ونود أن نشكر كيرت ميزر من إيزيس الصيدلة لتقديم المشورة المتعلقة جراحة بلعة ICV، وكذلك إيزيس الصيدلة ككل لتوريد مختبرنا مع منظمات خدمات الإيدز. وعلاوة على ذلك، نود أن نشكر كاري Shaner لمراجعة هذه المادة. معتمدة TMM وSLD بواسطة المعاهد الوطنية للصحة منح P50AG005681، K08NS074194، وR01NS078398.

<ol>
	<li>Crooke, S. T., Bennett, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+antisense+oligonucleotide+therapeutics.">Progress in antisense oligonucleotide therapeutics.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 36, 107-129 (1996).</li><li>Sazani, P., Kole, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+potential+of+antisense+oligonucleotides+as+modulators+of+alternative+splicing.">Therapeutic potential of antisense oligonucleotides as modulators of alternative splicing.</a> The Journal of Clinical Investigation. 112 (4), 481-486 (2003).</li><li>Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxic+Proteins+in+Neurodegenerative+Disease.">Toxic Proteins in Neurodegenerative Disease.</a> Science. 296 (5575), 1991-1995 (2002).</li><li>Ross, C. A., Poirier, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+and+neurodegenerative+disease.">Protein aggregation and neurodegenerative disease.</a> Nature Medicine. 10, S10-S17 (2004).</li><li>Miller, T. M., Smith, R. A., Kordasiewicz, H., Kaspar, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-Targeted+Therapies+for+the+Central+Nervous+System.">Gene-Targeted Therapies for the Central Nervous System.</a> Archives of Neurology. 65 (4), 447-451 (2008).</li><li>Vickers, T. A., Koo, S., Bennett, C. F., Crooke, S. T., Dean, N. M., Baker, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Reduction+of+Target+RNAs+by+Small+Interfering+RNA+and+RNase+H-dependent+Antisense+Agents.">Efficient Reduction of Target RNAs by Small Interfering RNA and RNase H-dependent Antisense Agents.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278, 7108-7118 (1074).</li><li>Smith, R. A., Miller, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisense+Oligonucleotide+therapy+for+neurodegenerative+disease.">Antisense Oligonucleotide therapy for neurodegenerative disease.</a> The Journal of Clinical Investigation. 116 (8), 2290-2296 (2006).</li><li>Rosen, D. R., Siddique, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+Cu/Zn+superoxide+disumutase+gene+are+associated+with+familial+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Mutations in Cu/Zn superoxide disumutase gene are associated with familial amyotrophic lateral sclerosis.</a> Nature. 362, 6415-62 (1993).</li><li>Haidet-Phillips, A. M., Hester, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+from+familial+and+sporadic+ALS+patients+are+toxic+to+motor+neurons.">Astrocytes from familial and sporadic ALS patients are toxic to motor neurons.</a> Nature Biotechnology. 29, 824-828 (2011).</li><li>Furukawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathological+roles+of+wild-type+Cu,Zn-superoxide+dismutase+in+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis.">Pathological roles of wild-type Cu,Zn-superoxide dismutase in Amyotrophic Lateral Sclerosis.</a> Neurology Research International. 2012, 1-6 (2012).</li><li>Hua, Y., Sahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisense+correction+of+SMN2+splicing+in+the+CNS+rescues+necrosis+in+a+type+III+SMA+mouse+model.">Antisense correction of SMN2 splicing in the CNS rescues necrosis in a type III SMA mouse model.</a> Genes and Development. 24, 1634-1644 (2010).</li><li>Passini, M. A., Bu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisense+Oligonucleotide+Delivered+to+the+Mouse+CNS+Ameliorate+Symptoms+of+Severe+Spinal+Muscular+Atrophy.">Antisense Oligonucleotide Delivered to the Mouse CNS Ameliorate Symptoms of Severe Spinal Muscular Atrophy.</a> Science Translational Medicine. 3 (72), (2011).</li><li>Kordasiewicz, H. B., Stanek, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+Therapeutic+Reversal+of+Huntington's+Disease+by+Transient+Repression+of+Huntingtin+Synthesis.">Sustained Therapeutic Reversal of Huntington's Disease by Transient Repression of Huntingtin Synthesis.</a> Neuron. 74 (6), 1031-1044 (2012).</li><li>Pritchett-Corning, K. R., Mulder, G. B., Luo, Y., White, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+Rodent+Surgery+for+the+New+Surgeon.">Principles of Rodent Surgery for the New Surgeon.</a> J. Vis. Exp. (47), e2586 (2011).</li><li>Planel, E., Richter, K. E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anesthesia+Leads+to+Tau+Hyperphosphorylation+through+Inhibition+of+Phosphatase+Activity+by+Hypothermia.">Anesthesia Leads to Tau Hyperphosphorylation through Inhibition of Phosphatase Activity by Hypothermia.</a> The Journal of Neuroscience. 27 (12), 3090-3097 (2007).</li><li>Southwell, A. L., Skotte, N. H., Bennett, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisense+oligonucleotide+therapeutics+for+inherited+neurodegenerative+diseases.">Antisense oligonucleotide therapeutics for inherited neurodegenerative diseases.</a> Trends in Molecular Medicine. , (2012).</li><li>Kole, R., Krainer, A. R., Altman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+therapeutics:+beyond+RNA+interference+and+antisense+oligonucleotides.">RNA therapeutics: beyond RNA interference and antisense oligonucleotides.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 11, 125-140 (2012).</li></ol>

تلقي الكتاب أليغنوكليوتيد] العقاقير الخاصة بهم من إيزيس الصيدلة.

القدرة على توصيل الأدوية عالميا في الجهاز العصبي المركزي كما هو موضح في الفيديو هي تقنية قوية للغاية التي هي سهلة التعلم والاستخدام على حد سواء. مع الممارسة، وزرع مضخة واحدة أو ICV بلعة يمكن أن تكتمل في 10 دقيقة، والسماح لأفواج كبيرة من الفئران لتلقي العلاج في نفس الوقت. هذا هو مفيدة بشكل خاص للدراسات مع قراءات السلوكية، كما بأعداد أكبر لسلوك الماوس حاسمة للمساعدة في رؤية اختلافات كبيرة. وبناء على تجاربنا تقديم خدمات الإيدز عن طريق المضخات وحقن بلعة، لاحظنا بعض الايجابيات والسلبيات لكل طريقة. وتجدر الإشارة إلى أن هذه هي آراء في مختبرنا، وربما لا يكون صحيحا لجميع الموديلات الماوس والفئران. نجد الاستفادة من استخدام مضخات هو قدرتها على تقديم كمية عالية من ASO منذ يتم توزيع ASO على مدى فترة أطول بكثير من الوقت. هذا عادة ما يعادل ضربة قاضية يعد المستمر أو الربط بعد نشطASO التسريب، على الرغم من أن هذا قد لا يكون الحال دائما. السماح للمضخات أيضا لوضع جدول زمني دقيق لتسليم ASO (14 يوما، 28 يوما، أو 42 يوما) ويمكن تغيير مضخات مرة واحدة للسماح للتسريب ASO حتى تعد نشطة. ومع ذلك، لاحظنا أن تغيير تضخ أكثر من مرة يزيد من تقلب بسبب تشكيل جيوب ليفية حول المضخة التي تمنع من امتصاص السوائل مضخة بشكل صحيح. والعيب من المضخات هو أن بعض الفئران لا يتسامح مع مضخة، فضلا عن غيرهم. إذا كان خط المعدلة وراثيا كنت تعمل مع أكثر هشاشة، قد يكون مضخة مرهق للغاية. تحتاج إلى مضخات أيضا إلى إزالتها بعد ضخ النهائي، إخضاع الفئران لعملية جراحية أخرى والتخدير المضافة. إذا تقوم بعمل السلوك، من المهم بصفة خاصة لإزالة مضخة والسماح لمدة 1-2 أسابيع على الأقل من الانتعاش منذ وجود المضخة سوف تؤثر على بعض السلوكيات في الفئران. مع ICV بلعة حقن، ميزة واحدة من حيث التكلفة. هناكالاستثمار مقدما لشراء المحاقن والإبر، ولكن مع مرور الوقت، والحقن البلعة هي فعالة من حيث التكلفة أكثر حيث لا توجد مضخات / أنابيب / أنابيب القسطرة لشراء. وعموما، هناك أقل تصل بين الحفاظ على مع حقن بلعة ICV نظرا لعدم وجود قنية والمضخات. نجد أيضا أن بلعة ICV يمكن استخدامها لتقديم خدمات الإيدز على الفئران الأصغر سنا الهشة و / أو أكثر. والعيب من ICV بلعة هو أنه في حقنة واحدة. لا قدر ASO العام يمكن تسليمها من خلال هذا الطريق، وإذا كانت مدة عمل ASO المستخدمة قصيرة، فإن الآثار ضربة قاضية / الربط أيضا أن تكون قصيرة الأجل. كل من مضخات التناضحي فضلا عن البلعة ICV لديها القدرة على تقديم خدمات الإيدز التي يمكن أن البروتينات ضربة قاضية أو تغيير الربط من الجينات في الجهاز العصبي المركزي بأكمله القوارض، وهي تقنية لها تطبيقات واسعة في مجالات متعددة ذات صلة علم الأعصاب. نقترح تجريب كل أساليب التسليم إذا كنت غير متأكد من طريقة التعاطي هو الانسب لبلدكمدراسة pecific.

بعض الأدوية غير قادر على عبور حاجز الدم في الدماغ (BBB)، والتي تتطلب الجهاز العصبي المركزي مباشرة (CNS) التسليم. للتحايل على BBB، والمخدرات، يمكن تسليمها مباشرة الى الدماغ باستخدام أساليب وصفها. بينما مختبرنا ورقة التركيز هنا مفصلة عن أليغنوكليوتيد] العقاقير (منظمات خدمات الإيدز)، والمخدرات الأخرى، مثل الجزيئات الصغيرة، والأجسام المضادة، وناقلات العلاج الجيني، وغيرها، ويمكن أيضا أن يتم تسليمها من خلال النهج نفسه بالضبط. بعض البروتينات تلعب دورا أساسيا في التسبب في أمراض الاعصاب. هذه البروتينات غالبا ما تشكل الأنواع السامة وتتراكم في المجاميع، مما يؤدي في نهاية المطاف إلى الموت العصبية والأمراض العصبية اللاحقة 3-4. في محاولة لإبطاء أو حتى وقف تطور هذه الأمراض، قد يكون الخيار العلاجي واحدة لاستهداف مباشرة وتقلل من البروتين المسبب للمرض. ومع ذلك، وغالبا ما توجد هذه البروتينات بتواجد مطلق من خلال الجهاز العصبي المركزي، مما يجعل من الصعب على البريد<html> استهداف ffectively لهم على نطاق عالمي. من أجل استهداف الجينات في جميع أنحاء الجهاز العصبي المركزي بأكمله، ونحن إدارة منظمات خدمات الإيدز في الماوس السائل النخاعي (CSF) عن طريق البطين الجانبي لتجاوز BBB. هذا أسلوب معين يستفيد من نظام البطين الماوس الذي يغمر المخ بأكمله والحبل الشوكي، مما يسمح للتوزيع على نطاق واسع من منظمات خدمات الإيدز. نحن نستخدم منظمات خدمات الإيدز التي هي 18-20 مير RNA مثل الجزيئات التي تربط مباشرة تسلسل مرنا الهدف، واعتمادا على التعديلات الكيميائية ASO، إما A) تجنيد ريبونوكلياز-H إلى تدهور مرنا تؤدي إلى ضربة قاضية أو B) تحول الربط البديل 1 ، 2،16،17. وتجدر الإشارة إلى أن وجود جزيئات متعددة لهدمت بروتين معين في الجسم الحي، بما في ذلك shRNA. منذ هذه الجزيئات ليست هي محور هذه المقالة، نوجه القارئ إلى مراجعة المقالات التي أفضل آليات ضربة قاضية التفاصيل من العمل والمزايا / عيوب كل منها 5-6. jove_content &quot;&gt; في العمل قبل، ونحن قد استخدمت منظمات خدمات الإيدز لاستهداف البروتين الفائق ديسموتاز 1 (SOD1) في نموذج الفئران المعدلة وراثيا من التصلب الجانبي الضموري (ALS) 7 (الشكل 4). الطفرات في SOD1 تحدث في حوالي 2٪ من جميع ALS 8 الحالات، على الرغم من أنه قد تم الافتراض مؤخرا أن SOD1 قد تلعب دورا هاما في ALS متفرقة فضلا 9-10. من خلال خفض مجمل مستويات SOD1 الفئران المعدلة وراثيا في ALS، البقاء على قيد الحياة بعد بداية حدثت زيادة كبيرة 7. وكانت هذه البيانات الهامة الأولى لإظهار أن العلاج ASO في الجهاز العصبي المركزي يمكن أن يكون له أثر إيجابي عميق على نموذج مرض عصبي. ومنذ ذلك الحين، دخلت منظمات خدمات الإيدز تستهدف SOD1 الإنسان وأنجزت بنجاح المرحلة الاولى من التجارب السريرية البشرية مع آثار جانبية أقل (Clnicaltrails.gov NCT01041222) ، كما قدمت في عام 2012 64 عشر الأكاديمية الأمريكية لعلم الأعصاب السنوي. خطط لتحريك منظمات خدمات الإيدز انتقل إلى المرحلة الثانية من التجارب تجري حاليا. <pالطبقة = &quot;jove_content&quot;&gt; بينما كان استهداف SOD1 المظاهرة الأولى من استخدام منظمات خدمات الإيدز لعلاج الأمراض العصبية، ومنذ ذلك الحين أجريت عدة دراسات أخرى تبحث في أمراض مختلفة، وأهداف كل منها البروتين. في عامي 2010 و 2011، واستخدمت التحول من الربط بقاء البروتين من الخلايا العصبية الحركية 2 (SMN2) منظمات خدمات الإيدز أن في نماذج الماوس المعدلة وراثيا من ضمور العضلات الشوكي (SMA)، وأسفرت عن تحسن كبير في الظواهر المرض 11،12. هذه منظمات خدمات الإيدز الربط هي الآن في المرحلة الأولى من التجارب السريرية في الأطفال الذين يعانون من SMA (Clinicaltrails.gov NCT01494701). بالإضافة إلى ذلك، وقد تبين مؤخرا أن إدارة عابر من منظمات خدمات الإيدز تستهدف الجين huntingtin تمكنوا من انقاذ بشكل كبير نموذج الفأر وهنتنغتون، حتى بعد أن عادت مستويات البروتين huntingtin إلى خط الأساس 13. في كل من هذه الدراسات، تم تسليم منظمات خدمات الإيدز إلى البطين الجانبي لخفض مجمل مستويات الجين أو الجينات من خلال تغيير الربطالجهاز العصبي المركزي بأكمله. كلا مضخات ناضح وحقن بلعة واحدة يمكن استخدامها لتقديم خدمات الإيدز إلى CSF. مضخات تسمح بطيئة، والتسليم مستمر، في حين أن intracerebroventricular (ICV) البلعة هو سريعة والحقن لمرة واحدة. وقد استخدمنا كل من هذه الأساليب مع النجاح، على الرغم من أننا لم تبلغ المقارنة المباشرة بين المضخة والبلعة في خط المعدلة وراثيا واحد. استخدام منظمات خدمات الإيدز في الجهاز العصبي المركزي هو وسيلة قوية لخفض مجمل مستويات البروتين و / أو تغيير الربط من عدة بروتينات. بينما نستخدم منظمات خدمات الإيدز حصرا كعلاج لاضطرابات عصبية، ونحن ندرك أن الحقول الأخرى قد تستفيد أيضا من هذه التقنية. طالما أن البروتين من الفائدة يتم التعبير في الجهاز العصبي المركزي والهدف النهائي هو تحقيق تغييرات على مستوى الجهاز العصبي المركزي في التعبير الجيني، وذلك باستخدام منظمات خدمات الإيدز في تقنيات أثبتت قد تكون مفيدة جدا.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>PREPARING ALZET OSMOTIC PUMPS </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Alzet Osmotic Pump 14 days</td>
 <td>DURECT</td>
 <td>Model 1002</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Alzet Osmotic Pump 28 days</td>
 <td>DURECT</td>
 <td>Model 2004</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Alzet Osmotic Pump 42 days</td>
 <td>DURECT</td>
 <td>Model 2006</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2.5 mm Catheters</td>
 <td>PlasticsOne</td>
 <td>3280PM/SPC</td>
 <td>Custom ordered to 2.5 mm Catheter Length</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vinyl Catheter Tubing</td>
 <td>DURECT</td>
 <td>7760</td>
 <td>ID: 0.027", OD: 0.045"</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.9% Sodium Chloride, Irrigation, USP</td>
 <td>Baxter</td>
 <td>2F7124</td>
 <td>NOT to be used in pumps or tubing</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.9% Sodium Chloride, Injection, USP</td>
 <td>Hospira</td>
 <td>NDC 0409-4888-10</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>p60 Petri Dish (Sterilized)</td>
 <td>TRP</td>
 <td>93060</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Surgical Blades (Sterile)</td>
 <td>Butler Schein</td>
 <td>#007319</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Latex Surgical Gloves (Sterile)</td>
 <td>Micro-Touch</td>
 <td></td>
 <td>CatNo will depend on size of the gloves needed</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sterile Towel Drape</td>
 <td>Dynarex</td>
 <td>4410</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>.2um Syringe Filters</td>
 <td>PALL</td>
 <td>4192</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 ml Syringe (Sterile)</td>
 <td>BD</td>
 <td>309625</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50 ml Conical Tubes</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>100% Ethanol</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>PUMP &amp; BOLUS SURGERY PROTOCOLS </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Curved Forceps</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>11001-12</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Curved Hemostat</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>13009-12</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fine Sharp Scissors</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>14060-09</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Curved Blunt Scissors</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>14029-10</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bone Cutter</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>16104-14</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Straight Hemostat</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>12002-12</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Syringe</td>
 <td>Hamilton</td>
 <td>7653-01</td>
 <td>10 &mu;l gas-tight with removable needles</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Needles</td>
 <td>Hamilton</td>
 <td>7758-04</td>
 <td>26 gauge, Point Style: 2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5-0 Nylon Suture Thread</td>
 <td>Covidient</td>
 <td>SN-871</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Alcohol Pads</td>
 <td>Select</td>
 <td>#521</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cotton Swabs (sterile)</td>
 <td>Puritan</td>
 <td>REF 806-WC</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Super Glue</td>
 <td>Loctite</td>
 <td></td>
 <td>Longneck Bottles</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CAUTION: FastGreen Dye</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>F7252-5G</td>
 <td>Wear Eyeshields and Gloves when handling this product</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Antibiotic Cream</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Eye Ointment</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Electric Shaver</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>70% Ethanol</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10% Provadone Iodine</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>3% Hydogen Peroxide</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Warming Pad</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bead Sterilizer</td>
 <td>SouthPointe Surgical</td>
 <td>GRM5-1450</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Small Animal Stereotaxic</td>
 <td>Kopf</td>
 <td>Model 940</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nose Cone</td>
 <td>Kopf</td>
 <td>Model 923-B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ear Bars</td>
 <td>Kopf</td>
 <td>Model 921</td>
 <td>This model is optional</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cannula Driver</td>
 <td>Kopf</td>
 <td>Model 1966</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Syringe Holder</td>
 <td>Kopf</td>
 <td>Model 1972</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Temperature Control System</td>
 <td>Kopf</td>
 <td>Model TCAT-2LV</td>
 <td>Optional</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Oxygen/Isoflurane System</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

direct intraventricular delivery of drugs to the rodent central nervous system

ونظرا لعدم القدرة على عبور حاجز الدم في الدماغ، والحاجة ليتم تسليمها مباشرة إلى الجهاز العصبي المركزي (CNS) بعض الأدوية. ويركز تحديدا على مختبرنا أليغنوكليوتيد] العقاقير (منظمات خدمات الإيدز)، على الرغم من أن التقنيات يظهر في شريط الفيديو هنا يمكن أن تستخدم أيضا لتقديم مجموعة كبيرة من المخدرات الأخرى إلى الجهاز العصبي المركزي. أليغنوكليوتيد] العقاقير (منظمات خدمات الإيدز) لديها القدرة على أهداف ضربة قاضية تسلسل محدد 1 وكذلك نسب الإسوي التحول من جينات معينة 2. لتحقيق واسع النطاق ضربة قاضية الجينات أو الربط في الجهاز العصبي المركزي من الفئران، ويمكن أن يتم تسليم منظمات خدمات الإيدز في الدماغ باستخدام طريقين منفصلين الإدارة، وكلاهما علينا أن نظهر في شريط الفيديو. الاستخدامات الأولى Alzet مضخات ناضح، وصله بجهاز القسطرة التي يتم زرعها جراحيا في البطين الجانبي. وهذا يسمح للمنظمات خدمات الإيدز إلى أن غرست بشكل مستمر إلى الجهاز العصبي المركزي لفترة محددة من الزمن. والثاني ينطوي على حقن بلعة واحدة من مرحباتركيز هرمون النمو من ASO إلى البطين الجانبي الأيمن. كلا أساليب استخدام نظام البطين الدماغي الماوس لتسليم ASO إلى الدماغ والحبل الشوكي بأكمله، على الرغم اعتمادا على احتياجات الدراسة، قد يكون من المفضل أسلوب واحد على الآخر.

بعد ضخ المضخة أو وقت معين بعد البلعة حقن ICV (نستخدم بشكل روتيني أربعة أسابيع)، من المهم لاختبار فعالية منظمات خدمات الإيدز. ونحن نوصي بأخذ مناطق مختلفة من الدماغ والحبل الشوكي لقياس مستويات / الإسوية من الجين المستهدف، سواء على المستوى الكمي باستخدام مرنا في الوقت الحقيقي PCR وكذلك مستوى البروتين باستخدام إما لطخة غربية أو ELISA (الشكل 4 لسبيل المثال نشرت ). وهذا سوف يساعد تحديد ASO فعالية في جميع أنحاء المناطق CNS مختلفة. إذا كان نصف عمر البروتين المستهدف هو طويل، ونحن ننصح الانتظار لفترة أطول بعد ASO التسريب من أجل تقييم أقصى ضربة قاضية البروتين أو الربط. ومن المهم أيضا لاختبار التوزيع بنسبة ضئيلة. ضخ مضخة يؤدي في التوزيع من خلال نصفي الكرة الأرضية على حد سواء المماثل والمقابل، على الرغم من تركيز ASO أعلى وغالبا ما ينظر في مناطق أقرب إلى نظام البطين 16. ICV بلعة حقن تسفر عن مزيد من unifoتوزيع RM من خلال الجهاز العصبي المركزي بنسبة ضئيلة 16، على الرغم من أن الآثار قد لا تستمر طويلا. نوجه القارئ إلى ساوثويل وآخرون. لرؤية مقارنة مباشرة لمضخة مقابل بلعة التوزيع بنسبة ضئيلة 16. نوصي أيضا اختبار جرعات متعددة فضلا عن مدة العمل لمنظمات خدمات الإيدز لأن كل ASO سوف تتصرف بشكل مختلف قليلا في الجسم الحي. منظمات خدمات الإيدز وعادة ما يكون مدة طويلة نسبيا من العمل، مع ضربة قاضية الهدف أو الربط استمرت عدة أشهر بعد التسليم ASO. وبالإضافة إلى ذلك، فإن بعض منظمات خدمات الإيدز تعمل على نحو أفضل من غيرها، وسوف بعض الأهداف الجين يكون من الأسهل ضربة قاضية من غيرها. وبسبب هذا، عندما ASOS فحص لتحديد مرشح الرصاص، نوصي اختبار لا يقل عن 3-5 منظمات خدمات الإيدز في الجسم الحي مع ن = 4-6 الكبار الفئران في ASO كما تمريرة الأول. في حالة استخدام المخدرات الأخرى من منظمات خدمات الإيدز، فإنه سيكون من المهم أيضا أن الطيار تركيز المثالي المخدرات، ومدة المخدرات من العمل، والجهاز العصبي المركزي المخدراتتوزيع لهذا المركب محددة. <img alt="الجدول 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50326/50326table1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50326/50326table1.jpg" /> الجدول 1. جراحة الإحداثيات. الإحداثيات المستخدمة لتصل إلى البطين الجانبي الحق في كل من الفئران والجرذان عندما زرع مضخات ناضح وكذلك إجراء عملية intracerebroventricular (ICV) البلعة. كلا إحداثيات، لمضخات والبلعة ICV، استهداف البطين الجانبي الأيمن. نحن نستخدم مجموعتين مختلفتين لأن هذه هي ما لدينا الأكثر خبرة ومعرفة مع توفير توزيع ممتازة من ASO. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/50326/50326fig1.jpg" /> الشكل 1. إعداد التجسيمي. (A) المعدات اللازمة لمضخة التجسيمي Alzet والعمليات الجراحية حقن بولس الأول) حبة الزجاج تعقيمص. الثاني) رقمية عبر الاقمار الصناعية. الثالث) قاعدة التجسيمي بأذرع متحركة. الرابع) درجة الحرارة التي تسيطر عليها سادة التدفئة. V) isoflurane و/ نظام الأوكسجين. السادس) غرفة isoflurane و. (B) عن قرب من مخروط الأنف والأذن القضبان. (C) اثنين من إرفاق المستندات المطلوبة. اليسار: الحقنة / حامل إبرة لحقن ICV البلعة. الحق: سائق قنية لالأسموزي زرع المضخة. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/50326/50326fig2.jpg" /> الشكل 2. Alzet الأسموزي زرع مضخة. (A) Alzet خيارات مضخة الاسموزي للفئران. مضخات 14 يوم (0.25 ميكرولتر / ساعة)، ومضخات يوم 28 (0.25 ميكرولتر / ساعة)، و 42 مضخات اليوم (0.15 ميكرولتر / ساعة) (B) إحداثيات لزرع مضخة من bregma: -0.5 مم مؤخره، -1.1 مم الجانبي ( اليمين)، و-2.5 ملم بطني (طول القسطرة). (C) بعد القيادة القسطرة من خلالالجمجمة والإلتصاق قنية، يتم مسح الصبغة عن طريق القسطرة لتقييم التنسيب المناسب للقسطرة في البطين الجانبي. (D) الدماغ Perfused مباشرة بعد صبغ تدار كما في (C). إذا تم وضع القسطرة بنجاح في البطين، وسيتم توزيع الصبغة في جميع أنحاء منظومة البطين الماوس. <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/50326/50326fig3.jpg" /> الشكل (3). Intracerebroventricular حقن بولس. (A) المتوافق مع حقن بلعة من bregma: +0.3 ملم الأمامي، -1.0 مم الجانبي (على اليمين)، و-3.0 ملم بطني (B) بعد القيادة الإبرة من خلال الجمجمة -3.0 ملم بطني، يتم الضغط صبغ من خلال حقنة. لتقييم التنسيب المناسب من الإبرة في البطين في وقت لاحق. (C) الدماغ Perfused بعد فترة وجيزة صبغ تدار كما في (B). إذا وضعت إبرة بنجاح في البطين، علىوسيتم توزيع الصبغة في جميع أنحاء منظومة البطين الماوس. <img alt="الشكل 4" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50326/50326fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50326/50326fig4.jpg" /> الشكل 4. أليغنوكليوتيد] العقاقير تقلل SOD1 الفئران في الجسم الحي (الشكل مأخوذة مباشرة من سميث وآخرون. 7). (AD) بواسطة العقاقير SOD1 [أليغنوكليوتيد الهيئة العامة للسدود r146192 أو الهيئة العامة للسدود سارعت وغرست لمدة 28 يوما في البطين الجانبي الأيمن من الفئران العادية بمعدل 100 ميكروغرام / يوم (A) الذاتية مستويات مرنا SOD1 من الدماغ والحبل الشوكي مقاسا QRT-PCR. ( B) SOD1 وA-تويولين مستويات البروتين بعد ASO التسريب. (C و D) مستويات البروتين لتويولين وSOD1 كميا لمناطق مختلفة من الدماغ التالي التسريب. (E) منظمات خدمات الإيدز ضد presenilin 1 أو GSK-3 وبيتا؛ وقد غرست لمدة 2 أسابيع في البطين الجانبي الأيمن من الفئران nontransgenic ومستويات مرنا المقررة في حق أمامي / الزمانية اللحاء. مستنسخة بإذن من الجمعية الأمريكية للالتحقيقات السريرية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50326/50326fig4large.jpg" target="_blank">انقر هنا لعرض أكبر شخصية</a> . <img alt="الرقم 5" src="/files/ftp_upload/50326/50326fig5.jpg" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50326/50326fig5highres.jpg"/> الشكل 5. تشغيل خياطة مفرش أفقي. وخيوطها 5-0 النايلون خيوط الجروح داخل وخارج الجلد، بدءا الأمامي والخلفي العمل، مع التركيز أكثر على قنية. مرة واحدة بعد أن وصلت إلى النقطة الأكثر الخلفي، ثم يتم جلب خيوط الجروح النسخ الاحتياطي ومترابطة على مدى قنية مرة أخرى. وهذا يضمن إغلاق الجرح السليم ويمنع قنية / أنابيب من العمل من خلال الجلد.

Watch this Scientific Journal Video about Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System at JoVE.com

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

نحن تصف طريقة لاستهداف المخدرات الى الجهاز العصبي المركزي عن طريق إما زرع القسطرة أو إجراء عملية حقن بلعة إلى البطين الجانبي الحق في الفئران. ونحن نركز بشكل خاص على إيصال أليغنوكليوتيد] العقاقير. هذه التقنية غير قابلة للتكيف بسهولة إلى الأدوية الأخرى والفئران.

مباشرة داخل البطين تسليم المخدرات الى القوارض الجهاز العصبي المركزي

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

direct-intraventricular-delivery-drugs-to-rodent-central-nervous

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Pharmacology

Neuroscience

Unit 1

Pharmacotherapy of Psychosis and Mania

SCIENTISTS IN ACTION

59.7K Views.  Washington University in St. Louis School of Medicine. نحن تصف طريقة لاستهداف المخدرات الى الجهاز العصبي المركزي عن طريق إما زرع القسطرة أو إجراء عملية حقن بلعة إلى البطين الجانبي الحق في الفئران. ونحن نركز بشكل خاص على إيصال أليغنوكليوتيد] العقاقير. هذه التقنية غير قابلة للتكيف بسهولة إلى الأدوية الأخرى والفئران.

Video: Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Systemic and Local Drug Delivery for Treating Diseases of the Central Nervous System in Rodent Models

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution in assessing therapeutic efficacy. Between the two major classifications of administration, local vs. systemic, systemic delivery approaches are often preferred due to ease of administration. However, systemic delivery may result in suboptimal drug concentration being achieved in the CNS, and lead to erroneous conclusions regarding agent efficacy. Local drug delivery methods are more invasive, but may be necessary to achieve therapeutic CNS drug levels. Here, we demonstrate proper technique for three routes of systemic drug delivery: intravenous injection, intraperitoneal injection, and oral gavage. In addition, we show a method for local delivery to the brain: convection-enhanced delivery (CED). The use of fluorescently-labeled compounds is included for in vivo imaging and verification of proper drug administration. The methods are presented using murine models, but can easily be adapted for use in rats.

Thorough preclinical testing of drugs that act in the central nervous system often involves assessing and comparing drug biodistribution in association with specific routes of administration. Here, three commonly used methods of systemic delivery (intravenous, intraperitoneal, and oral) as well as a method for local delivery (convection-enhanced delivery) are demonstrated in mice.

النظامية والمحلية تسليم المخدرات لعلاج أمراض الجهاز العصبي المركزي في المجموعات القوارض

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution ...

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, both in preclinical and clinical studies. However, to date results regarding functional outcome and/or tissue regeneration following stem cell transplantation are quite diverse. Generally, a clinical benefit is observed without profound understanding of the underlying mechanism(s)1. Therefore, multiple efforts have led to the development of different molecular imaging modalities to monitor stem cell grafting with the ultimate aim to accurately evaluate survival, fate and physiology of grafted stem cells and/or their micro-environment. Changes observed in one or more parameters determined by molecular imaging might be related to the observed clinical effect. In this context, our studies focus on the combined use of bioluminescence imaging (BLI), magnetic resonance imaging (MRI) and histological analysis to evaluate stem cell grafting.
BLI is commonly used to non-invasively perform cell tracking and monitor cell survival in time following transplantation2-7, based on a biochemical reaction where cells expressing the Luciferase-reporter gene are able to emit light following interaction with its substrate (e.g. D-luciferin)8, 9. MRI on the other hand is a non-invasive technique which is clinically applicable10 and can be used to precisely locate cellular grafts with very high resolution11-15, although its sensitivity highly depends on the contrast generated after cell labeling with an MRI contrast agent. Finally, post-mortem histological analysis is the method of choice to validate research results obtained with non-invasive techniques with highest resolution and sensitivity. Moreover end-point histological analysis allows us to perform detailed phenotypic analysis of grafted cells and/or the surrounding tissue, based on the use of fluorescent reporter proteins and/or direct cell labeling with specific antibodies.
In summary, we here visually demonstrate the complementarities of BLI, MRI and histology to unravel different stem cell- and/or environment-associated characteristics following stem cell grafting in the CNS of mice. As an example, bone marrow-derived stromal cells, genetically engineered to express the enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) and firefly Luciferase (fLuc), and labeled with blue fluorescent micron-sized iron oxide particles (MPIOs), will be grafted in the CNS of immune-competent mice and outcome will be monitored by BLI, MRI and histology (Figure 1).

This article describes an optimized sequence of events for multimodal imaging of cellular grafts in rodent brain using: (i) in vivo bioluminescence and magnetic resonance imaging, and (ii) post mortem histological analysis. Combining these imaging modalities on a single animal allows cellular graft evaluation with high resolution, sensitivity and specificity.

التصوير المتعدد الوسائط من زرع الخلايا الجذعية في الجهاز العصبي المركزي من الفئران

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing therapeutic approaches. Lentiviral vectors are attractive tools in transduction of neurons and other cell types in CNS as they transduce both dividing and non-dividing cells, support sustained expression of transgenes, and have relatively large packaging capacity and low toxicity 1-3. Lentiviral vectors have been successfully used in transducing many neural cell types in vitro 4-6 and in animals 7-10.
Great efforts have been made to develop lentiviral vectors with improved biosafety and efficiency for gene delivery. The current third generation replication-defective and self-inactivating (SIN) lentiviral vectors are depicted in Figure 1. The required elements for vector packaging are split into four plasmids. In the lentiviral transfer plasmid, the U3 region in the 5' long terminal repeat (LTR) is replaced with a strong promoter from another virus. This modification allows the transcription of the vector sequence independent of HIV-1 Tat protein that is normally required for HIV gene expression 11. The packaging signal (&Psi;) is essential for encapsidation and the Rev-responsive element (RRE) is required for producing high titer vectors. The central polypurine tract (cPPT) is important for nuclear import of the vector DNA, a feature required for transducing non-dividing cells 12. In the 3' LTR, the cis-regulatory sequences are completely removed from the U3 region. This deletion is copied to 5' LTR after reverse transcription, resulting in transcriptional inactivation of both LTRs. Plasmid pMDLg/pRRE contains HIV-1 gag/pol genes, which provide structural proteins and reverse transcriptase. pRSV-Rev encodes Rev which binds to the RRE for efficient RNA export from the nucleus. pCMV-G encodes the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-G) that replaces HIV-1 Env. VSV-G expands the tropism of the vectors and allows concentration via ultracentrifugation 13. All the genes encoding the accessory proteins, including Vif, Vpr, Vpu, and Nef are excluded in the packaging system. The production and manipulation of lentiviral vectors should be carried out according to NIH guidelines for research involving recombinant DNA (<a href="http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf" target="_blank">http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf</a>). An approval from individual Institutional Biological and Chemical Safety Committee may be required before using lentiviral vectors. Lentiviral vectors are commonly produced by cotransfection of 293T cells with lentiviral transfer plasmid and the helper plasmids encoding the proteins required for vector packaging. Many lentiviral transfer plasmids and helper plasmids can be obtained from Addgene, a non-profit plasmid repository (<a href="http://www.addgene.org/" target="_blank">http://www.addgene.org/</a>). Some stable packaging cell lines have been developed, but these systems provide less flexibility and their packaging efficiency generally declines over time 14, 15. Commercially available transfection kits may support high efficiency of transfection 16, but they can be very expensive for large scale vector preparations. Calcium phosphate precipitation methods provide highly efficient transfection of 293T cells and thus provide a reliable and cost effective approach for lentiviral vector production.
In this protocol, we produce lentiviral vectors by cotransfection of 293T cells with four plasmids based on the calcium phosphate precipitation principle, followed by purification and concentration with ultracentrifugation through a 20% sucrose cushion. The vector titers are determined by fluorescence- activated cell sorting (FACS) analysis or by real time qPCR. The production and titration of lentiviral vectors in this protocol can be finished with 9 days. We provide an example of transducing these vectors into murine neocortical cultures containing both neurons and astrocytes. We demonstrate that lentiviral vectors support high efficiency of transduction and cell type-specific gene expression in primary cultured cells from CNS.

In this protocol we describe production, purification and titration of lentiviral vectors. We provide an example of lentiviral vector-mediated gene delivery in primary cultured neurons and astrocytes. Our methods may also apply to other cell types in vitro and in vivo.

انتاج ناقلات Lentiviral للخلايا Transducing من الجهاز العصبي المركزي

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

وضع العلامات واحدة من الخلايا في الجهاز العصبي المركزي<em&gt; ذبابة الفاكهة الدروسوفيلا</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. Understanding repair and regeneration in animals is a key question in biology. The damaged human CNS does not regenerate, and understanding how to promote the regeneration is one of main goals of medical neuroscience. The powerful genetic toolkit of Drosophila can be used to tackle the problem of CNS regeneration.
A lesion to the CNS ventral nerve cord (VNC, equivalent to the vertebrate spinal cord) is applied manually with a tungsten needle. The VNC can subsequently be filmed in time-lapse using laser scanning confocal microscopy for up to 24 hr to follow the development of the lesion over time. Alternatively, it can be cultured, then fixed and stained using immunofluorescence to visualize neuron and glial cells with confocal microscopy. Using appropriate markers, changes in cell morphology and cell state as a result of injury can be visualized. With ImageJ and purposely developed plug-ins, quantitative and statistical analyses can be carried out to measure changes in wound size over time and the effects of injury in cell proliferation and cell death. These methods allow the analysis of large sample sizes. They can be combined with the powerful genetics of Drosophila to investigate the molecular mechanisms underlying CNS regeneration and repair.

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An injury paradigm using the Drosophila larval ventral nerve cord to investigate central nervous system regeneration and repair is described. Stabbing followed by laser scanning confocal microscopy in time-lapse and fixed specimens, combined with quantitative analysis with purposefully developed software and genetics, are used to investigate the molecular mechanisms of CNS regeneration and repair.

والنموذج الإصابات المعنية بالتحقيق في وسط الجهاز العصبي في إصلاح<em&gt; ذبابة الفاكهة</em

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are tightly regulated, affecting the final dynamics of protein abundance. Various regulatory mechanisms exist at the translation step, rendering mRNA levels alone an unreliable indicator of gene expression. In addition, local regulation of mRNA translation has been particularly implicated in neuronal functions, shifting &#39;translatomics&#39; to the focus of attention in neurobiology. The presented method can be used to bridge transcriptomics and proteomics.
Here we describe essential modifications to the technique of polyribosome fractionation, which interrogates the translatome based on the association of actively translated mRNAs to multiple ribosomes and their differential sedimentation in sucrose gradients. Traditionally, working with in vivo samples, particularly of the central nervous system (CNS), has proven challenging due to the restricted amounts of material and the presence of fatty tissue components. In order to address this, the described protocol is specifically optimized for use with minimal amount of CNS material, as demonstrated by the use of single mouse spinal cord and brain. Briefly, CNS tissues are extracted and translating ribosomes are immobilized on mRNAs with cycloheximide. Myelin flotation is then performed to remove lipid rich components. Fractionation is performed on a sucrose gradient where mRNAs are separated according to their ribosomal loading. Isolated fractions are suitable for a range of downstream assays, including new genome wide assay technologies.

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

This protocol illustrates essential modifications of polyribosome fractionation in order to study the translatome of in vivo CNS samples. It allows global assessment of translation and transcription regulation through the isolation and comparison of total RNA to ribosome bound RNA fractions.

في الجسم الحي الاستجواب من النظام العصبي المركزي Translatome بواسطة Polyribosome تجزئة

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

في الجسم الحي Optogenetic تحفيز الجهاز العصبي المركزي القوارض

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique non-linear deformations, dramatically hampering one's ability to evaluate cellular morphology, distribution and connectivity in the central nervous system (CNS). However, optical clearing techniques are changing the way tissues are visualized. These approaches permit one to probe deeply into intact organ preparations, providing tremendous insight into the structural organization of tissues in health and disease. Techniques such as Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) achieve this goal by providing a matrix that binds important biomolecules while permitting light-scattering lipids to freely diffuse out. Lipid removal, followed by refractive index matching, renders the tissue transparent and readily imaged in 3 dimensions (3D). Nevertheless, the electrophoretic tissue clearing (ETC) used in the original CLARITY protocol can be challenging to implement successfully and the use of a proprietary refraction index matching solution makes it expensive to use the technique routinely. This report demonstrates the implementation of a simple and inexpensive optical clearing protocol that combines passive CLARITY for improved tissue integrity and 2,2&#8242;-thiodiethanol (TDE), a previously described refractive index matching solution.

Optical clearing techniques are revolutionizing the way tissues are visualized. In this report we describe modifications of the original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol that yields more consistent and less expensive results.

المقاصة البصري للنظام العصبي المركزي الماوس عن طريق وضوح السلبي

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

A Computerized Test Battery to Study Pharmacodynamic Effects on the Central Nervous System of Cholinergic Drugs in Early Phase Drug Development

Investigating potential pharmacodynamic effects in an early phase of central nervous system (CNS) drug research can provide valuable information for further development of new compounds. A computerized and thoroughly validated battery of neuropsychological and neurophysiological tests has been shown to be sensitive to detect drug-induced effects of multiple new and existing compounds. The test battery covers the main CNS domains, which have been shown to respond to drug effects and can be repeatedly administered following drug administration to characterize the concentration-effect profile of a drug.
The standard tests in the battery are saccadic eye movement, smooth pursuit eye movement, the Bowdle visual analog scale (VAS), the Bond and Lader VAS, body sway, adaptive tracking, visual verbal learning, and quantitative electroencephalography (qEEG). However, the test battery is adaptive in nature, meaning that it can be composed and adjusted with tests fit to investigate specific drug classes, or even specific receptors.
Showing effects of new cholinergic drugs designed to have a pro-cognitive outcome has been difficult. The pharmacological challenge model is a tool for early proof-of-pharmacology. Here, a marketed drug is used to induce temporary and reversible disease-like symptoms in healthy subjects, via a pharmacological mechanism related to the disease that is targeted as indication for the new compound. The test battery was implemented to investigate the potential of the nicotinic receptor antagonist mecamylamine to be used as a challenge model for cholinergic dysfunction, as seen in neurodegenerative disorders.
A worsening of scores in a dose dependent manner on the visual verbal learning test (VVLT; a test for learning and memory abilities) and the adaptive tracking test (a measure of visuomotor control and arousal), in particular, showed that the test battery is sensitive to showing acute pharmacodynamic effect after administration of anti-cholinergic drugs.

A validated computerized battery of neuropsychological and neurophysiological tests is used to study pharmacodynamic effects on the central nervous system of newly developed drugs in early phase development. To demonstrate the test battery, the acute effects of mecamylamine and the reversal of these effects by two agonist drugs are described.

بطارية اختبار محوسبة لدراسة تأثيرات ميكروبيولوجية على الجهاز العصبي المركزي المخدرات اتروبين في المرحلة المبكرة من تطوير العقاقير

Investigating potential pharmacodynamic effects in an early phase of central nervous system (CNS) drug research can provide valuable information for ...

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield deleterious consequences, yet the current methods for recording nervous system activity of an individual animal is costly and laborious. This suction electrode preparation of the third-instar larval central nervous system of Drosophila melanogaster, is a tractable system for testing the physiological effects of neuroactive agents, determining the physiological role of various neural pathways to CNS activity, as well as the influence of genetic mutations to neural function. This ex vivo preparation requires only moderate dissecting skill and electrophysiological expertise to generate reproducible recordings of insect neuronal activity. A wide variety of chemical modulators, including peptides, can then be applied directly to the nervous system in solution with the physiological saline to measure the influence on the CNS activity. Further, genetic technologies, such as the GAL4/UAS system, can be applied independently or in tandem with pharmacological agents to determine the role of specific ion channels, transporters, or receptors to arthropod CNS function. In this context, the assays described herein are of significant interest to insecticide toxicologists, insect physiologists, and developmental biologists for which D. melanogaster is an established model organism. The goal of this protocol is to describe an electrophysiological method to enable the measurement of electrogenesis of the central nervous system in the model insect, Drosophila melanogaster, which is useful for testing a diversity of scientific hypotheses.

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar  Drosophila Melanogaster

This protocol describes a method to record the descending electrical activity of the Drosophila melanogaster central nervous system to enable the cost-efficient and convenient testing of pharmacological agents, genetic mutations of neural proteins, and/or the role of unexplored physiological pathways.

تسجيل الكهربية لنشاط الجهاز العصبي المركزي للطور الثالث Melanogaster المورفولوجية

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield ...