وأيد هذا العمل من قبل EMBO طويل الأجل الزمالة (ABW)، وزمالة الدولية المؤسسة الوطنية للعلوم ما بعد الدكتوراه البحوث (ABW)، وماكس بلانك غزلشافت (ABW، DS، JS، أكو)، وهو يحفر-BB الزمالة (AO)، ومجلس البحوث الأوروبي في إطار الإطاري السابع المجتمعات الأوروبية برنامج STG-207634 (DS، أكو). نشكر رافي ديساي للتعليقات مفيدة على المخطوطة. نود أيضا أن نشكر MPI-CBG مرفق تعبير البروتين لإنتاج Fibronectin1 جزء الزرد، وموظفي مرفق الأسماك MPI-CBG للرعاية وصيانة خطوط الأسماك لدينا وMPI-CBG مرفق المجهر الضوئي للحصول على الدعم التصوير.

1. قبل تشريح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم قبل التشريح، والحصول على أجنة من تزاوج متماثلي الجينات من أزواج الزرد متخالف لأليل المعدلة وراثيا. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رفع الأجنة في E3 المتوسطة دون الميثيلين الأزرق في 28 درجة مئوية حتى الدرع المرحلة (6 ساعة بعد الإخصاب). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الأجنة في E3 المتوسطة دون الميثيلين الأزرق إلى 20 س CO / N. في 20 درجة مئوية، سوف تشكل الأجنة 1 الجسيدة في ساعة بمجرد وصولها إلى مرحلة tailbud. بعد 17-20 ساعة O / N عند 20 درجة مئوية، وينبغي أن تكون الأجنة في 5-8 الجسيدة المرحلة في صباح اليوم التالي في بداية البروتوكول تشريح. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميع الأدوات والكواشف اللازمة للتشريح. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الزجاج المصقول النار ماصة لنقل الأجنة والأنسجة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> زوج من ملقط غرامة لإزالة chorions من الأجنة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sylgard المغلفة 35 ملم طبق للتشريح - صب Sylgard البوليمر في طبق 35 ملم وعلاج O / N في 37 درجة مئوية. جعل تشريح جيدا باستخدامتلميح إبرة لإزالة كمية صغيرة من البوليمر علاجه. الطبق يمكن تنظيفها وإعادة استخدامها في وقت لاحق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شحذ، بالارض أدوات سلك التنغستن لPSM التلاعب الأنسجة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الدقيقة مشرط لقطع قطعة المرجوة من PSM للثقافة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 35 ملم طبق من البلاستيك لالتربسين الحضانة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> L15 المتوسطة التي تحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.25٪ حل التربسين / EDTA </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sigmacoted نصائح هلام التحميل للتشتت </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أطباق بتري بلاستيكية تحتوي على E3 المتوسطة دون الميثيلين الأزرق. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية صحن التصوير أسفل الزجاج مع Fibronectin1 الركيزة (10 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني). يترك الطبق على مقاعد البدلاء لمعطف أثناء تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام المجسام مع مرشحات مضان المناسبة لتحديد والأجنة وراثيا إيجابية نوع (مرحلة 5-8 الجسيدة). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد الأجنة وراثيا عن طريق فحص الأديم المتوسط ​​presomitic (PSM) للYFP التعبير تحت قناة مضان (الشكل 1A). مضان شويونيتبول تكون مرئية في المنطقة من الجسيدة شكلت مشاركة لtailbud. تحديد الأجنة مع ألمع إشارة؛ يجب أن يكون 25٪ من الأجنة ذرية متماثلة اللواقح تحمل 2 نسخ من التحوير. يختلف عدد الأجنة التي تم تحديدها اللازمة على أساس التجربة. قطعة واحدة tailbud تشريح سوف تسفر 1،000 الخلايا، في المتوسط. عادة، عدد قليل من الأجنة إيجابية إضافية مفيدة في حالة مصنوعة أخطاء أثناء تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الضوء المرسل كمرجع الموضعية للتمييز أي تألق ذاتي، ولا سيما في الخلية صفار، من إشارة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الأجنة إيجابية إلى طبق بتري بلاستيكية منفصلة تحتوي على E3 المتوسطة دون الميثيلين الأزرق. </li></ol></li></ol> 2. PSM تشريح والتشتيت <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الأجنة للتشريح. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت المجهر تشريح، وذلك باستخدام ملقط غرامة، وإزالة بعناية المشيماء من كل جنين في E3 المتوسطة. تأكد من عدم تلف الجنين أو تعطيل الخلية صفار. </lط&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء Sylgard المغلفة تشريح الطبق مع L15 المتوسطة مع المصل. باستخدام ملقط أو أداة أخرى مسطحة، وإزالة أي فقاعات الهواء من سطح Sylgard. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الأجنة dechorionated باستخدام الزجاج ماصة النار مصقول لطبق تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام أدوات الأسلاك، نقل جميع الأجنة إلى جانب واحد من الطبق تشريح. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح PSM من جنين واحد. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توجيه جنين واحد على جانبها الوحشي في صغيرة مصنوعة جيدا في طبقة Sylgard داخل الطبق تشريح (الشكل 1B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مشرط الصغرى، من خلال شريحة الجنين والخلايا البيض فقط الأمامي إلى الدماغ المؤخر وعبر القطب البطني للجنين (الشكل 1B، منقط خط أحمر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة قطعة الأمامي من الجنين من البئر، ونقله بعيدا إلى جانب الطبق، ثم استخدام أدوات سلك لكشط بعيدا المتبقية حبيبات الخلية صفار من قسم الخلفي بما في ذلك PSM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">بمجرد كشط صفار البيض بعيدا، تتسطح وتوجيه PSM مع نهاية الأمامي لافتا بعيدا عن المجرب والخلفي لافتا نحو مجرب (الشكل 1C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كانت طبقة رقيقة من الأديم الظاهر لم اقتلع من خلال هذه النقطة، واستخدام الأدوات والأسلاك لقشر بعيدا عن الجزء العلوي من الأنسجة PSM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مشرط الصغرى قطع tailbud، الطرف الأكثر الخلفي من PSM الماضي نهاية الحبل الظهري، بعيدا عن بقية الأنسجة (الشكل 1C، منقط خط أحمر). ملاحظة: قطعة أخرى من نسيج PSM، لPSM سبيل المثال الأمامي أقرب إلى الجسيدة شكلت مشاركة، ويمكن أيضا أن تؤخذ في الثقافة، وهذا يتوقف على مسألة تجريبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحريك قطعة tailbud لزاوية واحدة من الطبق بعيدا عن منطقة تشريح. استخدام أدوات سلك لمسح أي حطام الأنسجة والأجنة غير المرغوب فيها من مجال تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر مع الجنين القادم. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطعة تجمع tailbud من عدة الإلكترونيةmbryos، اعتمادا على كيفية العديد من الخلايا سوف تكون هناك حاجة للتجربة. في المتوسط، وقطعة واحدة من النسيج tailbud غلة 1،000 الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء فارغة 35 ملم طبق من البلاستيك مع كمية صغيرة من التربسين EDTA-. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة الزجاج المصقول النار، ونقل قطعة من tailbud تشريح الطبق في صحن يحتوي التربسين / EDTA. احتضان قطعة tailbud في التربسين / EDTA لمدة 20 دقيقة في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بينما يتم تحضين الأنسجة في التربسين، وإزالة الحل Fibronectin1 من الطبق التصوير القاع الزجاجي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الحل من الزجاج 3 مرات مع الماء MilliQ. استخدام الشفط لإزالة كل غسل وضمان الطبق هو جاف تماما. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تفريق قطعة tailbud في المتوسط ​​للتصوير. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة 100 ميكرولتر من L15 المتوسطة مع المصل في صحن التصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام هلام طرف المغلفة، وإزالة قطع tailbud من التربسين / EDTA في صغيرة مثل حجم ممكن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة القطع tailbud في المتوسط ​​فيطبق التصوير. ماصة القطع صعودا وهبوطا عدة مرات لكسر بينهما ووقف الخلايا في المتوسط. يجب الحرص على عدم إدخال فقاعات الهواء. التحقق من وجود كتل الخلايا تحت المجهر وتفريق أكثر حسب الحاجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمح الخلايا المتفرقة في تعليق ليستقر على الزجاج Fibronectin1 المغلفة لمدة 20 دقيقة في RT. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة كمية صغيرة من متوسطة إضافية L15 مع المصل إلى الخلايا قبل البدء في التصوير. استخدام الحرص على عدم تعطيل الخلايا المستقرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بالنظر إلى مسألة تجريبية، إضافة تكميلية أو أي علاجات دوائية للثقافة. </li></ol> 3. التصوير من خلايا متناثرة PSM <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد طبق التصوير في غرفة درجة الحرارة على المجهر الوقت الفاصل بين التصوير. تعيين وارنر غرفة لدرجة الحرارة المطلوبة للتجربة. تسمح طبق لكي تتوازن لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل البدء في الحصول على الصور. درجة الحرارة شيك مسطر مع التحقيق في درجة الحرارة الخارجية وضعها في الطبق، إذا لزم الأمر. ملاحظة: نظرا لالعلاقة بين درجة الحرارة ومعدل somitogenesis 21 التحكم في درجة الحرارة مستقرة أمر ضروري لقياسات دقيقة من فترة في الخلايا PSM احد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على صور الاختبار في القناة مضان للتأكد من أن وقت التعرض وزيادة توفير مجموعة ديناميكية كبيرة من شدة دون التشبع لضمان اشارة جيدة لمستويات الضوضاء. صورة مضان نموذجية تم الحصول عليها من خلايا متناثرة المتولدة من خطوطنا باستخدام هذا البروتوكول يتطلب 400 مللي ثانية و 40 مللي ثانية للحصول على صورة الضوء المرسل مع كاميرا EMCCD العاملة في لEM الربح من 85، بالإضافة إلى تحقيق مكاسب قبل أمبير وسرعة قراءات من الكاميرا ضرورية لتحقيق أقصى قدر من الضجيج أكثر من إشارة أيضا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام القناة الضوء المرسل، واختيار مجالات الخلايا لاكتساب الوقت الفاصل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل الوقت الفاصل بين بروتوكول اقتناء لمدة من الوقت المطلوب. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على ضوء واحد وصورة واحدة تنتقل مضان لكل حقل. ملاحظة: تعيين فاصل زمني بين ريال عماني الاستحواذجهاز الأمم المتحدة الإنمائي التي من شأنها التقاط صورة ديناميكية الزمنية دون تبيض أكثر من التصوير الموسعة أو سمية حمل في الخلايا. يستخدم هذا البروتوكول فاصل 2 دقيقة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق الوقت الفاصل بين انشاء أحيانا أثناء التسجيل لضمان أن الخلايا تظل في التركيز، لا البرمجيات أو الأجهزة الأخطاء، الخ </li></ol> 4. معالجة الصور من الأفلام متلازمة الوقت الفاصل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملف الفيلم مفتوحة لحقل المكتسبة في برامج معالجة الصور. ملاحظة: تم استخدام فيجي لتجهيز جميع في هذا البروتوكول. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقسام تنتقل ضوء ومضان إطارات من حقل واحد لخلق 2 رزمة من الصور. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتبع خلية واحدة في القناة الضوء المرسل. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع ROI دائرية (منطقة الفائدة) حول الخلية المحددة في الإطار الأول في القناة الضوء المرسل. ملاحظة:. الخلايا فقط أن 1 يتمتعون بصحة جيدة في نهاية التسجيل، 2 لا تتحرك خارج الميدان، و 3 لا تتلامس مع اوربا أخرى.يتم تعقب LLS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حفظ ROI كل بضعة إطارات إلى مدير العائد على الاستثمار. تتبع الخلية حتى الإطار الأخير. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس كثافة استخدام رويس المحفوظة على قناة مضان. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد كومة مضان ومع حفظ رويس، استخدم دائرة العرف interpolator المكونات في والكلي لقياس كثافة الخلية تعقب على مر الزمن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق تتبع الإخراج من الماكرو. إذا التتبع يلتقط نوعيا ملامح مضان الوقت الفاصل، تصدير القيم إلى ورقة عمل Excel. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حفظ قائمة العائد على الاستثمار للخلية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكرار تتبع في قناة تبث في قناة وقياس مضان للخلايا الأخرى في هذا المجال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكرار جميع الخطوات لحقول إضافية من التجربة. </li></ol>

<ol>
	<li>Cooke, J., Zeeman, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clock+and+wavefront+model+for+control+of+the+number+of+repeated+structures+during+animal+morphogenesis.">A clock and wavefront model for control of the number of repeated structures during animal morphogenesis.</a> J Theor Biol. 58, 455-476 (1976).</li><li>Oates, A. C., Morelli, L. G., Ares, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+embryos+with+oscillations:+structure,+function+and+dynamics+of+the+vertebrate+segmentation+clock.">Patterning embryos with oscillations: structure, function and dynamics of the vertebrate segmentation clock.</a> Development. 139, 625-639 (2012).</li><li>Dequeant, M. L., Pourquie, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segmental+patterning+of+the+vertebrate+embryonic+axis.">Segmental patterning of the vertebrate embryonic axis.</a> Nat Rev Genet. 9, 370-382 (2008).</li><li>Oates, A. C., Gorfinkiel, N., Gonzalez-Gaitan, M., Heisenberg, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+approaches+in+developmental+biology.">Quantitative approaches in developmental biology.</a> Nat Rev Genet. 10, 517-530 (2009).</li><li>Oates, A. C., Ho, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hairy/E(spl)-related+(Her)+genes+are+central+components+of+the+segmentation+oscillator+and+display+redundancy+with+the+Delta/Notch+signaling+pathway+in+the+formation+of+anterior+segmental+boundaries+in+the+zebrafish.">Hairy/E(spl)-related (Her) genes are central components of the segmentation oscillator and display redundancy with the Delta/Notch signaling pathway in the formation of anterior segmental boundaries in the zebrafish.</a> Development. 129, 2929-2946 (2002).</li><li>Lewis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoinhibition+with+transcriptional+delay:+a+simple+mechanism+for+the+zebrafish+somitogenesis+oscillator.">Autoinhibition with transcriptional delay: a simple mechanism for the zebrafish somitogenesis oscillator.</a> Curr Biol. 13, 1398-1408 (2003).</li><li>Schroter, C., Oates, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segment+Number+and+Axial+Identity+in+a+Segmentation+Clock+Period+Mutant.">Segment Number and Axial Identity in a Segmentation Clock Period Mutant.</a> Curr Biol. 20, 1254-1258 (2010).</li><li>Riedel-Kruse, I. H., Muller, C., Oates, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchrony+dynamics+during+initiation,+failure,+and+rescue+of+the+segmentation+clock.">Synchrony dynamics during initiation, failure, and rescue of the segmentation clock.</a> Science. 317, 1911-1915 (2007).</li><li>Ozbudak, E. M., Lewis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signalling+synchronizes+the+zebrafish+segmentation+clock+but+is+not+needed+to+create+somite+boundaries.">Notch signalling synchronizes the zebrafish segmentation clock but is not needed to create somite boundaries.</a> PLoS Genet. 4, e15 (2008).</li><li>Herrgen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercellular+Coupling+Regulates+the+Period+of+the+Segmentation+Clock.">Intercellular Coupling Regulates the Period of the Segmentation Clock.</a> Curr Biol. 20, 1244-1253 (2010).</li><li>Sawada, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf/MAPK+signalling+is+a+crucial+positional+cue+in+somite+boundary+formation.">Fgf/MAPK signalling is a crucial positional cue in somite boundary formation.</a> Development. 128, 4873-4880 (2001).</li><li>Giudicelli, F., Ozbudak, E. M., Wright, G. J., Lewis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Setting+the+tempo+in+development:+an+investigation+of+the+zebrafish+somite+clock+mechanism.">Setting the tempo in development: an investigation of the zebrafish somite clock mechanism.</a> PLoS Biol. 5, e150 (2007).</li><li>Herrgen, L., Schroter, C., Bajard, L., Oates, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+embryo+time-lapse+imaging+of+zebrafish+development.">Multiple embryo time-lapse imaging of zebrafish development.</a> Methods Mol Biol. 546, 243-254 (2009).</li><li>Hirata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oscillatory+expression+of+the+bHLH+factor+Hes1+regulated+by+a+negative+feedback+loop.">Oscillatory expression of the bHLH factor Hes1 regulated by a negative feedback loop.</a> Science. 298, 840-843 (2002).</li><li>Maroto, M., Dale, J. K., Dequeant, M. L., Petit, A. C., Pourquie, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronised+cycling+gene+oscillations+in+presomitic+mesoderm+cells+require+cell-cell+contact.">Synchronised cycling gene oscillations in presomitic mesoderm cells require cell-cell contact.</a> Int J Dev Biol. 49, 309-315 (2005).</li><li>Reppert, S. M., Weaver, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+circadian+timing+in+mammals.">Coordination of circadian timing in mammals.</a> Nature. 418, 935-941 (2002).</li><li>Welsh, D. K., Imaizumi, T., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+reporting+of+circadian-regulated+gene+expression+by+luciferase+imaging+in+plants+and+mammalian+cells.">Real-time reporting of circadian-regulated gene expression by luciferase imaging in plants and mammalian cells.</a> Methods Enzymol. 393, 269-288 (2005).</li><li>Soroldoni, D., Oates, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+transgenic+reporters+of+the+vertebrate+embryo's+Segmentation+Clock.">Live transgenic reporters of the vertebrate embryo's Segmentation Clock.</a> Curr Opin Genet Dev. 21, 600-605 (2011).</li><li>Masamizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+the+somite+segmentation+clock:+revelation+of+unstable+oscillators+in+the+individual+presomitic+mesoderm+cells.">Real-time imaging of the somite segmentation clock: revelation of unstable oscillators in the individual presomitic mesoderm cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103, 1313-1318 (2006).</li><li>Soroldoni, D., Hogan, B. M., Oates, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+efficient+transgenesis+with+meganuclease+constructs+in+zebrafish.">Simple and efficient transgenesis with meganuclease constructs in zebrafish.</a> Methods in molecular biology. 546, 117-130 (2009).</li><li>Schroter, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+zebrafish+somitogenesis.">Dynamics of zebrafish somitogenesis.</a> Dev Dyn. 237, 545-553 (2008).</li><li>Picker, A., Roellig, D., Pourquie, O., Oates, A. C., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+micromanipulation+in+zebrafish+embryos.">Tissue micromanipulation in zebrafish embryos.</a> Methods in molecular biology. 546, 153-172 (2009).</li><li>Mould, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+multiple+integrin+beta1+homologs+in+zebrafish+(Danio+rerio).">Identification of multiple integrin beta1 homologs in zebrafish (Danio rerio).</a> BMC Cell Biol. 7, 24 (2006).</li><li>Mould, A. P., Koper, E. J., Byron, A., Zahn, G., Humphries, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+ligand-binding+pocket+of+integrin+alpha5beta1+using+a+gain-of-function+approach.">Mapping the ligand-binding pocket of integrin alpha5beta1 using a gain-of-function approach.</a> Biochem J. 424, 179-189 (2009).</li><li>Zhao, Q., Liu, X., Collodi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+novel+fibronectin+in+zebrafish.">Identification and characterization of a novel fibronectin in zebrafish.</a> Exp Cell Res. 268, 211-219 (2001).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+The+zebrafish+book+:+a+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+(Brachydanio+rerio).">In The zebrafish book : a guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio).</a> , (1993).</li><li>Vallone, D., Santoriello, C., Gondi, S. B., Foulkes, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+protocols+for+zebrafish+cell+lines:+maintenance+and+transfection.">Basic protocols for zebrafish cell lines: maintenance and transfection.</a> Methods Mol Biol. 362, 429-441 (2007).</li><li>Carr, A. J., Whitmore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+single+light-responsive+clock+cells+reveals+fluctuating+free-running+periods.">Imaging of single light-responsive clock cells reveals fluctuating free-running periods.</a> Nat Cell Biol. 7, 319-321 (2005).</li><li>Whitmore, D., Foulkes, N. S., Sassone-Corsi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+acts+directly+on+organs+and+cells+in+culture+to+set+the+vertebrate+circadian+clock.">Light acts directly on organs and cells in culture to set the vertebrate circadian clock.</a> Nature. 404, 87-91 (2000).</li><li>Soroldoni, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Doppler+effect+in+embryonic+pattern+formation.">A Doppler effect in embryonic pattern formation.</a> Science. 345, 222-225 (1126).</li></ol>

المؤلف المساهمات: ABW تطوير وصقل تشتت، والثقافة، والتصوير، والبروتوكولات تتبع الخلية. DS إنشاء خطوط المعدلة وراثيا وأشرف على تصميم المجهر مضان الوقت الفاصل المستخدمة في هذا البروتوكول. رائدة AO الأولي إثبات صحة المبدأ التجارب لفصل الخلايا والصورة PSM في الثقافة. كتب JS الأداة المساعد دائرة interpolator في فيجي تستخدم لقياس كثافة مضان من الأفلام مرور الزمن. ABW وأكو كتب مخطوطة.

لدراسة عملية الخلوية التي تجري على مدى التطور الجنيني، وعلماء الأحياء عادة استخدام هذا النهج في سياق الجنين بأكمله. ومع ذلك، ولكي نفهم تماما كيف يتصرف خلية واحدة ضمن إطار زمني التنموية، وهي طريقة لدراسة والتشويش على الخلايا الفردية في عزلة هو أيضا مفيد للغاية. عن طريق توليد فرقت الثقافات الخلية PSM باستخدام الأجنة الزرد المعدلة وراثيا لدينا الآن أداة لدراسة الخلية مباشرة الطابع المستقل من التذبذبات الوراثية في ساعة تجزئة بطريقة الكمي. فمن الممكن لقياس ديناميكية التذبذبات في مراسل الفلورسنت لدينا في مئات من الخلايا تحت مجموعة متنوعة من الظروف. فترة احظ واحد من الخلايا في الثقافة أطول من الفترة somitogenesis في الجنين سليمة. نلاحظ أن ازدراع PSM سليمة في الثقافة يسلك أيضا التذبذبات أبطأ من الجنين سليمة (لا تظهر البيانات)، مما يوحي ثار فترة أطول لوحظ في خلايا معزولة لا يعود ببساطة إلى الأضرار الناجمة عن تشتت. ويلاحظ وجود فترة متغير والسعة في معظم لدينا وحيدة الخلية سلسلة زمنية. مصدر هذا التباين هو معروف، ولكن ينبغي أن تكشف تفاصيل مهمة عن دوائر صنع تيرة على مدار الساعة في تجزئة. مع هذا الأسلوب يمكننا دراسة المكونات الجينية للتجزئة على المستوى الخلوي، والأسئلة العنوان الذي يتحدون لدراسة في الجنين كله. على سبيل المثال، من خلال إضافة للرقابة من جزيئات إشارة معروفة وجدت في الجنين النامية لثقافاتنا، يمكن أن ندرس آثارها على PSM مذبذب الخلوية واحد في مقايسة قوية وقابلة للتكرار. يفتح نظامنا الثقافة PSM الباب أمام إجراء تقييم دقيق للعوامل ما، وحده، أو بالاشتراك تعزيز التذبذبات في هذه الخلايا، ما هي العوامل التي تحول دون هذه التذبذبات، واختبار التفاعل بين هذه الجزيئات. مع هذه الأدوات في متناول اليد، ونحن نهدف إلىتقييم النماذج القائمة من somitogenesis التي تستند إلى بيانات على مستوى الأنسجة المنشورة، فضلا عن نتائج استخدام في الخلايا وحيدة لتوليد التنبؤات التي يمكن اختبارها في الجنين كله. على حد علمنا، هذا هو أول الزرد بروتوكول الثقافة الخلية الأولية للالحاد تسجيل الوقت الفاصل بين مضان في الخلايا واحد؛ مزيد من التطوير والتنقيح من هذا البروتوكول هو بلا شك ممكن. بروتوكولات أخرى غالبا ما تستخدم الأجنة الزرد لتوليد خطوط الخلايا المستقرة التي يمكن transfected مع صحفيين وتستخدم للتصوير على المدى الطويل 27-29. بينما خطوط مستقرة هي مفيدة لتصوير عملية ليست مرتبطة توقيت التنمية، مثل الساعة اليومية، مسألة تجزئة الجنينية يتطلب التصوير على الفور في حين أن الخلايا لا تزال في متذبذبة، دولة السلف الخاصة بهم. مرة واحدة خلايا وقف تتأرجح، فإنها تفترض مصير الخلايا المتمايزة، وعندما تكون في الأنسجة، وستدرج في الجسيدة. فمن بوssible أنه مع عامل الحق أو عوامل موجودة في المختبر فإننا يمكن أن تولد الزرد خطوط خلية ثقافة PSM مثل التي من شأنها أن تبقى متذبذبة، مما يتيح بشكل ملحوظ الملاحظات على المدى الطويل، اضطرابات متتابعة متعددة، أو الفرز الفائق الإنتاجية. ونحن نتوقع أن هذا الأسلوب في إعداد الثقافات الأولية من خلايا متناثرة للتصوير مرور الزمن هو مناسبة تماما لدراسة أي عملية الخلوية التي تحدث ضمن إطار زمني التنموية التي ليس دود باستخدام خطوط الخلايا الزرد مستقرة. عزلة متميزة الخلية الأنواع في مراحل نمو متميزة من خطوط مراسل المعدلة وراثيا المناسب، إما عن طريق تشريح أو عن طريق نظام مراقبة الأصول الميدانية بعد التفكك الجنينية، يمكن أن توفر الخلايا تبدأ. بعض التحسين من ظروف الثقافة، مسترشدة في ذلك المنشأ الجنينية من الخلايا، قد تكون مطلوبة. من خلال الجمع بين هذا البروتوكول مرنة وحساسة مع مجموعة متنامية بسرعة من الزرد المعدلة وراثياخطوط، ونحن نأمل أن تسهل في المختبر التنموية نهج البيولوجيا التي هي مكملة لأساليب الوراثية والجنينية الكلاسيكية.

تشكيل دورية للقطاعات على طول محور الجسم الفقاريات، أو somitogenesis، هو دليل على وجود مذبذب المكانية والزمانية في الجنين النامية. آلية يفضل السيطرة somitogenesis والمفاهيمية وصفها ب &quot;على مدار الساعة واجهة الموجة&quot; نموذج 1، حيث &quot;ساعة&quot; التي تتألف من مؤشرات التذبذب الخلوية، ويعتقد الآن أن تكون مدفوعة من قبل داخل الخلية التعبير الايقاعي من مجموعة من الجينات دوري 2، القراد قبالة تشكيل من somites من الأديم المتوسط ​​presomitic (PSM). مع تطور الجنين، والنضج &quot;واجهة الموجة&quot; في PSM يتحرك بالتنسيق مع الأنسجة تراجع نحو الخلفي، وتباطؤ واعتقال مؤشرات التذبذب الخلوية لأنها تمر 3. معا، ويطلق على هذا النظام الديناميكي spatiotemporally على مدار الساعة تجزئة. النهج الحالي لدراسة تجزئة مدار الساعة فترة ثلاثة مستويات متزايدة من التنظيم من مذبذب الوراثية في الخلايا واحد إلى عشرة اقتران المحليةفي يحدث بين الخلايا، وأخيرا إلى التنظيم العالمي للمعلومات الموضعية في PSM الأنسجة الجماعية 4. وتشير الدراسات السابقة إلى تجزئة مذبذب خلية مستقلة في الزرد يتكون من الجينات ومنتجات البروتين من النسخ لها / هس] factorfamily، التي يعتقد أنها تشكل رد الفعل السلبي من خلال القمع النسخي 5-7. إشارات الطريق دلتا / الشق بمزامنة التذبذبات بين الخلايا المجاورة وينظم الفترة الجماعي للسكان 8-10. جمعية جيل المستقبل تظهر إشارات الجزيئات التي تنتج في tailbud لبناء التدرج عبر PSM الزرد، وبالتالي افترض أن تساهم في تباطؤ واعتقال خلايا تتأرجح في 11 الأمامي. حتى الآن، وقد تم التحقيق في الأدوار الوظيفية لكل من هذه الجزيئات في somitogenesis التي كتبها طفرة جينية، حقن morpholino الحرارية صدمة الإفراط في التعبير، وخصم trea المخدراتtment من مكونات مدار الساعة والإشارات بين الخلايا 5،7،10،12. باستخدام هذه الاضطرابات، وقد يستدل تجزئة ظيفة على مدار الساعة من أوصاف مستوى الأنسجة من العيوب الجسيدة وفقدان التذبذبات موحدة في التعبير عن الجينات دوري مثل her1، her7، ودلتا C. ومع ذلك، وكلها تقريبا من هذه البيانات هي من أجنة الثابتة وتفشل في التقاط بدقة التغييرات التي هي متأصلة في وظيفة حيوية على مدار الساعة تجزئة. في الآونة الأخيرة، كشفت متعددة الأجنة الوقت الفاصل بين التصوير المسوخ الأولى مع الفترة مذبذب تتغير، ولكن قدمت هذه الملاحظات أيضا على مستوى 7،13 الأنسجة. وبالتالي، لم يحترم سلوك مذبذب خلايا مستقلة افترض خلال somitogenesis. لقطات ثابتة من somitogenesis إعطاء صورة مكتملة لأنه، بطبيعته، هو الدافع وراء العملية من خلال نظام متذبذبة. أظهر العمل في وقت سابق من خلايا فأر وفرخ أن مستويات النصوارتفاع البروتين والخريف، ولكن أخذ العينات التذبذب ما يقرب من 2 ساعة كل 30 أو 45 دقيقة يقيد بالضرورة البيانات التي تم جمعها، وبالتالي فإن الاستنتاجات التي يمكن استخلاصها 14،15. دراسة مؤشرات التذبذب البيولوجية الأخرى، وأبرزها، والساعات الإيقاعية، تحركت بعيدا عن قياسات نظم الجينات والبروتينات التعبير لرصد الوقت الحقيقي باستخدام الفلورسنت وصحفيين للإضاءة الحيوية 16،17. هذه الأدوات ضرورية لإظهار الخصائص على مدار الساعة من الخلايا واحد 18. وقد تم تطوير مراسل إضاءة الحيوية للجين دوري Hes1 وتتميز الخلايا واحد في الماوس PSM 19 لفترة وجيزة. تم حساب متوسط ​​فترة والتباين لعدد صغير من الخلايا، وتبين أن التذبذبات تستمر لعدة دورات في المختبر. ومع ذلك، فإن هذه الدراسات لم تتناول كميا استقرار ومتانة تردد المذبذب والسعة، ما إذا كانت الخلايا يمكن أن تدخل بشكل عفوي أو التذبذبات الخروج،وكيف تحافظ على خلايا العلاقات مرحلتها. بالإضافة إلى ذلك، لم يتم اختبارها آثار إشارات الجزيئات الموجودة في الجنين على مدار الساعة خلية مستقلة مباشرة. وبالتالي، هذه الخصائص الأساسية للمذبذب خلية واحدة لا تزال مجهولة تماما. وقد وضعنا مؤخرا خطوط الأسماك المعدلة وراثيا باستخدام BAC recombineering 20 لدفع فينوس (YFP) للصحفيين مضان من her1 التعبير 30. هذه الخطوط استغلال العظة التنظيمية للموضع الكروموسومات سليمة التي تضمهم وألخص ديناميات الزماني والمكاني للنمط her1. هذا اختراق يسمح للرصد في الوقت الحقيقي من التعبير الجيني في الجنين الزرد النامية في الجسم الحي. لدراسة الخصائص الأساسية للالتذبذبات خلية مستقلة وكيف يتم تنظيم مثل هذا التعبير مع مرور الوقت، ونحن في الآونة الأخيرة وضعت طريقة موثوق بها لعزل وسجل من الخلايا في المختبر PSM. هذا بروتوويصف العقيد كيف يمكننا استخدمت خطوط مراسل المعدلة وراثيا لدينا لتوليد مزارع الخلايا المشتتة، يمكننا من خلاله توصيف التذبذبات على مدار الساعة تجزئة الزرد في الخلايا واحد. يمكننا بالتالي معالجة المسائل العالقة في الحقل الذي لم تكن في متناول مع تحليل ثابتة أو على مستوى الأنسجة، فضلا عن التلاعب مباشرة على مدار الساعة تجزئة على مستوى خلية واحدة مع إشارات الجزيئات ومثبطات.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Epifluorescence microscope</td>
 <td>Olympus</td>
 <td>Model: SZX16</td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Epifluorescence microscope</td>
 <td>X-cite Illumination</td>
 <td>Series: 120Q</td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dissection microscope</td>
 <td>Olympus</td>
 <td>Model: SZX12</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fine forceps no. 55</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>11295-51</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass transfer pipettes</td>
 <td>Assistent</td>
 <td>567/2</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>35 mm plastic petri dishes</td>
 <td>Greiner</td>
 <td>627102</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>60 mm plastic petri dishes</td>
 <td>Greiner</td>
 <td>628102</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sylgard polymer</td>
 <td>SASCO</td>
 <td>266727</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Manipulation tools</td>
 <td>Made in-house</td>
 <td></td>
 <td>For description of manipulation tools Ref. 22</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microsurgical knife</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>500249</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L15 medium</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>57322</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Penicillin/streptomyocin</td>
 <td>PAA</td>
 <td>P11-010</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fetal bovine serum</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>257322</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.05% trypsin / 0.02% EDTA</td>
 <td>PAA </td>
 <td>L11-004</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gel loading tips</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>253188</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sigmacote</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>254589</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Micropipette set</td>
 <td>Gilson International</td>
 <td>F167300</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Zebrafish Fibronectin1 70 kD fragment</td>
 <td>MPI-CBG protein facility</td>
 <td></td>
 <td>Generated in-house from construct based on previously published work Ref. 23-25</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass bottom imaging dishes</td>
 <td>Mattek (single well)</td>
 <td>P35G-1.5-14-C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass bottom imaging dishes</td>
 <td>Greiner (CellView -multi-well)</td>
 <td>262502</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>E3 medium without methylene blue</td>
 <td>Made in-house</td>
 <td></td>
 <td>From The Zebrafish Book, 5th Ed. Ref. 26 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Plastic transfer pipettes</td>
 <td>Ratiolab</td>
 <td>260011</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Warner heating/cooling chamber</td>
 <td>Warner Instruments</td>
 <td>TC-324B/344B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EM-CCD camera</td>
 <td>Andor</td>
 <td>Model: iXOn 888</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set</td>
 <td>Zeiss</td>
 <td>Model: Axiovert 200M</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set</td>
 <td></td>
 <td>NeoFluor 40x, NA 0.75</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set</td>
 <td>Lumencor Light Engine</td>
 <td>Model: Spectra X</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set</td>
 <td>BrightLine HC 575/15</td>
 <td>F39-575</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

generation of dispersed presomitic mesoderm cell cultures for imaging of the zebrafish segmentation clock in single cells

تجزئة هو عملية التخلق دورية ومتتابعة في الفقاريات. هذا التشكيل الإيقاعي من كتل من الأنسجة تسمى somites على طول محور الجسم هو دليل على وجود مذبذب الوراثية الزخرفة الجنين النامية. في الزرد، وتتكون على مدار الساعة داخل الخلايا تجزئة الدافعة للأعضاء عامل النسخ عائلتها / هس تنظيمها في الحلقات ردود فعل سلبية. لقد ولدت مؤخرا المعدلة وراثيا خطوط مراسل الفلورسنت لher1 الجين دوري أن ألخص نمط المكانية والزمانية من التذبذبات في الأديم المتوسط ​​presomitic (PSM). باستخدام هذه الخطوط، قمنا بتطوير نظام الثقافة في المختبر الذي يسمح التحليل في الوقت الحقيقي من خلال تجزئة التذبذبات على مدار الساعة، والخلايا المعزولة PSM احد. عن طريق إزالة الأنسجة PSM من الأجنة وراثيا ومن ثم تفريق الخلايا من المناطق تتأرجح على الأطباق الزجاجية القاع، ونحن ولدت الثقافات مناسبة للالوقت الفاصل بين التصوير من إشارة مضان منالخلايا الفردية على مدار الساعة. ويوفر هذا النهج إطارا التجريبية والمفاهيمية للتلاعب المباشر على مدار الساعة لقرار تجزئة وحيدة الخلية غير مسبوقة، مما يسمح للخصائص خلية مستقلة وعلى مستوى الأنسجة لتمييزها وتشريح.

هذا البروتوكول تنتج ثقافات، وفرقت، وخلايا PSM واحدة قابلة للالوقت الفاصل بين التصوير من إشارة مضان (الشكل 2). لدينا التحوير يولد مراسل الذين دورة الإنتاج وتدهور تحدث مع ديناميات مماثلة لهذا الجين الذاتية والبروتين في الجنين، بناء على أمر من نصف ساعة. بسبب دوران سريع لها، ويجب أن يتم الكشف عن إشارة YFP في الخلايا واحد بسرعة لتقليل تبيض ومع القرار الزماني عالية لالتقاط ملامح كل دورة متذبذبة. أيضا، بالنظر إلى الخفوت النسبي للإشارة، تم ضبطها الظروف الثقافة واكتساب بعناية لضمان نتائج حساسة وقوية. لقد تم العثور على العوامل التالية إلى أن تكون مهمة في توليد الأمثل الثقافات الخلية PSM للتصوير: 1 إن الركيزة ECM تستخدم لطلاء الأطباق ثقافة أسفل الزجاج. 2. إضافة مصل للتشريح والمتوسطة التصوير. 3. تشريح PSM من الأجنة التي تم تحديدها اتخذت بعد التزاوج HETEأزواج rozygous، التي يحتمل أن تكون ذرية تحمل 2 نسخ من التحوير. 4. اقتناء صورة ضمن نطاق التكبير الأمثل، وذلك باستخدام الهدف NA أعلى لضمان كفاءة التقاط إشارة مضان. 5. الإضاءة مع مصدر ضوء الحالة الصلبة للحد من تقلبات الكثافة التي يمكن أن تسهم في ضجيج الخلفية. 6. كشف الإشارات مع كاميرا حساسة للغاية EM-CCD لتعظيم إشارة قراءات. والثقافات الفرعية الأمثل تحتوي على الخلايا التي لا تبقى مدورة وصحية في جميع أنحاء التسجيل. افترضنا أن لدينا الركيزة ECM، جزء من fibronectin1 الزرد تبقي الخلايا في PSM مثل حالة غير متمايزة، بالمقارنة مع غيرها من ركائز استخداما مثل بولي يسين أو laminin. ركائز أخرى اختبرنا تسبب الخلايا للشد على الزجاج وفقدان إشارة الفلورسنت تتأرجح على مدار التسجيل. وجدنا أيضا أن إضافة مصل إلى متوسطة أثناء تشريح، تشتت،وكان تسجيل ليس فقط مهم لإرواء التربسين المستخدمة لتفارق، ولكن أيضا زيادة كثافة مضان على الخلفية، على الأرجح بسبب تحسن بقاء الخلية. لضمان التقاط إشارة الأمثل من الخلايا واحد كنا هدفا 40X مصممة خصيصا للتصوير مضان (زايس خطة NeoFluor سلسلة) مع ارتفاع NA. وجدنا أيضا أن مصدر ضوء الحالة الصلبة تقديم إضاءة أكثر استقرارا من مصابيح الزئبق التقليدية، وهو أمر حاسم للحد من تقلبات الخلفية التي تسهم في الصور صاخبة. هذه التعديلات مهمة لضمان تحقيق نتائج قوية. باستخدام هذا البروتوكول نتوقع الثقافات التي يتم فلوري غالبية الخلايا في مجال معين في مرحلة ما أثناء التسجيل. نجد أن الخلايا الفلورسنت تبقى عادة مدورة وأحيانا متحركة جدا خلال التسجيلات. وهناك عدد قليل الخلايا، بما في ذلك الخلايا الفلورسنت، قد تصبح أفكارك أثناء التسجيل. وتستبعد هذه الخلايا من أي أحدnalysis. نحن أيضا استبعاد الخلايا التي تتلامس مع خلايا أخرى أو نقلها خارج مجال الرؤية. في المتوسط، ونحن نرى انخفاضا بنسبة 12٪ في عدد الخلايا لكل حقل من نهاية التسجيل 10 ساعة كما تم قياسها عن طريق حساب عدد الخلايا السليمة في القناة الضوء المرسل. وتشمل هذه الخسارة على حد سواء موت الخلايا والخلايا التي انتقلت من مجال. ونظرا لهذه المحاذير وسعنا، في المتوسط، المسار 5 خلايا لكل حقل الفلورسنت التي لا تزال قابلة للحياة ومرئية، وعادة ما تسجل 6 حقول في الشرط. على سبيل المثال، سوف تجربة مع 4 شروط دينا 24 مجموع الحقول المكتسبة وعادة حوالي 30 خلية في تعقب الشرط. في ظل ظروف التصوير القياسية مع L15 المتوسطة التي تحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني، نجد أن الخلايا PSM (ن = 101 الخلايا من 4 مكررات التجريبية) يمكن أن تنتج ما بين 2 و 7 قمم، مع متوسط ​​والانحراف المعياري 3 ± 1 قمم (2 دورات -3). عدد الذروة الوسيط، وكذلك المئين 25٪، هو 2 القمم و75٪ المئين طق 3 قمم. باستخدام لدينا تتبع وتحليل شبه الآلي، ونحن يمكن أن تولد بسرعة كثافة مضان على آثار الوقت لخلايا PSM الفردية، مع اثر خلية ممثل هو مبين في الشكل 2C. ويمكن بعد هذه آثار الخام أن تستخدم لجعل القياسات الكمية من خصائص الخلايا PSM تتأرجح، مثل تردد، والسعة، وعدد الدورات، وتوقيت القمم. <img alt="الشكل 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50307/50307fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50307/50307fig1.jpg" /> الشكل 1. تحديد الأجنة والخطط المعدلة وراثيا من تشريح بهم. (A) عرض الجانبي للجنين الزرد المعدلة وراثيا معربا عن YFP مضان في مرحلة ~ 5 الجسيدة. الصورة تراكب الضوء المرسل وقناة مضان. السهام تشير إلى مجالات إشارة البدء في غيض من tailbud، في جميع أنحاء PSM، نحو لتر<html> AST شكلت الجسيدة. يظهر أقحم التخطيطي من التحوير مراسل (لمزيد من المعلومات حول تطوره والسلوك في الجسم الحي الرجوع إلى Soroldoni وآخرون 30. (B) تخطيطي للعرض الوحشي من الجنين قبل أن يقطع لأول مرة خلال تشريح. يشير خط أحمر منقط في أول خطوة من نوعها قدمت عبر الدماغ المؤخر، على الرغم من الخلية صفار فقط وراء tailbud. (C) عرض تخطيطي بالارض PSM التالية إزالة حبيبات الصفار وطبقة البشرة، الموجهة على طول المحور الأمامي الخلفي لها. يشير خط أحمر منقط خفض ثانية لإزالة غيض من tailbud للتشتت والثقافة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50307/50307fig1highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> 07fig2.jpg &quot;/&gt; الشكل 2. صور الممثل وآثار من خلية واحدة في ثقافة PSM فرقت. (A) مونتاج الصور المنقولة من ضوء خلية PSM واحد في 6 ساعات تسجيل الوقت الفاصل. لاحظ أن الخلية ما زالت مدورة وصحية طوال فترة التسجيل. (B) الموافق المونتاج من الصور مضان من خلية واحدة PSM. يتم ترقيم قمم في كثافة الخلية على مدار التسجيل. (C) متوسط ​​الكثافة مع مرور الوقت يقاس من العائد على الاستثمار وضعت على هذه الخلية. تؤخذ القيم من كل إطار من الفيلم مع معدل الإطار الواحد في 2 دقيقة باستخدام دائرة interpolator المكونات في وماكرو مخصصة مكتوب في فيجي. يتم ترقيم قمم في شدة مرة أخرى في جميع أنحاء التتبع. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50307/50307fig2highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Dispersed Presomitic Mesoderm Cell Cultures for Imaging of the Zebrafish Segmentation Clock in Single Cells at JoVE.com

Generation of Dispersed Presomitic Mesoderm Cell Cultures for Imaging of the Zebrafish Segmentation Clock in Single Cells

Somitogenesis هو عملية التنموية الإيقاعية التي مكانيا أنماط محور الجسم من أجنة الفقاريات. سابقا، قمنا بتطوير خطوط الزرد المعدلة وراثيا التي تستخدم للصحفيين الفلورسنت لمراقبة الجينات التي تدفع دوري هذه العملية. هنا، ونحن ثقافة فرقت الخلايا من هذه الخطوط والصورة التذبذبات على مر الزمن في المختبر.

جيل من تفرقوا Presomitic الأديم المتوسط ​​الثقافات خلية التصوير من اسماك الزرد الإنقسام على مدار الساعة في خلايا واحدة

Segmentation is a  periodic and sequential morphogenetic process in vertebrates. This rhythmic  formation of blocks of tissue called somites along the ...

generation-dispersed-presomitic-mesoderm-cell-cultures-for-imaging

Research

JoVE Journal

Biology

13.6K Views.  Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics.  Somitogenesis هو عملية التنموية الإيقاعية التي مكانيا أنماط محور الجسم من أجنة الفقاريات. سابقا، قمنا بتطوير خطوط الزرد المعدلة وراثيا التي تستخدم للصحفيين الفلورسنت لمراقبة الجينات التي تدفع دوري هذه العملية. هنا، ونحن ثقافة فرقت الخلايا من ه?...

Video: Generation of Dispersed Presomitic Mesoderm Cell Cultures for Imaging of the Zebrafish Segmentation Clock in Single Cells

Single Cell Fate Mapping in Zebrafish

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, lymphatic, and blood vessel lineages arise in developing embryos requires fate mapping and lineage tracing of undifferentiated precursor cells. Recently, photoactivatable proteins which include: Eos1, 2, PAmCherry3, Kaede4-7, pKindling8, and KikGR9, 10 have received wide interest as cell tracing probes. The fluorescence spectrum of these photosensitive proteins can be easily converted with UV excitation, allowing a population of cells to be distinguished from adjacent ones. However, the photoefficiency of the activated protein may limit long-term cell tracking11. As an alternative to photoactivatable proteins, caged fluorescein-dextran has been widely used in embryo model systems7, 12-14. Traditionally, to uncage fluorescein-dextran, UV excitation from a fluorescence lamp house or a single photon UV laser has been used; however, such sources limit the spatial resolution of photoactivation. Here we report a protocol to fate map, lineage trace, and detect single labeled cells. Single cells in embryos injected with caged fluorescein-dextran are photoactivated with near-infrared laser pulses produced from a titanium sapphire femtosecond laser. This laser is customary in all two-photon confocal microscopes such as the LSM 510 META NLO microscope used in this paper. Since biological tissue is transparent to near-infrared irradiation15, the laser pulses can be focused deep within the embryo without uncaging cells above or below the selected focal plane. Therefore, non-linear two-photon absorption is induced only at the geometric focus to uncage fluorescein-dextran in a single cell. To detect the cell containing uncaged fluorescein-dextran, we describe a simple immunohistochemistry protocol16 to rapidly visualize the activated cell. The activation and detection protocol presented in this paper is versatile and can be applied to any model system. 
Note: The reagents used in this protocol can be found in the table appended at the end of the article.

A method is described to photoactivate single cells containing a caged fluorescent protein using two-photon absorption from a Ti:Sapphire femtosecond laser oscillator. To fate map the photoactivated cell, immunohistochemistry is used. This technique can be applied to any cell type.

واحدة رسم الخرائط ذات الصلة مصير الخليوي في الزرد

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

في الجسم الحي من Electroporation Morpholinos في شبكية العين اسماك الزرد الكبار

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration of adult tissues, such as the heart1, retina2, spinal cord3, optic nerve4, sensory hair cells5, and fins6.
The zebrafish fin is a relatively simple appendage that is easily manipulated to study multiple stages in epimorphic regeneration. Classically, fin regeneration was characterized by three distinct stages: wound healing, blastema formation, and fin outgrowth. After amputating part of the fin, the surrounding epithelium proliferates and migrates over the wound. At 33 &deg;C, this process occurs within six hours post-amputation (hpa, Figure 1B)6,7. Next, underlying cells from different lineages (ex. bone, blood, glia, fibroblast) re-enter the cell cycle to form a proliferative blastema, while the overlying epidermis continues to proliferate (Figure 1D)8. Outgrowth occurs as cells proximal to the blastema re-differentiate into their respective lineages to form new tissue (Figure 1E)8. Depending on the level of the amputation, full regeneration is completed in a week to a month.
The expression of a large number of gene families, including wnt, hox, fgf, msx, retinoic acid, shh, notch, bmp, and activin-betaA genes, is up-regulated during specific stages of fin regeneration9-16. However, the roles of these genes and their encoded proteins during regeneration have been difficult to assess, unless a specific inhibitor for the protein exists13, a temperature-sensitive mutant exists or a transgenic animal (either overexpressing the wild-type protein or a dominant-negative protein) was generated7,12. We developed a reverse genetic technique to quickly and easily test the function of any gene during fin regeneration.
Morpholino oligonucleotides are widely used to study loss of specific proteins during zebrafish, Xenopus, chick, and mouse development17-19. Morpholinos basepair with a complementary RNA sequence to either block pre-mRNA splicing or mRNA translation. We describe a method to efficiently introduce fluorescein-tagged antisense morpholinos into regenerating zebrafish fins to knockdown expression of the target protein. The morpholino is micro-injected into each blastema of the regenerating zebrafish tail fin and electroporated into the surrounding cells. Fluorescein provides the charge to electroporate the morpholino and to visualize the morpholino in the fin tissue.
This protocol permits conditional protein knockdown to examine the role of specific proteins during regenerative fin outgrowth. In the Discussion, we describe how this approach can be adapted to study the role of specific proteins during wound healing or blastema formation, as well as a potential marker of cell migration during blastema formation.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

We describe a method to conditionally knockdown the expression of a target protein during adult zebrafish fin regeneration. This technique involves micro-injecting and electroporating antisense oligonucleotide morpholinos into fin tissue, which allows testing the protein&#x2019;s role in various stages of fin regeneration, including wound healing, blastema formation, and regenerative outgrowth.

في Electroporation المجراة من Morpholinos في الكبار التجديد زعنفة الذيل الزرد

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

جيل من الفئران المستمدة من الخلايا الجذعية المحفزة المستحثة

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters

In mammals, many aspects of behavior and physiology such as sleep-wake cycles and liver metabolism are regulated by endogenous circadian clocks (reviewed1,2). The circadian time-keeping system is a hierarchical multi-oscillator network, with the central clock located in the suprachiasmatic nucleus (SCN) synchronizing and coordinating extra-SCN and peripheral clocks elsewhere1,2. Individual cells are the functional units for generation and maintenance of circadian rhythms3,4, and these oscillators of different tissue types in the organism share a remarkably similar biochemical negative feedback mechanism. However, due to interactions at the neuronal network level in the SCN and through rhythmic, systemic cues at the organismal level, circadian rhythms at the organismal level are not necessarily cell-autonomous5-7. Compared to traditional studies of locomotor activity in vivo and SCN explants ex vivo, cell-based in vitro assays allow for discovery of cell-autonomous circadian defects5,8. Strategically, cell-based models are more experimentally tractable for phenotypic characterization and rapid discovery of basic clock mechanisms5,8-13.
Because circadian rhythms are dynamic, longitudinal measurements with high temporal resolution are needed to assess clock function. In recent years, real-time bioluminescence recording using firefly luciferase as a reporter has become a common technique for studying circadian rhythms in mammals14,15, as it allows for examination of the persistence and dynamics of molecular rhythms. To monitor cell-autonomous circadian rhythms of gene expression, luciferase reporters can be introduced into cells via transient transfection13,16,17 or stable transduction5,10,18,19. Here we describe a stable transduction protocol using lentivirus-mediated gene delivery. The lentiviral vector system is superior to traditional methods such as transient transfection and germline transmission because of its efficiency and versatility: it permits efficient delivery and stable integration into the host genome of both dividing and non-dividing cells20. Once a reporter cell line is established, the dynamics of clock function can be examined through bioluminescence recording. We first describe the generation of P(Per2)-dLuc reporter lines, and then present data from this and other circadian reporters. In these assays, 3T3 mouse fibroblasts and U2OS human osteosarcoma cells are used as cellular models. We also discuss various ways of using these clock models in circadian studies. Methods described here can be applied to a great variety of cell types to study the cellular and molecular basis of circadian clocks, and may prove useful in tackling problems in other biological systems.

Circadian clocks function within individual cells, i.e., they are cell-autonomous. Here, we describe methods for generating cell-autonomous clock models using non-invasive, luciferase-based real-time bioluminescence technology. Reporter cells provide tractable, functional model systems for studying circadian biology.

رصد الخلية التي تتمتع بحكم ذاتي إيقاعات الساعة اليومية في التعبير الجيني باستخدام مراسلون ضوء بارد وسيفيراز

In mammals, many aspects of behavior and physiology such as sleep-wake cycles and liver metabolism are regulated by endogenous circadian clocks ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

يعيش التصوير من تخليص الخلية أفكارك أثناء<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; مرحلة التطور الجنيني

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

كفاءة الجيل المستحثة الإنسان افرة القوة الخلايا الجذعية من الخلايا الجسدية البشرية مع سينداي الفيروسات

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

سم كلوي حقن مكروي في الزرد لنموذج قصور كلوي حاد

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to hyperglycemia and severe, life-threatening consequences. Understanding how the beta-cells operate under physiological conditions and what genetic and environmental factors might cause their dysfunction could lead to better treatment options for diabetic patients. The ability to measure calcium levels in beta-cells serves as an important indicator of beta-cell function, as the influx of calcium ions triggers insulin release. Here we describe a protocol for monitoring the glucose-stimulated calcium influx in zebrafish beta-cells by using GCaMP6s, a genetically encoded sensor of calcium. The method allows monitoring the intracellular calcium dynamics with single-cell resolution in ex vivo mounted islets. The glucose-responsiveness of beta-cells within the same islet can be captured simultaneously under different glucose concentrations, which suggests the presence of functional heterogeneity among zebrafish beta-cells. Furthermore, the technique provides high temporal and spatial resolution, which reveals the oscillatory nature of the calcium influx upon glucose stimulation. Our approach opens the doors to use the zebrafish as a model to investigate the contribution of genetic and environmental factors to beta-cell function and dysfunction.

Beta-cell functionality is important for blood-glucose homeostasis, which is evaluated at single-cell resolution using a genetically encoded reporter for calcium influx.

تحليل وظيفة خلايا بيتا باستخدام تصوير الكالسيوم القرار خلية واحدة في الجزيرات الزرد

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an application of smFISH to measure the rates of transcription and mRNA degradation in Escherichia coli. As smFISH is based on fixed cells, we perform smFISH at multiple time points during a time-course experiment, i.e., when cells are undergoing synchronized changes upon induction or repression of gene expression. At each time point, sub-regions of an mRNA are spectrally distinguished to probe transcription elongation and premature termination. The outcome of this protocol also allows for analyzing intracellular localization of mRNAs and heterogeneity in mRNA copy numbers among cells. Using this protocol many samples (~50) can be processed within 8 h, like the amount of time needed for just a few samples. We discuss how to apply this protocol to study the transcription and degradation kinetics of different mRNAs in bacterial cells.

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

This protocol describes an application of single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) to measure the in vivo kinetics of mRNA synthesis and degradation.

فحص حركية الميرنا في المكان والزمان في الإشريكية القولونية باستخدام الفلورس أحادي الجزيء بلونين في التهجين الموقعي

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an ...

جيل من تفرقوا Presomitic الأديم المتوسط ​​الثقافات خلية التصوير من اسماك الزرد الإنقسام على مدار الساعة في خلايا واحدة

جيل من تفرقوا Presomitic الأديم المتوسط الثقافات خلية التصوير من اسماك الزرد الإنقسام على مدار الساعة في خلايا واحدة