وأيد هذه الدراسة من قبل جائزة تقدير من وزارة الخارجية الامريكية للشؤون المحاربين القدامى، والمعاهد الوطنية للصحة منح R01CA138528 إلى RW.

1. إعداد التركيبات التعبير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل البدء في البروتوكول، PRMTs استنساخ في ناقلات التعبير الثدييات مع-N محطة حاتمة العلامة (MYC أو HA)، والركيزة في الإطار مع الجلوتاثيون-S-ترانسفيراز (GST) للتعبير البروتين رفيع المستوى وتنقيتها من الخلايا البكتيرية لست]، وذلك باستخدام التقنيات البيولوجية الجزيئية القياسية. </li></ol> 2. تنقية PRMTs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام 100 ملم الأطباق الثقافة للحفاظ على الخلايا الظهارية القصبية الإنسان (Beas2B). مرور الخلايا كل 3 أيام وعدم السماح لهم تنمو لالتقاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم قبل ترنسفكأيشن، البذور 7.5 × 10 5 خلايا في 10 مل مستنبت في طبق ثقافة 100 ملم. دوامة لتفريق بالتساوي الخلايا، واحتضان عند 37 درجة مئوية في ترطيب 5٪ CO 2 الحاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم التالي، ونضح وسائل الإعلام وإضافة 5 مل من وسائل الإعلام ثقافة دون المصل والمضادات الحيوية. دوامة ونضح المتوسطة. كرر هذه الخطوة واحدةالمزيد من الوقت، وأخيرا إضافة 5 مل من المصل / متوسطة الحرة المضادات الحيوية والشروع في ترنسفكأيشن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع 6 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد في 750 ميكرولتر من المصل خالية المتوسطة في العقيمة 1.5 مل أنبوب الطرد المركزي البلاستيك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في 1.5 مل البلاستيك الطرد المركزي أنبوب آخر، تمييع 30 ميكرولتر من كاشف ترنسفكأيشن في 750 ميكرولتر من مصل المتوسطة مجانا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الحل ترنسفكأيشن كاشف المخفف (الخطوة 2.5) إلى أنبوب يحتوي على الحمض النووي المخفف (الخطوة 2.4). المزيج بلطف pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخليط ترنسفكأيشن في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 15 دقيقة، ماصة الخليط بلطف على ترنسفكأيشن الخلايا، ودوامة لخلط بالتساوي، واحتضان عند 37 درجة مئوية في ترطيب 5٪ CO 2 الحاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 3 ساعة، نضح المتوسطة التي تحتوي على خليط ترنسفكأيشن من الخلايا. إضافة جديدة خلية ثقافة المتوسط ​​تستكمل مع المصل والمضادات الحيوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان عند 37 درجة مئوية في ترطيب 5٪ CO 2حاضنة لمدة 48 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 48 ساعة، ليز الخلايا في 1 مل من تحلل العازلة (1X الفوسفات مخزنة المالحة، 1٪ Nonidet P-40، 0.5٪ deoxycholate الصوديوم، 0.1٪ دوديسيل كبريتات الصوديوم، و 1 ميكروغرام / مل phenlymethyl سلفونيل الفلورايد). جمع لست] في جهاز للطرد المركزي أنبوب بلاستيكي مع رافع الخلية واحتضان لست] على الجليد لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي في 15،000 لست] x ج لمدة 10 دقيقة على جهاز للطرد المركزي المقعد العلوي لمسح لست] من الحطام الخلية. [* من المستحسن للغاية لتأكيد التعبير عن HA-PRMT1 عبر immunoblotting من قسامة من لست] مع معاداة HA الأجسام المضادة، قبل الشروع في تنقية الانزيمات لفحص الحامض.] </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتنقية PRMTs، واحتضان 3 ملغ من الخلية لست] مع 30 ميكرولتر من 50:50 تعليق معاداة HA تقارب مصفوفة في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، وتناوب بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في محور دوار الأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اليوم التالي، وتدور الأنابيب في 14،000 x ج على جهاز للطرد المركزي المقعد العلوي لمدة 2 دقيقة لجمعالخرز. تجاهل طاف وتغسل حبات 3X مع 1 مل من RIPA العازلة [20 ملي تريس (الرقم الهيدروجيني 8.0)، 150 مم كلوريد الصوديوم، 5 ملي EDTA و 1٪ تريتون-X-100] في كل غسل تليها الطرد المركزي في 14،000 x ج لمدة 2 دقيقة. بعد غسل الثالث، تغسل حبات مرة واحدة مع 100 ميكرولتر من العازلة مثيلة (50 ملي تريس درجة الحموضة 8.5، 20 ملي بوكل، 10 ملم MgCl 2، 1 ملم β المركابتويثانول، 100 ملي السكروز). بعد الطرد المركزي، وإزالة طاف. حبات تحتوي على PRMTs يجمد جاهزة لاستخدامها في فحص الحامض. [* ينصح بشدة استخدام PRMTs يجمد فورا في مقايسة مثيلة.] </li></ol> 3. تنقية الركيزة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تلقيح مستعمرة واحدة من GST-BL21 G3BP1 حولت إلى 5 مل من لوريا، Bertani (LB) متوسطة تحتوي على 100 ميكروغرام / مل الأمبيسلين. تنمو الثقافات بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع اهتزاز عند 250 دورة في الدقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اليوم التالي، ونقل الثقافة بين عشية وضحاها الى 50 مل من الطازجة المتوسطة LB وتابعinue أن تنمو إلى OD 600 من 0.5-0.7 (يستغرق حوالي 2 ساعة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما يصل OD 600 0.5-0.7، إضافة الآيزوبروبيل-β-D-thiogalactoside (IPTG) إلى تركيز النهائي من 1 ملم والاستمرار في ثقافة لمدة 4 ساعة إضافية عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز عند 250 دورة في الدقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حصاد الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 1500 x ج لمدة 10 دقيقة، ومعالجة بيليه لتنقية ضريبة المبيعات أو تخزينها في -80 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تعليق بيليه البكتيرية في 5 مل من تحلل العازلة (1X PBS مع مثبطات الأنزيم البروتيني، 100 ميكروغرام / مل من الليزوزيم، و 0.1٪ تريتون-X-100) واحتضان لست] عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. في هذا الوقت لست] سيظهر العكرة ولزج بسبب الإفراج عن الحمض النووي الجيني البكتيري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> القص الحمض النووي الجيني بواسطة صوتنة (10 نبضات من كل 1 ثانية مع اتساع 30٪). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مسح لست] بواسطة الطرد المركزي عند 15،000 x ج لمدة 10 دقيقة ونقل طاف واضحة إلى أنبوب 15 مل. إذا طاف غير واضح تكرار centrifugation عملية واحدة لمزيد من الوقت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وفي الوقت نفسه، تغسل حبات GST-سيفاروز مرتين مع PBS الجليد الباردة وجعل 50:50 تعليق GST-sepharose و في برنامج تلفزيوني. إضافة 200 ميكرولتر من تعليق GST-sepharose و لالمحللة الخلية البكتيرية التي تم تطهيرها وتناوب على 4 درجات مئوية لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 1 ساعة، أنابيب الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 3 دقائق لجمع الخرز. تغسل حبات 3X مع الثلج الباردة PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد غسل النهائي، resuspend والخرز في 100 ميكرولتر من العازلة شطف (50 ملي تريس الرقم الهيدروجيني 8.0، 150 مم كلوريد الصوديوم، و 30 ملي الجلوتاثيون) وتناوب على 4 درجات مئوية لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنابيب الطرد المركزي في 15،000 x ج لمدة 2 دقيقة ونقل طاف تحتوي على البروتين النقي في أنبوب الطرد المركزي البلاستيك آخر. تنفيذ SDS هلام بولي أكريلاميد الكهربائي (SDS-PAGE) تحليل في 5 ميكرولتر من البروتين النقي جنبا إلى جنب مع كميات معروفة من ألبومين المصل البقري (BSA) لتقدير تركيز البروتين النقي. </li></ol> 4. مثلأيشن الفحص ملاحظة: إجراء الخطوات التالية في منطقة منفصلة مخصصة للعمل والنظائر المشعة في الامتثال للبروتوكولات المؤسسة على إجراء التجارب مع النظائر المشعة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 2 ميكروغرام من المنقى GST-الركيزة والتي تحتوي على مزيج الرئيسي 1X عازلة مثيلة (50 ملي تريس درجة الحموضة 8.5، 20 ملي بوكل، 10 ملم MgCl 2، 1 ملم β المركابتويثانول، والسكروز 100 ملم)، 1 μCi من S-adenosyl- L- [ميثيل 3 H] ميثيونين، والماء إلى الحجم النهائي من 10 ميكرولتر إلى PRMTs يجمد (الخطوة 2.13)، واحتضان رد الفعل عند 30 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 1 ساعة، ووقف رد الفعل من خلال إضافة 10 ميكرولتر من 2X SDS عينة العازلة. بعد تمسخ من العينات في 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، وفصل العينات على هلام SDS-PAGE. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في وقت لاحق، نقل البروتينات فصلها عن هلام SDS على غشاء النيتروسليلوز باستخدام نقل الكهربي شبه الجافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد نقل، وتغطي الغشاء معutofluor (صورة تكثيف autoradiographic)، وصخرة بلطف لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة. بعد 2 ساعة، صب قبالة autofluor والاحتفاظ بها لاستخدامها لاحقا. [* تسمية أنبوب كمادة مشعة] </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بسرعة الهواء يجف الغشاء على ورق الترشيح، وختم في كيس من البلاستيك وتعرض الغشاء إلى فيلم الأشعة السينية في -20 درجة مئوية. يكفي التعرض الوقت يتراوح بين 5-30 أيام. </li></ol> 5. التأكيد التعبير PRMT تحميل والمساواة من الركيزة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد تحقيق التعرض كافية، ونقل إلى غشاء مربع من البلاستيك تحتوي على عرقلة العازلة [تريس مخزنة المالحة مع توين 20 (TBST + 3٪ الحليب الخالي من الدسم)] وصخرة بلطف لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل عازلة تمنع والنفايات المشعة. احتضان الغشاء مع مكافحة HA الأجسام المضادة (1: 1،000 تمييع) في TBST بين عشية وضحاها في 4 ° C، مع هزاز لطيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل الغشاء مع TBST 3X واحتضان الغشاء مع HRP المسمى مكافحة فأر الضد الثانوية(1: 5،000 تمييع) في TBST في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة مع هزاز لطيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 1 ساعة، ويغسل الغشاء مع TBST 3X، وإجراء الكشف chemiluminiscence من البروتينات مع الركيزة HRP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الكشف عن PRMTs HA الموسومة، واحتضان الغشاء مع Ponseau-S الحل تلطيخ لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. يغسل بسرعة 3X الغشاء مع الماء للكشف عن ركائز الموسومة GST. مسح الصورة. </li></ol>

<ol>
	<li>Paik, W. K., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+methylase+I.+Purification+and+properties+of+the+enzyme.">Protein methylase I. Purification and properties of the enzyme.</a> J Biol Chem. 243, 2108-2114 (1968).</li><li>Lin, W. J., Gary, J. D., Yang, M. C., Clarke, S., Herschman, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mammalian+immediate-early+TIS21+protein+and+the+leukemia-associated+BTG1+protein+interact+with+a+protein-arginine+N-methyltransferase.">The mammalian immediate-early TIS21 protein and the leukemia-associated BTG1 protein interact with a protein-arginine N-methyltransferase.</a> J Biol Chem. 271, 15034-15044 (1996).</li><li>Boffa, L. C., Karn, J., Vidali, G., Allfrey, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+NG,+NG,-dimethylarginine+in+nuclear+protein+fractions.">Distribution of NG, NG,-dimethylarginine in nuclear protein fractions.</a> Biochem Biophys Res Commun. 74, 969-976 (1977).</li><li>Bedford, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arginine+methylation+at+a+glance.">Arginine methylation at a glance.</a> J Cell Sci. 120, 4243-4246 (2007).</li><li>Lee, Y. H., Stallcup, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minireview:+protein+arginine+methylation+of+nonhistone+proteins+in+transcriptional+regulation.">Minireview: protein arginine methylation of nonhistone proteins in transcriptional regulation.</a> Mol Endocrinol. 23, 425-433 (2009).</li><li>Bedford, M. T., Clarke, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+arginine+methylation+in+mammals:+who,+what,+and+why.">Protein arginine methylation in mammals: who, what, and why.</a> Mol Cell. 33, 1-13 (2009).</li><li>Bikkavilli, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dishevelled3+is+a+novel+arginine+methyl+transferase+substrate.">Dishevelled3 is a novel arginine methyl transferase substrate.</a> Scientific reports. 2, 805 (2012).</li><li>Bikkavilli, R. K., Malbon, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arginine+methylation+of+G3BP1+in+response+to+Wnt3a+regulates+{beta}-catenin+mRNA.">Arginine methylation of G3BP1 in response to Wnt3a regulates {beta}-catenin mRNA.</a> J Cell Sci. 124, 2310-2320 (2011).</li><li>Bikkavilli, R. K., Malbon, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt3a-stimulated+LRP6+phosphorylation+is+dependent+upon+arginine+methylation+of+G3BP2.">Wnt3a-stimulated LRP6 phosphorylation is dependent upon arginine methylation of G3BP2.</a> J Cell Sci. , (2012).</li><li>Tini, M., Naeem, H., Torchia, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+analysis+of+arginine+methylation+in+transcription.">Biochemical analysis of arginine methylation in transcription.</a> Methods Mol Biol. 523, 235-247 (2009).</li><li>Lee, J., Cheng, D., Bedford, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+in+protein+methylation.">Techniques in protein methylation.</a> Methods Mol Biol. 284, 195-208 (2004).</li><li>Cheng, D., Vemulapalli, V., Bedford, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+applied+to+the+study+of+protein+arginine+methylation.">Methods applied to the study of protein arginine methylation.</a> Methods Enzymol. 512, 71-92 (2012).</li><li>Zurita-Lopez, C. I., Sandberg, T., Kelly, R., Clarke, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+protein+arginine+methyltransferase+7+(PRMT7)+is+a+type+III+enzyme+forming+omega-NG-monomethylated+arginine+residues.">Human protein arginine methyltransferase 7 (PRMT7) is a type III enzyme forming omega-NG-monomethylated arginine residues.</a> J Biol Chem. 287, 7859-7870 (2012).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

يتم استخدام بروتوكول الموصوفة هنا بشكل روتيني لتحديد الوضع مثيلة من ركائز PRMT تحديدها. وهذا الاختبار قوي، ومتماسك تقدم أيضا دليل قاطع على خصوصية PRMTs لركائز بهم. المكونات الرئيسية لنجاح هذا الاختبار هي: 1. التعبير عن PRMTs في خلايا الثدييات، 2. آخر من PRMTs المنقى، 3. التعبير و...

وكان أول وصف مثيلة البروتين في عام 1968 1. لم يكن حتى استنساخ أول من PRMT1 في عام 1996، أن الباحثين بدأوا نقدر أهمية هذا التعديل بعد متعدية 2. ومن المثير للاهتمام، الميثيلي وحوالي 2٪ من بقايا أرجينين في البروتينات مقتطفات النووية 3، مما يدل على وفرة من هذا التعديل. أرجينين هو حمض أميني موجبة مع سلسلة الجانبية الأساسية والنيتروجين / س في غضون السلاسل الجانبية للأرجينين يمكن أن يكون بعد translationally تعديل عن طريق إضافة مجموعة الميثيل، وهي عملية تعرف باسم أرجينين مثيلة 4-6. يتم تحفيز أرجينين مثيلة من قبل فئة من الإنزيمات وهي، transferases البروتين الميثيل أرجينين (PRMTs). Arginines يمكن أن تكون إما monomethylated أو dimethylated وهذا الأخير يمكن أن يكون إما متماثل أو غير متماثل تبعا لنوع من PRMTs تحفيز عملية 4-6. البروتينات التي تعرض argininزخارف الإلكتروني جليكاين الغنية هي أهداف محتملة لبوساطة PRMT الحفز. وقد تبين بوساطة PRMT مثيلة من ركائز لتعديل التفاعل البروتين البروتين، البروتين النووي تفاعل حامض، وظيفة البروتين، والتعبير الجيني، و / أو الإشارات الخلوية، والتي تعتبر بالغة الأهمية لالتوازن الخلوي العادي 7-9. من أجل فهم الدور البيولوجي للبروتين أرجينين مثيلة، يطلب فحوصات دقيقة وفعالة، وقابلة للتكرار لإنشاء مركز مثيلة من ركائز PRMT تحديدها. في المختبر فحص الحامض، الذي يقيم قدرات PRMTs تنقيته لتحفيز مثيلة من ركائز بهم، هو فحص مقبولة تماما لدراسة مثيلة أرجينين 10-12. النجاح الشامل لهذا الاختبار يعتمد إلى حد كبير على نشاط PRMTs المنقى. ويمكن التعبير عن PRMTs وتنقيته من البكتيريا، أو خلايا الثدييات 10،11. هذا الفحص في المختبر مثيلة، ودetailed في قسم البروتوكول، وبناء على الطريقة الموصوفة في الأصل من قبل تيني وزملاؤه 10. في هذا البروتوكول، وتبين لنا بالتفصيل الخطوات المتبعة في التعبير وتنقية PRMT1 في خلايا الثدييات. تم تقييم قدرة PRMT1 تنقيته لتحفيز مثيلة على رأس GTPase تفعيل بروتين بروتين ملزمة 1 (G3BP1)، وPRMT الركيزة المعروف 8، في وقت لاحق وجود S-أدينوزيل-L- [ميثيل 3 H] ميثيونين باسم المانحة الميثيل. باستخدام هذا الاختبار، يمكننا تحديد موثوق قدرات PRMTs لرواية ميثيل أو ركائز معروفة، وهي الخطوة الأولى في دراسة البروتين أرجينين مثيلة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="673">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:136px;">Company</td>
			<td style="width:111px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ecoscint ultra&#160;</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>LS-270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bottle top dispenser</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>LS-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AutoFluor</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>LS-315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6 ml Scintillation Vials</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>SKU:SVC-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">GST-sepharose</td>
			<td style="width:136px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">L-Glutathione Reduced</td>
			<td style="width:136px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">G4251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Lipofectamine</td>
			<td style="width:136px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Beas2B</td>
			<td style="width:136px;">ATCC</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Optimem</td>
			<td style="width:136px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">NP-40</td>
			<td style="width:136px;">US-Biologicals</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">SDS</td>
			<td style="width:136px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Sodium deoxycholate</td>
			<td style="width:136px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">PMSF</td>
			<td style="width:136px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">anti-HA affinity matrix</td>
			<td style="width:136px;">Roche</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Tris</td>
			<td style="width:136px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Nacl</td>
			<td style="width:136px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Bio-rad gel doc</td>
			<td style="width:136px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">anti-HA antibody</td>
			<td style="width:136px;">roche</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Ponseau S</td>
			<td style="width:136px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro methylation assay to study protein arginine methylation

بروتين أرجينين مثيلة هي واحدة من التعديلات بعد متعدية الأكثر وفرة في النواة. يمكن تحديد البروتين أرجينين مثيلة و / أو عبر تحديد النهج البروتين و / أو immunoblotting مع الأجسام المضادة المحددة ميثيل أرجينين. ومع ذلك، هذه التقنيات يمكن أن تكون أحيانا مضللة وغالبا ما تقدم نتائج إيجابية كاذبة. الأهم من ذلك، يمكن لهذه التقنيات لا توفر دليلا مباشرا في دعم خصوصية PRMT الركيزة. في المختبر فحوصات الحامض، من ناحية أخرى، هي فحوصات الكيمياء الحيوية المفيدة، التي تعتبر حساسة، وتكشف باستمرار إذا كانت البروتينات التي تم تحديدها هي في الواقع ركائز PRMT. يتضمن نموذجية في المختبر فحص الحامض المنقى، PRMTs النشطة، الركيزة المنقى والنظائر المشعة وصفت المانحة الميثيل (S-أدينوزيل-L- [ميثيل 3 H] ميثيونين). نحن هنا وصف بروتوكول خطوة بخطوة لعزل PRMT1 نشطة حفاز، أحد أفراد الأسرة PRMT أعرب بتواجد مطلق. وليتم اختبار الأنشطة ترانسفيراز thyl من PRMT1 تنقيته في وقت لاحق الراس GTPase تفعيل البروتين البروتين 1 (G3BP1) ملزمة، ركيزة PRMT معروف، في حضور S-أدينوزيل-L- [ميثيل 3 H] ميثيونين كما المانح الميثيل. يمكن استخدام هذا البروتوكول ليس فقط لإنشاء وضع ركائز جديدة مثيلة من PRMT1 الفسيولوجية، ولكن أيضا لفهم الآلية الأساسية من البروتين أرجينين مثيلة.

<html> تم تحديد قدرات HA-PRMT1 إلى ميثيل GST-G3BP1 من قبل في المختبر فحص الحامض. كان يعمل PRMT1 HA الموسومة تنقيته من الخلية لست] Beas2B في رد فعل مثيلة تحتوي GST-G3BP1، و1 μCi من S-أدينوزيل-L- [ميثيل 3 H] ميثيونين، باعتباره المانح الميثيل. PRMT1 يمكن أن تحفز بكفاءة مثيلة من GST-G3BP1 (الشك...

Watch this Scientific Journal Video about In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation at JoVE.com

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

بروتين أرجينين مثيلة، يحفزه فئة من الإنزيمات وهي، البروتين الميثيل أرجينين transferases (PRMTs)، هو عملية إضافة الأنزيمية من مجموعة الميثيل (ق) إلى arginines داخل البروتينات. في المختبر فحص الحامض هو الأداة الأكثر الاعتماد عليها لتقييم حالة مثيلة من ركائز PRMT معروفة أو جديدة.

في المختبر مثلأيشن الفحص لدراسة البروتين أرجينين مثلأيشن

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified ...

in-vitro-methylation-assay-to-study-protein-arginine-methylation

Research

JoVE Journal

Biology

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

15.1K Views.  University of Illinois at Chicago.  بروتين أرجينين مثيلة، يحفزه فئة من الإنزيمات وهي، البروتين الميثيل أرجينين transferases (PRMTs)، هو عملية إضافة الأنزيمية من مجموعة الميثيل (ق) إلى arginines داخل البروتينات. في المختبر فحص الحامض هو الأداة الأكثر الاعتماد عليها لتقييم حالة م...

Video: In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

اختبار الحساسية البصرية للسرعة واتجاه الحركة في السحالي

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Arabidopsis thaliana is an excellent model organism for studying epigenetic mechanisms. One of the reasons is the loss-of-function null mutant of DNA methyltransferases is viable, thus providing a system to study how loss of DNA methylation in a genome affects growth and development. Imprinting refers to differential expression of maternal and paternal alleles and plays an important role in reproduction development in both mammal and plants. DNA methylation is critical for determining whether the maternal or paternal alleles of an imprinted gene is expressed or silenced. In flowering plants, there is a double fertilization event in reproduction: one sperm cell fertilizes the egg cell to form embryo and a second sperm fuses with the central cell to give rise to endosperm. Endosperm is the tissue where imprinting occurs in plants. MEDEA, a SET domain Polycomb group gene, and FWA, a transcription factor regulating flowering, are the first two genes shown to be imprinted in endosperm and their expression is controlled by DNA methylation and demethylation in plants. In order to determine imprinting status of a gene and methylation pattern in endosperm, we need to be able to isolate endosperm first. Since seed is tiny in Arabidopsis, it remains challenging to isolate Arabidopsis endosperm and examine its methylation. In this video protocol, we report how to conduct a genetic cross, to isolate endosperm tissue from seeds, and to determine the methylation status by bisulfite sequencing.

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Imprinting is a phenomenon in plant and mammal reproduction. DNA methylation plays an important role in mechanisms of imprinting. Isolating endosperm and determining methylation status of imprinted genes in Arabidopsis can be difficult. In this protocol, we describe how to isolate endosperm and determine methylation by bisulfite sequencing.

تقرير من الحامض النووي من الجينات في مطبوع Arabidopsis السويداء

Arabidopsis thaliana is an excellent model organism for studying epigenetic mechanisms. One of the reasons is the loss-of-function null mutant of DNA ...

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Validating interactions between different proteins is vital for investigation of their biological functions on the molecular level. There are several methods, both in vitro and in vivo, to evaluate protein binding, and at least two methods that complement the shortcomings of each other should be conducted to obtain reliable insights. 
For an in vivo assay, the bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assay represents the most popular and least invasive approach that enables to detect protein-protein interaction within living cells, as well as identify the intracellular localization of the interacting proteins 1,2. In this assay, non-fluorescent N- and C-terminal halves of GFP or its variants are fused to tested proteins, and when the two fusion proteins are brought together due to the tested proteins&#x2019; interactions, the fluorescent signal is reconstituted3-6. Because its signal is readily detectable by epifluorescence or confocal microscopy, BiFC has emerged as a powerful tool of choice among cell biologists for studying about protein-protein interactions in living cells 3. This assay, however, can sometimes produce false positive results. For example, the fluorescent signal can be reconstituted by two GFP fragments arranged as far as 7 nm from each other due to close packing in a small subcellular compartment, rather that due to specific interactions7.
Due to these limitations, the results obtained from live cell imaging technologies should be confirmed by an independent approach based on a different principle for detecting protein interactions. Co-immunoprecipitation (Co-IP) or glutathione transferase (GST) pull-down assays represent such alternative methods that are commonly used to analyze protein-protein interactions in vitro. However, iIn these assays, however, the tested proteins must be readily soluble in the buffer that supportsused for the binding reaction. Therefore, specific interactions involving an insoluble protein cannot be assessed by these techniques.
 Here, we illustrate the protocol for the protein membrane overlay binding assay, which circumvents this difficulty. In this technique, interaction between soluble and insoluble proteins can be reliably tested because one of the proteins is immobilized on a membrane matrix. This method, in combination with in vivo experiments, such as BiFC, provides a reliable approach to investigate and characterize interactions faithfully between soluble and insoluble proteins. In this article, binding between Tobacco mosaic virus (TMV) movement protein (MP), which exerts multiple functions during viral cell-to-cell transport8-14, and a recently identified plant cellular interactor, tobacco ankyrin repeat-containing protein (ANK) 15, is demonstrated using this technique.

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Testing protein-protein interaction is indispensable for dissection of protein functionality. Here, we introduce an in vitro protein-protein binding assay to probe a membrane-immobilized protein with a soluble protein. This assay provides a reliable method to test interaction between an insoluble protein and a protein in solution.

الفحص البروتين تراكب الأغشية : بروتوكول لاختبار التفاعل بين البروتينات القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان في المختبر</em

Validating interactions between different proteins is vital for investigation of their biological functions on the molecular level.  There are several ...

DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene regulation is complex, but essentially involves modifications to the DNA itself or the proteins with which DNA associates. The predominant epigenetic modification of DNA in mammalian genomes is methylation of cytosine nucleotides (5-MeC). DNA methylation provides instruction to gene expression machinery as to where and when the gene should be expressed. The primary target sequence for DNA methylation in mammals is 5'-CpG-3' dinucleotides (Figure 1). CpG dinucleotides are not uniformly distributed throughout the genome, but are concentrated in regions of repetitive genomic sequences and CpG "islands" commonly associated with gene promoters (Figure 1). DNA methylation patterns are established early in development, modulated during tissue specific differentiation and disrupted in many disease states including cancer. To understand the biological role of DNA methylation and its role in human disease, precise, efficient and reproducible methods are required to detect and quantify individual 5-MeCs.
This protocol for bisulphite conversion is the "gold standard" for DNA methylation analysis and facilitates identification and quantification of DNA methylation at single nucleotide resolution. The chemistry of cytosine deamination by sodium bisulphite involves three steps (Figure 2). (1) Sulphonation: The addition of bisulphite to the 5-6 double bond of cytosine (2) Hydrolic Deamination: hydrolytic deamination of the resulting cytosine-bisulphite derivative to give a uracil-bisulphite derivative (3) Alkali Desulphonation: Removal of the sulphonate group by an alkali treatment, to give uracil. Bisulphite preferentially deaminates cytosine to uracil in single stranded DNA, whereas 5-MeC, is refractory to bisulphite-mediated deamination. Upon PCR amplification, uracil is amplified as thymine while 5-MeC residues remain as cytosines, allowing methylated CpGs to be distinguished from unmethylated CpGs by presence of a cytosine "C" versus thymine "T" residue during sequencing.
DNA modification by bisulphite conversion is a well-established protocol that can be exploited for many methods of DNA methylation analysis. Since the detection of 5-MeC by bisulphite conversion was first demonstrated by Frommer et al.1 and Clark et al.2, methods based around bisulphite conversion of genomic DNA account for the majority of new data on DNA methylation. Different methods of post PCR analysis may be utilized, depending on the degree of specificity and resolution of methylation required. Cloning and sequencing is still the most readily available method that can give single nucleotide resolution for methylation across the DNA molecule.

The gold standard for DNA methylation analysis is genomic sequencing of bisulphite converted DNA. This method takes advantage of the increased sensitivity of cytosine compared with 5-methylcytosine (5-MeC) to bisulphite deamination under acidic conditions. Unmethylated cytosines can be distinguished from methylated cytosines after PCR amplification of the target genomic DNA.

الحامض النووي : Bisulphite تعديل وتحليل

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein labeled, this method can be implemented for the investigation of protein-protein interactions. It is based on one hand on the recognition of the tagged protein by cobalt coated magnetic beads and on the other hand on the interaction between the tagged protein and a second specific protein that is labeled. First, the labeled and tagged proteins are mixed and incubated at room temperature. The magnetic beads, that recognize the tag, are added and the bound fraction of labeled protein is separated from the unbound fraction using magnets. The amount of labeled protein that is captured can be determined in an indirect way by measuring the signal of the labeled protein remained in the unbound fraction. The described liquid phase affinity assay is extremely useful when conformational conversion sensitive proteins are assayed. The development and application of the assay is demonstrated for the interaction between poliovirus and poliovirus recognizing nanobodies1. Since poliovirus is sensitive to conformational conversion2 when attached to a solid surface (unpublished results), the use of ELISA is limited and a liquid phase based system should therefore be preferred. An example of a liquid phase based system often used in polioresearch3,4 is the micro protein A-immunoprecipitation test5. Even though this test has proven its applicability, it requires an Fc-structure, which is absent in the nanobodies6,7. However, as another opportunity, these interesting and stable single-domain antibodies8 can be easily engineered with different tags. The widely used (His)6-tag shows affinity for bivalent ions such as nickel or cobalt, which can on their turn be easily coated on magnetic beads. We therefore developed this simple quantitative affinity capture assay based on cobalt coated magnetic beads. Poliovirus was labeled with 35S to enable unhindered interaction with the nanobodies and to make a quantitative detection feasible. The method is easy to perform and can be established with a low cost, which is further supported by the possibility of effectively regenerating the magnetic beads.

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. It is a reliable technique based on the interaction between magnetic beads and tagged proteins (e.g. nanobodies) on one hand and the affinity between the tagged protein and a second, labeled protein (e.g. poliovirus) on the other.

تقارب المرحلة السائلة الفحص التقاطها باستخدام الخرز المغناطيسي لدراسة البروتين البروتين التفاعل: المثال فيروس شلل الأطفال، Nanobody

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

Application of an In vitro DNA Protection Assay to Visualize Stress Mediation Properties of the Dps Protein

Oxidative stress is an unavoidable byproduct of aerobic life. Molecular oxygen is essential for terrestrial metabolism, but it also takes part in many damaging reactions within living organisms. The combination of aerobic metabolism and iron, which is another vital compound for life, is enough to produce radicals through Fenton chemistry and degrade cellular components. DNA degradation is arguably the most damaging process involving intracellular radicals, as DNA repair is far from trivial. The assay presented in this article offers a quantitative technique to measure and visualize the effect of molecules and enzymes on radical-mediated DNA damage.
The DNA protection assay is a simple, quick, and robust tool for the in vitro characterization of the protective properties of proteins or chemicals. It involves exposing DNA to a damaging oxidative reaction and adding varying concentrations of the compound of interest. The reduction or increase of DNA damage as a function of compound concentration is then visualized using gel electrophoresis. In this article we demonstrate the technique of the DNA protection assay by measuring the protective properties of the DNA-binding protein from starved cells (Dps). Dps is a mini-ferritin that is utilized by more than 300 bacterial species to powerfully combat environmental stressors. Here we present the Dps purification protocol and the optimized assay conditions for evaluating DNA protection by Dps.

Application of an In vitro DNA Protection Assay to Visualize Stress Mediation Properties of the Dps Protein

The DNA-binding protein from starved cells (Dps) plays a crucial role in combating bacterial stress. This article discusses the purification of E. coli Dps and the protocol for an in vitro assay demonstrating Dps-mediated protection of DNA from degradation by reactive oxygen species.

تطبيق على<em&gt; في المختبر</em&gt; الحمض النووي الفحص حماية لتصور الإجهاد خصائص الوساطة من البروتين DPS

Oxidative stress is an unavoidable byproduct of  aerobic life.  Molecular oxygen is  essential for terrestrial metabolism, but it also takes part in many ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using this protocol, angiogenesis may be measured in vitro in a fast, quantifiable manner. Primary or immortalized endothelial cells are mixed with conditioned media and plated on basement membrane matrix. The endothelial cells form capillary like structures in response to angiogenic signals found in conditioned media. The tube formation occurs quickly with endothelial cells beginning to align themselves within 1&#160;hr and lumen-containing tubules beginning to appear within 2 hr. Tubes can be visualized using a phase contrast inverted microscope, or the cells can be treated with calcein AM prior to the assay and tubes visualized through fluorescence or confocal microscopy. The number of branch sites/nodes, loops/meshes, or number or length of tubes formed can be easily quantified as a measure of in vitro angiogenesis. In summary, this assay can be used to identify genes and pathways that are involved in the promotion or inhibition of angiogenesis in a rapid, reproducible, and quantitative manner.

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

The tube formation assay is a fast, quantifiable method for measuring in vitro angiogenesis. Endothelial cells are combined with conditioned media and plated on basement membrane extract. Tube formation occurs within hours and newly formed tubules easily quantified.

البطانية أنبوب تشكيل خلية الفحص ل<em&gt; في المختبر</em&gt; دراسة الأوعية الدموية

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using ...

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing for Assessment of DNA Methylation at Base Pair Resolution

DNA methylation pattern mapping is heavily studied in normal and diseased tissues. A variety of methods have been established to interrogate the cytosine methylation patterns in cells. Reduced representation of whole genome bisulfite sequencing was developed to detect quantitative base pair resolution cytosine methylation patterns at GC-rich genomic loci. This is accomplished by combining the use of a restriction enzyme followed by bisulfite conversion. Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing (ERRBS) increases the biologically relevant genomic loci covered and has been used to profile cytosine methylation in DNA from human, mouse and other organisms. ERRBS initiates with restriction enzyme digestion of DNA to generate low molecular weight fragments for use in library preparation. These fragments are subjected to standard library construction for next generation sequencing. Bisulfite conversion of unmethylated cytosines prior to the final amplification step allows for quantitative base resolution of cytosine methylation levels in covered genomic loci. The protocol can be completed within four days. Despite low complexity in the first three bases sequenced, ERRBS libraries yield high quality data when using a designated sequencing control lane. Mapping and bioinformatics analysis is then performed and yields data that can be easily integrated with a variety of genome-wide platforms. ERRBS can utilize small input material quantities making it feasible to process human clinical samples and applicable in a range of research applications. The video produced demonstrates critical steps of the ERRBS protocol.

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing is a method for the preparation of sequencing libraries for DNA methylation analysis based on restriction enzyme digestion combined with cytosine bisulfite conversion. This protocol requires 50 ng of starting material and yields base pair resolution data at GC-rich genomic regions.

المحسن انخفاض التمثيل بيسلفيت تسلسل لتقييم الحامض النووي في قرار قاعدة زوج

DNA methylation pattern mapping is heavily studied in normal and diseased tissues. A variety of methods have been established to interrogate the cytosine ...

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 (Kir4.1)

DNA methylation serves to regulate gene expression through the covalent attachment of a methyl group onto the C5 position of a cytosine in a cytosine-guanine dinucleotide. While DNA methylation provides long-lasting and stable changes in gene expression, patterns and levels of DNA methylation are also subject to change based on a variety of signals and stimuli. As such, DNA methylation functions as a powerful and dynamic regulator of gene expression. The study of neuroepigenetics has revealed a variety of physiological and pathological states that are associated with both global and gene-specific changes in DNA methylation. Specifically, striking correlations between changes in gene expression and DNA methylation exist in neuropsychiatric and neurodegenerative disorders, during synaptic plasticity, and following CNS injury. However, as the field of neuroepigenetics continues to expand its understanding of the role of DNA methylation in CNS physiology, delineating causal relationships in regards to changes in gene expression and DNA methylation are essential. Moreover, in regards to the larger field of neuroscience, the presence of vast region and cell-specific differences requires techniques that address these variances when studying the transcriptome, proteome, and epigenome. Here we describe FACS sorting of cortical astrocytes that allows for subsequent examination of a both RNA transcription and DNA methylation. Furthermore, we detail a technique to examine DNA methylation, methylation sensitive high resolution melt analysis (MS-HRMA) as well as a luciferase promoter assay. Through the use of these combined techniques one is able to not only explore correlative changes between DNA methylation and gene expression, but also directly assess if changes in the DNA methylation status of a given gene region are sufficient to affect transcriptional activity.

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 Kir4.1

DNA methylation is capable of maintaining stable levels of gene expression as well as allowing for dynamic changes in gene expression in response to a variety of stimuli. We detail techniques that allow the study of gene-specific changes in DNA methylation and the effect of these changes on gene expression.