우리는 미카엘라 데 마르티노, 윌프레드 R. 하겐, 유용한 토론 Kourosh Honarmand Ebrahimi에 감사합니다. 이 작품은 기술의 델프트 대학에서 기금을 시작으로 지원되었다.

1. DPS 발현과 정제 높은 순도의 단백질을 얻기 DNA 보호 분석을위한 필수적인 첫 번째 단계입니다. DPS 단백질의 정제는 4 5 일에서 수행 할 수 있습니다. <ol><li> E.의 단백질 분해 효소 결핍 긴장을 변환 DPS 단백질 인코딩 시퀀스가 복제 된 어떤에 애완 동물 벡터 (예 : pET17 등)와 대장균 (예 : BL21 (DE3) pLysS 등). </li><li> 킬 적절한 항생제 (예 : 1.1에서 제공하는 예제 암피실린 및 클로람페니콜 등)를 포함 루리아 국물 (LB) 한천 플레이트에 세포를 변형. 37에서 하룻밤 번호판을 품어 ° C. </li><li> 적절한 항생제를 포함하는 LB 매체의 30 ML에 플레이트에서 단일 콜로니를 접종한다. 37 밤새 품어 ° C 200 ~ 250 rpm으로 흔들어. </li><li> 10 ML 야간 문화의 각각 적절한 항생제를 포함하는 2 x 1 L의 LB 배지에 접종한다. OD 600에 떨고 동안 37 ° C에서 성장 </서브&gt; 약 0.6. (눈에 띄게 최종 제품의 순도를 손상시키지 않고, 더 높은 OD 증가 단백질 수율에 세포 성장을.) 0.3 mM의 농도로 IPTG 첨가하여 공격력의 발현을 유도하고, 흔들어 섞으면 서 37 ° C 3 ~ 4 시간 동안 배양한다. </li><li> 15 분 6,000 XG에서 원심 분리하여 수확 세포. 유도 세포 배양의 L 당 DEAE 버퍼 (50 MM의 HEPES - 코이, 산도 7.5, 100 MM의 염화나트륨, 0.1 mM의 EDTA) 7.5 ㎖에 세포 펠렛을 resuspend을. 샘플은 액체 질소에 냉동 원하는 경우, -80 ° C에 저장할 수 있습니다. 절차는 다음 4 ℃에서 물을 욕조에 샘플을 해동 계속 될 수있다 </li><li> 과발현 공격력의 저하를 방지하기 위해 세포 현탁액에 프로테아제 억제제 (예 : Calbiochem 세트 III 단백질 분해 효소 억제제로 세포 현탁액의 ML 당 0.167 μL)에서의 혼합물을 추가합니다. </li><li> 프랑스 프레스를 사용하여 세포가없는 추출물을 준비합니다. 20 ML DEAE 버퍼 (연속 흐름 모델을 사용하는 경우), 다음 운영 중단과 총리는 프랑스 프레스t 20 KPSI 두 번 샘플. 불용성 입자를 명확히하기 위해 4 ° C에서 35 분 동안 30,000 XG에서 해물을 원심 분리기 및 뜨는을 저장합니다. 원하는 경우 상층 액을 한 후, 액체 질소를 사용하여 냉동 및 -80 ° C에 저장할 수 있습니다. </li><li> FPLC를 사용하여 DEAE 버퍼와 함께 30 ML DEAE 세파 CL-6B 열을 평형. 배경 0.2 MPa의의 최대 압력으로 1-2 ML / 분에 열을 버퍼를 실행합니다. 칼럼에있는 셀이없는 추출물을로드하고 흐름을 통해 OD 280 신호가 기준보다 증가하기 시작 한 번 수집하기 시작합니다. DEAE 버퍼 열을 씻어 지속적으로 흐름을 통해 수집하는 동안 OD 280 값이 기준에 돌아올 때까지. 흐름을 통해 바인딩 된 DNA에서 무료로 DPS 단백질의 대부분을 포함해야합니다. 100 % 버퍼 B (50 MM의 HEPES - 코이, 산도 7.5, 1 M의 NaCl, 0.1 mM의 EDTA)로 컬럼을 씻으십시오. 이 용출액은 DPS-DNA 복합체뿐만 아니라 다른 단백질을 포함하고 삭제할 수 있습니다. </li><li> 광고를 제거황산 암모늄 침전을 통해 단백질을 추가적인 오염. 풀링 흐름을 통해의 볼륨을 결정합니다. 천천히 (20 분 동안) 4시에 62 % 포화 (솔루션의 ML 당 390 밀리그램)에 ° C 잘 교반하면서 건조한 작은 입자 황산 암모늄을 추가합니다. 완전한 평형을 보장하기 위해 황산 암모늄의 마지막 부분을 추가 한 후 추가로 20 ~ 30 분 동안 혼합물을 저어. 오염 단백질 용액 침전 할 때 DPS는, 용해 상태로 유지됩니다. </li><li> 4에서 30 분 동안 20,000 XG에서 원심 분리하여 침전 된 단백질을 제거 ° C 및 뜨는을 저장합니다. </li><li> 천천히 94 % 포화에 도달하고 완전한 평형을 보장하기 위해 20-30 분 동안 저어 상등액의 ML 당 추가로 227 mg을 황산 암모늄을 추가합니다. 공격력이 높은 염 농도에서 침전, 4 ℃에서 30 분 동안 20,000 XG에서 원심 분리하여 수집 할 수 있습니다 DPS는 펠릿에있을 것이다 상층 액을 삭제할 수 있습니다. 펠렛은 -80 ° C에 저장할 수 있습니다 경우 데IRED. </li><li> 부유 버퍼의 DPS 함유 펠렛을 (50 mM의 HEPES - 코이, 산도 7.5, 150 MM의 염화나트륨, 0.1 mM의 EDTA)를 Resuspend. 2.5 ML로 샘플 볼륨을 조정합니다. </li><li> 버퍼 교환은 PD-10 겔 여과 칼럼을 사용하여 황산 암모늄을 제거합니다. 25 ML의 부유 버퍼에 젤 침대 평형. PD-10 열 상단에 DPS 샘플의 2.5 ML을 적용하고 흐름을 통해 폐기 안으로 흡수 할 수 있습니다. 3.5 ML의 부유 버퍼에 용출 DPS를 수집합니다. </li><li> 4 10 분 16,000 XG에서 버퍼 교환 샘플을 원심 분리기 ° C 모든 불용성 구성 요소를 제거하고, 6-10 ML 희석 버퍼 (50 MM의 HEPES - 코이, 산도 7.5, 0.1 mM의 EDTA)로 희석을 보장하기 위해 그 소금 농도는 DPS가 SP 파로스 열에 바인딩 할 정도로 낮습니다. 초당 특히 농축 시료는 액체의 흐림에 의해 입증 낮은 소금 버퍼에 희석시 작 용해 될 수 있지만, 완전히 작은 amou의 추가에 의해 resolubilized 할 수 있습니다5 M 염화나트륨 용액 NT (추가 10-20 밀리미터). </li><li> SP 버퍼 (50 MM의 HEPES - 코이, 산도 7.5, 50 MM의 염화나트륨, 0.1 mM의 EDTA)와 함께 30 ML SP 세파 빠른 흐름 열 평형. 1.5 ML / 배경 위에 0.3 MPa까지 압력 한계를 가진 분에 열을 버퍼를 실행합니다. 컬럼에 샘플을로드합니다. OD 280 추적이 반환 될 때까지 기준선에 SP 버퍼로 세척하고 흐름을 통해 폐기하십시오. 2 ㎖ 분수를 수집하는 동안, 0 100 % 버퍼 B에서 1​​50 ML 선형 그라데이션을 실행합니다. 10 % 변형이 가능하지만 공격력은 약 50 % B에서 날카로운 피크 용출된다. </li><li> 15 % SDS-PAGE 젤에 용출 분획을 실행하고 분광 광도계를 사용하여 OD 260 / OD 280 비율을 측정하여 DNA의 오염을 확인합니다. 젤은 19 kDa의 주위에 하나의 밴드를 표시해야하며, OD 260 / OD 280 0.7 주위에 일반적이다. 순수한 DPS의 분수 수영장. 와 원심 필터 장치 (예 : Amicon 울트라 여과 장치)를 사용10K 분자량 컷 - 오프 초당 집중하고 저장 버퍼 (50 MM의 HEPES - 코이, 산도 7.5, 50 MM의 염화나트륨)로 교환합니다. -80에서 저장을위한 액체 질소에 분주은 정제 된 DPS 및 동결 ° C. </li></ol> 2. DNA 보호 분석 분석은 여러 시간에 민감한 단계를 포함하고 재현성 결과를 얻기 위해 두 번째로 초과해야한다. 다양한 재료와 피펫 단계가 포함되어 피펫 테이블 (표 1 참조) 단계와 볼륨을 추적하는 것이 좋습니다 때문에. 분석에 필요한 총 시간은 더 이상 3 시간입니다. <ol><li> 밀폐 유리 병에 30 ML 물을 측정, 용액으로부터 산소를 제거하는 10 분 (두 주사기 바늘, 액체의 한, 그 위에 하나를 사용하여)에 대한 N 2와 물을 세척하십시오. 2 밀리미터 주식 솔루션을 얻기 위해 물에 0.0168 g FeSO 4 • 7H 2 O를 추가합니다. 유리 병을 밀봉하고 혼합 한 후, 더 5 분 동안 질소로 세척하십시오. 해결책은해야합니다분명, 노란색의 힌트가 감지되면, 새로운 철 용액을 준비합니다. </li><li> 얼음에 보관하고 알루미늄 호일에 싸서 빛으로부터 보호, H 2 O 2 용액 (1ml를 물에 9.2MH 2 O 2의 10.87 μL)이 100 밀리미터를 확인합니다. 자연 붕괴로 인해 준비 후 1-2 시간 동안 만 사용하십시오. 과산화수소 주식은 부분적으로 적절한 보관 (어둠 속에서, 4 ° C에서)에 의해 개량 할 수있다 고장에 유사하게 적용됩니다. OD 240을 측정하여 주식의 농도를 정기적으로 검사하는 것이 좋습니다. </li><li> 상온의 물을 욕조에 빠르게 초당 정화의 나누어 지는를 해동, 얼음 계속. 침전 집계에 테이블 상단 picocentrifuge 4,000 XG에 10 초 동안 원심 분리기. 분광 광도계 (OD 280 = 1.547 100 μM 단량체 DPS의 농도를 나타낸다)를 사용하여 원심 분리 한 후 농도를 측정한다. </li><li> 12X 반응 버퍼 (1을 사용하여 높은 농도 재고에서 선형 DNA를 희석μL / NG 100의 농도 M MOPS-KOH 산도 7.0, 1 M NaCl을). 선형 DNA를 정량보다 쉽게​​ 사용되지만, 플라스미드 DNA도 함께 사용할 수 있습니다. </li><li> PCR 튜브에 DNA 버퍼 혼합물의 피펫 1 μL. 최종 반응 부피 (마이너스 SDS)은 12 μL 될 수 있도록 반응에 충분한 물을 추가합니다. 이 금액은 피펫 테이블을 사용하여 사전에 계산되어야한다. 3 μM의 최종 dodecamer 농도에 DPS를 추가합니다. DPS는 DNA에 결합 할 수 있도록 실온에서 15 분 알을 품다. </li><li> 원하는 농도에 도달하는 2 개 mm FeSO 4 용액을 추가합니다. 전형적인 실험은 0에서 1 mM의 FeSO 4 농도의 범위를 사용합니다. 높은 농도는 더 광범위한 DNA 저하의 원인이됩니다뿐만 아니라 철은 반응 혼합물에 침전물의 형성으로 이어질 수 있습니다. 빨리 100 개 mm H 2 O 2 용액 (10 mM의 최종 농도) 1 μl를 추가하고, 펜톤 수 있도록, 5 분 실온에서 알을 품다자리를 차지할 매개 분해 반응. </li><li> 20 % SDS (나트륨 도데 실 황산)의 0.8 μl를 추가합니다. 혼합 DPS-DNA 복합체를 방해하는 5 분 동안 85 ° C에서 알을 품다. SDS는 DPS-DNA 복합체를 불안정하게하고 정량의 용이성을 향상 DNA, 원치 않는 젤 변화를 방지 할 수 있습니다. 선택적 단계는 무독성 제품으로 촉매 분해 과산화수소로 반응을 중지하는 것입니다. 이 프로토콜에 설명 된 조건이 단계는 DNA 저하의 넓은 범위를 얻기 위해 필요하지 않습니다. </li><li> 염료를로드 추가 1 분 동안 얼음에 품어와 아가로 오스 겔에로드합니다. 젤을 실행하고 ethidium의 브로마이드를 사용하여 DNA를 얼룩. 젤은 젤 ethidium의 브로마이드 유통을 방해 SDS를 방지하기 위해 사후 전기 스테인드보다는 전기 이전에해야한다. </li></ol>

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우리는 공개 아무것도 없어.

이 문서에 설명 된대로 공격력의 정화 과정은 매우 강력합니다. 순도는 지속적으로 (&gt; 99 %) 고하고있다, 다른 단백질 보이는 밴드로 SDS-PAGE 젤에 표시되지 않습니다. DPS의 매우 높은 농도로 배양 할 때 부분적으로 DNA의 분해에 의해 입증 그럼에도 불구하고, 정제 된 DPS의 일부 일괄 처리, 핵산의 활동이 나타납니다. 이것은 우리가 정화를 통해 제거 할 수 없었던 낮은 농도에서 높은 활성 DNases의 ?...

호기성 생물은 끊임없이 자신의 DNA뿐만 아니라 다른 중요한 생물학적 거대 분자를 손상시킬 수있는 반응성 산소 종으로 주장해야합니다. 산화 손상의 독성을 중화하는 하나의 강력한 도구 굶주린 세포 (DPS)에서 DNA 결합 단백질이다. 굶주린 E.에서 1992 년 발견 이후 대장균 문화 1, 공격력이 박테리아와 archaebacteria 2의 300 개 이상의 종에서 발견되었습니다. 정지 단계 동안 초당 엄청난 상향 조절은 E의 가장 높은 표현 핵 양체 - 관련 단백질을 만든다 기아 상태 3, 4 이하 대장균. 또한, DPS는 기아, 높은 철 농도, 자외선 노출, 열 충격 및 산화 스트레스 5, 6을 (를) 포함하여 많은 다양한 스트레스 동안 세균의 생존과 DNA의 무결성을 모두 보존하기 위해 표시되었습니다. 12 단량체, w의 안정적인 호모 중합체 복합에 구조적, DPS는 자기 동료의 hich은 구형 빈 껍질로 조립합니다. ~ 4.5 nm의 넓은 내부 구멍은 작은 분자 (7)의 통과를 허용 모공을 통해 용매를 외부에 액세스 할 수 있습니다, 그것은 철 8과 같은 광물 금속을 격리 할 수 있습니다. DPS의 보호 효과가 아닌 특정 DNA 바인딩 1, ferroxidase 활동 및 철 저장 8 등의 여러 가지 생화학 적 활동에서 파생됩니다. DPS의 유익한 생화학 활동의 자세한 연구는 먼저 정화가 필요합니다. DPS는뿐만 아니라 다른 단백질 분리뿐만 아니라, 바인드 된 DNA 7에서해야하므로 초당 정화는 정교한 절차입니다. 우리 최적의 정화 과정은 두 이온 교환 컬럼과 황산 암모늄 침전 단계로 구성된, 많은 일반적인 기술을 사용합니다. 고도로 집중된 공격력이 낮은 소금 조건에서 용액 침전 수있는 여러 버퍼 교환이 필요합니다. 일단 DPS 단백질은 정제 된, 그것은 직접 ferroxidase 활동 8, DNA-결합 양론 9, 철 결합 10의 메커니즘을 측정 분석에 적용 할 수 있습니다. 정제 DPS는 다른 잠재적 인 응용 프로그램이 있습니다. DPS의 안정 중공 구형 구조는 단백질 캐비티 내부 11 소수성 입자를 저장하기위한 발판으로 사용되어 반응 챔버 소설 자성 나노 입자에게 12 합성하는 것 같이. 활성 산소로 인한 손상을 중재하는 초당 공격력의 보호 능력은 명확해야하며 직접 DNA 보호 분석 13, 14을 사용하여 설명 할 수 있습니다. 철 펜튼 화학을 통해 H 2 O 2 분해를 촉진 할 때 체외 과정에서이, 라디칼이 생성됩니다. 이러한 활성 산소를 직접 반응에서 DNA 선물을 손상하고 완전하게 높은 농도를 저하시킬 수 있습니다. 두 가지 주요 DPS 활동은 직접 Fent의 효과를 방해 할 수 두에 매개 급진적 인 생산. DPS는 프로세스에 사용할 수있는 과산화수소를 소모 광물을 촉매 철의 농도를 낮춘다. 또한, DNA에 바인딩 초당 잠재적으로 유리기 손상으로부터 물리적으로 보호하고 덜 반응 표면적이 작은 볼륨으로 그것을 응축 수 있습니다. 이 두 속성의 조합은 잘 보호 DPS 활동을 측정하는 목적에 적합한 DNA 보호 분석을합니다. DNA 보호 분석은 매우 다재다능하고 DPS 특성을 넘어 다양한 애플리케이션에 사용될 수 있습니다. 유리기 손상은 세포의 스트레스의 일반적인 형태이고, 많은 다른 단백질과 화학 물질을 중화하는 데 사용됩니다. 유리기 손상에 대한 마커로 DNA의 무결성을 사용하여 분석의 일반적인 원칙은 거의 모든 라디칼 생산 반응 또는 방해를 에이전트와 함께 사용할 수 있습니다. 다른 사람의 사이에서, 분석은 성공적으로 항산화 특성을 결정하는 데 사용되었습니다K.의 수산기 손상 중재 16 요산의 효과를 특성화하고, 모피 전사 조절 단백질 17의 기능에 새로운 통찰력을 얻기 위해 식품 산업 15에 사용의 paniculata 압축을 풉니 다. 발표 논문에서 분석의 다양한 사용에도 불구하고, 우리는 처음으로 많은 연구자에 대한 불필요 힘든 프로세스에 대한 분석을 설정하게되는 많은 최적화 및 문제 해결 단계가 필수 였을 것으로 나타났습니다. 우리는이 문서에서 제시 프로토콜 항목이 장벽을 제거하는 것을 목표로하고있다.

<table><tbody><tr><td>BL21(DE3)pLysS competent cells</td><td>Promega</td><td>L1195</td><td></td></tr><tr><td>pET-17b DNA</td><td>EMD-Millipore</td><td>69663-3</td><td></td></tr><tr><td>LB broth powder</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin sodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0166</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>BDH</td><td>441476L</td><td></td></tr><tr><td>Potassium hydroxide</td><td>Merck</td><td>105033</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>VWR</td><td>443824T</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail Set III</td><td>EMD-Millipore</td><td>539134</td><td></td></tr><tr><td>DEAE-Sepharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DFF100</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium sulphate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4418</td><td></td></tr><tr><td>PD-10 Desalting Columns</td><td>GE Healthcare LS</td><td>17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>SP-Sepharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1799</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra Centr. Filter (10K MWCO)</td><td>Millipore</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>Ferrous Sulphate heptahydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8048</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216763</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Calbiochem</td><td>475898</td><td></td></tr><tr><td>SDS solution</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0418</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium bromide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td></td></tr><tr><td>Static incubator</td><td>Hettich</td><td>INE500</td><td></td></tr><tr><td>Shaking Incubator </td><td>New Brunswick Sc.</td><td>Inova 44</td><td></td></tr><tr><td>Cooled centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>Avanti J-E</td><td></td></tr><tr><td>Table-top centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>Cell disrupter</td><td>Constant Systems Ltd.</td><td>TS2/40/AA/AA</td><td></td></tr><tr><td>FPLC Purifier</td><td>General Electric</td><td>AKTA</td><td></td></tr><tr><td>Airtight vials</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-08918-85</td><td></td></tr><tr><td>Syringe needles</td><td>BD</td><td>305128</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes</td><td>Eppendorf</td><td>Z683779-1EA, Z683795-1EA</td><td></td></tr></tbody></table>

application of an in vitro dna protection assay to visualize stress mediation properties of the dps protein

산화 스트레스는 유산소 생활의 피할 수없는 부산물이다. 산소 분자 지상파 신진 대사를 위해 필수적이며,뿐만 아니라 살아있는 유기체 내의 많은 손상 반응에 참여합니다. 삶에 대한 또 다른 중요한 화합물이다 호기성 대사와 철의 결합은 펜톤 화학을 통해 래디 칼을 생산하고 세포 구성 요소를 분해하기 위해 충분하다. DNA 수리 멀리 사소한에서 그대로 DNA 저하, 틀림없이 세포 내 활성 산소를 포함하는 가장 유해한 프로세스입니다. 이 문서에서 제시된 분석은 급진적 인 매개 DNA 손상에 대한 분자와 효소의 효과를 측정하고 시각화하는 정량 기법을 제공합니다. DNA 보호 분석은 단백질이나 화학 물질의 보호 속성의 체외 특성화, 간단한 빠르고 강력한 도구입니다. 그것은 손상 산화 반응에 DNA를 노출하고 그 화합물의 농도를 다양하게 추가 포함. 화합물의 농도의 함수로 DNA 손상의 감소 또는 증가는 다음 겔 전기 영동을 사용하여 시각화합니다. 이 문서에서 우리는 굶주린 세포 (DPS)에서 DNA-결합 단백질의 보호 특성을 측정하여 DNA 보호 분석의 기법을 보여줍니다. 공격력이 강력하게 환경 스트레스에 대처하기 위해 300 개 이상의 박테리아에 의해 이용되는 미니 페리틴입니다. 여기에서 우리는 DPS 정화 프로토콜과 DPS에 의해 DNA의 보호를 평가하기위한 최적의 분석 조건을 제시한다.

여기에 설명 된 DPS의 정화 과정은 매우 재현. 설명 프로토콜에 따라 DPS 정화, E. 2 L을 사용하여 시작 지점으로 대장균 문화, 일반적으로 5, 12 μM 사이의 농도에서 12 초당을 포함하는 단백질 2.5 mL를 얻을 것입니다. 긴 유도 회 (4 시간)이 변동성을 줄일 것으로 보인다. 단백질 순도는 SDS-PAGE 젤 (그림 1)에 의해 입증, 99 % 이상 일관되게됩니다. DNA 오염의 수준은 모두 DN...

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Application of an In vitro DNA Protection Assay to Visualize Stress Mediation Properties of the Dps Protein

굶주린 세포 (DPS)에서 DNA-결합 단백질은 세균의 스트레스를 퇴치에 중요한 역할을한다. 이 문서의 정화에 대해 설명합니다<em&gt; E. 대장균</em&gt; 공격력과에 대한 프로토콜<em&gt; 체외에서</em&gt; 분석은 활성 산소에 의해 분해로부터 DNA의 DPS - 중재 보호를 시연.

의 적용<em&gt; 체외</emDPS 단백질의 스트레스 중재 속성을 시각화&gt; DNA 보호 분석

Oxidative stress is an unavoidable byproduct of  aerobic life.  Molecular oxygen is  essential for terrestrial metabolism, but it also takes part in many ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Application of an In vitro DNA Protection Assay to Visualize Stress Mediation Properties of the Dps Protein

11.1K 조회수.  Delft University of Technology. 굶주린 세포 (DPS)에서 DNA-결합 단백질은 세균의 스트레스를 퇴치에 중요한 역할을한다. 이 문서의 정화에 대해 설명합니다 E. 대장균 공격력과에 대한 프로토콜 체외에서 분석은 활성 산소에 의해 분해로부터 DNA의 DPS - 중재 보호를 시연.

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Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live cells. The DDR to helix distorting covalent DNA modifications, including interstrand DNA crosslinks (ICLs), is not as well defined. We have studied the DDR stimulated by ICLs, localized by laser photoactivation of immunotagged psoralens, in the nuclei of live cells. In order to address fundamental questions about adduct distribution and replication fork encounters, we combined laser localization with two other technologies. DNA fibers are often used to display the progress of replication forks by immunofluorescence of nucleoside analogues incorporated during short pulses. Immunoquantum dots have been widely employed for single molecule imaging. In the new approach, DNA fibers from cells carrying laser localized ICLs are spread onto microscope slides. The tagged ICLs are displayed with immunoquantum dots and the inter-lesion distances determined. Replication fork collisions with ICLs can be visualized and different encounter patterns identified and quantitated.

Lasers are frequently used in studies of the cellular response to DNA damage. However, they generate lesions whose spacing, frequency, and collisions with replication forks are rarely characterized. Here, we describe an approach that enables the determination of these parameters with laser localized interstrand crosslinks.

레이저 지역화 소라렌 부가 물의 단일 분자 분석

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live ...

연구

유전학

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of programmed DNA breaks in lymphocytes. The Ataxia-Telangiectasia Mutated kinase (ATM), ATM- and Rad3-Related kinase (ATR) and the catalytic subunit of DNA-dependent Protein Kinase (DNA-PKcs) are among the first that are activated upon induction of DNA damage, and are central regulators of a network that controls DNA repair, apoptosis and cell survival. As part of a tumor-suppressive pathway, ATM and ATR activate p53 through phosphorylation, thereby regulating the transcriptional activity of p53. DNA damage also results in the formation of so-called ionizing radiation-induced foci (IRIF) that represent complexes of DNA damage sensor and repair proteins that accumulate at the sites of DNA damage, which are visualized by fluorescence microscopy. Co-localization of proteins in IRIFs, however, does not necessarily imply direct protein-protein interactions, as the resolution of fluorescence microscopy is limited. 
In situ Proximity Ligation Assay (PLA) is a novel technique that allows the direct visualization of protein-protein interactions in cells and tissues with unprecedented specificity and sensitivity. This technique is based on the spatial proximity of specific antibodies binding to the proteins of interest. When the interrogated proteins are within ~40 nm an amplification reaction is triggered by oligonucleotides that are conjugated to the antibodies, and the amplification product is visualized by fluorescent labeling, yielding a signal that corresponds to the subcellular location of the interacting proteins. Using the established functional interaction between ATM and p53 as an example, it is demonstrated here how PLA can be used in suspension cell cultures to study the direct interactions between proteins that are integral parts of the DNA damage response.

Here, it is demonstrated how the in situ Proximity Ligation Assay (PLA) can be used to detect and visualize the direct protein-protein interactions between ATM and p53 in suspension cell cultures exposed to genotoxic stress.

Proximity Ligation Assay를 이용한 현탁 세포 배양에서의 DNA 손상 유발 단백질 복합체의 검출 및 가시화

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

생화학

Investigation of Protein Recruitment to DNA Lesions Using 405 Nm Laser Micro-irradiation

The DNA Damage Response (DDR) uses a plethora of proteins to detect, signal, and repair DNA lesions. Delineating this response is critical to understand genome maintenance mechanisms. Since recruitment and exchange of proteins at lesions are highly dynamic, their study requires the ability to generate DNA damage in a rapid and spatially-delimited manner. Here, we describe procedures to locally induce DNA damage in human cells using a commonly available laser-scanning confocal microscope equipped with a 405 nm laser line. Accumulation of genome maintenance factors at laser stripes can be assessed by immunofluorescence (IF) or in real-time using proteins tagged with fluorescent reporters. Using phosphorylated histone H2A.X (&#947;-H2A.X) and Replication Protein A (RPA) as markers, the method provides sufficient resolution to discriminate locally-recruited factors from those that spread on adjacent chromatin. We further provide ImageJ-based scripts to efficiently monitor the kinetics of protein relocalization at DNA damage sites. These refinements greatly simplify the study of the DDR dynamics.

Studying DNA damage repair kinetics requires a system to induce lesions at defined sub-nuclear regions. We describe a method to create localized double-stranded breaks using a laser-scanning confocal microscope equipped with a 405 nm laser and provide automated procedures to quantify the dynamics of repair factors at these lesions.

단백질 DNA 장애 405 Nm 레이저 마이크로 방사선 조사를 사용 하 여 채용의 조사

The DNA Damage Response (DDR) uses a plethora of proteins to detect, signal, and repair DNA lesions. Delineating this response is critical to understand ...

A Simple, Rapid, and Quantitative Assay to Measure Repair of DNA-protein Crosslinks on Plasmids Transfected into Mammalian Cells

The purpose of this method is to provide a flexible, rapid, and quantitative technique to examine the kinetics of DNA-protein crosslink (DPC) repair in mammalian cell lines. Rather than globally assaying removal of xenobiotic-induced or spontaneous chromosomal DPC removal, this assay examines the repair of a homogeneous, chemically defined lesion specifically introduced at one site within a plasmid DNA substrate. Importantly, this approach avoids the use of radioactive materials and is not dependent on expensive or highly-specialized technology. Instead, it relies on standard recombinant DNA procedures and widely available real-time, quantitative polymerase chain reaction (qPCR) instrumentation. Given the inherent flexibility of the strategy utilized, the size of the crosslinked protein, as well as the nature of the chemical linkage and the precise DNA sequence context of the attachment site can be varied to address the respective contributions of these parameters to the overall efficiency of DPC repair. Using this method, plasmids containing a site-specific DPC were transfected into cells and low molecular weight DNA recovered at various times post-transfection. Recovered DNA is then subjected to strand-specific primer extension (SSPE) using a primer complementary to the damaged strand of the plasmid. Since the DPC lesion blocks Taq DNA polymerase, the ratio of repaired to un-repaired DNA can be quantitatively assessed using qPCR. Cycle threshold (CT) values are used to calculate percent repair at various time points in the respective cell lines. This SSPE-qPCR method can also be used to quantitatively assess the repair kinetics of any DNA adduct that blocks Taq polymerase.

The goal of this protocol is to quantify the repair of defined DNA-protein crosslinks on plasmid DNA. Lesioned plasmids are transfected into recipient mammalian cell lines and low-molecular weight harvested at multiple time points post-transfection. DNA repair kinetics are quantified using strand-specific primer extension followed by qPCR.

간단 하 고 빠른, 양적 분석 결과에 플라스 미드 DNA-단백질 Crosslinks의 측정 수리에 포유류 세포로 페

The purpose of this method is to provide a flexible, rapid, and quantitative technique to examine the kinetics of DNA-protein crosslink (DPC) repair in ...

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude stringent methods for the isolation and identification of protein networks around a protein of interest. The use of chemical crosslinkers allows the selective stabilization of labile interactions, thus bypassing biochemical limitations for purification. Here we present a protocol amenable for cells in culture that uses a homobifunctional crosslinker with a spacer arm of 12 &Aring;, dithiobis-(succinimidyl proprionate) (DSP). DSP is cleaved by reduction of a disulphide bond present in the molecule. Cross-linking combined with immunoaffinity chromatography of proteins of interest with magnetic beads allows the isolation of protein complexes that otherwise would not withstand purification. This protocol is compatible with regular western blot techniques and it can be scaled up for protein identification by mass spectrometry1.
Stephanie A. Zlatic and Pearl V. Ryder contributed equally to this work.

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The cell permeable crosslinker DSP [dithiobis-(succinimidyl propionate)] stabilizes transient and labile interactions in vivo, which allows their isolation using stringent protein complex purification techniques. Here we present a technique for crosslinking cells grown in culture followed by isolation of protein complexes by immunoprecipitation.

불안 정한 다중 단백질 단지의 분리에 의해 생체내에 제어 세포 간 연결 및 단백질 자기 동질 크로마 토그래피

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

생물학

Ubiquitylated, SUMOylated 및 ADP-Ribosylated DNA-Protein Crosslinks 측정

Quantitative Detection of DNA-Protein Crosslinks and Their Post-Translational Modifications

DNA-protein crosslinks (DPCs) are frequent, ubiquitous, and deleterious DNA lesions, which arise from endogenous DNA damage, enzyme (topoisomerases, methyltransferases, etc.) malfunctioning, or exogenous agents such as chemotherapeutics and crosslinking agents. Once DPCs are induced, several types of post-translational modifications (PTMs) are promptly conjugated to them as early response mechanisms. It has been shown that DPCs can be modified by ubiquitin, small ubiquitin-like modifier (SUMO), and poly-ADP-ribose, which prime the substrates to signal their respective designated repair enzymes and, in some cases, coordinate the repair in sequential manners. As PTMs transpire quickly and are highly reversible, it has been challenging to isolate and detect PTM-conjugated DPCs that usually remain at low levels. Presented here is an immunoassay to purify and quantitatively detect ubiquitylated, SUMOylated, and ADP-ribosylated DPCs (drug-induced topoisomerase DPCs and aldehyde-induced non-specific DPCs) in vivo. This assay is derived from the RADAR (rapid approach to DNA adduct recovery) assay that is used for the isolation of genomic DNA containing DPCs by ethanol precipitation. Following normalization and nuclease digestion, PTMs of DPCs, including ubiquitylation, SUMOylation, and ADP-ribosylation, are detected by immunoblotting using their corresponding antibodies. This robust assay can be utilized to identify and characterize novel molecular mechanisms that repair enzymatic and non-enzymatic DPCs&#160;and has the potential to discover small molecule inhibitors targeting specific factors that regulate PTMs to repair DPCs.

저자 스포트라이트: DNA 단백질 교차결합의 정량적 검출 및 번역 후 변형(Post-Translational Modifications)  

The present protocol highlights a modified method to detect and quantify DNA-protein crosslinks (DPCs) and their post-translational modifications (PTMs), including ubiquitylation, SUMOylation, and ADP-ribosylation induced by topoisomerase inhibitors and by formaldehyde, thereby allowing the study of the formation and repair of DPCs and their PTMs.

DNA-단백질 가교 및 번역 후 변형의 정량적 검출

DNA-protein crosslinks (DPCs) are frequent, ubiquitous, and deleterious DNA lesions, which arise from endogenous DNA damage, enzyme (topoisomerases, ...

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate mutations and chromosomal aberrations1. To prevent this trauma from catalyzing genomic instability, it is crucial for cells to detect DSBs, activate the DNA damage response (DDR), and repair the DNA. When stimulated, the DDR works to preserve genomic integrity by triggering cell cycle arrest to allow for repair to take place or force the cell to undergo apoptosis. The predominant mechanisms of DSB repair occur through nonhomologous end-joining (NHEJ) and homologous recombination repair (HRR) (reviewed in2). There are many proteins whose activities must be precisely orchestrated for the DDR to function properly. Herein, we describe a method for 2- and 3-dimensional (D) visualization of one of these proteins, 53BP1.
The p53-binding protein 1 (53BP1) localizes to areas of DSBs by binding to modified histones3,4, forming foci within 5-15 minutes5. The histone modifications and recruitment of 53BP1 and other DDR proteins to DSB sites are believed to facilitate the structural rearrangement of chromatin around areas of damage and contribute to DNA repair6. Beyond direct participation in repair, additional roles have been described for 53BP1 in the DDR, such as regulating an intra-S checkpoint, a G2/M checkpoint, and activating downstream DDR proteins7-9. Recently, it was discovered that 53BP1 does not form foci in response to DNA damage induced during mitosis, instead waiting for cells to enter G1 before localizing to the vicinity of DSBs6. DDR proteins such as 53BP1 have been found to associate with mitotic structures (such as kinetochores) during the progression through mitosis10.
In this protocol we describe the use of 2- and 3-D live cell imaging to visualize the formation of 53BP1 foci in response to the DNA damaging agent camptothecin (CPT), as well as 53BP1's behavior during mitosis. Camptothecin is a topoisomerase I inhibitor that primarily causes DSBs during DNA replication. To accomplish this, we used a previously described 53BP1-mCherry fluorescent fusion protein construct consisting of a 53BP1 protein domain able to bind DSBs11. In addition, we used a histone H2B-GFP fluorescent fusion protein construct able to monitor chromatin dynamics throughout the cell cycle but in particular during mitosis12. Live cell imaging in multiple dimensions is an excellent tool to deepen our understanding of the function of DDR proteins in eukaryotic cells.

This protocol describes a method for visualizing a DNA double-strand break signaling protein activated in response to DNA damage as well as its localization during mitosis.

DNA의 손상 응답 단백질의 2와 3 차원 라이브 셀 이미징

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often depend on its interactions with other proteins. Here, we describe a protocol for the yeast protein-fragment complementation assay (PCA), a powerful method to detect direct and proximal associations between proteins in living cells. The interaction between two proteins, each fused to a dihydrofolate reductase (DHFR) protein fragment, translates into growth of yeast strains in presence of the drug methotrexate (MTX). Differential fitness, resulting from different amounts of reconstituted DHFR enzyme, can be quantified on high-density colony arrays, allowing to differentiate interacting from non-interacting bait-prey pairs. The high-throughput protocol presented here is performed using a robotic platform that parallelizes mating of bait and prey strains carrying complementary DHFR-fragment fusion proteins and the survival assay on MTX. This protocol allows to systematically test for thousands of protein-protein interactions (PPIs) involving bait proteins of interest and offers several advantages over other PPI detection assays, including the study of proteins expressed from their endogenous promoters without the need for modifying protein localization and for the assembly of complex reporter constructs.

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

Proteins interact with each other and these interactions determine in a large part their functions. Protein interaction partners can be identified at high-throughput in vivo using a yeast fitness assay based on the dihydrofolate reductase protein-fragment complementation assay (DHFR-PCA).

살아있는 세포의 단백질 조각 보완 분석 (PCA)에 의해 게놈 전체 단백질 - 단백질 상호 작용 상영

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...

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레이저 지역화 소라렌 부가 물의 단일 분자 분석

Proximity Ligation Assay를 이용한 현탁 세포 배양에서의 DNA 손상 유발 단백질 복합체의 검출 및 가시화

단백질 DNA 장애 405 Nm 레이저 마이크로 방사선 조사를 사용 하 여 채용의 조사

간단 하 고 빠른, 양적 분석 결과에 플라스 미드 DNA-단백질 Crosslinks의 측정 수리에 포유류 세포로 페

불안 정한 다중 단백질 단지의 분리에 의해 생체내에 제어 세포 간 연결 및 단백질 자기 동질 크로마 토그래피

DNA-단백질 가교 및 번역 후 변형의 정량적 검출

DNA-단백질 가교 및 번역 후 변형의 정량적 검출

DNA-단백질 가교 및 번역 후 변형의 정량적 검출

DNA의 손상 응답 단백질의 2와 3 차원 라이브 셀 이미징

살아있는 세포의 단백질 조각 보완 분석 (PCA)에 의해 게놈 전체 단백질 - 단백질 상호 작용 상영