Todo el protocolo después de aislamiento de células tarda aproximadamente 2 horas. 1. Preparación microquirúrgica <ol><li> Realizar el aislamiento de células madre de la médula ósea del donante y etiquetado fluorescente de la subpoblación aislada de acuerdo con protocolos 9,12 permitir que las células descansan durante el tiempo que se realiza la operación de los animales estandarizados. Para el marcaje fluorescente recomendamos CFDA (succinimidiléster diacetato de carboxifluoresceína). </li><li> Anestesiar a un ratón macho 20-25 g de peso con ketamina (75 mg / kg) y xilazina (2.5 mg / kg). A lo largo de los procedimientos quirúrgicos y protocolos experimentales, la anestesia debe ser mantenida por los suplementos (10% de la inyección inicial, ip), según sea necesario (por lo general cada 30 a 60 min). </li><li> Afeitarse suavemente la cara anterior del escroto derecho, así como el muslo derecho y la ingle. Recoge todos pierden el cabello con un bastoncillo de algodón humedecido. Coloque el lado ventral del ratón hacia arriba en un escenario de visualización de plexiglás y fijar la cuotat usando cortina elástica. Está hecho a medida La etapa, que consiste en una placa base y una segunda placa en el borde caudal de la placa base para la elevación de las dos piernas y el escroto. Coloque el escenario en una almohadilla térmica para mantener la temperatura del cuerpo a 37 ° C. Después de la fijación en el escenario, colocar al animal en un microscopio de funcionamiento y realice los siguientes pasos de la operación usando 10 - a la ampliación de 16 veces. </li><li> Hacer la incisión inicial con unas tijeras de la piel en el muslo derecho, justo por delante de los vasos femorales de la rodilla hasta la ingle. </li><li> Identificar la arteria femoral y seguirla en dirección proximal, la movilización de la arteria de los tejidos blandos circundantes. Identificar y cortar una rama grande al testículo izquierdo con termocauterio. A partir de entonces colocar una sutura estancia superficialmente en el testículo izquierdo. Tracción suave facilitará aún más la movilización proximal de la arteria femoral. </li><li> Después de la terminación de la movilización proximal, identificar y cortar una rama grande corriendo medially en el muslo por termocauterio. A partir de entonces ligar la arteria femoral en la parte distal del muslo derecho. Tracción suave sobre la ligadura ayudará más preparación. </li><li> Girar la atención ahora a la arteria femoral proximal de nuevo y colocar una sutura alrededor de la arteria como proximalmente como sea posible. Preparar un nudo, pero no lo ate abajo todavía. Aplicar una suave tracción a la sutura y crear un retorcimiento arterial. </li><li> Después de establecer el retorcimiento, haga una incisión de la arteria está utilizando cuidadosamente un microscissor. Tenga especial cuidado de no dañar la vena femoral. </li><li> Insertar un microcatéter preparado (diámetro interior 0,28 mm) a través de la incisión. El catéter debe ser desaireado (cloruro de sodio 0,9%, NaCl) y conectado a una inserción antes de jeringa de 1 ml. </li><li> Después de la inserción exitosa del catéter, aflojar cuidadosamente el acodamiento con el fin de facilitar el paso del catéter. El flujo de sangre arterial debe ser inmediatamente visible dentro del catéter. Avanzar suavemente el catéter de pocos milímetross más allá del retorcimiento anterior. A partir de entonces, la corbata por la ligadura preparado para la fijación del catéter. </li><li> Enjuague suavemente el catéter (0,9% NaCl) y aspirar para confirmar la posición correcta. Utilice un trozo de cinta adhesiva para asegurar aún más el catéter para la etapa de operación. </li><li> Después de la fijación adecuada, coloque el catéter a un lado para los siguientes pasos de preparación del músculo cremáster. Aplicar el lavado regular y aspiración del catéter cada 5-10 minutos con el fin de prevenir la formación de coágulos. </li><li> Gire ahora la atención en el escroto derecho y hacer una incisión cortando la piel y la fascia por encima de la cara ventral del escroto derecho. Tenga cuidado de no tocar el tejido subyacente con ningún instrumento. </li><li> Extender la incisión hasta el pliegue inguinal y caudalmente hasta el extremo distal del escroto. </li><li> Tejido cuidadosamente separada subyacente suave y conectivo encima del saco cremáster, sin tocarlo. Identifique el extremo distal del cremáster, y colocar una sutura estancia aquí para slightly extender el músculo. Resecar ahora el tejido blando restante debajo del saco muscular tirando suavemente el músculo caudal y anterior. </li><li> Después de la separación completa a partir de tejido conectivo, abrir el saco cremáster en un punto en el borde craneal con unas tijeras. Extender la incisión de esta abertura hacia abajo hasta el extremo distal del músculo. </li><li> Selle la pequeña embarcación que conecta el testículo y el cremáster usando termocauterio, después cortar los contactos que persisten entre el músculo y el testículo con unas tijeras. </li><li> Deja a un lado del testículo, fuera del campo de la microscopía. </li><li> El cremáster abierto ahora está plano en el escenario. Coloque cuatro puntos de Prolene 6-0 estancia en los bordes de los tejidos y fijarlas con cortina elástica con el fin de extender el tejido del músculo cremáster. A partir de ahora humedecer continuamente el tejido con solución salina tamponada con fosfato (PBS) usando una jeringa de 1 ml (Figura 1). </li><li> Autorizar ahora la preparación reposar 15 min. A partir de entonces inyectar0,05-0,1 ml de 1% de rodamina-dextrano a través de la arteria femoral izquierda para la mejora de contraste de la microvasculatura. Si se planifican las quimiocinas o agentes inflamatorios para su aplicación, ahora debería humedecer tópicamente el músculo con el respectivo reactivo usando una jeringa de 1 ml. En el caso de un experimento de control, continuar humedeciendo con PBS. </li></ol> 2. Microscopia intravital <ol><li> Mantenga el ratón fijada en la etapa de operación y moverse bajo un microscopio de fluorescencia modificado para epi-iluminación y conectado a un CCD (dispositivo de carga acoplada) de la cámara de vídeo. Tenga especial cuidado de no dislocar el catéter en la arteria femoral. </li><li> Llevar a cabo experimentos utilizando un objetivo de inmersión en agua. </li><li> Después de ajustar el objetivo para la visualización suficiente de la microcirculación cremáster y antes de la inyección de células, definir estocásticamente seis vénulas post-capilares para su posterior análisis de la firma de la adhesión de células madre. </li><li> Administrar las células madre fluorescentes que llevan la etiqueta,disuelto en 200 l de PBS, a 0,4 x 10 6 células por inyección, con un total de cinco inyecciones consecutivas utilizando el catéter en la arteria femoral y una jeringa de 1 ml. Sacudir cuidadosamente la muestra de células antes de la primera inyección. </li><li> Células madre disco de los Rolling inmediatamente después de la inyección de células, definiendo de este modo &quot;rodar&quot; como una reducción de más del 50% de la velocidad de la célula a lo largo del revestimiento endotelial en combinación con típico celular &quot;palo y liberar&quot; movimientos. Lleve a cabo el recuento de las células madre de rodadura y todas las células madres que pasan una distancia predefinida venular durante 1 min de la observación después de cada inyección única. La cantidad de laminación de células madre se expresa como porcentaje de todas las células que pasan. No contar las células que exhiben fenómenos inmovilización breves aleatorios como células de rodadura. </li><li> Después de la última inyección de células determinar el número de células madre firmemente adherentes contando y expresar la cantidad en relación a la superficie endotelial calculado de the seis vénulas predefinidos (diámetro x largo x π) como células adherentes / mm 2. Adherencia firme se considera cuando hay movimiento celular es detectable durante 30 segundos. </li><li> Después de la terminación de la microscopía intravital retirar con cuidado el músculo cremáster y almacenarlo en correspondencia con el análisis posterior (inmunohistoquímica o biología molecular). Sacrificio del animal por dislocación cervical. El análisis de las grabaciones de microscopía intravital para la cuantificación de la laminación de células madre y firme adhesión endotelial, así como la hemodinámica microvasculares, tales como la velocidad de la sangre de glóbulos rojos (mm / s), la eslora del buque (m), el diámetro del vaso (m), tasa de cuota de pared (s-1); se debe realizar fuera de línea por un investigador ciego para el tratamiento respectivo tejido experimental que utiliza un software de procesamiento de imágenes. </li></ol>

<ol>
	<li>Madlambayan, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=marrow+stem+and+progenitor+cell+contribution+to+neovasculogenesis+is+dependent+on+model+system+with+SDF-1+as+a+permissive+trigger.">marrow stem and progenitor cell contribution to neovasculogenesis is dependent on model system with SDF-1 as a permissive trigger.</a> Blood. 114, 4310-4319 (2009).</li><li>Lapidot, T., Dar, A., Kollet, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+stem+cells+find+their+way+home?.">How do stem cells find their way home?.</a> Blood. 106, 1901-1910 (2005).</li><li>Lehr, H. A., Vollmar, B., Vajkoczy, P., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+fluorescence+microscopy+for+the+study+of+leukocyte+interaction+with+platelets+and+endothelial+cells.">Intravital fluorescence microscopy for the study of leukocyte interaction with platelets and endothelial cells.</a> Methods Enzymol. 300, 462-481 (1999).</li><li>Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+for+the+study+of+mouse+microcirculation+in+anti-inflammatory+drug+research:+focus+on+the+mesentery+and+cremaster+preparations.">Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).</li><li>Leister, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+peritoneal+cavity+chamber+for+intravital+microscopy+of+the+liver+under+conditions+of+pneumoperitoneum.">A peritoneal cavity chamber for intravital microscopy of the liver under conditions of pneumoperitoneum.</a> Surg. Endosc. 17, 939-942 (2003).</li><li>Sriramarao, P., Anderson, W., Wolitzky, B. A., Broide, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+bone+marrow-derived+mast+cells+roll+on+P-selectin+under+conditions+of+flow+in+vivo.">Mouse bone marrow-derived mast cells roll on P-selectin under conditions of flow in vivo.</a> Lab Invest. 74, 634-643 (1996).</li><li>Baez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+open+cremaster+muscle+preparation+for+the+study+of+blood+vessels+by+in+vivo+microscopy.">An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy.</a> Microvasc. Res. 5, 384-394 (1973).</li><li>Bagher, P., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+cremaster+muscle+preparation+for+intravital+imaging+of+the+microcirculation.">The mouse cremaster muscle preparation for intravital imaging of the microcirculation.</a> J. Vis. Exp. , e2874 (2011).</li><li>Kaminski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+NOS+is+required+for+SDF-1alpha/CXCR4-mediated+peripheral+endothelial+adhesion+of+c-kit++bone+marrow+stem+cells.">Endothelial NOS is required for SDF-1alpha/CXCR4-mediated peripheral endothelial adhesion of c-kit+ bone marrow stem cells.</a> Lab Invest. 88, 58-69 (2008).</li><li>Furlani, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HMGB-1+induces+c-kit++cell+microvascular+rolling+and+adhesion+via+both+toll-like+receptor-2+and+toll-like+receptor-4+of+endothelial+cells.">HMGB-1 induces c-kit+ cell microvascular rolling and adhesion via both toll-like receptor-2 and toll-like receptor-4 of endothelial cells.</a> J. Cell Mol. Med. 16, 1094-1105 (2012).</li><li>Furlani, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+the+intravascular+administration+of+mesenchymal+stem+cells+safe?+Mesenchymal+stem+cells+and+intravital+microscopy.">Is the intravascular administration of mesenchymal stem cells safe? Mesenchymal stem cells and intravital microscopy.</a> Microvasc. Res. 77, 370-376 (2009).</li><li>Donndorf, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysing+migratory+properties+of+human+CD+133(+)+stem+cells+in+vivo+after+intraoperative+sternal+bone+marrow+isolation.">Analysing migratory properties of human CD 133(+) stem cells in vivo after intraoperative sternal bone marrow isolation.</a> Cell Transplant. , (2012).</li></ol>

Todos los experimentos con animales, llevados a cabo por este manuscrito han sido aprobados por el comité local de cuidado y uso de animales. Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

<html> Microscopía de fluorescencia intravital permite la visualización directa y el análisis cuantitativo de la madre de las interacciones célula-endotelio. El modelo de músculo cremáster es particularmente útil, ya que la exposición de microcirugía y técnicas de visualización intravital han sido bien establecido durante la investigación sobre las interacciones entre leucocitos y endotelio diversos componentes químicos se puede aplicar selectivamente al tejido diana mediante la técnica de superfusión senc...

El propósito del presente artículo es describir la técnica de microscopía intravital (IVM) aplicado sobre la microcirculación cremáster ratón para la observación directa y el análisis de médula ósea periférica migración de células madre. La regeneración de tejidos y de órganos El concepto actual de células madre basado implica el homing de las células madre derivadas de la médula ósea al tejido lesionado 1. Un paso crucial para el éxito de la migración de células madre incluye la interacción de células madre con el endotelio local dentro del órgano lesionado, seguido de la migración transendotelial y, finalmente, el injerto de órganos 2. Análisis intravital de estas células madre - interacciones de células endoteliales se forma un parámetro ideal para la cuantificación de una respuesta regenerativa de células madre basada en diferentes contextos fisiopatológicos in vivo. Además, parece concebible, que, en el futuro, el análisis intravital de la capacidad migratoria de p específico de células madreopulations dentro de los entornos de la microcirculación estandarizadas, podrían aplicarse antes de avanzar en estas poblaciones de más pruebas clínicas. Microscopía intravital se ha desarrollado inicialmente para la observación y cuantificación de la interacción célula-endotelial de leucocitos in vivo en el campo de la investigación inflamatoria 3. Primeras grabaciones exitosas de estudios de microscopía intravital fueron reportados por Cohnheim ya en el siglo 19, el estudio de las lenguas y entresijos de rana con un microscopio de luz 4. Desde su primer uso IVM ha experimentado un enorme desarrollo técnico y en la actualidad ciertos componentes esenciales formen requisitos previos para llevar a cabo IVM cuantitativa: (i) preparaciones de tejidos que permiten el acceso óptico, (ii) sondas moleculares que pueden ser detectadas por un microscopio, (iii ) un microscopio conectado a un sistema de detección y (iv) los sistemas de análisis basados ​​en ordenador que puede extraer parámetros de interés a partir de los datos de imagenestablecer 4. Una variedad de preparaciones de tejidos se ha introducido para los estudios de MIV incluyendo los entresijos y el hígado del ratón y de rata 5, las cámaras de los pliegues cutáneos dorsal de ratón 6 y el hámster, la oreja del conejo y de la bolsa de la mejilla del hámster por nombrar algunos. Sin embargo, en lo que sigue nos centraremos en el músculo cremáster ratón, lo que representa un tejido ideal para las observaciones intravitales, como la preparación y la visualización son posibles mediante un procedimiento quirúrgico bien estandarizados, y en general no se producen problemas de artefactos de movimiento. La preparación del músculo cremáster abierto se llevó a cabo por primera vez en la década de 1970 por Báez y sus colegas 7. Originalmente descrito para ratas, se ha adoptado con éxito también para el ratón 8. Después de los estudios anteriores se habían centrado principalmente en la interacción de leucocitos con la pared del vaso, nuestro grupo ha presentado recientemente la preparación Cremáster ratón como valoraciónble herramienta para la visualización directa y el análisis cuantitativo de la madre de las interacciones célula-endotelio dentro de un microambiente definido 9. Varios subpoblaciones de células madre se han estudiado utilizando este modelo, incluyendo las células madre mesenquimales de c-kit murino + de células madre de médula ósea y, así como de CD humano células madre de la médula ósea 133 + 10-12. Tras el aislamiento de células de donante de médula ósea y etiquetado fluorescente para la visualización, las células madre se aplican selectivamente en la microcirculación cremáster la utilización de una inyección arterial a través de la arteria femoral, evitando de este modo cualquier atrapamiento de células dentro de los órganos remotos. Además, el modelo de músculo cremáster es particularmente útil, ya que diversas quimiocinas potencialmente que median la migración de células madre local dentro de los ajustes respectivos, se pueden aplicar tópicamente al tejido diana mediante la técnica de superfusión sencilla.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxy-fluorescein diacetate succinimidylester (CFDA)</td>
			<td>Invitrogen, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>C1157</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine 6 G (1%)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Munich, Germany</td>
			<td>83697</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamin (Ketanest)</td>
			<td>Pfizer, Berlin, Germany</td>
			<td>not available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylacin (Rompun)</td>
			<td>Bayer, Leverkusen, Germany</td>
			<td>not available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate - buffered saline (PBS)</td>
			<td>PAN Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P04-36500</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intravital microscopy of the microcirculation in the mouse cremaster muscle for the analysis of peripheral stem cell migration

En la era de los protocolos de aplicación de células intravasculares en el contexto de la terapia celular regenerativa, los mecanismos subyacentes de la migración de células madre de tejido nonmarrow no han sido completamente aclarados. Se describe aquí la técnica de microscopía intravital aplicado a la microcirculación cremáster ratón para el análisis de médula ósea periférica migración de células madre in vivo. Microscopía intravital de la M. cremáster se ha introducido previamente en el campo de la investigación inflamatoria para la observación directa de la interacción de leucocitos con el endotelio vascular. Desde madre periféricas suficiente y la migración de células progenitoras incluye los pasos iniciales similares de rodar a lo largo de y la adhesión firme en el revestimiento endotelial es concebible aplicar el modelo M. cremáster para la observación y cuantificación de la interacción de las células madre administrados intravasculary con el endotelio. Como diversos componentes químicos pueden ser aplicados selectivamente a la diana Tproblema mediante técnicas de superfusión simples, es posible establecer condiciones previas esenciales microambientales, para el reclutamiento de células madre inicial que tendrá lugar en un organismo que vive fuera de la médula ósea.

En general, la interacción de directamente inyectado células madre o progenitoras con el endotelio vascular dentro de la microcirculación músculo cremáster es un evento raro y se produce exclusivamente en las vénulas postcapilares (diámetro: 30-80 micras). Debido a la fluorescencia de etiquetado de rodadura y las células madre firmemente adherentes pueden ser claramente cuantificados en la separación de leucocitos circulantes endógenas en las vénulas observadas (Figura 2). <p class="jove_...

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Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration

Microscopía intravital del cremáster microcirculación ratón M. ofrece un único y bien estandarizada-modelo in vivo para el análisis de médula ósea periférica migración de células madre en.

Microscopia intravital de la microcirculación en el músculo de ratón Cremaster para el análisis de la migración de la célula madre periféricas

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to ...

intravital-microscopy-microcirculation-mouse-cremaster-muscle-for

Research

JoVE Journal

Biology

15.2K vistas.  University Rostock.  Microscopía intravital del cremáster microcirculación ratón M. ofrece un único y bien estandarizada-modelo in vivo para el análisis de médula ósea periférica migración de células madre en. 

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The Mouse Cremaster Muscle Preparation for Intravital Imaging of the Microcirculation

Throughout the body, the maintenance of homeostasis requires the constant supply of oxygen and nutrients concomitant with removal of metabolic by-products. This balance is achieved by the movement of blood through the microcirculation, which encompasses the smallest branches of the vascular supply throughout all tissues and organs. Arterioles branch from arteries to form networks that control the distribution and magnitude of oxygenated blood flowing into the multitude of capillaries intimately associated with parenchymal cells. Capillaries provide a large surface area for diffusional exchange between tissue cells and the blood supply. Venules collect capillary effluent and converge as they return deoxygenated blood towards the heart. To observe these processes in real time requires an experimental approach for visualizing and manipulating the living microcirculation.
The cremaster muscle of rats was first used as a model for studying inflammation using histology and electron microscopy post mortem1,2. 
The first in vivo report of the exposed intact rat cremaster muscle investigated microvascular responses to vasoactive drugs using reflected light3. However 
curvature of the muscle and lack of focused illumination limited the usefulness of this preparation. The major breakthrough entailed opening the muscle, 
detaching it from the testicle and spreading it radially as a flat sheet for transillumination under a compound microscope4. While shown to be a valuable 
preparation to study the physiology of the microcirculation in rats5 and hamsters6, the cremaster muscle in mice7 has proven particularly useful in dissecting 
cellular pathways involved in regulating microvascular function8-11 and real-time imaging of intercellular signaling12. 
The cremaster muscle is derived from the internal oblique and transverse abdominus muscles as the testes descend through the inguinal canal13. 
It serves to support (Greek: cremaster = suspender) and maintain temperature of the testes. As described here, the cremaster muscle is prepared as a thin flat sheet 
for outstanding optical resolution. With the mouse maintained at a stable body temperature and plane of anesthesia, surgical preparation involves freeing the muscle 
from surrounding tissue and the testes, spreading it onto transparent pedestal of silastic rubber and securing the edges with insect pins while irrigating it 
continuously with physiological salt solution. The present protocol utilizes transgenic mice expressing GCaMP2 in arteriolar endothelial cells. GCaMP2 is a 
genetically encoded fluorescent calcium indicator molecule12. Widefield imaging and an intensified charge-coupled device camera enable in vivo study of 
calcium signaling in the arteriolar endothelium.

A tissue preparation is described for visualization and experimental manipulation of the living microcirculation. In anesthetized male mice, the thin, highly vascularized cremaster muscle is prepared for intravital microscopy to study microvascular networks including arterioles, capillaries and venules. This preparation is readily adapted for rats and hamsters.

El ratón Cremaster preparación muscular for Imaging intravital de la microcirculación

Throughout the body, the maintenance of homeostasis requires the constant supply of oxygen and nutrients concomitant with removal of metabolic ...

Investigación

Biología

Microiontophoresis and Micromanipulation for Intravital Fluorescence Imaging of the Microcirculation

Microiontophoresis entails passage of current through a micropipette tip to deliver a solute at a designated site within an experimental preparation. Microiontophoresis can simulate synaptic transmission1 by delivering neurotransmitters and neuropeptides onto neurons reproducibly2. Negligible volume (fluid) displacement avoids mechanical disturbance to the experimental preparation. Adapting these techniques to the microcirculation3 has enabled mechanisms of vasodilation and vasoconstriction to be studied at the microscopic level in vivo4,5. A key advantage of such localized delivery is enabling vasomotor responses to be studied at defined sites within a microvascular network without evoking systemic or reflexive changes in blood pressure and tissue blood flow, thereby revealing intrinsic properties of microvessels.
A limitation of microiontophoresis is that the precise concentration of agent delivered to the site of interest is difficult to ascertain6. Nevertheless, its release from the micropipette tip is proportional to the intensity and duration of the ejection current2,7, such that reproducible stimulus-response relationships can be readily determined under defined experimental conditions (described below). Additional factors affecting microiontophoretic delivery include solute concentration and its ionization in solution. The internal diameter of the micropipette tip should be &tilde; 1 &mu;m or less to minimize diffusional 'leak', which can be counteracted with a retaining current. Thus an outward (positive) current is used to eject a cation and a negative current used to retain it within the micropipette.
Fabrication of micropipettes is facilitated with sophisticated electronic pullers8. Micropipettes are pulled from glass capillary tubes containing a filament that 'wicks' solution into the tip of the micropipette when filled from the back end ("backfilled"). This is done by inserting a microcapillary tube connected to a syringe containing the solution of interest and ejecting the solution into the lumen of the micropipette. Micromanipulators enable desired placement of micropipettes within the experimental preparation. Micromanipulators mounted on a movable base can be positioned around the preparation according to the topography of microvascular networks (developed below). 
The present protocol demonstrates microiontophoresis of acetylcholine (ACh+ Cl-) onto an arteriole of the mouse cremaster muscle preparation (See associated protocol: JoVE ID#2874) to produce endothelium-dependent vasodilation. Stimulus delivery is synchronized with digitized image acquisition using an electronic trigger. The use of Cx40BAC-GCaMP2 transgenic mice9 enables visualization of intracellular calcium responses underlying vasodilation in arteriolar endothelial cells in the living microcirculation.

Microiontophoresis entails movement of ions from a micropipette in response to a difference in electrical potential between the inside and outside of the micropipette. Biologically active molecules are thereby delivered in proportion to electrical current. We illustrate acetylcholine microiontophoresis in conjunction with micromanipulation to study endothelium-dependent vasodilation in the microcirculation.

Microiontophoresis y micromanipulación de imagen intravital de fluorescencia de la microcirculación

Microiontophoresis entails passage of current through a micropipette tip to deliver a solute at a designated site within an experimental  preparation. ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

Generación de ratones derivados de células madre pluripotentes inducidas

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective isolation in culture. Recently, using fluorescence-activated cell sorting (FACS), we and other researchers prospectively identified and purified three subpopulations of multipotent precursor cells associated with the vasculature of human skeletal muscle. These three cell populations: myogenic endothelial cells (MECs), pericytes (PCs), and adventitial cells (ACs), are localized respectively to the three structural layers of blood vessels: intima, media, and adventitia. All of these human blood-vessel-derived stem cell (hBVSC) populations not only express classic MSC markers but also possess mesodermal developmental potentials similar to typical MSCs. Previously, MECs, PCs, and ACs have been isolated through distinct protocols and subsequently characterized in separate studies. The current isolation protocol, through modifications to the isolation process and adjustments in the selective cell surface markers, allows us to simultaneously purify all three hBVSC subpopulations by FACS from a single human muscle biopsy. This new method will not only streamline the isolation of multiple BVSC subpopulations but also facilitate future clinical applications of hBVSCs for distinct therapeutic purposes.

Blood vessels within human skeletal muscle harbor several multi-lineage precursor populations that are ideal for regenerative applications. This isolation method allows simultaneous purification of three multipotent precursor cell populations respectively from three structural layers of blood vessels: myogenic endothelial cells from intima, pericytes from media, and adventitial cells from adventitia.

Aislamiento de Vaso sanguíneo derivado Multipotentes Precursores de músculo esquelético humano

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Identification of Key Factors Regulating Self-renewal and Differentiation in EML Hematopoietic Precursor Cells by RNA-sequencing Analysis

Hematopoietic stem cells (HSCs) are used clinically for transplantation treatment to rebuild a patient&#39;s hematopoietic system in many diseases such as leukemia and lymphoma. Elucidating the mechanisms controlling HSCs self-renewal and differentiation is important for application of HSCs for research and clinical uses. However, it is not possible to obtain large quantity of HSCs due to their inability to proliferate in vitro. To overcome this hurdle, we used a mouse bone marrow derived cell line, the EML (Erythroid, Myeloid, and Lymphocytic) cell line, as a model system for this study.
RNA-sequencing (RNA-Seq) has been increasingly used to replace microarray for gene expression studies. We report here a detailed method of using RNA-Seq technology to investigate the potential key factors in regulation of EML cell self-renewal and differentiation. The protocol provided in this paper is divided into three parts. The first part explains how to culture EML cells and separate Lin-CD34+ and Lin-CD34- cells. The second part of the protocol offers detailed procedures for total RNA preparation and the subsequent library construction for high-throughput sequencing. The last part describes the method for RNA-Seq data analysis and explains how to use the data to identify differentially expressed transcription factors between Lin-CD34+ and Lin-CD34- cells. The most significantly differentially expressed transcription factors were identified to be the potential key regulators controlling EML cell self-renewal and differentiation. In the discussion section of this paper, we highlight the key steps for successful performance of this experiment.
In summary, this paper offers a method of using RNA-Seq technology to identify potential regulators of self-renewal and differentiation in EML cells. The key factors identified are subjected to downstream functional analysis in vitro and in vivo.

RNA-sequencing and bioinformatics analyses were used to identify significantly and differentially expressed transcription factors in Lin-CD34+ and Lin-CD34- subpopulations of mouse EMLcells. These transcription factors might play important roles in determining the switch between self-renewing Lin-CD34+ and partially differentiated Lin-CD34- cells.

Identificación de los factores clave que regula la auto-renovación y diferenciación de las células precursoras hematopoyéticas EML por análisis de secuenciación de ARN-

Hematopoietic stem cells (HSCs) are used clinically for transplantation treatment to rebuild a patient&#39;s hematopoietic system in many diseases such as ...

Visualization and Quantification of the Cell-free Layer in Arterioles of the Rat Cremaster Muscle

The cell-free layer is defined as the parietal plasma layer in the microvessel flow, which is devoid of red blood cells. The measurement of the in vivo cell-free layer width and its spatiotemporal variations can provide a comprehensive understanding of hemodynamics in microcirculation. In this study, we used an intravital microscopic system coupled with a high-speed video camera to quantify the cell-free layer widths in arterioles in vivo. The cremaster muscle of Sprague-Dawley rats was surgically exteriorized to visualize the blood flow. A custom-built imaging script was also developed to automate the image processing and analysis of the cell-free layer width. This approach enables the quantification of spatiotemporal variations more consistently than previous manual measurements. The accuracy of the measurement, however, partly depends on the use of a blue filter and the selection of an appropriate thresholding algorithm. Specifically, we evaluated the contrast and quality of images acquired with and without the use of a blue filter. In addition, we compared five different image histogram-based thresholding algorithms (Otsu, minimum, intermode, iterative selection, and fuzzy entropic thresholding) and illustrated the differences in their determination of the cell-free layer width.

This study demonstrates the surgical preparation of the rat cremaster muscle for the visualization of the in vivo cell-free layer. Considerable factors affecting the accuracy of the cell-free layer width measurement are discussed in this study.

La visualización y cuantificación de la Capa libre de células en las arteriolas del músculo cremáster Rata

The cell-free layer is defined as the parietal plasma layer in the microvessel flow, which is devoid of red blood cells. The measurement of the in vivo ...

Analysis of the Gap Junction-dependent Transfer of miRNA with 3D-FRAP Microscopy

Small antisense RNAs, like miRNA and siRNA, play an important role in cellular physiology and pathology and, moreover, can be used as therapeutic agents in the treatment of several diseases. The development of new, innovative strategies for miRNA/siRNA therapy is based on an extensive knowledge of the underlying mechanisms. Recent data suggest that small RNAs are exchanged between cells in a gap junction-dependent manner, thereby inducing gene regulatory effects in the recipient cell. Molecular biological techniques and flow cytometric analysis are commonly used to study the intercellular exchange of miRNA. However, these methods do not provide high temporal resolution, which is necessary when studying the gap junctional flux of molecules. Therefore, to investigate the impact of miRNA/siRNA as intercellular signaling molecules, novel tools are needed that will allow for the analysis of these small RNAs at the cellular level. The present protocol describes the application of three-dimensional fluorescence recovery after photobleaching (3D-FRAP) microscopy to elucidating the gap junction-dependent exchange of miRNA molecules between cardiac cells. Importantly, this straightforward and non-invasive live-cell imaging approach allows for the visualization and quantification of the gap junctional shuttling of fluorescently labeled small RNAs in real time, with high spatio-temporal resolution. The data obtained by 3D-FRAP confirm a novel pathway of intercellular gene regulation, where small RNAs act as signaling molecules within the intercellular network.

Here, we describe the application of three-dimensional fluorescence recovery after photobleaching (3D-FRAP) for the analysis of the gap junction-dependent shuttling of miRNA. In contrast to commonly applied methods, 3D-FRAP allows for the quantification of the intercellular transfer of small RNAs in real time, with high spatio-temporal resolution.

Análisis de la transferencia dependiente de la unión Gap de miARN con 3D-FRAP Microscopía

Small antisense RNAs, like miRNA and siRNA, play an important role in cellular physiology and pathology and, moreover, can be used as therapeutic agents ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to hyperglycemia and severe, life-threatening consequences. Understanding how the beta-cells operate under physiological conditions and what genetic and environmental factors might cause their dysfunction could lead to better treatment options for diabetic patients. The ability to measure calcium levels in beta-cells serves as an important indicator of beta-cell function, as the influx of calcium ions triggers insulin release. Here we describe a protocol for monitoring the glucose-stimulated calcium influx in zebrafish beta-cells by using GCaMP6s, a genetically encoded sensor of calcium. The method allows monitoring the intracellular calcium dynamics with single-cell resolution in ex vivo mounted islets. The glucose-responsiveness of beta-cells within the same islet can be captured simultaneously under different glucose concentrations, which suggests the presence of functional heterogeneity among zebrafish beta-cells. Furthermore, the technique provides high temporal and spatial resolution, which reveals the oscillatory nature of the calcium influx upon glucose stimulation. Our approach opens the doors to use the zebrafish as a model to investigate the contribution of genetic and environmental factors to beta-cell function and dysfunction.

Beta-cell functionality is important for blood-glucose homeostasis, which is evaluated at single-cell resolution using a genetically encoded reporter for calcium influx.

Análisis de la función de célula Beta usando proyección de imagen de resolución sola célula calcio en islotes de pez cebra

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...

Intravital Subcellular Microscopy of the Mammary Gland

The mammary gland constitutes a model par excellence for investigating epithelial functions, including tissue remodeling, cell polarity, and secretory mechanisms. During pregnancy, the gland expands from a primitive ductal tree embedded in a fat pad to a highly branched alveolar network primed for the formation and secretion of colostrum and milk. Post-partum, the gland supplies all the nutrients required for neonatal survival, including membrane-coated lipid droplets (LDs), proteins, carbohydrates, ions, and water. Various milk components, including lactose, casein micelles, and skim-milk proteins, are synthesized within the alveolar cells and secreted from vesicles by exocytosis at the apical surface. LDs are transported from sites of synthesis in the rough endoplasmic reticulum to the cell apex, coated with cellular membranes, and secreted by a unique apocrine mechanism. Other preformed constituents, including antibodies and hormones, are transported from the serosal side of the epithelium into milk by transcytosis. These processes are amenable to intravital microscopy because the mammary gland is a skin gland and, therefore, directly accessible to experimental manipulation. In this paper, a facile procedure is described to investigate the kinetics of LD secretion in situ, in real-time, in live anesthetized mice. Boron-dipyrromethene (BODIPY)665/676&#160;or monodansylpentane are used to label the neutral lipid fraction of transgenic mice, which either express soluble EGFP (enhanced green fluorescent protein) in the cytoplasm, or a membrane-targeted peptide fused to either EGFP or tdTomato. The membrane-tagged fusion proteins serve as markers of cell surfaces, and the lipid dyes resolve LDs &#8805; 0.7 &#181;m. Time-lapse images can be recorded by standard laser scanning confocal microscopy down to a depth of 15-25 &#181;m or by multiphoton microscopy for imaging deeper in the tissue. The mammary gland may be bathed with pharmacological agents or fluorescent dyes throughout the surgery, providing a platform for acute experimental manipulations as required.

<meta charset="utf8"></head><body>Microscopía subcelular intravital de la glándula mamaria

The present protocol describes a facile technique for the intravital imaging of the lactating mouse mammary gland by laser scanning confocal and multiphoton microscopy.

Microscopía subcelular intravital de la glándula mamaria

The mammary gland constitutes a model par excellence for investigating epithelial functions, including tissue remodeling, cell polarity, and secretory ...