البروتوكول بالكامل بعد عزل الخلايا يستغرق حوالي 2 ساعة. 1. إعداد المجهرية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء الجذعية العزلة الخلية من نخاع العظام المانحة ووضع العلامات الفلورية من الفئات السكانية المعزولة وفقا لبروتوكولات موحدة 9،12 يسمح للخلايا للراحة خلال فترة يتم تنفيذ العملية الحيوان. لوضع العلامات الفلورية نوصي CFDA (Carboxyfluorescein ثنائي الأسيتات succinimidyl استر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير ماوس الذكور وزنها 20-25 غ مع الكيتامين (75 ملغ / كلغ) وزيلازين (2.5 ملغ / كلغ). في جميع أنحاء العمليات الجراحية التجريبية والبروتوكولات، ينبغي الحفاظ على التخدير عن طريق المكملات الغذائية (10٪ من الحقن الأولى، IP) حسب الحاجة (عادة كل 30-60 دقيقة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يحلق بلطف الجانب الأمامي من كيس الصفن الحق وكذلك الفخذ الأيمن وأعلى الفخذ. جمع كل يفقد الشعر مع مسحة القطن مبللة. وضع الجانب البطني الماوس حتى على مرحلة عرض شبكي وتحديد رسومر باستخدام ثنى مرونة. وحسب الطلب المرحلة، تتكون من قاعدة لوحة لوحة والثانية على حافة الذيلية من قاعدة لوحة لارتفاع كل من الساقين وكيس الصفن. وضع المرحلة على وسادة التدفئة للحفاظ على درجة حرارة الجسم عند 37 درجة مئوية. بعد التثبيت على المسرح، وضع الحيوان تحت المجهر تشغيل وتنفيذ الخطوات العملية التالية باستخدام 10 - إلى 16 أضعاف التكبير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل شق الأولي باستخدام مقص الجلد في الفخذ الأيمن، الأمامي فقط من السفن الفخذ من الركبة حتى إلى أعلى الفخذ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التعرف على الشريان الفخذي ومتابعته بشكل قريب، وحشد من الشريان المحيطة الأنسجة اللينة. تحديد وخفض فرع كبير إلى الخصية اليسرى باستخدام مكواة. وضع بعد ذلك خياطة إقامة سطحي في الخصية اليسرى. والجر لطيف تيسير مواصلة تعبئة القريب من الشريان الفخذي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الانتهاء من تعبئة الداني، وتحديد وخفض فرع بتشغيل كبير medially في الفخذ بواسطة مكواة. بعد ذلك ligate الشريان الفخذي في الجزء الأعلى من الفخذ الأيمن. والجر لطيف على ربطة مساعدة مزيد من التحضير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل الاهتمام الآن إلى الشريان الفخذي الداني مرة أخرى ووضع خياطة حول الشريان قريب كما ممكن. إعداد عقدة ولكن لا ربط عليه حتى الآن. تطبيق الجر لطيف لخياطة وخلق مجعد الشرايين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد إنشاء مجعد، شق الشريان يتم بعناية باستخدام microscissor. عناية خاصة لا تلحق الضرر الوريد الفخذي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج microcatheter استعداد (القطر الداخلي 0.28 مم) عن طريق شق. يجب deaired القسطرة (0.9٪ كلوريد الصوديوم، كلوريد الصوديوم) ومتصلة الإدراج قبل 1 مل حقنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الإدراج الناجح لقسطرة، وتخفيف بعناية مجعد من أجل تسهيل مرور القسطرة. وينبغي أن يكون تدفق الدم في الشرايين مرئية على الفور داخل القسطرة. بلطف دفع القسطرة بضعة ملليمترما وراء مجعد السابقة. بعد ذلك، ربط ربطة أسفل أعدت لتثبيت القسطرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مسح بلطف القسطرة (0.9٪ كلوريد الصوديوم) ونضح لتأكيد الموقف الصحيح. استخدام قطعة من الشريط لتأمين مزيد من القسطرة إلى المرحلة العملية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد تثبيت كافية، ووضع القسطرة جانبا لإعداد الخطوات التالية للعضلة المشمرة. تطبيق التنظيف العادية وتطلع القسطرة كل 5-10 دقيقة من أجل منع تشكيل جلطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل الاهتمام الآن إلى كيس الصفن الحق وإجراء شق طريق قطع الجلد واللفافة فوق الجانب البطني للكيس الصفن الحق. والحرص على عدم لمس الأنسجة الكامنة مع أي الصكوك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمديد شق تصل إلى أضعاف الأربية ونحو caudally إلى نهاية البعيدة للكيس الصفن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأنسجة منفصلة بعناية الكامنة لينة والضام فوق كيس المشمرة، دون لمسها. تحديد نهاية البعيدة للالمشمرة، ووضع خياطة البقاء هنا لSLightly تمديد العضلات. يقطع الآن المتبقية الأنسجة الرخوة تحت كيس العضلات عن طريق سحب بلطف العضلة الأمامية ونحو caudally. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد فصل كامل من النسيج الضام، وفتح كيس المشمرة عند نقطة واحدة على حافة الجمجمة باستخدام المقص. تمديد شق من هذا الانفتاح وصولا الى نهاية البعيدة للعضلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ختم سفينة صغيرة يربط بين الخصية والمشمرة باستخدام مكواة، وقطع الاتصالات بعد ذلك المتبقية بين العضلات والخصية باستخدام المقص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع جانبا الخصية، من الحقل المجهري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> والمشمرة فتح الآن يضع شقة على المسرح. وضع أربع 6-0 الغرز إقامة البرولين على حواف الأنسجة واصلاحها مع ثنى مرونة من أجل نشر الأنسجة العضلية المشمرة. من الآن فصاعدا بلل باستمرار الأنسجة بمحلول ملحي (PBS) الفوسفات مخزنة باستخدام حقنة 1 مل (الشكل 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمح الآن إعداد لبقية لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك حقن0.05-0.1 مل من 1٪ رودامين-ديكستران عبر الشريان الفخذي الأيسر لتعزيز النقيض من الأوعية الدموية الدقيقة. إذا تم التخطيط لأي كيموكينات التهابات أو وكلاء للتطبيق، يجب عليك الآن بلل موضعيا في العضلات مع كاشف كل باستخدام حقنة 1 مل. في حالة وجود تجربة السيطرة، ويستمر تبليل مع برنامج تلفزيوني. </li></ol> 2. حيوي داخلي المجهر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على الماوس ثابتة على الساحة العملية وتتحرك تحت المجهر مضان المعدلة لبرنامج التحصين الموسع في الإضاءة ومتصلة اتفاقية مكافحة التصحر (إلى جانب المسؤول عن الجهاز) كاميرا الفيديو. عناية خاصة ليس لخلخل الشريان الفخذي القسطرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء تجارب باستخدام الهدف الغمر بالماء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد ضبط الهدف لتصور كاف من دوران الأوعية الدقيقة المشمرة وقبل حقن الخلايا، وتحديد عشوائيا ستة الوريدات شعيرة وريدية لتحليلها لاحقا من شركة تمسك الخلايا الجذعية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدارة الخلايا الجذعية التي تحمل علامات الفلورسنت،المذاب في 200 ميكرولتر PBS، عند 0.4 × 10 6 خلايا في الحقن، مع ما مجموعه خمسة حقن متتالية الاستفادة من الشريان الفخذي والقسطرة حقنة 1 مل. يهز بعناية عينة الخلية قبل الحقنة الأولى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سجل الخلايا الجذعية المتداول مباشرة بعد حقن الخلايا، وبالتالي تحديد &quot;المتداول&quot;، كما خفض أكثر من 50٪ من سرعة الخلايا البطانية على طول بطانة بالاشتراك مع نموذجية الخلوية &quot;العصا والافراج عن&quot; الحركات. أداء عد الخلايا الجذعية المتداول وجميع الخلايا الجذعية اجتياز المسافة المحددة مسبقا وريدي خلال 1 دقيقة من المراقبة بعد كل حقنة واحدة. وأعرب عن كمية من الخلايا الجذعية المتداول كنسبة مئوية من جميع الخلايا المارة. لا تعول الخلايا العارضة عشوائية الظواهر الربط الإيجاز قدر الخلايا المتداول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد حقن الخلايا الماضي تحديد عدد الخلايا الجذعية ملتصقة بقوة عن طريق عد والتعبير عن كمية فيما يتعلق سطح البطانية تحسب من اله ستة الأوردة محددة مسبقا (قطر × طول × π) كما الخلايا الملتصقة / مم 2. وتعتبر شركة التصاق عندما لا حركة الخلية قابلا للاكتشاف لمدة 30 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الانتهاء من intravital المجهري إزالة بعناية العضلات المشمرة وتخزينها في المراسلات لتحليلها لاحقا (المناعية أو البيولوجيا الجزيئية). التضحية الحيوانية خلع عنق الرحم. تحليل تسجيلات intravital المجهري لتقدير حجم الخلية الجذعية المتداول والتصاق البطانية الشركة، فضلا عن ديناميكا الدم الاوعية الدموية الدقيقة، مثل سرعة خلية الدم الحمراء (ملم / ثانية)، وطول السفينة (ميكرون)، وقطره سفينة (ميكرون)، ومعدل نصيب الجدار (ثانية -1)، وينبغي أن يؤديها حاليا من قبل المحقق أعمى لعلاج الأنسجة التجريبية منها على الاستفادة من برامج معالجة الصور. </li></ol>

<ol>
	<li>Madlambayan, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=marrow+stem+and+progenitor+cell+contribution+to+neovasculogenesis+is+dependent+on+model+system+with+SDF-1+as+a+permissive+trigger.">marrow stem and progenitor cell contribution to neovasculogenesis is dependent on model system with SDF-1 as a permissive trigger.</a> Blood. 114, 4310-4319 (2009).</li><li>Lapidot, T., Dar, A., Kollet, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+stem+cells+find+their+way+home?.">How do stem cells find their way home?.</a> Blood. 106, 1901-1910 (2005).</li><li>Lehr, H. A., Vollmar, B., Vajkoczy, P., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+fluorescence+microscopy+for+the+study+of+leukocyte+interaction+with+platelets+and+endothelial+cells.">Intravital fluorescence microscopy for the study of leukocyte interaction with platelets and endothelial cells.</a> Methods Enzymol. 300, 462-481 (1999).</li><li>Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+for+the+study+of+mouse+microcirculation+in+anti-inflammatory+drug+research:+focus+on+the+mesentery+and+cremaster+preparations.">Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).</li><li>Leister, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+peritoneal+cavity+chamber+for+intravital+microscopy+of+the+liver+under+conditions+of+pneumoperitoneum.">A peritoneal cavity chamber for intravital microscopy of the liver under conditions of pneumoperitoneum.</a> Surg. Endosc. 17, 939-942 (2003).</li><li>Sriramarao, P., Anderson, W., Wolitzky, B. A., Broide, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+bone+marrow-derived+mast+cells+roll+on+P-selectin+under+conditions+of+flow+in+vivo.">Mouse bone marrow-derived mast cells roll on P-selectin under conditions of flow in vivo.</a> Lab Invest. 74, 634-643 (1996).</li><li>Baez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+open+cremaster+muscle+preparation+for+the+study+of+blood+vessels+by+in+vivo+microscopy.">An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy.</a> Microvasc. Res. 5, 384-394 (1973).</li><li>Bagher, P., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+cremaster+muscle+preparation+for+intravital+imaging+of+the+microcirculation.">The mouse cremaster muscle preparation for intravital imaging of the microcirculation.</a> J. Vis. Exp. , e2874 (2011).</li><li>Kaminski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+NOS+is+required+for+SDF-1alpha/CXCR4-mediated+peripheral+endothelial+adhesion+of+c-kit++bone+marrow+stem+cells.">Endothelial NOS is required for SDF-1alpha/CXCR4-mediated peripheral endothelial adhesion of c-kit+ bone marrow stem cells.</a> Lab Invest. 88, 58-69 (2008).</li><li>Furlani, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HMGB-1+induces+c-kit++cell+microvascular+rolling+and+adhesion+via+both+toll-like+receptor-2+and+toll-like+receptor-4+of+endothelial+cells.">HMGB-1 induces c-kit+ cell microvascular rolling and adhesion via both toll-like receptor-2 and toll-like receptor-4 of endothelial cells.</a> J. Cell Mol. Med. 16, 1094-1105 (2012).</li><li>Furlani, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+the+intravascular+administration+of+mesenchymal+stem+cells+safe?+Mesenchymal+stem+cells+and+intravital+microscopy.">Is the intravascular administration of mesenchymal stem cells safe? Mesenchymal stem cells and intravital microscopy.</a> Microvasc. Res. 77, 370-376 (2009).</li><li>Donndorf, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysing+migratory+properties+of+human+CD+133(+)+stem+cells+in+vivo+after+intraoperative+sternal+bone+marrow+isolation.">Analysing migratory properties of human CD 133(+) stem cells in vivo after intraoperative sternal bone marrow isolation.</a> Cell Transplant. , (2012).</li></ol>

وقد تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات، التي أجريت لهذه المخطوطة من قبل لجنة رعاية الحيوان واستخدام المحلي. يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

<html> حيوي داخلي المجهري مضان يسمح للرؤية مباشرة والتحليل الكمي من الخلايا الجذعية، البطانة التفاعلات. نموذج العضلات المشمرة مفيد بشكل خاص، لأن التعرض المجهرية وتقنيات التصور حيوي داخلي تم راسخة خلال البحوث على التفاعلات الكرية البيضاء البطانة والمكونات الكيميائية ...

الغرض من هذه المادة هو لوصف أسلوب intravital المجهري (IVM) تطبق على المشمرة دوران الأوعية الدقيقة الماوس للمراقبة المباشرة وتحليل الطرفية نخاع العظم الخلايا الجذعية الهجرة. المفهوم الحالي من الخلايا الجذعية استنادا الأنسجة والأعضاء التجديد ينطوي على صاروخ موجه من نخاع العظم الخلايا الجذعية المستمدة من الأنسجة المصابة 1. خطوة حاسمة لنجاح الهجرة الخلايا الجذعية يشمل وقف تفاعل الخلايا مع البطانة المحلية داخل الجهاز المصاب تليها الهجرة transendothelial وفي النهاية الجهاز engraftment 2. تحليل حيوي داخلي من هذه الخلايا الجذعية - التفاعلات الخلية البطانية يشكل معلمة مثالية لتقدير حجم استجابة التجدد الخلايا الجذعية ومقرها في إعدادات الفيزيولوجية المرضية المختلفة في الجسم الحي. وعلاوة على ذلك، يبدو تصور، أنه في المستقبل، وتحليل حيوي داخلي قدرة هجرة محددة ع الخلايا الجذعيةopulations ضمن بيئات الأوعية الدقيقة موحدة، يمكن تطبيقها قبل دفع هؤلاء السكان إلى مزيد من التجارب السريرية. وقد intravital المجهري وضعت في البداية لرصد وتقدير حجم الكرية البيضاء-البطانية تفاعل الخلايا في الجسم الحي في مجال البحوث التهابات 3. ولم يبلغ عن والتسجيلات الناجحة الأولى من دراسات intravital المجهري بواسطة كونهايم بالفعل في القرن 19، ودراسة ألسنة الضفادع &#39;والمساريقا تحت المجهر الضوء 4. منذ أول استخدام لها IVM شهد التطور التقني الهائل واليوم بعض مكونات أساسية تشكل الشروط الأساسية من أجل أداء IVM الكمية: (ط) الاستعدادات الأنسجة التي تسمح بالوصول البصرية، (ب) تحقيقات الجزيئية التي يمكن الكشف عنها بواسطة المجهر، (ج ) المجهر متصلا نظام الكشف و (iv) تحليل النظم كمبيوتر يستند التي يمكن استخراج المعلمات من الاهتمام من بيانات الصورةضبط 4. وقد تم عرض مجموعة متنوعة من الأعمال التحضيرية للدراسات الأنسجة بما في ذلك الإدارة المتكاملة للنواقل المساريقا وكبد الفأر والجرذ 5، غرف الظهرية ثنية الجلد من الماوس 6 والهامستر، والأذن الأرنب والقداد الخد الحقيبة على سبيل المثال لا الحصر. ومع ذلك، في ما يلي سوف نركز على عضلة المشمرة الماوس، وهو ما يمثل الأنسجة مثالية للملاحظات حيوي داخلي، وإعداد والتصور ممكنة من خلال إجراء العمليات الجراحية موحدة بشكل جيد، وبصفة عامة أي مشاكل من التحف حركة تحدث. وقد أجريت إعداد العضلات المشمرة مفتوحة للمرة الأولى في 1970s من قبل بايز وزملاؤه 7. ووصف في الأصل للفئران، وقد تم اعتماده بنجاح أيضا في الماوس 8. بعد أن تركز أساسا على الدراسات السابقة التفاعلات الكرية البيضاء مع جدار الوعاء الدموي، وعرض مجموعتنا مؤخرا الماوس إعداد العضلات المشمرة باعتبارها valuaأداة بلي لرؤية مباشرة والتحليل الكمي من الخلايا الجذعية التفاعلات البطانة داخل المكروية تعريف 9. وقد تم دراسة مختلف المجموعات السكانية الفرعية الخلايا الجذعية باستخدام هذا النموذج، بما في ذلك الفئران ج طقم + الخلايا الجذعية نخاع العظم والخلايا الجذعية الوسيطة، وكذلك CD الإنسان الخلايا الجذعية نخاع العظم 133 + 10-12. بعد عزل الخلايا من نخاع العظام المانحة ووضع العلامات الفلورية عن التصور، يتم تطبيق انتقائي الخلايا الجذعية في دوران الأوعية الدقيقة المشمرة باستخدام حقنة الشرياني عن طريق الشريان الفخذي، وبالتالي تجنب أي فخ خلية داخل الأجهزة عن بعد. وعلاوة على ذلك، فإن النموذج العضلات المشمرة مفيد بشكل خاص منذ كيموكينات مختلف يحتمل التوسط الهجرة الخلايا الجذعية المحلية ضمن إعدادات منها، ويمكن تطبيقها موضعيا على الأنسجة المستهدفة بواسطة تقنية superfusion بسيطة.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxy-fluorescein diacetate succinimidylester (CFDA)</td>
			<td>Invitrogen, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>C1157</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine 6 G (1%)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Munich, Germany</td>
			<td>83697</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamin (Ketanest)</td>
			<td>Pfizer, Berlin, Germany</td>
			<td>not available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylacin (Rompun)</td>
			<td>Bayer, Leverkusen, Germany</td>
			<td>not available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate - buffered saline (PBS)</td>
			<td>PAN Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P04-36500</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intravital microscopy of the microcirculation in the mouse cremaster muscle for the analysis of peripheral stem cell migration

في عصر داخل الأوعية تطبيق البروتوكولات خلية في سياق العلاج بالخلايا التجدد، الآليات الكامنة وراء هجرة الخلايا الجذعية إلى أنسجة nonmarrow لم تتوضح تماما. نحن هنا وصف تقنية intravital المجهري تطبيقها على المشمرة دوران الأوعية الدقيقة الماوس لتحليل نخاع العظام الطرفية هجرة الخلايا الجذعية في الجسم الحي. intravital المجهري للM. المشمرة وقد أدخلت سابقا في مجال البحوث لالتهابات الملاحظة المباشرة للتفاعل الكرية البيضاء مع بطانة الأوعية الدموية. منذ الجذعية الطرفية كافية والسلف الخلية الهجرة يتضمن خطوات أولية مماثلة من المتداول على طول التصاق وطيد في البطانية المبطنة فمن المتصور لتطبيق نموذج المشمرة M. لرصد وتقدير حجم التفاعل بين الخلايا الجذعية تدار intravasculary مع البطانة. كما المكونات الكيميائية المختلفة يمكن تطبيقها بشكل انتقائي لر الهدفالمشكلة عن طريق تقنيات superfusion بسيطة، فمن الممكن لإنشاء شروط مسبقة microenvironmental الأساسية، للتجنيد الخلايا الجذعية الأولية لتجري في الكائن الحي خارج نخاع العظام.

بشكل عام، والتفاعل مباشرة من حقن الخلايا الجذعية أو السلف مع بطانة الأوعية الدموية داخل العضلات المشمرة دوران الأوعية الدقيقة هو حدث نادر ويحدث حصرا في الأوردة شعيرة وريدية (قطر: 30-80 ميكرون). نظرا لوضع العلامات مضان المتداول والخلايا الجذعية تمسكا راسخا يمكن قياسها ?...

Watch this Scientific Journal Video about Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration at JoVE.com

Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration

intravital المجهري للالمشمرة دوران الأوعية الدقيقة الماوس M. عروض فريدة وموحدة جيدا في نموذج الجسم الحي لتحليل الطرفية نخاع العظم الخلايا الجذعية الهجرة.

حيوي داخلي المجهري للدوران الأوعية الدقيقة في العضلات المشمرة ماوس لتحليل الهجرة الجذعية الطرفية المحمولة

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to ...

intravital-microscopy-microcirculation-mouse-cremaster-muscle-for

Research

JoVE Journal

Biology

15.1K Views.  University Rostock.  intravital المجهري للالمشمرة دوران الأوعية الدقيقة الماوس M. عروض فريدة وموحدة جيدا في نموذج الجسم الحي لتحليل الطرفية نخاع العظم الخلايا الجذعية الهجرة. 

Video: Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration

The Mouse Cremaster Muscle Preparation for Intravital Imaging of the Microcirculation

Throughout the body, the maintenance of homeostasis requires the constant supply of oxygen and nutrients concomitant with removal of metabolic by-products. This balance is achieved by the movement of blood through the microcirculation, which encompasses the smallest branches of the vascular supply throughout all tissues and organs. Arterioles branch from arteries to form networks that control the distribution and magnitude of oxygenated blood flowing into the multitude of capillaries intimately associated with parenchymal cells. Capillaries provide a large surface area for diffusional exchange between tissue cells and the blood supply. Venules collect capillary effluent and converge as they return deoxygenated blood towards the heart. To observe these processes in real time requires an experimental approach for visualizing and manipulating the living microcirculation.
The cremaster muscle of rats was first used as a model for studying inflammation using histology and electron microscopy post mortem1,2. 
The first in vivo report of the exposed intact rat cremaster muscle investigated microvascular responses to vasoactive drugs using reflected light3. However 
curvature of the muscle and lack of focused illumination limited the usefulness of this preparation. The major breakthrough entailed opening the muscle, 
detaching it from the testicle and spreading it radially as a flat sheet for transillumination under a compound microscope4. While shown to be a valuable 
preparation to study the physiology of the microcirculation in rats5 and hamsters6, the cremaster muscle in mice7 has proven particularly useful in dissecting 
cellular pathways involved in regulating microvascular function8-11 and real-time imaging of intercellular signaling12. 
The cremaster muscle is derived from the internal oblique and transverse abdominus muscles as the testes descend through the inguinal canal13. 
It serves to support (Greek: cremaster = suspender) and maintain temperature of the testes. As described here, the cremaster muscle is prepared as a thin flat sheet 
for outstanding optical resolution. With the mouse maintained at a stable body temperature and plane of anesthesia, surgical preparation involves freeing the muscle 
from surrounding tissue and the testes, spreading it onto transparent pedestal of silastic rubber and securing the edges with insect pins while irrigating it 
continuously with physiological salt solution. The present protocol utilizes transgenic mice expressing GCaMP2 in arteriolar endothelial cells. GCaMP2 is a 
genetically encoded fluorescent calcium indicator molecule12. Widefield imaging and an intensified charge-coupled device camera enable in vivo study of 
calcium signaling in the arteriolar endothelium.

A tissue preparation is described for visualization and experimental manipulation of the living microcirculation. In anesthetized male mice, the thin, highly vascularized cremaster muscle is prepared for intravital microscopy to study microvascular networks including arterioles, capillaries and venules. This preparation is readily adapted for rats and hamsters.

العضلة المشمرة ماوس التحضير لتصوير Intravital للدوران الأوعية الدقيقة

Throughout the body, the maintenance of homeostasis requires the constant supply of oxygen and nutrients concomitant with removal of metabolic ...

Microiontophoresis and Micromanipulation for Intravital Fluorescence Imaging of the Microcirculation

Microiontophoresis entails passage of current through a micropipette tip to deliver a solute at a designated site within an experimental preparation. Microiontophoresis can simulate synaptic transmission1 by delivering neurotransmitters and neuropeptides onto neurons reproducibly2. Negligible volume (fluid) displacement avoids mechanical disturbance to the experimental preparation. Adapting these techniques to the microcirculation3 has enabled mechanisms of vasodilation and vasoconstriction to be studied at the microscopic level in vivo4,5. A key advantage of such localized delivery is enabling vasomotor responses to be studied at defined sites within a microvascular network without evoking systemic or reflexive changes in blood pressure and tissue blood flow, thereby revealing intrinsic properties of microvessels.
A limitation of microiontophoresis is that the precise concentration of agent delivered to the site of interest is difficult to ascertain6. Nevertheless, its release from the micropipette tip is proportional to the intensity and duration of the ejection current2,7, such that reproducible stimulus-response relationships can be readily determined under defined experimental conditions (described below). Additional factors affecting microiontophoretic delivery include solute concentration and its ionization in solution. The internal diameter of the micropipette tip should be &tilde; 1 &mu;m or less to minimize diffusional 'leak', which can be counteracted with a retaining current. Thus an outward (positive) current is used to eject a cation and a negative current used to retain it within the micropipette.
Fabrication of micropipettes is facilitated with sophisticated electronic pullers8. Micropipettes are pulled from glass capillary tubes containing a filament that 'wicks' solution into the tip of the micropipette when filled from the back end ("backfilled"). This is done by inserting a microcapillary tube connected to a syringe containing the solution of interest and ejecting the solution into the lumen of the micropipette. Micromanipulators enable desired placement of micropipettes within the experimental preparation. Micromanipulators mounted on a movable base can be positioned around the preparation according to the topography of microvascular networks (developed below). 
The present protocol demonstrates microiontophoresis of acetylcholine (ACh+ Cl-) onto an arteriole of the mouse cremaster muscle preparation (See associated protocol: JoVE ID#2874) to produce endothelium-dependent vasodilation. Stimulus delivery is synchronized with digitized image acquisition using an electronic trigger. The use of Cx40BAC-GCaMP2 transgenic mice9 enables visualization of intracellular calcium responses underlying vasodilation in arteriolar endothelial cells in the living microcirculation.

Microiontophoresis entails movement of ions from a micropipette in response to a difference in electrical potential between the inside and outside of the micropipette. Biologically active molecules are thereby delivered in proportion to electrical current. We illustrate acetylcholine microiontophoresis in conjunction with micromanipulation to study endothelium-dependent vasodilation in the microcirculation.

Microiontophoresis والمجهرية للتصوير الإسفار Intravital للدوران الأوعية الدقيقة

Microiontophoresis entails passage of current through a micropipette tip to deliver a solute at a designated site within an experimental  preparation. ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

جيل من الفئران المستمدة من الخلايا الجذعية المحفزة المستحثة

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective isolation in culture. Recently, using fluorescence-activated cell sorting (FACS), we and other researchers prospectively identified and purified three subpopulations of multipotent precursor cells associated with the vasculature of human skeletal muscle. These three cell populations: myogenic endothelial cells (MECs), pericytes (PCs), and adventitial cells (ACs), are localized respectively to the three structural layers of blood vessels: intima, media, and adventitia. All of these human blood-vessel-derived stem cell (hBVSC) populations not only express classic MSC markers but also possess mesodermal developmental potentials similar to typical MSCs. Previously, MECs, PCs, and ACs have been isolated through distinct protocols and subsequently characterized in separate studies. The current isolation protocol, through modifications to the isolation process and adjustments in the selective cell surface markers, allows us to simultaneously purify all three hBVSC subpopulations by FACS from a single human muscle biopsy. This new method will not only streamline the isolation of multiple BVSC subpopulations but also facilitate future clinical applications of hBVSCs for distinct therapeutic purposes.

Blood vessels within human skeletal muscle harbor several multi-lineage precursor populations that are ideal for regenerative applications. This isolation method allows simultaneous purification of three multipotent precursor cell populations respectively from three structural layers of blood vessels: myogenic endothelial cells from intima, pericytes from media, and adventitial cells from adventitia.

العزلة من الدم والأوعية المشتقة متعددة القدرات السلائف من العضلات الهيكلية البشرية

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Identification of Key Factors Regulating Self-renewal and Differentiation in EML Hematopoietic Precursor Cells by RNA-sequencing Analysis

Hematopoietic stem cells (HSCs) are used clinically for transplantation treatment to rebuild a patient&#39;s hematopoietic system in many diseases such as leukemia and lymphoma. Elucidating the mechanisms controlling HSCs self-renewal and differentiation is important for application of HSCs for research and clinical uses. However, it is not possible to obtain large quantity of HSCs due to their inability to proliferate in vitro. To overcome this hurdle, we used a mouse bone marrow derived cell line, the EML (Erythroid, Myeloid, and Lymphocytic) cell line, as a model system for this study.
RNA-sequencing (RNA-Seq) has been increasingly used to replace microarray for gene expression studies. We report here a detailed method of using RNA-Seq technology to investigate the potential key factors in regulation of EML cell self-renewal and differentiation. The protocol provided in this paper is divided into three parts. The first part explains how to culture EML cells and separate Lin-CD34+ and Lin-CD34- cells. The second part of the protocol offers detailed procedures for total RNA preparation and the subsequent library construction for high-throughput sequencing. The last part describes the method for RNA-Seq data analysis and explains how to use the data to identify differentially expressed transcription factors between Lin-CD34+ and Lin-CD34- cells. The most significantly differentially expressed transcription factors were identified to be the potential key regulators controlling EML cell self-renewal and differentiation. In the discussion section of this paper, we highlight the key steps for successful performance of this experiment.
In summary, this paper offers a method of using RNA-Seq technology to identify potential regulators of self-renewal and differentiation in EML cells. The key factors identified are subjected to downstream functional analysis in vitro and in vivo.

RNA-sequencing and bioinformatics analyses were used to identify significantly and differentially expressed transcription factors in Lin-CD34+ and Lin-CD34- subpopulations of mouse EMLcells. These transcription factors might play important roles in determining the switch between self-renewing Lin-CD34+ and partially differentiated Lin-CD34- cells.

تحديد العوامل الرئيسية تنظيم-تجديد الذات والتمايز في الخلايا المكونة للدم EML السلائف بواسطة تحليل الحمض النووي الريبي التسلسل

Hematopoietic stem cells (HSCs) are used clinically for transplantation treatment to rebuild a patient&#39;s hematopoietic system in many diseases such as ...

Visualization and Quantification of the Cell-free Layer in Arterioles of the Rat Cremaster Muscle

The cell-free layer is defined as the parietal plasma layer in the microvessel flow, which is devoid of red blood cells. The measurement of the in vivo cell-free layer width and its spatiotemporal variations can provide a comprehensive understanding of hemodynamics in microcirculation. In this study, we used an intravital microscopic system coupled with a high-speed video camera to quantify the cell-free layer widths in arterioles in vivo. The cremaster muscle of Sprague-Dawley rats was surgically exteriorized to visualize the blood flow. A custom-built imaging script was also developed to automate the image processing and analysis of the cell-free layer width. This approach enables the quantification of spatiotemporal variations more consistently than previous manual measurements. The accuracy of the measurement, however, partly depends on the use of a blue filter and the selection of an appropriate thresholding algorithm. Specifically, we evaluated the contrast and quality of images acquired with and without the use of a blue filter. In addition, we compared five different image histogram-based thresholding algorithms (Otsu, minimum, intermode, iterative selection, and fuzzy entropic thresholding) and illustrated the differences in their determination of the cell-free layer width.

This study demonstrates the surgical preparation of the rat cremaster muscle for the visualization of the in vivo cell-free layer. Considerable factors affecting the accuracy of the cell-free layer width measurement are discussed in this study.

التصور النوعي والكمي للطبقة خالية من الخلايا في الشرايين من العضلات الفئران المشمرة

The cell-free layer is defined as the parietal plasma layer in the microvessel flow, which is devoid of red blood cells. The measurement of the in vivo ...

Analysis of the Gap Junction-dependent Transfer of miRNA with 3D-FRAP Microscopy

Small antisense RNAs, like miRNA and siRNA, play an important role in cellular physiology and pathology and, moreover, can be used as therapeutic agents in the treatment of several diseases. The development of new, innovative strategies for miRNA/siRNA therapy is based on an extensive knowledge of the underlying mechanisms. Recent data suggest that small RNAs are exchanged between cells in a gap junction-dependent manner, thereby inducing gene regulatory effects in the recipient cell. Molecular biological techniques and flow cytometric analysis are commonly used to study the intercellular exchange of miRNA. However, these methods do not provide high temporal resolution, which is necessary when studying the gap junctional flux of molecules. Therefore, to investigate the impact of miRNA/siRNA as intercellular signaling molecules, novel tools are needed that will allow for the analysis of these small RNAs at the cellular level. The present protocol describes the application of three-dimensional fluorescence recovery after photobleaching (3D-FRAP) microscopy to elucidating the gap junction-dependent exchange of miRNA molecules between cardiac cells. Importantly, this straightforward and non-invasive live-cell imaging approach allows for the visualization and quantification of the gap junctional shuttling of fluorescently labeled small RNAs in real time, with high spatio-temporal resolution. The data obtained by 3D-FRAP confirm a novel pathway of intercellular gene regulation, where small RNAs act as signaling molecules within the intercellular network.

Here, we describe the application of three-dimensional fluorescence recovery after photobleaching (3D-FRAP) for the analysis of the gap junction-dependent shuttling of miRNA. In contrast to commonly applied methods, 3D-FRAP allows for the quantification of the intercellular transfer of small RNAs in real time, with high spatio-temporal resolution.

تحليل الفجوة تعتمد على تقاطع نقل ميرنا مع المجهر 3D فراب

Small antisense RNAs, like miRNA and siRNA, play an important role in cellular physiology and pathology and, moreover, can be used as therapeutic agents ...

Intravital Subcellular Microscopy of the Mammary Gland

The mammary gland constitutes a model par excellence for investigating epithelial functions, including tissue remodeling, cell polarity, and secretory mechanisms. During pregnancy, the gland expands from a primitive ductal tree embedded in a fat pad to a highly branched alveolar network primed for the formation and secretion of colostrum and milk. Post-partum, the gland supplies all the nutrients required for neonatal survival, including membrane-coated lipid droplets (LDs), proteins, carbohydrates, ions, and water. Various milk components, including lactose, casein micelles, and skim-milk proteins, are synthesized within the alveolar cells and secreted from vesicles by exocytosis at the apical surface. LDs are transported from sites of synthesis in the rough endoplasmic reticulum to the cell apex, coated with cellular membranes, and secreted by a unique apocrine mechanism. Other preformed constituents, including antibodies and hormones, are transported from the serosal side of the epithelium into milk by transcytosis. These processes are amenable to intravital microscopy because the mammary gland is a skin gland and, therefore, directly accessible to experimental manipulation. In this paper, a facile procedure is described to investigate the kinetics of LD secretion in situ, in real-time, in live anesthetized mice. Boron-dipyrromethene (BODIPY)665/676&#160;or monodansylpentane are used to label the neutral lipid fraction of transgenic mice, which either express soluble EGFP (enhanced green fluorescent protein) in the cytoplasm, or a membrane-targeted peptide fused to either EGFP or tdTomato. The membrane-tagged fusion proteins serve as markers of cell surfaces, and the lipid dyes resolve LDs &#8805; 0.7 &#181;m. Time-lapse images can be recorded by standard laser scanning confocal microscopy down to a depth of 15-25 &#181;m or by multiphoton microscopy for imaging deeper in the tissue. The mammary gland may be bathed with pharmacological agents or fluorescent dyes throughout the surgery, providing a platform for acute experimental manipulations as required.

<meta charset="utf8"></head><body>الفحص المجهري تحت الخلوي داخل الجسم للغدة الثديية

The present protocol describes a facile technique for the intravital imaging of the lactating mouse mammary gland by laser scanning confocal and multiphoton microscopy.

الفحص المجهري تحت الخلوي داخل الجسم للغدة الثديية

The mammary gland constitutes a model par excellence for investigating epithelial functions, including tissue remodeling, cell polarity, and secretory ...

Live Imaging of Microtubule Dynamics in Glioblastoma Cells Invading the Zebrafish Brain

With a dismal median survival time in real populations-between 6 to 15 months-glioblastoma (GBM) is the most devastating malignant brain tumor. Treatment failure is mainly due to the invasiveness of GBM cells, which speaks for the need for a better understanding of GBM motile properties. To investigate the molecular mechanism supporting GBM invasion, new physiological models enabling in-depth characterization of protein dynamics during invasion are required. These observations would pave the way to the discovery of novel targets to block tumor infiltration and improve patient outcomes. This paper reports how an orthotopic xenograft of GBM cells in the zebrafish brain permits subcellular intravital live imaging. Focusing on microtubules (MTs), we describe a procedure for MT labeling in GBM cells, microinjecting GBM cells in the transparent brain of 3 days post fertilization (dpf) zebrafish larvae, intravital imaging of MTs in the disseminating xenografts, altering MT dynamics to assess their role during GBM invasion, and analyzing the acquired data.

We report a technique permitting live imaging of microtubule dynamics in glioblastoma (GBM) cells invading a vertebrate brain tissue. Coupling the orthotopic injection of fluorescently tagged GBM cells into a transparent zebrafish brain with high-resolution intravital imaging allows the measurement of cytoskeleton dynamics during in situ cancer invasion.

التصوير الحي لديناميات الأنابيب الدقيقة في خلايا الورم الأرومي الدبقي التي تغزو دماغ الزرد

With a dismal median survival time in real populations-between 6 to 15 months-glioblastoma (GBM) is the most devastating malignant brain tumor. Treatment ...