching 3&#8217; and 5&#8217; oligonucleotide adapters to miRNA molecules and allows de novo miRNA discovery. Coupling with powerful next-generation sequencing platforms, miR-Seq has been instrumental in the study of miRNA biology. However, significant biases introduced by oligonucleotide ligation steps have prevented miR-Seq from being employed as an accurate quantitation tool. Previous studies demonstrate that biases in current miR-Seq methods often lead to inaccurate miRNA quantification with errors up to 1,000-fold for some miRNAs1,2. To resolve these biases imparted by RNA ligation, we have developed a small RNA ligation method that results in ligation efficiencies of over 95% for both 3&#8217; and 5&#8242; ligation steps. Benchmarking this improved library construction method using equimolar or differentially mixed synthetic miRNAs, consistently yields reads numbers with less than two-fold deviation from the expected value. Furthermore, this high-efficiency miR-Seq method permits accurate genome-wide miRNA profiling from in vivo total RNA samples2.

MicroRNAs (miRNAs) are a widely conserved class of regulatory molecules. Here we describe a miRNA cloning method that relies upon two potent ligation steps followed by high-throughput sequencing. Our method permits accurate genome-wide quantitation of miRNAs.

ربط ذات كفاءة عالية من الحمض النووي الريبي الجزيئات الصغيرة لالرنا الميكروي الكميات من قبل التسلسل الإنتاجية العالية

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

الإنتاجية العالية للكشف عن المغيرون الكيميائية من الجينات المشاركة ما بعد transcriptionally الخاضعة للرقابة

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an array of hundreds of queried 3&#8217;UTRs. Target identification is based on the dual-luciferase assay, which detects binding at the mRNA level by measuring translational output, giving a functional readout of miRNA targeting. 3&#8217;LIFE uses non-proprietary buffers and reagents, and publically available reporter libraries, making genome-wide screens feasible and cost-effective. 3&#8217;LIFE can be performed either in a standard lab setting or scaled up using liquid handling robots and other high-throughput instrumentation. We illustrate the approach using a dataset of human 3&#8217;UTRs cloned in 96-well plates, and two test miRNAs, let-7c and miR-10b. We demonstrate how to perform DNA preparation, transfection, cell culture and luciferase assays in 96-well format, and provide tools for data analysis. In conclusion 3&#39;LIFE is highly reproducible, rapid, systematic, and identifies high confidence targets.

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3&#039;LIFE Assay

Luminescent identification of functional elements in 3&#8217; untranslated regions (3&#8217;UTRs) (3&#8217;LIFE) is a technique to identify functional regulation in 3&#8217;UTRs by miRNAs or other regulatory factors. This protocol utilizes high-throughput methodology such as 96-well transfection and luciferase assays to screen hundreds of putative interactions for functional repression.

الكشف عن أهداف ميرنا في إنتاجية عالية باستخدام الفحص 3&#39;LIFE

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

تحديد أزواج كيناز الركيزة عن طريق فحص إنتاجية عالية


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...