ونحن ممتنون لميشيلا دي مارتينو، ويلفريد R. هاجن، وكوروش Honarmand ابراهيمي لإجراء مناقشات مفيدة. وأيد هذا العمل من قبل بدء التمويل من جامعة دلفت للتكنولوجيا.

1. DPS التعبير وتنقية الحصول على بروتين عالية النقاء هو خطوة أولى أساسية لفحص الحمض النووي الحماية. تنقية DPS البروتين يمكن أن يؤديها في 4-5 أيام. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل سلالة البروتيني التي تعاني من نقص من E. القولونية (مثل BL21 (DE3) pLysS) مع ناقلات الحيوانات الأليفة (مثل pET17) إلى التي تم استنساخ DPS تسلسل البروتين الترميز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الإنتصارات وتحولت الخلايا خارجا على مرق لوريا (LB) لوحات أجار التي تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة (مثل الأمبيسلين والكلورامفينيكول لالأمثلة المقدمة في 1.1). احتضان لوحات بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطعيم مستعمرة واحدة من لوحة إلى 30 مل من المتوسط ​​LB التي تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة. احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في حين تهتز في 200-250 دورة في الدقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطعيم 2 × 1 L المتوسطة LB تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة مع 10 مل من كل ثقافة بين عشية وضحاها. ينمو بمعدل 37 درجة مئوية، في حين تهتز، إلى OD 600 </الفرعية&gt; ما يقرب من 0.6. (زراعة الخلايا لأعلى OD زيادة الغلة البروتين، دون المساس بشكل ملحوظ على نقاء المنتج النهائي.) لحث على التعبير من DPS بإضافة IPTG إلى تركيز من 0.3 ملم، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 3-4 ساعة في حين تهتز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حصاد الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 6،000 x ج لمدة 15 دقيقة. Resuspend وكريات خلية في 7.5 مل من العازلة DEAE A (50 ملي HEPES KOH-، ودرجة الحموضة 7.5، 100 مم كلوريد الصوديوم، 0.1 ملي EDTA) لكل لتر من زراعة الخلايا المستحثة. قد يتم تجميد العينات في النيتروجين السائل وتخزينه في -80 درجة مئوية، إذا رغبت في ذلك. ويمكن عندئذ أن استمر الإجراء من قبل ذوبان العينات في حمام الماء عند 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة خليط من مثبطات الأنزيم البروتيني (مثل Calbiochem مجموعة III مثبطات الأنزيم البروتيني، في 0.167 ميكرولتر لكل مل من تعليق خلية) إلى تعليق خلية لمنع تدهور DPS بإفراط (overexpressed). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مستخلص خالية من الخلايا باستخدام الصحافة الفرنسية. رئيس الصحافة الفرنسية مع 20 مل DEAE العازلة A (إذا باستخدام نموذج التدفق المستمر)، ثم disrupر العينة مرتين في 20 kpsi. أجهزة الطرد المركزي في المحللة في 30،000 x ج لمدة 35 دقيقة في 4 درجات مئوية لتوضيح جزيئات غير قابلة للذوبان، وحفظ طاف. قد ثم يتم تجميد طاف باستخدام النيتروجين السائل وتخزينه في -80 درجة مئوية، إذا رغبت في ذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتوازن 30 مل DEAE سيفاروز العمود CL-6B مع DEAE العازلة A، باستخدام FPLC. تشغيل المخزن المؤقت من خلال العمود في 1-2 مل / دقيقة مع أقصى قدر من الضغط من 0.2 ميجا باسكال على الخلفية. تحميل استخراج خالية من الخلايا على العمود، والبدء في جمع من خلال تدفق مرة واحدة تبدأ OD 280 إشارة إلى زيادة فوق خط الأساس. غسل العمود مع DEAE الاحتياطي A حتى يعود OD 280 القيمة إلى خط الأساس، في حين جمع مستمر التدفق من خلال. من خلال تدفق يجب أن يحتوي على غالبية البروتين DPS، وخالية من الحمض النووي ملزمة. غسل العمود مع 100٪ الواق B (50 ملي HEPES KOH-، ودرجة الحموضة 7.5، 1 M كلوريد الصوديوم، 0.1 ملي EDTA). هذا شطافة يحتوي المجمعات DPS-DNA وكذلك البروتينات الأخرى، ويمكن التخلص منها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الإعلاناتditional تلويث البروتينات من خلال الأمونيوم هطول كبريتات. تحديد حجم المجمعة خلال تدفق. ببطء (على مدى فترة من 10-20 دقيقة) إضافة الجافة سلفات الأمونيوم صغيرة من الحبوب إلى التشبع 62٪ (390 ملغ لكل مل من محلول) في 4 درجات مئوية مع التحريك جيدا. يقلب الخليط لمدة 20-30 دقيقة إضافية بعد إضافة الجزء الأخير من كبريتات الأمونيوم لضمان موازنة كاملة. ستبقى DPS القابلة للذوبان، بينما البروتينات تلويث سوف تترسب من المحلول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة البروتينات المترسبة بواسطة الطرد المركزي عند 20،000 XG لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية وحفظ طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ببطء إضافة 227 ملغ كبريتات الأمونيوم إضافية لكل مل من طاف لتصل إلى 94٪ التشبع ويحرك المزيج لمدة 20-30 دقيقة لضمان موازنة كاملة. DPS يترسب في هذا تركيز الملح عالية، ويمكن جمعها بواسطة الطرد المركزي عند 20،000 x ج لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية. وسوف يكون في DPS بيليه، ويمكن أن يتم تجاهل طاف. يمكن تخزين بيليه في -80 ° C إذا قصرIRED. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend الكرية التي تحتوي على DPS في إعادة تعليق العازلة (50 ملي HEPES KOH-، ودرجة الحموضة 7.5، 150 مم كلوريد الصوديوم، 0.1 ملي EDTA). ضبط حجم العينة إلى 2.5 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبادل العازلة لإزالة كبريتات الأمونيوم باستخدام عمود الترشيح PD-10 هلام. تتوازن السرير هلام مع 25 مل العازلة إعادة تعليق. تطبيق مل 2.5 من عينة DPS إلى الجزء العلوي من العمود PD-10 والسماح لها نقع فيها تجاهل التدفق من خلال. جمع DPS بواسطة يبلغ حجمه مع 3.5 مل العازلة إعادة تعليق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي المخزن المؤقت تبادل عينة في 16،000 XG لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية لإزالة أي مكونات غير قابلة للذوبان، وتمييع مع 6-10 مل العازلة تخفيف (50 ملي HEPES KOH-، ودرجة الحموضة 7.5، 0.1 ملي EDTA) لضمان أن تركيز الملح منخفضة بما فيه الكفاية لDPS لربط العمود سيفاروز SP. عينات مركزة خاصة من DPS قد تصبح أقل للذوبان على التخفيف في المخزن مؤقت أقل من الملح، كما يتضح من ملبد من السائل، ولكن يمكن resolubilized تماما قبل إضافة عمو الصغيرةNT من 5 M محلول كلوريد الصوديوم (وهي 10-20 ملم إضافية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتوازن لمل SP سيفاروز عمود تدفق سريع 30 مع SP العازلة A (50 ملي HEPES KOH-، ودرجة الحموضة 7.5، 50 ملي مول كلوريد الصوديوم، 0.1 ملي EDTA). تشغيل المخزن المؤقت من خلال العمود في 1.5-2 مل / دقيقة مع الحد من الضغط 0.3 ميجا باسكال على الخلفية. تحميل العينة على العمود. يغسل مع SP الاحتياطي A حتى OD عائدات التتبع 280 إلى خط الأساس، وتجاهل التدفق من خلال. تشغيل الانحدار الخطي 150 مل 0-100٪ B الاحتياطي، في حين جمع الكسور 2 مل. سوف DPS أزل في ذروة حادة في حوالي 50٪ B، على الرغم من اختلاف بنسبة 10٪ هو ممكن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل الكسور شطف على 15٪ SDS-PAGE هلام، والتحقق من وجود تلوث الحمض النووي عن طريق قياس OD 260/280 OD نسبة باستخدام مقياس الطيف الضوئي. الجل ينبغي أن تظهر فقط فرقة واحدة حوالي 19 كيلو دالتون، وOD 260/280 OD هو عادة حوالي 0.7. تجمع أنقى DPS الكسور. استخدام وحدة تصفية الطرد المركزي (مثل وحدة الترشيح Amicon الترا) مع10K الوزن الجزيئي وقف انتاج المواد الانشطارية لتركيز DPS ويتبادل عليها في المخزن مؤقت تخزين (50 ملي HEPES KOH-، ودرجة الحموضة 7.5، 50 ملي كلوريد الصوديوم). قسامة DPS تنقيته، والتجميد في النيتروجين السائل لتخزين في -80 درجة مئوية. </li></ol> 2. DNA الفحص حماية ينطوي على فحص متعددة الخطوات حساسة للوقت، وينبغي تزامنت مع ثاني للحصول على نتائج قابلة للتكرار. وتشارك العديد من المكونات والخطوات pipetting ل، لذلك جدول pipetting ل(انظر الجدول 1) من المستحسن أن تتبع الخطوات وحدات التخزين. إجمالي الوقت اللازم لفحص وجود أكثر من 3 ساعة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس 30 مل من الماء إلى قارورة محكمة الإغلاق؛ تدفق المياه مع N 2 لمدة 10 دقيقة (باستخدام اثنين من الإبر المحاقن، واحدة في السائل، واحدة فوقه) لإزالة الأكسجين من الحل. أضف 0.0168 ز FESO 4 • 7H 2 O إلى الماء للحصول على محلول المخزون 2 مم. اغلاق القارورة وتدفق مع النيتروجين لمدة 5 دقائق أكثر، ثم خلط. يجب أن يكون الحلواضحة، وإذا كان أي تلميح من الأصفر قابلا للاكتشاف، وإعداد حل الحديد الجديدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل ملم 100 H 2 O 2 حل (10.87 ميكرولتر من 9.2MH 2 O 2 في 1 مل من الماء)؛ الحفاظ على الجليد ومحمية من الضوء بواسطة التفاف في رقائق الألومنيوم. استخدم فقط لحوالي 1-2 ساعة بعد التحضير بسبب تسوس عفوية. الأسهم بيروكسيد الهيدروجين هو وبالمثل تخضع لانهيار، والتي يمكن تحسينها جزئيا التخزين السليم (في الظلام، في 4 درجات مئوية). ويوصى الشيكات العادية للتركيز الأسهم عن طريق قياس OD 240. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد قسامة من المنقى DPS بسرعة في حمام مائي درجة حرارة الغرفة، والحفاظ على الجليد. أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 ثانية في 4،000 x ج في جدول أعلى picocentrifuge إلى المجاميع راسب. قياس تركيز بعد الطرد المركزي باستخدام مقياس الطيف الضوئي (OD 280 = 1.547 يشير إلى وجود تركيز من 100 DPS مونومر ميكرومتر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع DNA خطي من الأوراق المالية عالية التركيز باستخدام 12X العازلة رد فعل (1M-MOPS KOH درجة الحموضة 7.0، 1 M كلوريد الصوديوم) إلى تركيز من 100 نانوغرام / ميكرولتر. ويستخدم الحمض النووي خطي لجعل الكمي أسهل، ولكن يمكن استخدام DNA البلازميد كذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة 1 ميكرولتر من خليط الحمض النووي العازلة في أنبوب PCR. إضافة ما يكفي من الماء في رد فعل بحيث حجم رد الفعل النهائي (ناقص SDS) سيكون 12 ميكرولتر. ينبغي أن يحسب هذا المبلغ مقدما باستخدام الجدول pipetting ل. إضافة DPS إلى تركيز النهائي من dodecamer 3 ميكرومتر. احتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للسماح لDPS لربط الحمض النووي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة ما يكفي من 2 ملي FESO 4 الحل للوصول إلى التركيز المطلوب. يستخدم تجربة نموذجية مجموعة من تركيزات 0-1 ملي FESO 4. سوف تركيزات أعلى يسبب تدهور الحمض النووي أكثر اتساعا ولكن قد يؤدي أيضا إلى تشكيل الحديد يترسب في خليط التفاعل. بسرعة إضافة 1 ميكرولتر من ملي H 2 O 2 حل 100 (إلى 10 ملي تركيز النهائي)، ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق للسماح للفنتونبوساطة رد فعل تدهور لتأخذ مكان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 0.8 ميكرولتر من 20٪ SDS (كبريتات الصوديوم دوديسيل). خلط واحتضان عند 85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لتعطيل المجمعات DPS-DNA. وSDS يزعزع استقرار معقدة DPS-DNA، ويمنع التحولات هلام غير المرغوب فيها لDNA، مما يحسن من سهولة القياس الكمي. خطوة اختيارية هو وقف رد فعل من جانب المهينة حفاز بيروكسيد الهيدروجين إلى منتجات غير سامة. لظروف وصفها في هذا البروتوكول، ليست هناك حاجة لهذه الخطوة الحصول على مجموعة واسعة من تدهور الحمض النووي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان على الجليد لمدة 1 دقيقة، إضافة صبغة التحميل، وتحميل على هلام الاغاروز. تشغيل هلام، وصمة عار لالحمض النووي باستخدام بروميد إيثيديوم. وينبغي أن يكون الجل الملون بعد الكهربائي بدلا من قبل الكهربائي، لمنع SDS من التدخل في توزيع بروميد إيثيديوم في هلام. </li></ol>

<ol>
	<li>Almiron, M., Link, A. J., Furlong, D., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+DNA-binding+protein+with+regulatory+and+protective+roles+in+starved+Escherichia+coli.">A novel DNA-binding protein with regulatory and protective roles in starved Escherichia coli.</a> Genes Dev. 6, 2646-2654 (1992).</li><li>Chiancone, E., Ceci, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multifaceted+capacity+of+Dps+proteins+to+combat+bacterial+stress+conditions:+Detoxification+of+iron+and+hydrogen+peroxide+and+DNA+binding.">The multifaceted capacity of Dps proteins to combat bacterial stress conditions: Detoxification of iron and hydrogen peroxide and DNA binding.</a> Biochimica et biophysica acta. 1800 (8), 798-805 (2010).</li><li>Ali Azam, T., Iwata, A., Nishimura, A., Ueda, S., Ishihama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+phase-dependent+variation+in+protein+composition+of+the+Escherichia+coli+nucleoid.">Growth phase-dependent variation in protein composition of the Escherichia coli nucleoid.</a> J. Bacteriol. 181 (20), 6361-6370 (1999).</li><li>Grainger, D. C., Goldberg, M. D., Lee, D. J., Busby, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+repression+by+Fis+and+H-NS+at+the+Escherichia+coli+dps+promoter.">Selective repression by Fis and H-NS at the Escherichia coli dps promoter.</a> Molecular Microbiology. 68 (6), 1366-1377 (2008).</li><li>Martinez, A., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+of+DNA+during+oxidative+stress+by+the+nonspecific+DNA-binding+protein+Dps.">Protection of DNA during oxidative stress by the nonspecific DNA-binding protein Dps.</a> J. Bacteriol. 179 (16), 5188-5194 (1997).</li><li>Nair, S., Finkel, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dps+protects+cells+against+multiple+stresses+during+stationary+phase.">Dps protects cells against multiple stresses during stationary phase.</a> J. Bacteriol. 186 (13), 4192-4198 (2004).</li><li>Grant, R. A., Filman, D. J., Finkel, S. E., Kolter, R., Hogle, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structure+of+Dps,+a+ferritin+homolog+that+binds+and+protects+DNA.">The crystal structure of Dps, a ferritin homolog that binds and protects DNA.</a> Nat. Struct. Biol. 5 (4), 294-303 (1998).</li><li>Zhao, G., Ceci, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iron+and+hydrogen+peroxide+detoxification+properties+of+DNA-binding+protein+from+starved+cells.+A+ferritin-like+DNA-binding+protein+of+Escherichia+coli.">Iron and hydrogen peroxide detoxification properties of DNA-binding protein from starved cells. A ferritin-like DNA-binding protein of Escherichia coli.</a> J. Biol. Chem. 277 (31), 27689-27696 (2002).</li><li>Ceci, P., Cellai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+condensation+and+self-aggregation+of+Escherichia+coli+Dps+are+coupled+phenomena+related+to+the+properties+of+the+N-terminus.">DNA condensation and self-aggregation of Escherichia coli Dps are coupled phenomena related to the properties of the N-terminus.</a> Nucleic Acids Res. 32 (19), 5935-5944 (2004).</li><li>Ilari, A., Ceci, P., Ferrari, D., Rossi, G. L., Chiancone, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iron+incorporation+into+Escherichia+coli+Dps+gives+rise+to+a+ferritin-like+microcrystalline+core.">Iron incorporation into Escherichia coli Dps gives rise to a ferritin-like microcrystalline core.</a> J. Biol. Chem. 277 (40), 37619-37623 (2002).</li><li>Swift, J., Wehbi, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+functional+ferritin-like+proteins+with+hydrophobic+cavities.">Design of functional ferritin-like proteins with hydrophobic cavities.</a> Journal of the American Chemical Society. 128 (20), 6611-6619 (2006).</li><li>Ceci, P., Chiancone, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+iron+oxide+nanoparticles+in+Listeria+innocua+Dps+(DNA-binding+protein+from+starved+cells):+a+study+with+the+wild-type+protein+and+a+catalytic+centre+mutant.">Synthesis of iron oxide nanoparticles in Listeria innocua Dps (DNA-binding protein from starved cells): a study with the wild-type protein and a catalytic centre mutant.</a> Chemistry. 16 (2), 709-717 (2010).</li><li>Ceci, P., Ilari, A., Falvo, E., Chiancone, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Dps+protein+of+Agrobacterium+tumefaciens+does+not+bind+to+DNA+but+protects+it+toward+oxidative+cleavage:+x-ray+crystal+structure,+iron+binding,+and+hydroxyl-radical+scavenging+properties.">The Dps protein of Agrobacterium tumefaciens does not bind to DNA but protects it toward oxidative cleavage: x-ray crystal structure, iron binding, and hydroxyl-radical scavenging properties.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (22), 20319-20326 (2003).</li><li>Su, M., Cavallo, S., Stefanini, S., Chiancone, E., Chasteen, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+so-called+Listeria+innocua+ferritin+is+a+Dps+protein.+Iron+incorporation,+detoxification,+and+DNA+protection+properties.">The so-called Listeria innocua ferritin is a Dps protein. Iron incorporation, detoxification, and DNA protection properties.</a> Biochemistry. 44 (15), 5572-5578 (2005).</li><li>Kumar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effects+of+Koelreuteria+paniculata+Laxm.+on+oxidative+stress+and+hydrogen+peroxide-induced+DNA+damage.">Protective effects of Koelreuteria paniculata Laxm. on oxidative stress and hydrogen peroxide-induced DNA damage.</a> Phytopharmacology. 1 (5), 177-189 (2011).</li><li>Stinefelt, B., Leonard, S. S., Blemings, K. P., Shi, X., Klandorf, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+radical+scavenging,+DNA+protection,+and+inhibition+of+lipid+peroxidation+mediated+by+uric+acid.">Free radical scavenging, DNA protection, and inhibition of lipid peroxidation mediated by uric acid.</a> Annals of Clinical and Laboratory Science. 35 (1), 37-45 (2005).</li><li>Lopez-Gomollon, S., Sevilla, E., Bes, M. T., Peleato, M. L., Fillat, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+role+of+Fur+proteins:+FurB+(All2473)+from+Anabaena+protects+DNA+and+increases+cell+survival+under+oxidative+stress.">New insights into the role of Fur proteins: FurB (All2473) from Anabaena protects DNA and increases cell survival under oxidative stress.</a> The Biochemical Journal. 418 (1), 201-207 (2009).</li><li>Ebrahimi, K. H., Hagedoorn, P. L., Hagen, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+and+stimulation+of+formation+of+the+ferroxidase+center+and+the+iron+core+in+Pyrococcus+furiosus+ferritin.">Inhibition and stimulation of formation of the ferroxidase center and the iron core in Pyrococcus furiosus ferritin.</a> Journal of Biological Inorganic Chemistry. 15 (8), 1243-1253 (2010).</li><li>Smith, F. E., Herbert, J., Gaudin, J., Hennessy, D. J., Reid, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+iron+determination+using+ferene+triazine.">Serum iron determination using ferene triazine.</a> Clinical Biochemistry. 17 (5), 306-310 (1984).</li></ol>

ليس لدينا شيء في الكشف عنها.

عملية تنقية DPS كما هو موضح في هذه المقالة هي قوية للغاية. وكان نقاء باستمرار عالية (&gt; 99٪)، وتظهر أي بروتينات أخرى على المواد الهلامية SDS-PAGE والعصابات مرئية. على الرغم من هذا، يبدو أن بعض دفعات من DPS تنقيته أن يكون النشاط نوكلياز، كما يتضح من تدهور الحمض النووي جزئية عند?...

يجب الكائنات الهوائية يتعامل باستمرار مع أنواع الاكسجين التفاعلية التي يمكن أن تضر الحمض النووي الخاصة بهم فضلا عن غيرها من الجزيئات البيولوجية حاسمة. واحدة أداة فعالة لمواجهة الآثار السامة من الضرر التأكسدي هو البروتين الحمض النووي ملزم من الخلايا المتعطشة (DPS). منذ اكتشافه في عام 1992 من E. المتعطشة القولونية الثقافة 1، وقد تم تحديد DPS في أكثر من 300 نوع من البكتيريا والعتائق 2. upregulation هائلة من DPS خلال مرحلة ثابتة يجعل من الاكثر أعرب عالية البروتين نوواني المصاحب من E. القولونية في ظل ظروف المجاعة 3، 4. بالإضافة إلى ذلك، وقد تبين DPS للحفاظ على حد سواء الجدوى البكتيرية وسلامة الحمض النووي خلال العديد من الضغوط المختلفة، بما في ذلك الموت جوعا، وتركيز عالية من الحديد، التعرض للضوء الأشعة فوق البنفسجية، الصدمة الحرارية، والإجهاد التأكسدي 5، 6. هيكليا، DPS-الزميلة النفس إلى مستقر معقد هومو بلازميدة قليلة القسيمات من 12 مونومرات، ثhich التجمع في قذيفة جوفاء كروية. التجويف الداخلي على نطاق نانومتر ~ 4.5 يمكن الوصول إلى الخارج المذيبات عبر المسام التي تسمح بمرور الجزيئات الصغيرة 7، وأنه يمكن عزل المعادن المعدنية مثل الحديد 8. تأثير وقائي من DPS مستمد من عدة أنشطتها والكيمياء الحيوية، والتي تشمل الحمض النووي غير محددة ملزمة 1، النشاط ferroxidase، وتخزين الحديد 8. دراسة مفصلة عن الأنشطة البيوكيميائية المفيدة للDPS يتطلب أولا تنقية لها. DPS تنقية هو إجراء تفصيلا، كما يجب فصل DPS ليس فقط من البروتينات الأخرى، ولكن أيضا من أي الحمض النووي ملزمة 7. يستخدم لدينا عملية تنقية الأمثل العديد من التقنيات الشائعة، التي تتألف من عمودين التبادل الأيوني وكبريتات الأمونيوم خطوة هطول الأمطار. وهناك حاجة إلى العديد من التبادلات العازلة، كما DPS تتركز بشكل كبير يمكن أن تترسب من المحلول في ظروف قليل الملح. مرة واحدة وقد تم تنقية البروتين DPS، قد يتم تطبيقه على المقايسات التي تقيس مباشرة نشاطها ferroxidase 8، رياضيات الكيمياء الحمض النووي ملزم 9، وآليات ملزمة الحديد 10. لديه DPS تنقيته أيضا التطبيقات المحتملة الأخرى. تم استخدام هيكل كروي مجوف مستقرة من DPS كما السقالات لتخزين جزيئات مسعور داخل تجويف بروتين 11 وحتى غرفة رد فعل لتجميع الجسيمات النانوية المغناطيسية رواية 12. القدرة واقية من DPS للتوسط الأضرار الناجمة عن أنواع الاكسجين التفاعلية يمكن أن تكون بشكل واضح وأظهر مباشرة باستخدام مقايسة حماية الحمض النووي 13 و 14. في هذا الإجراء في المختبر، ويتم إنتاج الأنواع جذري عندما يحفز الحديد H 2 O 2 من التدهور عن طريق فنتون الكيمياء. هذه الجذور تلف الحمض النووي الحالي مباشرة في رد الفعل ويمكن أن تتحلل تماما في تركيزات عالية. نشاطين DPS مفتاح قد كلا مواجهة مباشرة آثار Fentإنتاج الجذور على بوساطة. DPS يقلل من تركيز الحديد حافز عن طريق تمعدن، وتستهلك وبيروكسيد الهيدروجين المتوفرة في هذه العملية. بالإضافة إلى ذلك، قد DPS ملزمة لالحمض النووي يحتمل أن تكون حمايته جسديا من ضرر الجذور ويتكثف قبل أن تتحول إلى حجم أصغر مع مساحة أقل على رد الفعل. الجمع بين هاتين الخاصيتين يجعل فحص DNA حماية مناسبة تماما لغرض قياس النشاط DPS واقية. مقايسة حماية الحمض النووي هي متعددة جدا، ويمكن استخدامها لمجموعة متنوعة من التطبيقات خارج DPS التوصيف. الضرر الراديكالية هو شكل شائع من التوتر في الخلايا، وتستخدم العديد من البروتينات والمواد الكيميائية المختلفة لمواجهة ذلك. المبدأ العام للمقايسة، وذلك باستخدام الحمض النووي سلامة كعلامة للضرر الجذور، ويمكن استخدامها في تركيبة مع أي تقريبا رد فعل المنتجة للراديكالية أو مواجهة وكيل. من بين أمور أخرى، وقد استخدمت بنجاح الفحص لتحديد خصائص مضادة للأكسدةمن K. استخراج بانيكولاتا للاستخدام في الصناعات الغذائية 15، لوصف آثار حمض اليوريك على الهيدروكسيل الضرر الوساطة 16، واكتساب رؤى جديدة في وظيفة الفراء النسخي البروتينات منظم 17. وعلى الرغم من الاستخدامات العديدة للمقايسة في الأبحاث المنشورة، وجدنا أن هناك حاجة إلى الكثير من التحسين والخطوات استكشاف الأخطاء وإصلاحها، الأمر الذي يجعل إعداد مقايسة لأول مرة عملية شاقة بلا داع لكثير من الباحثين. بروتوكول نقدم في هذه المقالة تهدف إلى إزالة هذا الحاجز للدخول.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BL21(DE3)pLysS competent cells</td>
 <td>Promega</td>
 <td>L1195</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pET-17b DNA</td>
 <td>EMD-Millipore</td>
 <td>69663-3</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LB broth powder</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>L3022</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ampicillin sodium salt</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A0166</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chloramphenicol</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>C0378</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>IPTG</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>I6758</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HEPES</td>
 <td>BDH</td>
 <td>441476L</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium hydroxide</td>
 <td>Merck</td>
 <td>105033</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium chloride</td>
 <td>VWR</td>
 <td>443824T</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EDTA</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>E9884</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Protease Inhibitor Cocktail Set III</td>
 <td>EMD-Millipore</td>
 <td>539134</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DEAE-Sepharose</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>DFF100</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ammonium sulphate</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A4418</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PD-10 Desalting Columns</td>
 <td>GE Healthcare LS</td>
 <td>17-0851-01</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SP-Sepharose</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>S1799</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Amicon Ultra Centr. Filter (10K MWCO)</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>UFC901024</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ferrous Sulphate heptahydrate</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>F8048</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hydrogen peroxide solution</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>216763</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MOPS</td>
 <td>Calbiochem</td>
 <td>475898</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SDS solution</td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>161-0418</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethidium bromide</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>E1510</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Equipment</td>
 <td>Company</td>
 <td>Model</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Static incubator</td>
 <td>Hettich</td>
 <td>INE500</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Shaking Incubator </td>
 <td>New Brunswick Sc.</td>
 <td>Inova 44</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cooled centrifuge</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>Avanti J-E</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Table-top centrifuge</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>5424</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cell disrupter</td>
 <td>Constant Systems Ltd.</td>
 <td>TS2/40/AA/AA</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>FPLC Purifier</td>
 <td>General Electric</td>
 <td>AKTA</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Airtight vials</td>
 <td>Cole-Parmer</td>
 <td>EW-08918-85</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Syringe needles</td>
 <td>BD</td>
 <td>305128</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pipettes</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>Z683779-1EA, Z683795-1EA</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

application of an in vitro dna protection assay to visualize stress mediation properties of the dps protein

الاكسدة هو نتيجة ثانوية لا مفر منه للحياة الهوائية. الأكسجين الجزيئي أمر ضروري لعملية التمثيل الغذائي للأرض، لكنه يأخذ أيضا في العديد من التفاعلات الضارة داخل الكائنات الحية. مزيج من الأيض الهوائي والحديد، وهو مركب حيوي آخر للحياة، ويكفي لإنتاج الجذور من خلال فنتون الكيمياء والحط من المكونات الخلوية. تدهور الحمض النووي يمكن القول إن عملية الأكثر إضرارا التي تنطوي على المتطرفين داخل الخلايا، كما إصلاح الحمض النووي لا يزال بعيدا عن تافهة. الفحص الواردة في هذه المادة تتيح تقنية الكمية لقياس وتصور تأثير الجزيئات والإنزيمات على الحمض النووي من التلف الراديكالي بوساطة. فحص الحمض النووي الحماية هو أداة بسيطة وسريعة وقوية لتوصيف المختبر في من خصائص وقائية من البروتينات أو المواد الكيميائية. أنه ينطوي على تعريض DNA إلى رد فعل الأكسدة الضارة وإضافة تركيزات مختلفة من مجمع الفائدة. ثم هو تصور خفض أو زيادة الحمض النووي من التلف بوصفها وظيفة من تركيز مركب باستخدام الكهربائي للهلام. في هذه المقالة ونحن لشرح تقنية للمقايسة حماية الحمض النووي عن طريق قياس خصائص وقائية من البروتين الحمض النووي ملزم من الخلايا المتعطشة (DPS). DPS هو مصغرة الفيريتين التي يتم استخدامها من قبل أكثر من 300 الأنواع البكتيرية لمكافحة بقوة الضغوطات البيئية. هنا نقدم بروتوكول تنقية DPS وشروط الفحص الأمثل لتقييم حماية الحمض النووي من قبل DPS.

عملية تنقية للDPS الموصوفة هنا هو تكرار للغاية. DPS تنقية وفقا للبروتوكول وصفها، وذلك باستخدام 2 لتر من E. ثقافة القولونية كنقطة انطلاق، وسوف تسفر عادة 2.5 مل من البروتين تحتوي على DPS 12 بتركيزات تتراوح بين 5 و 12 ميكرومتر. مرات الاستقراء أطول (4 ساعات) ويبدو للح...

Watch this Scientific Journal Video about Application of an In vitro DNA Protection Assay to Visualize Stress Mediation Properties of the Dps Protein at JoVE.com

Application of an In vitro DNA Protection Assay to Visualize Stress Mediation Properties of the Dps Protein

البروتين الحمض النووي ملزم من الخلايا المتعطشة (DPS) يلعب دورا حاسما في مكافحة الإجهاد الجرثومي. تتناول هذه المقالة تنقية<em&gt; E. القولونية</em&gt; DPS وبروتوكول ل<em&gt; في المختبر</em&gt; مقايسة يتظاهرون حماية DPS بوساطة من الحمض النووي من التدهور عن طريق أنواع الاكسجين التفاعلية.

تطبيق على<em&gt; في المختبر</em&gt; الحمض النووي الفحص حماية لتصور الإجهاد خصائص الوساطة من البروتين DPS

Oxidative stress is an unavoidable byproduct of  aerobic life.  Molecular oxygen is  essential for terrestrial metabolism, but it also takes part in many ...

application-an-vitro-dna-protection-assay-to-visualize-stress

Research

JoVE Journal

Biology

Application of an In vitro DNA Protection Assay to Visualize Stress Mediation Properties of the Dps Protein

11.1K Views.  Delft University of Technology. البروتين الحمض النووي ملزم من الخلايا المتعطشة (DPS) يلعب دورا حاسما في مكافحة الإجهاد الجرثومي. تتناول هذه المقالة تنقية E. القولونية DPS وبروتوكول ل في المختبر مقايسة يتظاهرون حماية DPS بوساطة من الحمض النووي من التدهور عن طريق أنواع الاكسجين التفا...

Video: Application of an In vitro DNA Protection Assay to Visualize Stress Mediation Properties of the Dps Protein

An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

The hallmark of metastatic cells is their ability to invade through the basement membrane and migrate to other parts of the body. Cells must be able to both secrete proteases that break down the basement membrane as well as migrate in order to be invasive. BD BioCoat Tumor Invasion System provides cells with conditions that allow assessment of their invasive property in vitro1,2. It consists of a BD Falcon FluoroBlok 24-Multiwell Insert Plate with an 8.0 micron pore size PET membrane that has been uniformly coated with BD Matrigel Matrix. This uniform layer of BD Matrigel Matrix serves as a reconstituted basement membrane in vitro providing a true barrier to non-invasive cells while presenting an appropriate protein structure to study invasion. The coating process occludes the pores of the membrane, blocking non-invasive cells from migrating through the membrane. In contrast, invasive cells are able to detach themselves from and migrate through the coated membrane. Quantitation of cell invasion can be achieved by either pre- or post-cell invasion labeling with a fluorescent dye such as DiIC12(3) or calcein AM, respectively, and measuring the fluorescence of invading cells. Since the BD FluoroBlok membrane effectively blocks the passage of light from 490-700 nm at &gt;99% efficiency, fluorescently-labeled cells that have not invaded are not detected by a bottom-reading fluorescence plate reader. However, cells that have invaded to the underside of the membrane are no longer shielded from the light source and are detected with the respective plate reader. This video demonstrates an endpoint cell invasion assay, using calcein AM to detect invaded cells.

An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

This video demonstrates how to measure cell invasion through cell culture inserts using a fluorescence-based methodology.

و في المختبر غزو الورم FluoroBlok الفحص

The hallmark of metastatic cells is their ability to invade through the basement membrane and migrate to other parts of the body. Cells must be able to ...

Application of Stopped-flow Kinetics Methods to Investigate the Mechanism of Action of a DNA Repair Protein

Transient kinetic analysis is indispensable for understanding the workings of biological macromolecules, since this approach yields mechanistic information including active site concentrations and intrinsic rate constants that govern macromolecular function. In case of enzymes, for example, transient or pre-steady state measurements identify and characterize individual events in the reaction pathway, whereas steady state measurements only yield overall catalytic efficiency and specificity. Individual events such as protein-protein or protein-ligand interactions and rate-limiting conformational changes often occur in the millisecond timescale, and can be measured directly by stopped-flow and chemical-quench flow methods. Given an optical signal such as fluorescence, stopped-flow serves as a powerful and accessible tool for monitoring reaction progress from substrate binding to product release and catalytic turnover1,2.
Here, we report application of stopped-flow kinetics to probe the mechanism of action of Msh2-Msh6, a eukaryotic DNA repair protein that recognizes base-pair mismatches and insertion/deletion loops in DNA and signals mismatch repair (MMR)3-5. In doing so, Msh2-Msh6 increases the accuracy of DNA replication by three orders of magnitude (error frequency decreases from ~10-6 to10-9 bases), and thus helps preserve genomic integrity. Not surprisingly, defective human Msh2-Msh6 function is associated with hereditary non-polyposis colon cancer and other sporadic cancers6-8. In order to understand the mechanism of action of this critical DNA metabolic protein, we are probing the dynamics of Msh2-Msh6 interaction with mismatched DNA as well as the ATPase activity that fuels its actions in MMR. DNA binding is measured by rapidly mixing Msh2-Msh6 with DNA containing a 2-aminopurine (2-Ap) fluorophore adjacent to a G:T mismatch and monitoring the resulting increase in 2-aminopurine fluorescence in real time. DNA dissociation is measured by mixing pre-formed Msh2-Msh6 G:T(2-Ap) mismatch complex with unlabeled trap DNA and monitoring decrease in fluorescence over time9. Pre-steady state ATPase kinetics are measured by the change in fluorescence of 7-diethylamino-3-((((2-maleimidyl)ethyl)amino)carbonyl) coumarin)-labeled Phosphate Binding Protein (MDCC-PBP) on binding phosphate (Pi) released by Msh2-Msh6 following ATP hydrolysis9,10.
The data reveal rapid binding of Msh2-Msh6 to a G:T mismatch and formation of a long-lived Msh2-Msh6 G:T complex, which in turn results in suppression of ATP hydrolysis and stabilization of the protein in an ATP-bound form. The reaction kinetics provide clear support for the hypothesis that ATP-bound Msh2-Msh6 signals DNA repair on binding a mismatched base pair in the double helix.
F. Noah Biro and Jie Zhai contributed to this paper equally.

Msh2-Msh6 is responsible for initiating repair of replication errors in DNA. Here we present a transient kinetics approach towards understanding how this critical protein works. The report illustrates stopped-flow experiments for measuring the coupled DNA binding and ATPase kinetics underlying Msh2-Msh6 mechanism of action in DNA repair.

تطبيق أساليب حركية متوقف تدفق بالتحقيق في آلية عمل لإصلاح الحمض النووي من البروتين

Transient kinetic analysis is indispensable for understanding the workings of biological macromolecules, since this approach yields mechanistic ...

Biophysical Assays to Probe the Mechanical Properties of the Interphase Cell Nucleus: Substrate Strain Application and Microneedle Manipulation

In most eukaryotic cells, the nucleus is the largest organelle and is typically 2 to 10 times stiffer than the surrounding cytoskeleton; consequently, the physical properties of the nucleus contribute significantly to the overall biomechanical behavior of cells under physiological and pathological conditions. For example, in migrating neutrophils and invading cancer cells, nuclear stiffness can pose a major obstacle during extravasation or passage through narrow spaces within tissues.1 On the other hand, the nucleus of cells in mechanically active tissue such as muscle requires sufficient structural support to withstand repetitive mechanical stress. Importantly, the nucleus is tightly integrated into the cellular architecture; it is physically connected to the surrounding cytoskeleton, which is a critical requirement for the intracellular movement and positioning of the nucleus, for example, in polarized cells, synaptic nuclei at neuromuscular junctions, or in migrating cells.2 Not surprisingly, mutations in nuclear envelope proteins such as lamins and nesprins, which play a critical role in determining nuclear stiffness and nucleo-cytoskeletal coupling, have been shown recently to result in a number of human diseases, including Emery-Dreifuss muscular dystrophy, limb-girdle muscular dystrophy, and dilated cardiomyopathy.3 To investigate the biophysical function of diverse nuclear envelope proteins and the effect of specific mutations, we have developed experimental methods to study the physical properties of the nucleus in single, living cells subjected to global or localized mechanical perturbation. Measuring induced nuclear deformations in response to precisely applied substrate strain application yields important information on the deformability of the nucleus and allows quantitative comparison between different mutations or cell lines deficient for specific nuclear envelope proteins. Localized cytoskeletal strain application with a microneedle is used to complement this assay and can yield additional information on intracellular force transmission between the nucleus and the cytoskeleton. Studying nuclear mechanics in intact living cells preserves the normal intracellular architecture and avoids potential artifacts that can arise when working with isolated nuclei. Furthermore, substrate strain application presents a good model for the physiological stress experienced by cells in muscle or other tissues (e.g., vascular smooth muscle cells exposed to vessel strain). Lastly, while these tools have been developed primarily to study nuclear mechanics, they can also be applied to investigate the function of cytoskeletal proteins and mechanotransduction signaling.

We present two independent, microscope-based tools to measure the induced nuclear and cytoskeletal deformations in single, living adherent cells in response to global or localized strain application. These techniques are used to determine nuclear stiffness (i.e., deformability) and to probe intracellular force transmission between the nucleus and the cytoskeleton.

البيوفيزيائية فحوصات للتحقيق في الخواص الميكانيكية للنواة الخلية الطور البيني : الركيزة التطبيق الانفعال والتلاعب Microneedle

In most eukaryotic cells, the nucleus is the largest organelle and is typically 2 to 10 times stiffer than the surrounding cytoskeleton; consequently, the ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish water and sediment. The choice of biological indicators must be based on reliable scientific knowledge and, possibly, on the availability of standardized procedures. In this article, we present a standardized protocol that used the marine crustacean Artemia to evaluate the toxicity of chemicals and/or of marine environmental matrices. Scientists propose that the brine shrimp (Artemia) is a suitable candidate for the development of a standard bioassay for worldwide utilization. A number of papers have been published on the toxic effects of various chemicals and toxicants on brine shrimp (Artemia). The major advantage of this crustacean for toxicity studies is the overall availability of the dry cysts; these can be immediately used in testing and difficult cultivation is not demanded1,2. Cyst-based toxicity assays are cheap, continuously available, simple and reliable and are thus an important answer to routine needs of toxicity screening, for industrial monitoring requirements or for regulatory purposes3. The proposed method involves the mortality as an endpoint. The numbers of survivors were counted and percentage of deaths were calculated. Larvae were considered dead if they did not exhibit any internal or external movement during several seconds of observation4. This procedure was standardized testing a reference substance (Sodium Dodecyl Sulfate); some results are reported in this work. This article accompanies a video that describes the performance of procedural toxicity testing, showing all the steps related to the protocol.

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

This study concerns the development and standardization of a valuable methodological protocol to determine long-term (14 days) lethal toxicity exerted by chemical substances, industrial wastewater or sewage and liquid environmental samples on the saltwater crustacean, Artemia franciscana.

على المدى الطويل اختبار السمية المهلكة مع القشريات الأرتيميا franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified and/or determined via proteomic approaches, and/or immunoblotting with methyl-arginine specific antibodies. However, these techniques sometimes can be misleading and often provide false positive results. Most importantly, these techniques cannot provide direct evidence in support of the PRMT substrate specificity. In vitro methylation assays, on the other hand, are useful biochemical assays, which are sensitive, and consistently reveal if the identified proteins are indeed PRMT substrates. A typical in vitro methylation assay includes purified, active PRMTs, purified substrate and a radioisotope labeled methyl donor (S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine). Here we describe a step-by-step protocol to isolate catalytically active PRMT1, a ubiquitously expressed PRMT family member. The methyl transferase activities of the purified PRMT1 were later tested on Ras-GTPase activating protein binding protein 1 (G3BP1), a known PRMT substrate, in the presence of S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine as the methyl donor. This protocol can be employed not only for establishing the methylation status of novel physiological PRMT1 substrates, but also for understanding the basic mechanism of protein arginine methylation.

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation, catalyzed by a class of enzymes viz., protein arginine methyl transferases (PRMTs), is the process of enzymatic addition of methyl group(s) to arginines within proteins. The in vitro methylation assay is the most dependable tool for assessing the methylation status of known or novel PRMT substrates.

في المختبر مثلأيشن الفحص لدراسة البروتين أرجينين مثلأيشن

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified ...

Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively inert because it has two unpaired electrons located in different pi * anti-bonding orbitals. These two electrons have parallel spins, meaning they rotate in the same direction about their own axes. This is why the oxygen molecule is not very reactive. Activation of oxygen may occur by two different mechanisms; either through reduction via one electron at a time (monovalent reduction), or through the absorption of sufficient energy to reverse the spin of one of the unpaired electrons. This results in the production of reactive oxidative species (ROS). There are a number of ways in which the human body eliminates ROS in its physiological state. If ROS production exceeds the repair capacity, oxidative stress results and damages different molecules. There are many different methods by which oxidative stress can be measured. This manuscript focuses on one of the methods named cell gel electrophoresis, also known as &#8220;comet assay&#8221; which allows measurement of DNA breaks. If all factors known to cause DNA damage, other than oxidative stress are kept constant, the amount of DNA damage measured by comet assay is a good parameter of oxidative stress. The principle is simple and relies upon the fact that DNA molecules are negatively charged. An intact DNA molecule has such a large size that it does not migrate during electrophoresis. DNA breaks, however, if present result in smaller fragments which move in the electrical field towards the anode. Smaller fragments migrate faster. As the fragments have different sizes the final result of the electrophoresis is not a distinct line but rather a continuum with the shape of a comet. The system allows a quantification of the resulting &#8220;comet&#8221; and thus of the DNA breaks in the cell.

Comet assay measures DNA breaks, induced by different factors. If all factors (except oxidative stress) causing DNA damage are kept constant, the amount of DNA damage is a good indirect parameter of oxidative stress. The goal of this protocol is to use comet assay for indirect measurement of oxidative stress.

المذنب الفحص كتدبير غير مباشر من الجهازية الاكسدة

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively ...

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

Low dose radiation exposure may produce a variety of biological effects that are different in quantity and quality from the effects produced by high radiation doses. Addressing questions related to environmental, occupational and public health safety in a proper and scientifically justified manner heavily relies on the ability to accurately measure the biological effects of low dose pollutants, such as ionizing radiation and chemical substances. DNA damage and repair are the most important early indicators of health risks due to their potential long term consequences, such as cancer. Here we describe a protocol to study the effect of chronic in vivo exposure to low doses of &#947;- and &#946;-radiation on DNA damage and repair in mouse spleen cells. Using a commonly accepted marker of DNA double-strand breaks, phosphorylated histone H2AX called &#947;H2AX, we demonstrate how it can be used to evaluate not only the levels of DNA damage, but also changes in the DNA repair capacity potentially produced by low dose in vivo exposures. Flow cytometry allows fast, accurate and reliable measurement of immunofluorescently labeled &#947;H2AX in a large number of samples. DNA double-strand break repair can be evaluated by exposing extracted splenocytes to a challenging dose of 2 Gy to produce a sufficient number of DNA breaks to trigger repair and by measuring the induced (1 hr post-irradiation) and residual DNA damage (24 hrs post-irradiation). Residual DNA damage would be indicative of incomplete repair and the risk of long-term genomic instability and cancer. Combined with other assays and end-points that can easily be measured in such in vivo studies (e.g., chromosomal aberrations, micronuclei frequencies in bone marrow reticulocytes, gene expression, etc.), this approach allows an accurate and contextual evaluation of the biological effects of low level stressors.

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

A protocol to evaluate changes in DNA damage levels and DNA repair capacity that may be induced by chronic in vivo low dose irradiation in mouse spleen lymphocytes, by measuring phosphorylated histone H2AX, a marker of DNA double-strand breaks, using flow cytometry is presented.

قياس الحمض النووي من التلف وإصلاح في ماوس Splenocytes بعد المزمنة<em&gt; في فيفو</em&gt; التعرض لجرعات منخفضة جدا من بيتا وغاما والأشعة السينية

Low dose radiation exposure may produce a variety of biological effects that are different in quantity and quality from the effects produced by high ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and silencing of genes mediate the response of plants to environmental signals and developmental cues. Therefore, insights into the mechanisms that control plant gene expression are essential to gain a deep understanding of how biological processes are regulated in plants. The chromatin immunoprecipitation (ChIP) technique described here is a procedure to identify the DNA-binding sites of proteins in genes or genomic regions of the model species Arabidopsis thaliana. The interactions with DNA of proteins of interest such as transcription factors, chromatin proteins or posttranslationally modified versions of histones can be efficiently analyzed with the ChIP protocol. This method is based on the fixation of protein-DNA interactions in vivo, random fragmentation of chromatin, immunoprecipitation of protein-DNA complexes with specific antibodies, and quantification of the DNA associated with the protein of interest by PCR techniques. The use of this methodology in Arabidopsis has contributed significantly to unveil transcriptional regulatory mechanisms that control a variety of plant biological processes. This approach allowed the identification of the binding sites of the Arabidopsis chromatin protein EBS to regulatory regions of the master gene of flowering FT. The impact of this protein in the accumulation of particular histone marks in the genomic region of FT was also revealed through ChIP analysis.

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin immunoprecipitation is a powerful technique for the identification of DNA binding sites of Arabidopsis proteins in vivo. This procedure includes chromatin cross-linking and fragmentation, immunoprecipitation with selective antibodies against the protein of interest, and qPCR analysis of bound DNA. We describe a simple ChIP assay optimized for Arabidopsis plants.

مناعي لونين الفحص لتحديد نبات الأرابيدوبسيس التفاعلات-DNA البروتين<em&gt; في فيفو</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as well as pathological changes in endothelial phenotype and gene expression. In particular, maladaptive effects of periodic, unidirectional flow induced shear stress can trigger a variety of effects on several vascular cell types, particularly endothelial cells. While by now endothelial cells from diverse anatomic origins have been cultured, in-depth analyses of their responses to fluid shear have been hampered by the relative complexity of shear models (e.g., parallel plate flow chamber, cone and plate flow model). While these all represent excellent approaches, such models are technically complicated and suffer from drawbacks including relatively lengthy and complex setup time, low surface areas, requirements for pumps and pressurization often requiring sealants and gaskets, creating challenges to both maintenance of sterility and an inability to run multiple experiments. However, if higher throughput models of flow and shear were available, greater progress on vascular endothelial shear responses, particularly periodic shear research at the molecular level, might be more rapidly advanced. Here, we describe the construction and use of shear rings: a novel, simple-to-assemble, and inexpensive tissue culture model with a relatively large surface area that easily allows for a high number of experimental replicates in unidirectional, periodic shear stress studies on endothelial cells.

The Assembly and Application of &#039;Shear Rings&#039;: A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

Different levels and patterns of fluid shear are known to modulate endothelial gene expression, phenotype and susceptibility to disease. We discuss the assembly and use of 'shear rings': a model that produces unidirectional, periodic shear stress patterns. Shear rings are simple to assemble, economical and can produce high cell yields.

الجمعية وتطبيق &quot;خواتم القص &#39;: رواية غشائي نموذج لالمداري، أحادي الاتجاه والدوري السائل تدفق وإجهاد القص

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as ...

Observation and Quantification of Mating Behavior in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

A method for observing and quantifying the mating behavior of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, was established under a stereomicroscope. To improve the mating efficiency of B. Xylophilus and to increase the chances of mating observation, virgin adults were cultured and used for the investigation. Eggs were obtained by keeping the nematodes in water and allowing the females to lay eggs for 10 min. The second-stage juveniles (J2) were synchronized by incubating the eggs for 24 h at 25 &#176;C in the dark, and the early J4 were obtained by culturing the J2 with grey mold, Botrytis cinerea, for another 52 h. At this time point, most J4 nematodes could be clearly distinguished as being male or female using their genital morphology. The male and female J4 were collected and cultured separately in two different Petri dishes for 24 h to get virgin adult nematodes. A virgin male and a virgin female were paired in a drop of water in the well of a concave slide. The mating behavior was filmed with a video recorder under a stereomicroscope. The whole period of the mating process was 82.8 &#177;3.91 min (mean &#177;SE) and could be divided into 4 different phases: searching, contacting, copulating, and lingering. The mean minutes of duration were 21.8 &#177; 2.0, 28.0 &#177; 1.9, 25.8 &#177; 0.7 and 7.2 &#177; 0.5, respectively. Eleven sub-behaviors were described: cruising, approaching, encountering, touching, hooping, locating, attaching, ejaculating, separating, quiescence, and roaming. Interestingly, obvious intra-sexual competition was observed when one female was grouped with 3 males or one male with 3 females. This protocol is useful and valuable, not only in investigating the mating behavior of B. xylophilus, but also in acting as a reference for ethological studies of other nematodes.

Observation and Quantification of Mating Behavior in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

A protocol for investigating the mating behavior of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, is presented. Behavioral features of B. xylophilus are described in the mating process.

المراقبة والقياس الكمي للسلوك التزاوج في غابة الصنوبر نيماتودا،<em&gt; Bursaphelenchus xylophilus</em

A method for observing and quantifying the mating behavior of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, was established under a stereomicroscope. ...