אני מודה לד&quot;ר ג&#39;סיקה דומינגז Rieg לקריאה ביקורתית של כתב היד הזה. עבודה זו נתמכה על ידי איגוד לב האמריקאי (מדען פיתוח גרנט 10SDG2610034), קרל וו גוטשלק מענק מחקר של האגודה האמריקנית לנפרולוגיה, המכון הלאומי לסוכרת ומחלות עיכול וכליות או &#39;בריין למרכז אקוטי פגיעה מחקר בכליות ( P30DK079337), והמחלקה לענייני יוצאי צבא.

1. פתרונות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.85% NaCl: 8.5 גרם NaCl / 1 ליטר DDH 2 O (8.5 גר &#39;/ ל&#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.5 HEPES mol / L-pH 7.4 (לפזר 59.6 גרם של HEPES ב0.5 ליטר של DDH 2 0 ולהתאים את pH 7.4 באמצעות 10 N NaOH). </li></ol> 2. הכנה של פתרון הזרקת FITC-אינולין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוקל FITC-אינולין להכין 5% פתרון ולהתמוסס ב0.85% NaCl (בדרך כלל 100 מ&quot;ג / 2 מ&quot;ל 0.85% NaCl) על ידי חימום עד 90 מעלות צלזיוס עד שהיא נמסה לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוקל פתרון FITC-אינולין מומס ומשקל פתק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכי חתיכה 20 ס&quot;מ של קרום דיאליזה (משקל מולקולרי חתך: 1,000) ולשים בDDH 2 O למשך 30 דקות כדי להסיר NaN שיורי 3 מהקרום ולשטוף כמה פעמים לאחר מכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא מומס FITC-אינולין לתוך קרום דיאליזה וחותם כראוי עם סגרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוקל קרום דיאליזה כולו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את קרום הדיאליזה ב0.85% פתרון 1 L NaCl ומערבבים לאט אור מוגן למשך 24 שעות בroטמפרטורת אום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוקל קרום דיאליזה כולו שוב ולחשב את הריכוז החדש (מים אוסמוטי יעברו לתוך הקרום וFITC מאוגד, או מחויבים FITC-אינולין &lt;1,000 משקל מולקולרי יהיה לעזוב את הקרום, ולכן הריכוז של FITC-אינולין יקטן באופן משמעותי) . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ריכוז FITC-אינולין החדש (ג) מחושב באמצעות נוסחה הבאה: C = n / V, כאשר n = סכום FITC-אינולין ראשוני, V = נפח חדש (הבדל במשקלים של צינורות דיאליזה לפני ואחרי הדיאליזה בתוספת נפח ראשוני פתרון FITC-אינולין). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני השימוש לעקר פתרון FITC-אינולין dialyzed על ידי סינון דרך פילטר 0.22 מיקרומטר מזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממשיך FITC-אינולין מוגן מפני אור (רדיד אלומיניום) ב 4 ° C. Dialyzed ומעוקר FITC-אינולין יכול לשמש לתקופה של עד 2 שבועות. השתתף יכול להיות מומס FITC-אינולין מחדש על ידי חימום על 90 מעלות צלזיוס במשך כמה דקות. </li></ol> הערה: אם באמצעותFITC-sinistrin 16-18, אשר אינה דורש דיאליזה, ניתן לדלג את כל הצעדים הנדרשים לדיאליזה. 3. הזרקה ודם אוסף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את משקל גוף (BW) של העכברים לפני הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי עכברים עם isoflurane בקצרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתפוקה גבוהה של 6 עכברים בצעו פרוטוקול בלבד באיור 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק 2 BW μl / גרם של dialyzed FITC-אינולין למקלעת retroorbital 24 באמצעות ½ G30 במחט (להסיר בועות אוויר ממזרק המילטון 100 μl באמצעות ראשון ½ G26 במחט ולאחר מכן לעבור ל½ ה-G30 במחט ל הזרקה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך 1 מ&quot;מ של זנב עכבר עם מספריים אחת ולאסוף דם בבית 3, 5, 7, 10, 15, 35, 56 ו -75 דקות לאחר ההזרקה בNa-הפרין minicapillaries. חותם minicapillaries לאחר איסוף דם עם צ&#39;ה חותם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור דגימות מוגנות מפני אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים האטום minicapillaries בתוך המטומכה קריטית נימים וצנטריפוגות במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשבור minicapillaries באמצעות חותך יהלומים וכל פלזמה העברה על ידי pipetting לתוך צינור 0.2 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך דילול 1:10 באמצעות 2 μl של פלזמה ו18 0.5 HEPES mol / L μl (pH 7.4) בצינור מ&quot;ל 0.2 החדש (דוגמאות יכולה להיות מאוחסנות הלילה ב 4 מעלות צלזיוס במשך מדידות הקרינה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד 2 μl של דגימה מדוללת עם NanoDrop 3300 בכפילויות. התיאור והשימוש של המכשיר מתואר כאן 5. </li></ol> 4. הכנת התקנים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף דם מעכברים מאותו הזן ברקע הפרין מצופה המטוקריט נימים, ספין למטה ולדלל 1:10 עם 0.5 HEPES mol / L (pH 7.4), בדרך כלל 80 פלזמה μl + 720 HEPES μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל פתרון הזרקת FITC-אינולין עם פלזמה עכבר מדוללת כדי לקבל את דילולים הסטנדרטיים הבאים: 01:10: 10 פתרון FITC-אינולין חי μl + 90 פלזמה עכבר מדוללת μl 1:100: 10 ומו; פתרון L (1:10) + 90 פלזמה עכבר מדוללת μl 1:1,000: 90 פלזמה עכבר מדוללת μl פתרון μl 10 (1:100) + 1:2,000: 30 μl (1:1) פתרון + 30 פלזמה עכבר מדוללת μl 1:10,000: 40 פלזמה עכבר מדוללת μl פתרון μl 10 (1:5) + 1:20,000: 20 μl (1:1) פתרון + 20 פלזמה עכבר מדוללת μl 1:100,000: 40 פלזמה עכבר מדוללת μl פתרון μl 10 (1:5) + הריכוז של הסטנדרטים יהיה תלוי בדיאליזה ותמיד יהיה שונה עבור כל הכנת FITC-אינולין. זה הכרחי כדי להיכנס לריכוז לעקומה החדשה הסטנדרטית בכל פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח נתונים כדי לחשב GFR עם תוכנה מתאימה (פריזמה GraphPad למשל) באמצעות פונקצית דעיכה מעריכית שני שלבים כפי שתואר כאן ב15, 20 ומוצג בסעיף נציג תוצאות. </li></ol>

<ol>
	<li>Bauer, J. H., Brooks, C. S., Burch, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+appraisal+of+creatinine+clearance+as+a+measurement+of+glomerular+filtration+rate.">Clinical appraisal of creatinine clearance as a measurement of glomerular filtration rate.</a> Am. J. Kidney Dis. 2 (3), 337-346 (1982).</li><li>Carrie, B. J., Golbetz, H. V., Michaels, A. S., Myers, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creatinine:+an+inadequate+filtration+marker+in+glomerular+diseases.">Creatinine: an inadequate filtration marker in glomerular diseases.</a> Am. J. Med. 69 (2), 177-182 (1980).</li><li>Chasis, H., Ranges, H. A., Goldring, W., Smith, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Control+of+Renal+Blood+Flow+and+Glomerular+Filtration+in+Normal+Man.">The Control of Renal Blood Flow and Glomerular Filtration in Normal Man.</a> J. Clin. Invest. 17 (5), 683-697 (1938).</li><li>Darling, I. M., Morris, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+"true"+creatinine+clearance+in+rats+reveals+extensive+renal+secretion.">Evaluation of "true" creatinine clearance in rats reveals extensive renal secretion.</a> Pharm. Res. 8 (10), 1318-1322 (1991).</li><li>Dunn, S. R., Qi, Z., Bottinger, E. P., Breyer, M. D., Sharma, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utility+of+endogenous+creatinine+clearance+as+a+measure+of+renal+function+in+mice.">Utility of endogenous creatinine clearance as a measure of renal function in mice.</a> Kidney Int. 65 (5), 1959-1967 (2004).</li><li>Eisner, C., Faulhaber-Walter, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Major+contribution+of+tubular+secretion+to+creatinine+clearance+in+mice.">Major contribution of tubular secretion to creatinine clearance in mice.</a> Kidney Int. 77 (6), 519-526 (2010).</li><li>Faulhaber-Walter, R., Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+A1+adenosine+receptors+augments+diabetic+hyperfiltration+and+glomerular+injury.">Lack of A1 adenosine receptors augments diabetic hyperfiltration and glomerular injury.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 19 (4), 722-730 (2008).</li><li>FINGL, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubular+excretion+of+creatinine+in+the+rat.">Tubular excretion of creatinine in the rat.</a> Am. J. Physiol. 169 (2), 357-362 (1952).</li><li>Keppler, A., Gretz, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+creatinine+determination+in+mice+and+rats:+an+enzymatic+method+compares+favorably+with+a+high-performance+liquid+chromatography+assay.">Plasma creatinine determination in mice and rats: an enzymatic method compares favorably with a high-performance liquid chromatography assay.</a> Kidney Int. 71 (1), 74-78 (2007).</li><li>Levey, A. S., Perrone, R. D., Madias, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+creatinine+and+renal+function.">Serum creatinine and renal function.</a> Annu. Rev. Med. 39, 465-490 (1988).</li><li>Lorenz, J. N., Gruenstein, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+nonradioactive+method+for+evaluating+single-nephron+filtration+rate+using+FITC-inulin.">A simple, nonradioactive method for evaluating single-nephron filtration rate using FITC-inulin.</a> Am. J. Physiol. 276, 172-177 (1999).</li><li>Meyer, M. H., Meyer, R. A., Gray, R. W., Irwin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Picric+acid+methods+greatly+overestimate+serum+creatinine+in+mice:+more+accurate+results+with+high-performance+liquid+chromatography.">Picric acid methods greatly overestimate serum creatinine in mice: more accurate results with high-performance liquid chromatography.</a> Anal. Biochem. 144 (1), 285-290 (1985).</li><li>Qi, Z., Breyer, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+glomerular+filtration+rate+in+conscious+mice.">Measurement of glomerular filtration rate in conscious mice.</a> Methods Mol. Biol. 466, 61-72 (2009).</li><li>Qi, Z., Whitt, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+determination+of+glomerular+filtration+rate+in+conscious+mice+using+FITC-inulin+clearance.">Serial determination of glomerular filtration rate in conscious mice using FITC-inulin clearance.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 286 (3), F590-F596 (2004).</li><li>Schock-Kusch, D., Sadick, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcutaneous+measurement+of+glomerular+filtration+rate+using+FITC-sinistrin+in+rats.">Transcutaneous measurement of glomerular filtration rate using FITC-sinistrin in rats.</a> Nephrol. Dial Transplant. 24 (10), 2997-3001 (2009).</li><li>Schock-Kusch, D., Xie, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcutaneous+assessment+of+renal+function+in+conscious+rats+with+a+device+for+measuring+FITC-sinistrin+disappearance+curves.">Transcutaneous assessment of renal function in conscious rats with a device for measuring FITC-sinistrin disappearance curves.</a> Kidney Int. 79 (11), 1254-1258 (2011).</li><li>Schreiber, A., Shulhevich, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcutaneous+measurement+of+renal+function+in+conscious+mice.">Transcutaneous measurement of renal function in conscious mice.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 303 (5), F783-F788 (2012).</li><li>Shemesh, O., Golbetz, H., Kriss, J. P., Myers, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+creatinine+as+a+filtration+marker+in+glomerulopathic+patients.">Limitations of creatinine as a filtration marker in glomerulopathic patients.</a> Kidney Int. 28 (5), 830-838 (1985).</li><li>Sturgeon, C., Sam, A. D., Law, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+determination+of+glomerular+filtration+rate+by+single-bolus+inulin:+a+comparison+of+estimation+analyses.">Rapid determination of glomerular filtration rate by single-bolus inulin: a comparison of estimation analyses.</a> J. Appl. Physiol. 84 (6), 2154-2162 (1998).</li><li>Vallon, V., Blantz, R. C., Thomson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+hyperfiltration+and+the+salt+paradox+in+early+[corrected]+type+1+diabetes+mellitus:+a+tubulo-centric+view.">Glomerular hyperfiltration and the salt paradox in early [corrected] type 1 diabetes mellitus: a tubulo-centric view.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 14 (2), 530-537 (2003).</li><li>Vallon, V., Eraly, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+the+organic+anion+transporter+OAT3+in+renal+creatinine+secretion+in+mice.">A role for the organic anion transporter OAT3 in renal creatinine secretion in mice.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 302 (10), F1293-F1299 (2012).</li><li>Vallon, V., Schroth, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenosine+A(1)+receptors+determine+glomerular+hyperfiltration+and+the+salt+paradox+in+early+streptozotocin+diabetes+mellitus.">Adenosine A(1) receptors determine glomerular hyperfiltration and the salt paradox in early streptozotocin diabetes mellitus.</a> Nephron. Physiol. 111 (1), 30-38 (2009).</li><li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retro-orbital+injections+in+mice.">Retro-orbital injections in mice.</a> Lab Anim. (NY. 40 (5), 155-160 (2011).</li></ol>

המחבר קיבל מימון כדי לכסות את העלויות של פרסום זה על ידי תרמו פישר סיינטיפיק.

המחקר הנוכחי מתאר טכניקה לקביעת GFR בעכברים בהכרה בזריקה חד בולוס וניתוח של הקרינה ב8 דגימות דם על ידי דעיכה מעריכית שני שלבים. מדידת GFR בעכבר 1 לוקחת 75 דקות. באמצעות תרשים זרימה מיוחד, ניתן למדוד את GFR של 6 עכברים ב -130 דקות. זה ריאלי לחזור על פרוטוקול זרימת תרשים זה עד 4 פעמים ביום ולמדוד GFR ב24 עכברים. אנחנו שונה בשיטה זו, כך שניתן לאסוף את הדם מחיתוך זנב קטן ולא לנקב וריד זנב, שהוא מהיר וקל יותר לחוקרים לבצע השוואה לנקב וריד זנב. באמצעות 10 μl המטוקריט נימים ודילול 1:10, ניתן להפחית את הסכום הכולל של דם לצורך &lt;100 μl. לבסוף, הקרינה נמדדת באמצעות 3300 fluorospectrometer NanoDrop, המאפשר קביעת הקרינה ב1-2 μl של מדגם בדילול מלא. שיטה זו תיתן לי investigato מעונייןערך GFR האמיתי RA. בניגוד לכך, יש לי מדידות קריאטינין בעכברים כמה חולשות, כולל &quot;מגוון עיוור קריאטינין&quot; וקשיים הקשורים לקביעה ספציפית ורגישה. &quot;מגוון העיוור קריאטינין&quot; מגביל את תפקודו כסמן לGFR משום הסרום קראטינין נשאר בטווח הנורמלי עד 50% מתפקוד כלייתי הוא איבד 19. מאז כמה חוקרים להשתמש בעכברים מהונדסים גנטי במחקר שלהם ללימוד פיזיולוגיה והפתופיזיולוגיה כליות, זה נושא את הבעיה הבאה: בהנחת שעכבר בנוקאאוט של X גנים תצטרך GFR נמוך באופן משמעותי (ב -40%) בהשוואה לעכבר פראי סוג, הקרנה על ידי השוואה פשוטה הפלזמה קריאטינין לא לזהות את ההבדל הזה. הצורך בשיטה מדויקת טובה של נחישות GFR הופך להיות קריטי יותר קטן יותר את ההבדלים בGFR להיות. יש עכברי ריכוזים גבוהים של chromagens הלא קריאטינין בפלזמה ובשתן שלהם שמפריעים מסחרימבחני קריאטינין זמינים. כתוצאה מכך, מבחני המבוססים על ריכוז אלקליין picrate יפה תגובת אומדן היתר קריאטינין בפלזמה בהשוואה לביצועים גבוהה כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC) 6 נחישות, 13. מגבלה נוספת היא שקריאטינין הוא מתחת מגבלות זיהוי של כמה מבחני זמינים מסחרי בהשוואה לנחישות HPLC. עם זאת, על ידי שימוש בחוקרי תגובות אנזימטיות הצליחו לקבוע הפלזמה קריאטינין ב10 עכברים, 22. GFR בטווח דומה נמצאו בעכברים בהכרה בשיטה דומה חד בולוס הזרקה, כמו גם אישור FITC-אינולין 14 שתן. בניגוד לפרוטוקול שלהם, הפרוטוקול שלנו באמצעות חיתוך זנב אינו דורש אמצעי זהירות מיוחד כדי לשמור על שלמות הכלי בהשוואה לוריד זנב או לנקב וריד saphenous. לאישור שתן / פלזמה מבוססת FITC-אינולין יש צורך להשתיל שני ק&quot;מ האוסמוטי בניתוחnipumps. שתי משאבות הן הכרחיים כדי להשיג ריכוזים גבוהים מספיק מצב יציב פלזמה FITC-אינולין שהם בבירור להבחין מהרקע. הדבר מחייב גם את השימוש בכלובים מטבוליים לאיסוף שתן מלא ומתוזמן. הכלובים צריכים להיות שטף לחשבון להפסד של 25-37% מFITC-אינולין, אשר אחרת מתרחש ללא שטיפה. את החסרונות של שימוש בשיטת FITC-אינולין זה מוגבלים. חוקרים צריכים להיות מודעים את הדברים הבאים: (i) להבטיח כי אין בועות אוויר במזרק המשמש להזרקה של FITC הפתרון, חייבת להיות מושגת (ii) הזרקת retrobulbar מלאה משום שהכמות המוזרקת קובעת GFR מחושב, ו( iii) עכברים להשתין הסביר ביותר במהלך ניסוי 75 דקות GFR, כך למנוע זיהום דגימות דם עם שתן, שיש לי ריכוז FITC-אינולין גבוה מאוד כתוצאה של יכולת ריכוז הכליות. o יתרונות כללייםF-שיטת FITC אינולין זה כוללת את הפעולות הבאות: (א) היא טכניקה לא רדיואקטיבי, (ii) ניתן לחזור על מדידות מספר פעמים באותו העכבר, (iii) assay יכול להתבצע בעכברים בהכרה, ( ד) אין צורך באיסוף שתן, ו( V) יכולה להיות מנוצל אפשרות תפוקה גבוהה. חסרונות להזרקת בולוס אחת כוללים את הצורך בדיאליזה של FITC-אינולין, שניתן להתגבר על ידי שימוש בFITC-סמן טוב יותר, FITC-sinistrin, שזמין כעת וניתן למדוד transcutaneously באמצעות מכשיר מיוחד 18 מיניאטורי. למרות GFR נמדד, לא ניתן למדוד את ההפרשות חלקיות של נוזל או יונים בשיטה זו. יחדיו, בשיטה זו מספקת את הכדאיות של שיטת תפוקה גבוהה למדידת GFR בעכברים בהכרה. לכן, טכניקה זו עשויה להיות עניין לחוקרים אחרים המתעניייינים בקביעת תפקוד כליה בעכברים.

קצב היווצרות של הפלזמה ultrafiltrate בglomerulus הפך בסיס להערכת תפקוד כליה (קצב סינון גלומרולרי, GFR). הסמן האידיאלי כדי לקבוע GFR צריך להיות מסונן באופן חופשי, לא מופרש או נספג מחדש ולא עובר מטבוליזם. כגון התנהגות נמצאה להיות אמיתי לאינולין, ואישור אינולין הפך סטנדרט זהב לקביעת GFR 3. ואילו אישור של קריאטינין נעשה שימוש נרחב כאמצעי של GFR בבני אדם ובעלי חיים, קריאטינין לא למלא את הדרישות של סמן GFR אידיאלי. בסביבות 10 - 40% מפינוי קריאטינין בבני האדם הוא התוצאה של הפרשה טובולרית פעילה 1, 11, ואת הפרשת כליות של קריאטינין היא גם בולטת בעכברים וחולדות 4, 7, 9, 22. פגיעת כלייתית ידועה להגדיל את הפרשת צינורי של קריאטינין אשר מגבילה את הערך שלו כסמן של 1 GFR, 2. אנחנו הראינו כי איזופורם טרנספורטר אניון האורגני בעבר3 (OAT3) תורם להפרשת קריאטינין כליות עכברית 22. עם זאת, בדרך כלל דורש אישור אינולין השימוש באינולין שכותרתו רדיואקטיבית (3 H או 14 ג). נחישות רדיואקטיבית של אינולין יכולה לשמש גם בעכברים מורדמים ומודעים, אבל מטפחת את החסרונות של תקנות בטיחות רבות וסוגיות טיפול מחמירות הגלומות בשימוש באיזוטופים רדיואקטיביים. לאורך שורות אלה, הכנות לפינוי כירורגיות קביעת GFR הן זמן רב, כמו גם מסוף בטבע. בשנת 1999 לורנץ ואח&#39;. הציג 12 FITC-אינולין כסמן של אחת נפרון GFR בעכברים מורדמים. חמש שנים לאחר מכן צ&#39;י et al. נקבע 15 כל הכליה GFR בעכברים מודעים באמצעות FITC-אינולין. פרוטוקולים אלטרנטיביים כיום באמצעות FITC-אינולין כסמן אקסוגני למדוד GFR בעכברים מודעים ומורדמים. פרוטוקולים אלה לשמר את הרגישות של אינולין רדיואקטיבי באמצעות הקרינה detectiובעקיפה על החסרונות של עבודה עם סמן מסומן רדיואקטיבית. Assay FITC-אינולין שונה על ידי אחרים 7, 8 ו 22, 23 לנצל את היכולת של microvolume 3300 fluorospectrometer NanoDrop. זה מאפשר להקטין את נפח הדגימה הכולל דרוש ל&lt; דם μl 100 לGFR מדידה. עם השיטה ופרוטוקול העברת נתונים גבוה סיפק בפרסום זה, אנחנו מדגימים את היתכנות המדידה GFR בעד 24 עכברים מודעים ליום. טכניקה זו יכולה להיות שימושית לחוקרים אחרים הלומדים GFR העכברי ואנו מקווים שהוא יחליף את שיטות פחות מדויקות ככל מדדים לתפקוד כליות, כגון קריאטינין וחנקן אוריאה בדם.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-inulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3272</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7706</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Webster Veterinary</td>
			<td>78366551</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis membrane (MWCO 1000)</td>
			<td>Spectrum Laboratories</td>
			<td>132636</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane closure</td>
			<td>Spectrum Laboratories</td>
			<td>132736</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80 &mu;l Hematocrit capillaries</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>22362566</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematocrit centrifuge</td>
			<td>IEC</td>
			<td>Micro-MB</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &mu;l Na+-Heparin minicaps</td>
			<td>Hirschmann</td>
			<td>9000210</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (100 &mu;l)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80601</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorospectrometer</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>NanoDrop 3300</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter (0.22 &mu;m)</td>
			<td>Spectrum Laboratories</td>
			<td>880-26464-UE</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealant</td>
			<td>Ch&acirc;-seal</td>
			<td>510</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles (G26 &frac12; and G30 &frac12;)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305111 &amp; 305106</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput method for measurement of glomerular filtration rate in conscious mice

המדידה של קצב סינון גלומרולרי (GFR) היא תקן הזהב להערכת תפקוד כליות. נכון לעכשיו, חוקרים לקבוע GFR על ידי מדידת רמת קריאטינין הסמן הביולוגי אנדוגני או יישומי רדיואקטיבי אינולין שכותרת exogenously (3 H או 14 ג). יש קריאטינין חסרון המשמעותי שהחשבונות טובולרית הפרוקסימלי ל~ 50% מהפרשת קריאטינין כליה מוחלטת ולכן קריאטינין לא GFR סמן אמין. בהתאם לניסוי שבוצע, ניתן לקבוע אישור אינולין ידי הזרקה תוך ורידית או בולוס יחידה עירוי מתמשך (minipump תוך ורידית או האוסמוטי). שתי הגישות דורשות אוסף של פלזמה או פלזמה ושתן, בהתאמה. חסרונות אחרים של אינולין שכותרתו רדיואקטיבית כוללים שימוש באיזוטופים, זמן רב הכנה כירורגית של בעלי החיים, ואת הדרישה של ניסוי מסוף. כאן אנו מתארים שיטה שבה משתמשת בזריקת בולוס בודדת שלisothiocyanate-(FITC) אינולין שכותרת והמדידה של הקרינה שלה ב1-2 μl של פלזמה דילול והעמסת. על ידי יישום מודל דו תא, עם 8 אוספי דם לכל עכבר, ניתן למדוד GFR בעד 24 עכברים ליום באמצעות פרוטוקול זרימת עבודה מיוחד. שיטה זו דורשת הרדמה isoflurane קצרה עם כל דגימות הדם שנאספו בעכבר הלא מרוסן וער בלבד. יתרון נוסף הוא שאפשר לעקוב אחרי עכברים על פני תקופה של מספר חודשים וטיפולים (כלומר עושה ניסויים לזווג עם שינויים תזונתיים או יישומי סמים). אנו מקווים כי טכניקה זו של המדידה GFR היא שימושית לחוקרים אחרים הלומדים בתפקוד כליות עכבר ותחליף שיטות פחות מדויקות של הערכת תפקוד כליות, כמו פלזמה וחנקן האוריאה קריאטינין בדם.

GFR יחושב באמצעות נוסחה הבאה: GFR = n / (A/K1 + B/K2), שבו n = כמות מוזרקת (n = C C = ריכוז FITC-אינולין, V = נפח מוזרק • V, שם) = Span1, חיתוך-y של אלימינציה K1 = ריקבון מתמיד לחיסול B = Span2, Y-ליירט הפצה ריקבון = K2 מתמיד להפצה הערה:, K1, B ו-K2 הם קיצורים שניתנו על ידי פריזמה GraphPad, כל תוכנה מסוגלת לנתח דעיכה מעריכית שני שלבים יכול להיות בשימוש, לעומת זאת, תוכנות מדעיות אחרות עלולות להשתמש בקיצורים שונים. על ידי שימוש בהתאמת שני שלבי מעריכי ריקבון עקום, שמבוססת על ריכוזי FITC-אינולין פלזמה, יש לקבל את עקומה דומה לזה שמוצג באיור 1. חישוב GFR על ידי נוסחה שהוצגה לעיל (וכפי שמתואר בכאן &lt;sup&gt; 20) מאפשר לזהות ירידת ערך של תפקוד כליות 15 או hyperfiltration גלומרולרי 8, 23 כפי שנמצא בעכברים עם סוכרת מסוג 1 סוכרת (איור 2). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/50330/50330fig1.jpg" /> איור 1. כדי למדוד GFR בעכברים מודעים, קינטיקה הפלזמה של FITC-אינולין לאחר הזרקה תוך ורידית אחת במינון משמשת. לחישוב GFR, מודל דו תא הוא מועסק. במודל דו התא, שלב הדעיכה המהיר הראשוני מייצג חלוקה מחדש של FITC-אינולין מתא intravascular לנוזל חוץ התאי. השלב מאוחר יותר, עם דעיכה איטית בריכוז FITC-אינולין, בעיקר משקף אישור מערכתי מהפלזמה. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/50330/50330fig2.jpg" /> איור 2. Detection של hyperfiltration סוכרת בעכברים מסוג פראי. סוג אני סוכרת הייתה מושרה על ידי יישום intraperitoneal של streptozotocin (STZ, 50 מ&quot;ג / ק&quot;ג במשך 5 ימים רצופים). GFR נקבע לפני (בסיס) ו 5 שבועות לאחר הגיוס של סוכרת. בשל משוב tubuloglomerular, גידול עיקרי בספיגה חוזרת הפרוקסימלי גורם hyperfiltration הסוכרתי המוקדם 21 ממצא שניתן לשחזור בwild-type עכברים (n = 10, p &lt;0.01 בהשוואה לאותו בסיס עכבר). <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/50330/50330fig3.jpg"/> איור 3. תרשים זרימה למדידת GFR בסט של 6 עכברים. כדי למדוד כל הכליה GFR בשיטת הזרקת בולוס הבית, 8 דגימות דם חייב להיות שנאספו בבית 3, 5, 7, 10 דקות, 15, 35, 56 ו -75 לאחר הזרקת FITC-אינולין. מספרים מצביעים על נקודות זמן. מספרים בסוגריים מציינים את מספר מדגם. נקודות זמן שנותרו מהקו האדום האנכי מעידות הזרקהנקודות זמן (ב 0, 11, 22, 33, 44 ו -55 דקות). כל עכבר מסומן בצבע שונה. כדי לקבל אוספי דם רציפים בצע את החצים. גריי תיבות לציין מתי חייב להיות מוכן העכבר הבא להרדמת isoflurane לפני הזריקה. באמצעות פרוטוקול זה הזמן המינימאלי בין 2 אוספי דם מעכברים שונים הוא 1 דקות.

Watch this Scientific Journal Video about A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice at JoVE.com

A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice

מדידה של קצב סינון גלומרולרי (GFR) היא תקן הזהב להערכת תפקוד כליות. כאן אנו מתארים שיטת תפוקה גבוהה המאפשרת קביעת GFR בעכברים מודעים באמצעות זריקה אחת בולוס, קביעת isothiocyanate ההעמסה (FITC)-אינולין בפלזמה וחישוב GFR ידי מודל דעיכה מעריכית שני שלבים.

שיטת תפוקה גבוהה למדידה של קצב סינון הגלומרולרי בעכברים בהכרה

The measurement of  glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function  assessment. Currently, investigators determine GFR by ...

a-high-throughput-method-for-measurement-glomerular-filtration-rate

Research

JoVE Journal

Biology

43.2K Views.  University of California, San Diego. מדידה של קצב סינון גלומרולרי (GFR) היא תקן הזהב להערכת תפקוד כליות. כאן אנו מתארים שיטת תפוקה גבוהה המאפשרת קביעת GFR בעכברים מודעים באמצעות זריקה אחת בולוס, קביעת isothiocyanate ההעמסה (FITC)-אינולין בפלזמה וחישוב GFR ידי מודל דעיכה מעריכית שני שלבים.

Video: A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help achieve an comprehensive understanding of molecular pathways. In Saccharomyces cerevisiae, with the development of the non-essential gene deletion array, we can globally study the morphology of different organelles like the endoplasmic reticulum (ER) and the mitochondria using GFP (or variant)-markers in different gene backgrounds. However, incorporating GFP markers in each single mutant individually is a labor-intensive process. Here, we describe a procedure that is routinely used in our laboratory. By using a robotic system to handle high-density yeast arrays and drug selection techniques, we can significantly shorten the time required and improve reproducibility. In brief, we cross a GFP-tagged mitochondrial marker (Apc1-GFP) to a high-density array of 4,672 nonessential gene deletion mutants by robotic replica pinning.  Through diploid selection, sporulation, germination and dual marker selection, we recover both alleles. As a result, each haploid single mutant contains Apc1-GFP incorporated at its genomic locus. Now, we can study the morphology of mitochondria in all non-essential mutant background. Using this high-throughput approach, we can conveniently study and delineate the pathways and genes involved in the inheritance and the formation of organelles in a genome-wide setting.

GFP-fusion proteins are widely used to visualize organelles by confocal microscopy. However, screening for mutations that affect the morphology of organelles generally requires individual mutagenesis and is time consuming. Here, we demonstrate a method to simultaneously incorporate organelle-GFP markers in almost 5,000 non-essential genes in yeast.

שיטת תפוקה גבוהה ברחבי העולם כדי ללמוד את המורפולוגיה של אברון cerevisiae ס

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to the original protocol that both streamline the procedure and increase sample uniformity.  First, we normalize all sperm volumes using freezing media that does not contain the cryoprotectant. Second, cryopreserved sperm are stored in cryovials instead of capillary tubes.  The rates of sperm freezing and thawing (&delta;&deg;C/time) are probably the two most critical variables to control in this procedure.  For this reason, do not substitute different tubes for those specified.  Working in teams of 2 it is possible to freeze the sperm of 100 males per team in ~2 hrs.  Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility (measured as the number of viable embryos generated in an in vitro fertilization divided by the total number of eggs fertilized) and this percent fertility is stable over many years.

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a high-throughput sperm cryopreservation protocol for zebrafish. Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility in subsequent vitro fertilization and is stable over many years.

שיטת תפוקה גבוהה עבור cryopreservation זרע דג הזברה במבחנה הפריה

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding location often influences function of a splicing factor.  However, as with any sampling strategy the chance of identifying an RNA bound to a splicing factor is proportional to its cellular abundance.  We have developed a novel in vitro approach for surveying binding specificity on otherwise transient pre-mRNA. This approach utilizes a specifically designed oligonucleotide pool that tiles across introns, exons, splice junctions, or other pre-mRNA.  The pool is subjected to some kind of molecular selection. Here, we demonstrate the method by separating the oligonucleotide into a bound and unbound fraction and utilize a two color array strategy to record the enrichment of each oligonucleotide in the bound fraction. The array data generates high-resolution maps with the ability to identify sequence-specific and structural determinates of ribonucleoprotein (RNP) binding on pre-mRNA.  A unique advantage to this method is its ability to avoid the sampling bias towards mRNA associated with current IP and SELEX techniques, as the pool is specifically designed and synthesized from pre-mRNA sequence. The flexibility of the oligonucleotide pool is another advantage since the experimenter chooses which regions to study and tile across, tailoring the pool to their individual needs.  Using this technique, one can assay the effects of polymorphisms or mutations on binding on a large scale or clone the library into a functional splicing reporter and identify oligonucleotides that are enriched in the included fraction.  This novel in vitro high-resolution mapping scheme provides a unique way to study RNP interactions with transient pre-mRNA species, whose low abundance makes them difficult to study with current in vivo techniques.  



A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

Due to the transient nature of pre-mRNA, it can be difficult to isolate and study in vivo. Here, we present a novel in vitro approach to investigate RNA-protein interactions using a synthetic oligo pool that tiles across selected regions of pre-mRNA.

שיטה מהירה תפוקה גבוהה עבור Ribonucleoproteins מיפוי (RNPs) על mRNA מראש אדם

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

High-Throughput Measurement and Classification of Organic P in Environmental Samples

Many types of organic phosphorus (P) molecules exist in environmental samples1. Traditional P measurements do not detect these organic P compounds since they do not react with colorimetric reagents2,3. Enzymatic hydrolysis (EH) is an emerging method for accurately characterizing organic P forms in environmental samples4,5. This method is only trumped in accuracy by Phosphorus-31 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (31P-NMR) -a method that is expensive and requires specialized technical training6. We have adapted an enzymatic hydrolysis method capable of measuring three classes of phosphorus (monoester P, diester P and inorganic P) to a microplate reader system7. This method provides researchers with a fast, accurate, affordable and user-friendly means to measure P species in soils, sediments, manures and, if concentrated, aquatic samples. This is the only high-throughput method for measuring the forms and enzyme-lability of organic P that can be performed in a standard laboratory. The resulting data provides insight to scientists studying system nutrient content and eutrophication potential.

This protocol describes a high-throughput method of enzymatic hydrolysis that utilizes a microplate reader to measure and classify soil phosphorus as P monoesters, P diesters and inorganic P. Up to 96 samples can be measured at one time in a standard laboratory.

תפוקה גבוהה מדידה סיווג P אורגני דגימות סביבתיות

Many types of organic phosphorus (P) molecules exist in environmental samples1.  Traditional P measurements do not detect these organic P compounds since ...

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping project is to collect a tissue sample from each individual plant. The traditional approach to this task is to sample plants one-at-a-time. If one wishes to genotype hundreds or thousands of individuals, however, using this strategy results in a significant bottleneck in the genotyping pipeline. The Ice-Cap method that we describe here provides a high-throughput solution to this challenge by allowing one scientist to collect tissue from several thousand seedlings in a single day 1,2. This level of throughput is made possible by the fact that tissue is harvested from plants 96-at-a-time, rather than one-at-a-time.
The Ice-Cap method provides an integrated platform for performing seedling growth, tissue harvest, and DNA extraction. The basis for Ice-Cap is the growth of seedlings in a stacked pair of 96-well plates. The wells of the upper plate contain plugs of agar growth media on which individual seedlings germinate. The roots grow down through the agar media, exit the upper plate through a hole, and pass into a lower plate containing water. To harvest tissue for DNA extraction, the water in the lower plate containing root tissue is rapidly frozen while the seedlings in the upper plate remain at room temperature. The upper plate is then peeled away from the lower plate, yielding one plate with 96 root tissue samples frozen in ice and one plate with 96 viable seedlings. The technique is named "Ice-Cap" because it uses ice to capture the root tissue. The 96-well plate containing the seedlings can then wrapped in foil and transferred to low temperature. This process suspends further growth of the seedlings, but does not affect their viability. Once genotype analysis has been completed, seedlings with the desired genotype can be transferred from the 96-well plate to soil for further propagation. We have demonstrated the utility of the Ice-Cap method using Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings. We expect that the method should also be applicable to other species of plants with seeds small enough to fit into the wells of 96-well plates.

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

The Ice-Cap method allows one to grow plants in 96-well plates and non-destructively harvest root tissue from each seedling. DNA extracted from this root tissue can be used for genotyping reactions. We have found that Ice-Cap works well for Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings.

Ice יתר: שיטה גידול ארבידופסיס צמחים עגבניות ב 96-פלטות היטב genotyping תפוקה גבוהה

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

תפוקה גבוהה התגבשות של חלבונים בממברנה שימוש בשיטה Lipidic Bicelle

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

מדידה של קצב חילוף החומרים ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; באמצעות Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

Physiology Lab Demonstration: Glomerular Filtration Rate in a Rat

Measurements of glomerular filtration rate (GFR), and the fractional excretion of sodium (Na) and potassium (K) are critical in assessing renal function in health and disease. GFR is measured as the steady state renal clearance of inulin which is filtered at the glomerulus, but not secreted or reabsorbed along the nephron. The fractional excretion of Na and K can be determined from the concentration of Na and K in plasma and urine. The renal clearance of inulin can be demonstrated in an anesthetized animal which has catheters in the femoral artery, femoral vein and bladder. The equipment and supplies used for this procedure are those commonly available in a research core facility, and thus makes this procedure a practical means for measuring renal function. The purpose of this video is to demonstrate the procedures required to perform a lab demonstration in which renal function is assessed before and after a diuretic drug. The presented technique can be utilized to assess renal function in rat models of renal disease.

The purpose of this protocol is to demonstrate the principles and techniques for measuring and calculating glomerular filtration rate, urine flow rate, and excretion of sodium and potassium in a rat. This demonstration can be used to provide students with an overall conceptual understanding of how to measure renal function.

הפגנת מעבדה לפיזיולוגיה: גלומרולרי סינון שיעור בחולדה

Measurements of glomerular filtration rate (GFR), and the fractional excretion of sodium (Na) and potassium (K) are critical in assessing renal function ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

הקרנת תפוקה גבוהה עבור כימית מאפננים של גני Post-תעתיק מוסדר

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both mitochondrial (respiration) and non-mitochondrial (other redox) reactions consume oxygen, but these reactions can be easily distinguished by chemical inhibition of mitochondrial respiration. However, while mitochondrial oxygen consumption is an unambiguous and direct measurement of respiration rate2, the same is not true for extracellular acid production and its relationship to glycolytic rate 3-6. Extracellular acid produced by cells is derived from both lactate, produced by anaerobic glycolysis, and CO2, produced in the citric acid cycle during respiration. For glycolysis, the conversion of glucose to lactate- + H+ and the export of products into the assay medium is the source of glycolytic acidification. For respiration, the export of CO2, hydration to H2CO3 and dissociation to HCO3- + H+ is the source of respiratory acidification. The proportions of glycolytic and respiratory acidification depend on the experimental conditions, including cell type and substrate(s) provided, and can range from nearly 100% glycolytic acidification to nearly 100% respiratory acidification 6. Here, we demonstrate the data collection and calculation methods needed to determine respiratory and glycolytic contributions to total extracellular acidification by whole cells in culture using C2C12 myoblast cells as a model.

Glycolysis is a defining metabolic marker in multiple biological systems. Monitoring glycolysis by measuring the extracellular flux of H+ is common, but requires correction to be quantitative and unambiguous. Here, we demonstrate how to gather and correct extracellular flux data to distinguish between respiratory and glycolytic sources of extracellular acidification.

מדידה וניתוח של תאי ייצור חומצה לקביעת glycolytic דרג

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both ...