نشكر جون دارغا من MGH الحمض النووي الأساسية لإعداد مكتبة فحص الحمض النووي. قدم كريستوفر Chigas من بيركن إلمر دعما لا يقدر بثمن لدينا Wallac 1420 luminometer. قدم ستيفن Ciacco ومارتن Thomae من اجيلنت الدعم للروبوت برافو. نشكر رون جونسون وستيف تيتوس في المعاهد الوطنية للصحة لتوفير بسخاء المزدوج توهج بروتوكول luciferase الفحص الخاصة بهم.

لمحة عامة التجريبية، انظر الشكل 1. 1. إعداد البلازميدات مراسل احتواء ألفا Synuclein المروج العناصر التنظيمية للجين ألفا synuclein (الشكل 2) تمتد ما يقرب من 10 كيلو بايت، من المنبع NACP (غير مكون بيتا اميلويد الببتيد) ثنائي النوكليوتيد تكرار تسلسل 1،2 خلال إنترون 2 3. نحن تشمل جزء من هذه المنطقة في لدينا بناء المراسل. وجدنا أن البلازميدات تحتوي على إنترون 2 الإجراءات الخاصة المطلوبة للنمو، كما هو مبين أدناه. البلازميدات luciferase المراسل، pGL4.10 وpGL4.75 (الشكل 3)، تتوفر تجاريا من PROMEGA ويمكن نشر باستخدام بروتوكولات البيولوجيا الجزيئية التقليدية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تضخيم المكونات 2 من المروج ألفا synuclein في تقارير إتمام المشروعات منفصلة باستخدام وصفة في الجدول 1 والاشعال في الجدول 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> VERIمنتجات السنة المالية PCR على agarose هلام ونظيفة باستخدام طقم تنقية Qiaquick PCR (في Qiagen)، يبلغ حجمه في 50 ميكرولتر من الشركة المصرية للاتصالات (تريس، EDTA). تخزين مزال 0.9 كيلو بايت شظية في -20 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هضم وحدة التخزين بالكامل من 3.4 كيلو بايت PCR جزء، فضلا عن 5 ميكروغرام من pGL4.10، مع SACI وXhoI. علاج ناقلات مع العجل الأمعاء الفوسفاتيز القلوية (روش) وهلام تنقية باستخدام عدة خيارات PureLink جل استخراج (إينفيتروجن). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Ligate جزء وناقلات باستخدام T4 يغاز الحمض النووي (نب). تنظيف تفاعل الانتهاء باستخدام عدة PureLink PCR مايكرو (إينفيتروجن)، يبلغ حجمه في 10 ميكرولتر TE العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل 2 ميكرولتر من تنظيفها، رد فعل ربط في 20 ميكرولتر من الخلايا المختصة ElectroMAX Stbl4 (إينفيتروجن) وelectroporate وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. هزة في 30 درجة مئوية حاضنة في 225 دورة في الدقيقة لمدة 90 دقيقة. 2 نشر وحدات التخزين على لوحات LB تحتوي على 100 ملغ / مل الأمبيسلين واحتضان عند 30 درجة مئوية لمدة 2 ايام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام المسواك، حدد 4-6 مستعمرات صغيرة للتلقيح في 2 مل من السل (رائع مرق). تنمو هذه الثقافات miniprep في 30 ° C شاكر O / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنقية DNA البلازميد من 1.5 مل من كل ثقافة miniprep استخدام عدة PureLink HiPure البلازميد Miniprep (إينفيتروجن). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هضم minipreps مع BamHI وelectrophorese على agarose هلام. استنساخ الصحيح ينبغي أن تنتج شظايا من 2.8 كيلو بايت و 4.9 كيلو بايت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Restreak ثقافة miniprep المتبقية من استنساخ الصحيحة على LB (لوريا مرق) لوحة جديدة وتنمو عند 30 درجة مئوية لمدة 2 ايام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد مستعمرة صغيرة وتطعيم ثقافة كاتب السل 1.5 مل. يهز O / N عند 30 درجة مئوية. لا تدع الثقافة بداية تنمو إلى التشبع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع الثقافة بداية بأكمله إلى 150 مل من prewarmed السل ويهز عند 30 درجة مئوية لمدة 2 ايام. قبل الانتقال إلى الخطوة التالية، استخدم 1.5 مل من هذه الثقافة لminiprep إضافية والهضم للتأكد من أن استنساخ لم يتحور خلال replicati<html> على. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنقية DNA البلازميد من ثقافة المتبقية باستخدام عدة PureLink HiPure البلازميد Maxiprep (إينفيتروجن). العوائد المتوقعة من هذا البلازميد وسيطة هي 50-150 ميكروغرام لكل 150 مل من الثقافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد جزء 0.9 كيلوبايت المجمدة في الخطوة 1.2. كرر الخطوات 1،3-1،12 لاستنساخ جزء 0.9 كيلو بايت في البلازميد وسيطة، وهضم بدلا من ذلك مع KpnI وSACI. Ligate، تحويل، حدد، وتنمو لmaxipreps على النحو الوارد أعلاه. الهضم مع BamHI ينبغي أن تسفر شظايا من 5.8 كيلو بايت و 2.8 كيلو بايت. هذا هو البلازميد التي سيتم استخدامها للشاشة. </li></ol> 2. إعداد خلايا 293T، مراسل البلازميدات، ومكتبة الحمض النووي لفحص هي المصنفة الخلايا 293T لأول مرة في لوحات 96 جيدا وtransfected في اليوم التالي. مخففة البلازميدات مراسل والسلطات الوطنية المعينة في لوحات 96 مكتبة جيدا. حصلنا على لوحات من الحمض النووي مكتبة ترنسفكأيشن الصف من كور الحمض النووي في مستشفى ماساتشوستس العام (الحصول = &quot;_blank&quot;&gt; dnacore.mgh.harvard.edu). هذا البروتوكول transfects لوحة مكتبة واحدة في لوحات 2 متطابقة من الخلايا 293T (الشكل 1)، وينبغي بالتالي المصنف 2 لوحات خلايا لكل لوحة المكتبة ليتم عرضه. ملاحظة: تنمو الخلايا في وسائل الإعلام دون الحمراء الفينول أو المضادات الحيوية، وهذه تتداخل مع المقايسات luciferase المراسل وزيادة سمية خلال ترنسفكأيشن، على التوالي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل لوحة المكتبة ليتم عرضه، الخلايا resuspend 293T trypsinized إلى تركيز 1.5 × 10 5 خلية / مل في DMEM تحتوي على 14٪ FBS. تصب في خزان معقم (Axygen). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الخزان، 2 القاع واضحة، لوحات 96 جيدا (كورنينج)، وعلبة من نصائح مرشح الماصة (اجيلنت) على سطح الروبوت. الاستغناء 100 ميكرولتر من الخلايا في كل بئر من كل من لوحات، لكثافة 1.5 × 10 4 خلايا لكل بئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لوحات الخلايا في 50 x ج لمدة 2 دقيقة، وذلك باستخدام سرعات منخفضة منحدر لضمان المساواةكثافة الخلية طوال كل بئر. احتضان عند 37 درجة مئوية و 10٪ CO 2 O / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع اليراع وRenilla البلازميدات مراسل ل5 نانوغرام / ميكرولتر في وسائل الإعلام خالية من المصل. الجمع بين التخفيفات في نسبة 05:03 اليراع لRenilla البلازميد (من حيث الحجم) في أنبوب 15 مل المخروطية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الماصة البلازميدات جنبا إلى جنب في كل بئر من لوحة 96 جيدا، والاستغناء 17 ميكرولتر لكل لوحة المكتبة، بالإضافة إلى 2-10 ميكرولتر الزائدة، في كل بئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول ترنسفكأيشن الصف الحمض النووي لوحات المكتبة على النحو الوارد أعلاه وتضعف إلى 13.3 نانوغرام / ميكرولتر مع المياه خالية من الذيفان الداخلي. وينبغي أن يكون الحد الأدنى لحجم 28 ميكرولتر لكل بئر. </li></ol> 3. تنفيذ Transfections في يوم 2 من الشاشة، و transfected البلازميدات مراسل والسلطات الوطنية المعينة مكتبة في الخلايا 293T. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل لوحة المكتبة، مزيج 107.5 ميكرولتر من RT Optifect (إينفيتروجن) مع 4.3 مل سائل الإعلام الحرة المصل (1:40 تمييع) في أنبوب البوليسترين. احتضان لمدة 5 دقائق على RT، ون تستغني 44 ميكرولتر (لكل لوحة المكتبة) في كل بئر من لوحة 96 جيدا، القاع V-البوليسترين (غرينر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع لوحة من المخفف Optifect، البلازميدات مراسل (الخطوة 2.5)، السلطات الوطنية المعينة مكتبة (الخطوة 2.6)، وعلبة من نصائح الماصة على سطح الروبوت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح 17 ميكرولتر من البلازميدات مراسل، 43 ميكرولتر من المخفف Optifect، و 26 ميكرولتر من الحمض النووي مكتبة، وإدراج فجوة الهواء 5 ميكرولتر بين كل الطموح. يجب أن يستنشق الحمض النووي مكتبة الماضي لمنع انتقال التلوث. الاستغناء محتويات نصائح في لوحة جديدة-V القاع البوليسترين، وخلط، والغطاء، ويترك جانبا لمدة 20 دقيقة للسماح للمجمعات الدهون / الحمض النووي لتشكيل. إذا transfecting لوحات المكتبة متعددة، استبدال نصائح الماصة ولوحة المكتبة، وتكرار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كشف وحة خليط Optifect / الحمض النووي ووضعه على سطح السفينة الروبوت مع 2 لوحات من الخلايا 293T. باستخدام مربع واحد من نصائح الماصة، نضح 80 ميكرولتر من Optifect: خليط الحمض النووي والاستغناء ببطء 40 ميكرولتر على كل لوحة من الخلايا. إذا العابرةfecting لوحات المكتبة متعددة، كرر لجميع Optifect: لوحات الحمض النووي. تغطية الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لوحات الخلية في 1،200 x ج لمدة 30 دقيقة. تغطية والعودة إلى الحاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا لمدة 4-6 ساعة. خلال هذه الحضانة، وإعداد وسائل الإعلام الجديدة عن طريق خلط 12 مل DMEM تحتوي على 10٪ FBS و 10 ميكروغرام / مل سيبروفلوكساسين (CellGro) لكل لوحة مكتبة transfected. صب سائل الإعلام الجديدة في خزان العقيمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 وضع صناديق من نصائح الروبوت، لوحة واحدة من الخلايا، الخزان تحتوي على وسائل الإعلام الجديدة، وخزان النفايات على سطح السفينة الروبوت. نضح 100 ميكرولتر من وسائل الإعلام من الخلايا والاستغناء في خزان النفايات تملأ جزئيا مع الايثانول 70٪. نصائح باستخدام الطازجة، نضح 100 ميكرولتر من وسائل الإعلام الجديدة والاستغناء ببطء على الخلايا. أكرر للجميع لوحات من الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العودة إلى لوحات الحاضنة لمدة 48 ساعة. </li></ol> 4. تنفيذ ثنائي luciferase المراسل فحوصات في يوم 4 من الشاشة، ويتم تنفيذ اليراع وRenilla المقايسات luciferase المراسل. ملاحظة: الفحص المزدوج luciferase المراسل يتطلب إضافة متتابعة من 2 مخازن الفحص، 3X العازلة مقايسة اليراع و3X Renilla العازلة الفحص، كما هو موضح في الجدول رقم 3 لا تفرز اليراع وRenilla luciferases، وبالتالي يجب أن تكون هي lysed الخلايا قبل قياس luciferase النشاط. . يراعة العازلة مقايسة lyses الخلايا ويوفر الركيزة ليراعة luciferase؛ Renilla العازلة مقايسة يروي إشارة اليراع ويوفر الركيزة لluciferase المراسل Renilla. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل لوحة المكتبة، وإعداد 8 مل من العازلة 3X فحص يراعة من الحلول الأوراق المالية كما هو موضح في الجدول رقم 3، والاستغناء عن 82 ميكرولتر في كل بئر من لوحة 96-V القاع جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل لوحة المكتبة، وأيضا إعداد 12 مل من العازلة 3X Renilla الفحص والاستغناء 122 ميكرولتر في كل بئر من لوحة 96-V القاع جيدا. جانبا كل منيراعة وRenilla مخازن الفحص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع مربع من نصائح الماصة، وخزان النفايات، و 2 لوحات من الخلايا (transfected من نفس لوحة المكتبة) على سطح الروبوت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح 60 ميكرولتر من وسائل الإعلام من كل لوحة وتجاهل في خزان النفايات تملأ جزئيا مع الايثانول 70٪. بطانات وتوضع جانبا. إذا transfecting لوحات المكتبة متعددة، كرر لجميع مجموعات من لوحات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 وضع صناديق من نصائح الماصة، لوحة من 3X العازلة مقايسة اليراع، ومجموعة من لوحات خلايا على سطح الروبوت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح 40 ميكرولتر من العازلة 3X فحص اليراع وإضافته إلى لوحة الأولى من الخلايا، والخلط جيدا. التحول إلى نصائح الماصة جديدة، كرر لوحة الخلية الثانية. وضع الخلايا في RT لمدة 10 دقيقة لاستكمال تحلل. إذا transfecting لوحات المكتبة متعددة، استبدال صناديق من النصائح وألواح الخلايا، وتكرار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سجل التلألؤ من كل بئر من كل لوحة الخلية على luminometer، وتسجيل ل1 ثانية لكل بئر. العودة وحات للروبوتسطح السفينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 وضع صناديق من نصائح الماصة، لوحة من 3X Renilla العازلة الفحص، ومجموعة من لوحات خلايا على سطح الروبوت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح 60 ميكرولتر من العازلة 3X Renilla الفحص، وإضافته إلى لوحة الأولى من الخلايا، والخلط جيدا. التبديل إلى مربع جديد من نصائح الماصة، كرر لوحة الخلية الثانية. إذا transfecting لوحات المكتبة متعددة، كرر لجميع مجموعات من لوحات الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سجل التألق من جميع لوحات على luminometer، وتسجيل كل بئر لمدة 1 ثانية على النحو الوارد أعلاه. تجاهل لوحات. </li></ol> 5. تحليل البيانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب يراعة: نسبة Renilla التلألؤ (&quot;F: نسبة R&quot;) لكل بئر بقسمة تهم إشارة يراعة من تهم إشارة Renilla. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب قيمة تحريض بقسمة F: نسبة R من كل بئر على المتوسط ​​F: نسبة R من لوحة، باستثناء أعلى وأدنى 25٪ من الآبار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> متوسط ​​القيم تحريض عبر مكرراتلوحة واحدة مكتبة transfected. تعتبر الجينات المحفزة أو قمع ألفا synuclein أكثر من ثلاثة أضعاف &quot;يضرب&quot; في هذه الشاشة وتخضع لمزيد من التحقق من صحة وشاشات الثانوي. </li></ol>

<ol>
	<li>Chiba-Falek, O., Nussbaum, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+allelic+variation+at+the+NACP-Rep1+repeat+upstream+of+the+&#945;-synuclein+gene+(SNCA)+on+transcription+in+a+cell+culture+luciferase+reporter+system.">Effect of allelic variation at the NACP-Rep1 repeat upstream of the &#945;-synuclein gene (SNCA) on transcription in a cell culture luciferase reporter system.</a> Hum. Mol. Genet. 10 (26), 3101-3109 (2001).</li><li>Chiba-Falek, O., Touchman, J. W., Nussbaum, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+intra-allelic+variation+at+NACP-Rep1+in+the+alpha-synuclein+gene.">Functional analysis of intra-allelic variation at NACP-Rep1 in the alpha-synuclein gene.</a> 113 (5), 426-431 (2003).</li><li>Scherzer, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GATA+transcription+factors+directly+regulate+the+Parkinson's+disease-linked+gene+&#945;-synuclein.">GATA transcription factors directly regulate the Parkinson's disease-linked gene &#945;-synuclein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (31), 10907-10912 (2008).</li><li>Spillantini, M. G., Schmidt, M. L., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q., Jakes, R., Goedert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;-Synuclein+in+Lewy+Bodies.">&#945;-Synuclein in Lewy Bodies.</a> Nature. 388 (6645), 839-840 (1997).</li><li>Pankratz, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meta-analysis+of+Parkinson's+disease:+identification+of+a+novel+locus,+RIT2.">Meta-analysis of Parkinson's disease: identification of a novel locus, RIT2.</a> Ann. Neurol. 71 (3), 370-384 (2012).</li><li>Satake, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+association+study+identifies+common+variants+at+four+loci+as+genetic+risk+factors+for+Parkinson's+disease.">Genome-wide association study identifies common variants at four loci as genetic risk factors for Parkinson's disease.</a> Nat. Genet. 41 (12), 1303-1307 (2009).</li><li>Sim&#243;n-S&#225;nchez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+association+study+reveals+genetic+risk+underlying+Parkinson's+disease.">Genome-wide association study reveals genetic risk underlying Parkinson's disease.</a> Nat. Genet. 41 (12), 1308-1312 (2009).</li><li>Polymeropoulos, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+in+the+alpha-synuclein+gene+identified+in+families+with+Parkinson's+disease.">Mutation in the alpha-synuclein gene identified in families with Parkinson's disease.</a> Science. 276 (5321), 2045-2047 (1997).</li><li>Ib&#225;&#241;ez, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causal+relationship+between+a-synuclein+gene+duplication+and+familial+Parkinson's+disease.">Causal relationship between a-synuclein gene duplication and familial Parkinson's disease.</a> Lancet. 364 (9440), 1169-1171 (2004).</li><li>Chartier-Harlin, M. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a-Synuclein+locus+duplication+as+a+cause+of+familial+Parkinson's+disease.">a-Synuclein locus duplication as a cause of familial Parkinson's disease.</a> Lancet. 364 (9440), 1167-1169 (2004).</li><li>Singleton, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a-Synuclein+locus+triplication+causes+Parkinson's+disease.">a-Synuclein locus triplication causes Parkinson's disease.</a> Science. 302 (5646), 841 (2003).</li><li>Ahn, T. -. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a-Synuclein+gene+duplication+is+present+in+sporadic+Parkinson+disease.">a-Synuclein gene duplication is present in sporadic Parkinson disease.</a> Neurology. 70 (1), 43-49 (2008).</li><li>Boyce, F. M., Bucher, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus-mediated+gene+transfer+into+mammalian+cells.">Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells.</a> Proc. Nat. Acad. USA. 93 (6), 2348-2352 (1996).</li><li>Montigny, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parameters+influencing+high-efficiency+transfection+of+bacterial+artificial+chromosomes+into+cultured+mammalian+cells.">Parameters influencing high-efficiency transfection of bacterial artificial chromosomes into cultured mammalian cells.</a> Biotechniques. 35, 796-807 (2003).</li><li>Gorman, C. M., Moffat, L. F., Howard, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+genomes+which+express+chloramphenicol+acetyltransferase+in+mammalian+cells.">Recombinant genomes which express chloramphenicol acetyltransferase in mammalian cells.</a> Mol. Cell. Biol. 2 (9), 1044-1051 (1982).</li><li>Li, J. J., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+ORC6,+a+Component+of+the+Yeast+Origin+Recognition+Complex+by+a+One-Hybrid+System.">Isolation of ORC6, a Component of the Yeast Origin Recognition Complex by a One-Hybrid System.</a> Science. 262, 1870-1874 (1993).</li><li>Dejardin, J., Kingston, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Proteins+Associated+with+Specific+Genomic+Loci.">Purification of Proteins Associated with Specific Genomic Loci.</a> Cell. 136, 175-186 (2009).</li><li>Shen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+map+of+the+cis-regulatory+sequences+in+the+mouseGenome.">A map of the cis-regulatory sequences in the mouseGenome.</a> Nature. 488, 116-120 (2012).</li><li>Fan, F., Wood, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescent+assays+for+high-throughput+screening.">Bioluminescent assays for high-throughput screening.</a> Assay Drug Dev. Technol. 5 (1), 127-136 (2007).</li><li>Hampf, M., Gossen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+combined+Photinus+and+Renilla+luciferase+quantification+compatible+with+protein+assays.">A protocol for combined Photinus and Renilla luciferase quantification compatible with protein assays.</a> Anal. Biochem. 356 (1), 94-99 (2006).</li><li>Auld, D. S., Thorne, N., Maguire, W. F., Inglese, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+PTC124+activity+in+cell-based+luciferase+assays+of+nonsense+codon+suppression.">Mechanism of PTC124 activity in cell-based luciferase assays of nonsense codon suppression.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106 (9), 3585-3590 (2009).</li><li>Pearlberg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screens+using+RNAi+and+cDNA+expression+as+surrogates+for+genetics+in+mammalian+tissue+culture+cells.">Screens using RNAi and cDNA expression as surrogates for genetics in mammalian tissue culture cells.</a> Cold Spring Harb.Symp. Quant. Biol. 70, 449-459 (2005).</li></ol>

وأيد هذا العمل من قبل الإتاوات التي حصل عليها BacMamreagents الترخيص (براءة اختراع أمريكية 5731182).

وقد تورط ألفا synuclein في مرض باركنسون (PD) كمكون من الهيئات ليوي 4، الادراج داخل الخلايا تعتبر اصم لهذا المرض. وربطت العديد من الدراسات رابطة الجينوم على نطاق تعدد الأشكال النوكليوتيدات واحد في ألفا synuclein مع خطر متزايد لالمتفرقة PD 5،6،7. على الرغم من أن أقل شيوع?...

القدرة على تحديد العناصر التنظيمية الوراثية الرئيسية والعوامل التي تعمل عليها أمر أساسي لاستكشاف العديد من العمليات البيولوجية. ومع ذلك، وتحديد العوامل التي تنظم التعبير عن الجينات في أنواع الخلايا نادرة، مثل السكان العصبية محددة، يمكن أن يكون تحديا. هنا، نقدم بروتوكول لتحديد المنظمين النسخي رواية ألفا synuclein (SNCA)، جين يرتبط مرض باركنسون وأعرب في الخلايا العصبية الدوبامين في substantianigra بارس المنطقة المكتنزة من الدماغ المتوسط. علينا أن ننجز هذا باستخدام عالية الإنتاجية، ثنائي luciferase المراسل، في المختبر شاشة مراسل لتفكيك ألفا synuclein التعبير في الخلايا 293T. يتم استنساخ المروج ألفا synuclein لأول مرة في البلازميد مراسل تحتوي على الجين يراعة luciferase. A البلازميد المتاحة تجاريا تحتوي على luciferase المراسل Renilla تحت سيطرة المروج النشط جوهري بمثابة الرقابة الداخلية. تساويبني مراسل ه شارك transfected-293T إلى خلايا في microplates مع البلازميدات من مكتبة الحمض النووي التعبير، مثل أن كل بئر يتم transfected مع البلازميد مكتبة واحدة. بعد 48 ساعة يتم قياس، luciferase النشاط لكل مراسل بالتتابع باستخدام الفحص المزدوج توهج. يستدل التعبير النسبية ألفا synuclein ردا على كل الجينات المكتبة عن طريق نسبة من يراعة: Renilla luciferase النشاط في كل بئر (F: نسبة R) بعد التطبيع القائم على طبق من ذهب. يوفر هذا البروتوكول القدرة على فحص عدد كبير من الجينات (~ 2،500 في الأسبوع) لقدرتها على transactivate الجين مراسل باستخدام الحد الأدنى من القوة العاملة (1-2 أشخاص) والحد الأدنى من التكلفة (حوالي 3 دولار تكلفة كاشف لكل صفيحة ميكروسكوبية مقايسة). المنظمين النسخي الجينات العصبية (على سبيل المثال، ألفا synuclein)، والتي هي صعبة للدراسة في الخلايا العصبية مثقف الحرارية للتلاعب الجيني، يمكن مقارنة جنبا إلى جنب في هذا الاختبار وظيفية مباشرة. ندرج في منطقتنابروتوكول طريقة مفصلة لالاستنساخ ونمو البلازميدات تحتوي على مروج ألفا synuclein، منذ وجدنا أن البلازميدات تحتوي على هذه المنطقة غير مستقرة عندما نمت مع الإجراءات التقليدية (انظر المناقشة). نحن تشمل أيضا بديل غير مكلفة لمتاحة تجاريا الكواشف المزدوجة luciferase المراسل لفحوصات عالية الإنتاجية. هذا البروتوكول يمكن تكييفها بسهولة لاستهداف العناصر التنظيمية الأخرى ذات الاهتمام، أو إلى أي عملية تتطلب الإنتاجية العالية transfections عابرة.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Material</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>QIAQuick PCR Purification Kit</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>28106</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PureLink Quick Gel Extraction Kit</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>K2100-12</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PureLink PCR Micro Kit</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>K310250</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PureLinkHiPure Plasmid Miniprep Kit</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>K2100-03</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PureLinkHiPure Plasmid Maxiprep Kit</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>K2100-07</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bravo Robot</td>
 <td>Agilent</td>
 <td>-</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Robot Pipet Tips with Filter</td>
 <td>Agilent</td>
 <td>19477-022</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Robot Pipet Tips without Filter</td>
 <td>Agilent</td>
 <td>19477-002</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Clear-bottomed 96-well Plates</td>
 <td>Corning</td>
 <td>3610</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Reservoirs</td>
 <td>Axygen</td>
 <td>RES-SW96-HP-SI</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Polystyrene V-bottomed 96-well Plate</td>
 <td>Greiner</td>
 <td>651101</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Polypropylene V-bottomed 96-well Plate</td>
 <td>Greiner</td>
 <td>651201</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Adhesive Plate Covers</td>
 <td>CryoStuff</td>
 <td>#FS100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagent</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phusion DNA Polymerase</td>
 <td>New England Biolabs</td>
 <td>M0530L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BAC 2002-D6</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>2002-D6</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Calf Intestine Alkaline Phosphatase</td>
 <td>Roche</td>
 <td>10713023001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>T4 DNA Ligase</td>
 <td>New England Biolabs</td>
 <td>M0202L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pGL4.10</td>
 <td>Promega</td>
 <td>E6651</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pGL4.74</td>
 <td>Promega</td>
 <td>E6931</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ElectroMAX Stbl4 Competent Cells</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>11635-018</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Subcloning Efficiency DH5&alpha; Competent Cells</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>18265-017</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMEM without Phenol Red</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>31053-028</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Optifect</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>12579017</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ciprofloxacin</td>
 <td>CellGro</td>
 <td>61-277-RF</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris-Hydrochloride Powder</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>93287</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris-Base Powder </td>
 <td>Sigma</td>
 <td>93286</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Triton X-100 Pure Liquid</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP151-100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DTT</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15508-013</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Coenzyme A</td>
 <td>Nanolight</td>
 <td>309</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ATP</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A6419</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Luciferin</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>L2912</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>h-CTZ</td>
 <td>Nanolight</td>
 <td>301</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PTC124</td>
 <td>SelleckBiochemicals</td>
 <td>S6003</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

high-throughput functional screening using a homemade dual-glow luciferase assay

نقدم بروتوكول الفرز الفائق الإنتاجية السريع وغير مكلفة لتحديد المنظمين النسخي ألفا synuclein، جين يرتبط مرض باركنسون. و transfected الخلايا 293T عابر مع البلازميدات من مكتبة التعبير ORF المحتشدة، جنبا إلى جنب مع البلازميدات مراسل luciferase، في شكل صفيحة ميكروسكوبية-جين واحد لكل جيدا. ويعاير يراعة luciferase النشاط بعد 48 ساعة لتحديد الآثار المترتبة على كل الجينات مكتبة على النسخ ألفا synuclein، تطبيع في التعبير من بناء الرقابة الداخلية (مروج HCMV توجيه Renilla luciferase المراسل). ومما يسهل هذا البروتوكول من قبل الروبوت مقعد بين كبار المغلقة في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية، الذي يؤدي التعامل مع السائل العقيم في شكل 96 جيدا. لدينا بروتوكول ترنسفكأيشن الآلي هو قابلية للتكيف مع الإنتاجية العالية الإنتاج المكتبة lentiviral أو غيرها من بروتوكولات الفحص وظيفية تتطلب transfections من ثلاث أعداد كبيرة من البلازميدات مكتبة فريدة من نوعها في conjunction مع مجموعة مشتركة من البلازميدات المساعد. كما نقدم بديل رخيص الثمن وإجازة المتاحة تجاريا، مزدوج الكواشف luciferase المراسل الذي يعمل PTC124، EDTA، وبيروفسفات لقمع النشاط يراعة luciferase قبل قياس Renilla luciferase المراسل. باستخدام هذه الأساليب، ونحن فحص 7،670 الجينات البشرية، وحددت 68 من المنظمين ألفا synuclein. هذا البروتوكول هو قابل للتعديل بسهولة لاستهداف الجينات الأخرى ذات الاهتمام.

القيم النموذجية luciferase المراسل، F: وتظهر نسب القيم والحث R لفترة واحدة نصف لوحة في الشكل (4) لاحظ جيدا في ضرب H2، وهو محفز 32 أضعاف. سوف الجينات المسببة للسمية المفرطة (على سبيل المثال، وأيضا E3)، أو الآبار التي و transfected سيئة، وإنتاج القيم المنخفضة لكلا اليراع وluciferas...

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay at JoVE.com

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

نقدم طريقة الفحص السريع وغير مكلفة لتحديد المنظمين النسخي باستخدام عالية الإنتاجية transfections الروبوتية ومحلية الصنع مزدوج توهج luciferase الفحص. هذا البروتوكول يولد بسرعة البيانات المباشرة وظيفية جنبا إلى جنب منذ آلاف الجينات وقابل للتعديل بسهولة لاستهداف أي الجينات في المصالح.

الإنتاجية العالية فحص وظيفية باستخدام محلية الصنع ثنائي توهج luciferase الفحص

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

high-throughput-functional-screening-using-homemade-dual-glow

Research

JoVE Journal

Biology

23.3K Views.  Massachusetts General Hospital.  نقدم طريقة الفحص السريع وغير مكلفة لتحديد المنظمين النسخي باستخدام عالية الإنتاجية transfections الروبوتية ومحلية الصنع مزدوج توهج luciferase الفحص. هذا البروتوكول يولد بسرعة البيانات المباشرة وظيفية جنبا إلى جنب منذ آلاف الجينات وقابل للتعديل بسه...

Video: High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes. However, many compounds identified in screens using cell culture models are often found to be toxic or pharmacologically inactive in vivo1-2. Screening in whole animal models can help avoid these pitfalls and streamline the path to drug development.
C. elegans is a multicellular model organism well suited for HTS. It is small (&lt;1 mm) and can be economically cultured and dispensed in liquids. C. elegans is also one of the most experimentally tractable animal models permitting rapid and detailed identification of drug mode-of-action3.
We describe a protocol for culturing and dispensing fluorescent strains of C. elegans for high-throughput screening of chemical libraries or detection of environmental contaminants that alter the expression of a specific gene. Large numbers of developmentally synchronized worms are grown in liquid culture, harvested, washed, and suspended at a defined density. Worms are then added to black, flat-bottomed 384-well plates using a peristaltic liquid dispenser. Small molecules from a chemical library or test samples (e.g., water, food, or soil) can be added to wells with worms. In vivo, real-time fluorescence intensity is measured with a fluorescence microplate reader. This method can be adapted to any inducible gene in C. elegans for which a suitable reporter is available. Many inducible stress and developmental transcriptional pathways are well defined in C. elegans and GFP transgenic reporter strains already exist for many of them4. When combined with the appropriate transgenic reporters, our method can be used to screen for pathway modulators or to develop robust biosensor assays for environmental contaminants. 
We demonstrate our C. elegans culture and dispensing protocol with an HTS assay we developed to monitor the C. elegans cap &#x2018;n&#x2019; collar transcription factor SKN-1. SKN-1 and its mammalian homologue Nrf2 activate cytoprotective genes during oxidative and xenobiotic stress5-10. Nrf2 protects mammals from numerous age-related disorders such as cancer, neurodegeneration, and chronic inflammation and has become a major chemotherapeutic target11-13.Our assay is based on a GFP transgenic reporter for the SKN-1 target gene gst-414, which encodes a glutathione-s transferase6. The gst-4 reporter is also a biosensor for xenobiotic and oxidative chemicals that activate SKN-1 and can be used to detect low levels of contaminants such as acrylamide and methyl-mercury15-16.

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

A procedure for liquid-based culturing and dispensing of C. elegans strains expressing fluorescent reporter proteins is described that does not require expensive sorting equipment. This approach can be applied to numerous inducible C. elegans genes for drug discovery or biosensing of contaminants.

الفرز الفائق الإنتاجية وBiosensing مع نيون C. ايليجانس سلالات

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

ارتفاع المناولة فحص النشاط Endoglucanase الفطرية في القولونية</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing a biorefinery. These raw materials would constitute a new industrial platform, which is both sustainable and carbon neutral, to replace 
the current dependency on fossil fuel. The recalcitrance to deconstruction observed in lignocellulosic materials is produced by several intrinsic properties 
of plant cell walls. Crystalline cellulose is embedded in matrix polysaccharides such as xylans and arabinoxylans, and the whole structure is encased by the 
phenolic polymer lignin, that is also difficult to digest 1. In order to improve the digestibility of plant materials we need to discover the main bottlenecks 
for the saccharification of cell walls and also screen mutant and breeding populations to evaluate the variability in saccharification 2. These tasks require 
a high throughput approach and here we present an analytical platform that can perform saccharification analysis in a 96-well plate format. This platform has 
been developed to allow the screening of lignocellulose digestibility of large populations from varied plant species. We have scaled down the reaction volumes 
for gentle pretreatment, partial enzymatic hydrolysis and sugar determination, to allow large numbers to be assessed rapidly in an automated system.
This automated platform works with milligram amounts of biomass, performing ball milling under controlled conditions to reduce the plant 
materials to a standardised particle size in a reproducible manner. Once the samples are ground, the automated formatting robot dispenses specified and recorded 
amounts of material into the corresponding wells of 96 deep well plate (Figure 1). Normally, we dispense the same material into 4 wells to have 4 replicates for 
analysis. Once the plates are filled with the plant material in the desired layout, they are manually moved to a liquid handling station (Figure 2). In this 
station the samples are subjected to a mild pretreatment with either dilute acid or alkaline and incubated at temperatures of up to 90&deg;C. The pretreatment solution 
is subsequently removed and the samples are rinsed with buffer to return them to a suitable pH for hydrolysis. The samples are then incubated with an enzyme
mixture for a variable length of time at 50&deg;C. An aliquot is taken from the hydrolyzate and the reducing sugars are automatically determined by the MBTH 
colorimetric method.

A simple, rapid method for determining the saccharification potential of large numbers of plant biomass samples is described. The automated platform for this analysis involves the preparation of the plant biomass for analysis in 96 well plates and the subsequent performance of pretreatment, hydrolysis and quantification of the sugars released.

الإنتاجية العالية للمواد الفحص تسكر Lignocellulosic

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural &amp; Functional Biology (MS&amp;FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4. 
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline. 
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&amp;FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.	
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 &deg;C) under ambient conditions.

Herein is described a robotic approach to high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography. Three robots capable of handling the viscous and sticky protein-laden mesophase integral to the method are introduced.

استخدام روبوت لارتفاع الإنتاجية البلورة من بروتينات الغشاء في Mesophases شحمي

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with viruses that do not form plaques. As an alternative to plaque assays, we have developed a high-throughput titration method that allows for the simultaneous titration of a high volume of samples in a single day. This approach involves infection of the samples with a Firefly luciferase tagged virus, transfer of the infected samples onto an appropriate permissive cell line, subsequent addition of luciferin, reading of plates in order to obtain luminescence readings, and finally the conversion from luminescence to viral titers. The assessment of cytotoxicity using a metabolic viability dye can be easily incorporated in the workflow in parallel and provide valuable information in the context of a drug screen. This technique provides a reliable, high-throughput method to determine viral titers as an alternative to a standard plaque assay.

This article presents a high-throughput luciferase expression-based method of titrating various RNA and DNA viruses using automated and manual liquid handlers.

عالية الإنتاجية المعايرة من luciferase المراسل، معربا عن الفيروسات المؤتلف

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...

A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology due to their considerable degree of genetic conservation with humans. Chemical genetics entails testing the effect that small molecules have on a biological process and is becoming a popular translational research method to identify therapeutic compounds. Zebrafish are specifically appealing to use for chemical genetics because of their ability to produce large clutches of transparent embryos, which are externally fertilized. Furthermore, zebrafish embryos can be easily drug treated by the simple addition of a compound to the embryo media. Using whole-mount in situ hybridization (WISH), mRNA expression can be clearly visualized within zebrafish embryos. Together, using chemical genetics and WISH, the zebrafish becomes a potent whole organism context in which to determine the cellular and physiological effects of small molecules. Innovative advances have been made in technologies that utilize machine-based screening procedures, however for many labs such options are not accessible or remain cost-prohibitive. The protocol described here explains how to execute a manual high-throughput chemical genetic screen that requires basic resources and can be accomplished by a single individual or small team in an efficient period of time. Thus, this protocol provides a feasible strategy that can be implemented by research groups to perform chemical genetics in zebrafish, which can be useful for gaining fundamental insights into developmental processes, disease mechanisms, and to identify novel compounds and signaling pathways that have medically relevant applications.

The zebrafish is an excellent experimental organism to study vertebrate developmental processes and model human disease. Here, we describe a protocol on how to perform a manual high-throughput chemical screen in zebrafish embryos with a whole-mount in situ hybridization (WISH) read-out.

دليل جزيء صغير شاشة تقترب عالية الإنتاجية عن طريق الزرد الأجنة

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

الإنتاجية العالية للكشف عن المغيرون الكيميائية من الجينات المشاركة ما بعد transcriptionally الخاضعة للرقابة

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an array of hundreds of queried 3&#8217;UTRs. Target identification is based on the dual-luciferase assay, which detects binding at the mRNA level by measuring translational output, giving a functional readout of miRNA targeting. 3&#8217;LIFE uses non-proprietary buffers and reagents, and publically available reporter libraries, making genome-wide screens feasible and cost-effective. 3&#8217;LIFE can be performed either in a standard lab setting or scaled up using liquid handling robots and other high-throughput instrumentation. We illustrate the approach using a dataset of human 3&#8217;UTRs cloned in 96-well plates, and two test miRNAs, let-7c and miR-10b. We demonstrate how to perform DNA preparation, transfection, cell culture and luciferase assays in 96-well format, and provide tools for data analysis. In conclusion 3&#39;LIFE is highly reproducible, rapid, systematic, and identifies high confidence targets.

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3&#039;LIFE Assay

Luminescent identification of functional elements in 3&#8217; untranslated regions (3&#8217;UTRs) (3&#8217;LIFE) is a technique to identify functional regulation in 3&#8217;UTRs by miRNAs or other regulatory factors. This protocol utilizes high-throughput methodology such as 96-well transfection and luciferase assays to screen hundreds of putative interactions for functional repression.

الكشف عن أهداف ميرنا في إنتاجية عالية باستخدام الفحص 3&#39;LIFE

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

تحليل qPCRTag - إنتاجية عالية، في الوقت الحقيقي PCR الفحص لSc2.0 التنميط الجيني

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

تحديد أزواج كيناز الركيزة عن طريق فحص إنتاجية عالية


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...