这项工作是由美国国立卫生研究院资助R37 AI34867和R01 GM064625为NWA我们感谢R. Twete​​n博士从俄克拉何马大学的SLO表达质粒的支持。

1。 ASM的转录沉默<ol><li>种子1.5×10 5个HeLa细胞于2ml DMEM生长培养基（DMEM高葡萄糖，10％胎牛血清（FBS），2mM的L-谷氨酰胺，1％青霉素-链霉素）在35 mm的玻璃底培养皿（MatTek）和在5％CO2 培养箱孵育过夜，在37℃。 </li><li>在第二天，吸出物离开的生长培养基，并添加siRNA转染混合物之前，用2ml的DMEM低血清培养基（DMEM，用4％FBS）中，至少1小时更换。 </li><li>准备4管的寡核苷酸的siRNA转染混合物。在管A和C，加入250μl的Optimem降低血清和4μL脂质体RNAiMax，每35mm培养皿进行转染。管B中，加入250μl的Optimem减少控制媒介GC含量寡（对照siRNA）血清和8μL（160皮摩尔），每35mm培养皿进行转染。在管D，加入250μl的Optimem减少SMPD1寡（热情）的血清和8μL（160皮摩尔），每35mm培养皿吨Ø转染。孵育所述管在室温下放置5分钟。 </li><li>结合管A和B，形成转染复合物为对照siRNA和管C和D为ASM的siRNA。孵育反应在室温下搅拌20分钟。 </li><li>添加对照siRNA和ASM siRNA转染反应混合物慢慢滴，到各自的35毫米的玻璃底菜和孵化在37℃/ 5％的CO 2。在24小时转染后，轻轻吸去培养基并更换新鲜的DMEM培养基。为了有效ASM击倒，该吃的食物应进一步前实时成像在37℃/ 5％的CO 2约31小时（共55小时）。 </li></ol> 2。试剂现场显微镜的研制<ol><li>在100纳克/微升冷的1X PBS的浓度准备重组的成孔毒素链球菌溶血素为O（SLO）溶液中不含Ca 2 +，Mg 2 +的。在这些测定中所使用的SLO是constitutivelY有功功率半胱氨酸突变体，不需要减少对活性剂，由Rod Twete​​n，奥克拉荷马大学博士惠赠。该毒素在大肠杆菌中表达大肠杆菌 BL21 DE3和天然条件下纯化，如先前描述的16。 </li><li>准备FM1-43原液：在DMSO中重悬FM1-43冻干粉来创建一个25毫米的解决方案。 </li><li>准备溶液A：与Ca 2 +的稀释FM1-43原液在寒冷的DMEM至4微米（需要每MatTek菜1.5ml）中的终浓度，直到需要在冰上保存。 </li><li>制备溶液B：稀释FM1-43储备溶液在冷的DMEM不含Ca 2 +和10mM EGTA（Ca 2 +的无DMEM）中于4微米（每MatTek菜需要1.5ml）中的终浓度，并在冰上储存直至需要的。 </li><li>预温（37°C）1毫升分装解决方案A和方案B的Eppendorf管。 </li><li>不断的DMEM冰解决方案的Ca 2 +和C一个2 +的DMEM。 </li></ol> 3。的FM1-43涌入SLO处理和未处理的细胞活细胞成像<ol><li>填充一个中等大小的浅的金属容器用碎冰，颠倒成冰的大玻璃容器中，并添加额外的冰留下露出的金属容器的唯一的底面。放置在暴露的金属底部湿纸巾以允许均匀的热传递。 </li><li>采取一对照siRNA处理MatTek菜（ 样品1），并将其放置在冰冷的湿纸巾。轻轻吸了所有媒体，并与冷的Ca 2 +的DMEM洗3次。最后一次洗涤后，吸过的菜所有媒体。 </li><li>对细胞图像进行相关的FM1-43细胞中没有SLO伤人（ 样品1）中的Ca 2 +的存在，加入180微升冰冷溶液B到35毫米的玻璃底培养皿的中心玻璃盖玻片，静置5分钟在冰上（ 表1）。 </li&gt; <li>放置MatTek盘上的共焦显微镜下加 ​​热至37℃，并配有环境室（即保持温度，湿度和CO 2水平）的阶段。发现细胞将成像期待通过40X 1.3 NA物镜（尼康）的领域。如果有的话，打开PerfectFocus或类似装置，以校正热漂移。 </li><li>加入1毫升预热的解决方案A轻轻的35毫米的菜一边，更换环境室（ 表1）的封面。 </li><li> （中的Ultraview Vox的珀金埃尔默旋转盘共聚焦显微系统Volocity）采用适当的图像处理软件在一帧图像采集4分钟，每3秒。 FM1-43的激励是通过使用二向色滤光片的488nm的带通488nm的激光线，并且发射鉴别是通过使用一个527（W55）发射滤波器的实现。激光功率水平和相机感光度设置达到100毫秒的形象曝光。 </li><li>重复步骤3.2至3.6，以检测FM1-43的对照siRNA处理的细胞与无SLO伤人（ 样品2）在不存在的Ca 2 +的，不同之处在于，在步骤3.5 B液应加入（ 表1）。 </li><li>测量FM1-43流入对照siRNA处理的细胞与SLO受伤或者在存在（ 样品3）或不存在的Ca 2 +的（ 样品4）中，添加180微升冰冷溶液B含有SLO到的中心玻璃盖玻片35毫米的玻璃底菜和孵化5分钟，冰如步骤3.3。重复步骤3.2至3.6;调整加入溶液A或溶液B在步骤3.5（ 表1）。 </li><li>来确定ASM在质膜修复中的作用，重复使用ASM siRNA处理的细胞中的所有条件下（ 样品5-8）（表1）步骤3.2-3.6。 </li><li>为了确定细胞外重组鞘磷脂（SM）上的作用细胞膜修复动力学（由抑制在FM1-43潮反映）（ 样品9-10），SM加（0-50μU）到溶液A或溶液B在步骤3.5，然后在活细胞加入细胞成像在1毫升（ 表1）的总体积。 </li></ol> 4。的FM1-43定量潮进入细胞<ol><li>电影已被收购后，使用图像分析软件（Volocity套房，珀金埃尔默）测量FM1-43的细胞内荧光强度。绘制的感兴趣区域中的字段中的每个小区的胞质区域和应用的软件工具，以确定在整个视频的所有帧的均值FM1-43的荧光强度。 </li><li>来调整变化的初始FM1-43染色，对于每个视频数据被表示为在一段时间内荧光强度倍的增加，并绘制为每个不同的条件。折叠增加每各个时间点的荧光细胞被计算为：F T / F 0，其中F T是平均荧光在特定的时间点，和F 0是平均荧光在t = 0（ 图1-2）。 </li></ol>

<ol>
	<li>Heilbrunn, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The dynamics of living protoplasm. , (1956).</li><li>Chambers, R., Chambers, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Explorations into the nature of the living cell. , (1961).</li><li>Bi, G. Q., Alderton, J. M., Steinhardt, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-regulated+exocytosis+is+required+for+cell+membrane+resealing.">Calcium-regulated exocytosis is required for cell membrane resealing.</a> J. Cell Biol. 131, 1747-1758 (1995).</li><li>Miyake, K., McNeil, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle+accumulation+and+exocytosis+at+sites+of+plasma+membrane+disruption.">Vesicle accumulation and exocytosis at sites of plasma membrane disruption.</a> J. Cell Biol. 131, 1737-1745 (1995).</li><li>Steinhardt, R. A., Guoqiang, B., Alderton, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+membrane+resealing+by+a+vesicular+mechanism+similar+to+neurotransmitter+release.">Cell membrane resealing by a vesicular mechanism similar to neurotransmitter release.</a> Science. 263, 390-393 (1994).</li><li>McNeil, P. L., Vogel, S. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proximal+lysosomes+are+the+major+vesicles+responsible+for+calcium-dependent+exocytosis+in+nonsecretory+cells.">Membrane proximal lysosomes are the major vesicles responsible for calcium-dependent exocytosis in nonsecretory cells.</a> J. Cell Biol. 159, 625-635 (2002).</li><li>Chakrabarti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+membrane+resealing+and+autoimmune+myositis+in+synaptotagmin+VII-deficient+mice.">Impaired membrane resealing and autoimmune myositis in synaptotagmin VII-deficient mice.</a> J. Cell Biol. 162, 543-549 (2003).</li><li>Walev, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+proteins+into+living+cells+by+reversible+membrane+permeabilization+with+streptolysin-O.">Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 3185-3190 (2001).</li><li>Iacovache, I., van der Goot, F. G., Pernot, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pore+formation:+an+ancient+yet+complex+form+of+attack.">Pore formation: an ancient yet complex form of attack.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1778, 1611-1623 (2008).</li><li>Morgan, B. P., Campbell, A. 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U.S.A. 100, 4592-4597 (2003).</li><li>Tam, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exocytosis+of+acid+sphingomyelinase+by+wounded+cells+promotes+endocytosis+and+plasma+membrane+repair.">Exocytosis of acid sphingomyelinase by wounded cells promotes endocytosis and plasma membrane repair.</a> J. Cell Biol. 189, 1027-1038 (2010).</li><li>Weisleder, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+MG53-mediated+cell+membrane+repair+using+in+vivo+and+in+vitro+systems.">Visualization of MG53-mediated cell membrane repair using in vivo and in vitro systems.</a> J. Vis. Exp. (52), e2717 (2011).</li><li>Tweten, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol-dependent+cytolysins,+a+family+of+versatile+pore-forming+toxins.">Cholesterol-dependent cytolysins, a family of versatile pore-forming toxins.</a> Infect. Immun. 73, 6199-6209 (2005).</li><li>Zha, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingomyelinase+treatment+induces+ATP-independent+endocytosis.">Sphingomyelinase treatment induces ATP-independent endocytosis.</a> J. Cell Biol. 140, 39-47 (1998).</li><li>Buckley, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crossing+three+membranes.+Channel+formation+by+aerolysin.">Crossing three membranes. Channel formation by aerolysin.</a> FEBS Lett. 307, 30-33 (1992).</li><li>Parker, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Aeromonas+toxin+proaerolysin+in+its+water-soluble+and+membrane-channel+states.">Structure of the Aeromonas toxin proaerolysin in its water-soluble and membrane-channel states.</a> Nature. 367, 292-295 .</li><li>Yamaji-Hasegawa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomerization+and+pore+formation+of+a+sphingomyelin-specific+toxin,+lysenin.">Oligomerization and pore formation of a sphingomyelin-specific toxin, lysenin.</a> J. Biol. Chem. 278, 22762-22770 (2003).</li></ol>

作者宣称他们没有竞争的经济利益。

机械损伤和细胞膜修复早期的研究依赖于细胞损伤的机制多种多样，从掉落的玻璃珠，micropipetting，剪切，划伤或者刮伤。所有这些测定的读数是定性而非定量的，并没有给于修复机制的动力学精确的信息。细胞的这些形式的损伤之后重新密封其质膜的能力被加入到在细胞质中，渗透膜不透染料，细胞内的酶，ATP水平，或长期的损失外液示踪物的存在或不存在下测定细胞存活。虽然几个这些测定?...

人们已经知道了几十年了机械性损伤后质膜修复是的Ca 2 +依赖性过程1,2。后来的研究表明，通过伤口的Ca 2 +内流触发细胞内囊泡的胞吐一场轰轰烈烈的过程在损伤部位，这是需要重新密封3,4。加载到细胞的细胞质中的荧光染料的损失率被用来评估修复的速度，并得出结论，被重新密封于&lt;30秒5伤后完成。两款车型最初提出来解释在质膜修为胞吐作用的要求：1）“补丁”的模式，这表明，Ca 2 +的内流，通过病灶触发细胞内囊泡最初同型融合，形成了一个庞大的“补丁”，将然后可以应用到质膜重新密封伤口6和2）的张力减小模型，其中提出，膜ADDEð通过在伤口附近的Ca 2 +依赖性胞吐作用将降低细胞膜张力，促进双层7的重新密封。 钙在细胞膜修复+触发胞吐作用通过研究表明，溶酶体含有Ca 2 +的传感器分子，突触七，这有利于它们的胞外分泌和质膜修复受损细胞，进一步加强8,9,10,11 。 然而，更多的证据表明，单纯胞吐作用不足以促进细胞膜修复。除了 ​​在质膜上的机械眼泪，细胞损伤的常见形式是透由细菌12,13或免疫细胞14,15产生的成孔毒素。不像机械眼泪，成孔蛋白插入本身对质膜形成稳定，蛋白质内衬的孔隙无法通过应用膜“补丁”或由红眼简单地重新密封ING膜的张力。有趣的是，研究发现，哺乳动物细胞具有与透孔形成蛋白后，以修理其质膜一个有效的机制，而这个过程也需要胞外Ca 2 +的12的存在。这一发现提出了从细胞表面跨膜孔隙去除是否也是一个快速的过程的问题，作为具有机械伤口5观察到。出人意料的是，我们最近的研究表明，细胞透化与成孔毒素的再密封具有非常相似的性质，以机械创伤的修复：这个过程需要细胞外Ca 2 +的，并且在约30秒完成。更详细地调查这个过程中，我们最近了解到，除了Ca 2 +的调节溶酶体的胞吐，质膜修复涉及内吞作用的快速形式，它是由溶酶体的释放引发酶的酸性鞘磷脂酶（ASM），是必需的不仅为日ë去除跨膜孔的，而且对机械创伤16的维修。 为了确定通透与成孔蛋白后细胞再密封的动力学，在我们的实验室，我们改编以前已经用于评估激光隔离受伤的肌肉纤维17的重新密封的实时成像方法。该测定依赖于亲脂性染料FM1-43，它稳定地可嵌入到脂质双层中的荧光强度增加的外小叶的属性。当细胞膜双分子层被破坏的细胞外染料得以进入细胞内的膜，提供了一个敏感的检测，以检测细胞膜损伤和修复18,16,19,20。要通透与成孔蛋白后细胞再密封的评估适应这个实验中，我们预孵育细胞在4℃与细菌毒素链球菌溶血素为O（SLO），其中结合细胞膜胆固醇21。同步单元透然后可以通过移动从冰细胞温热介质中加热的显微镜载物台，其激活低聚和变化中的构象，导致跨膜孔形成很容易地实现。这种方法的一个优点，通过使用激光伤人先前公布的测定中，是细胞中的更大的数目可以在一个显微镜视野同时进行分析，提供上述细胞群的较好采样。给定的机械损伤和透化与成孔毒素后见到的细胞重新密封过程之间的机械的相似性，我们在这里描述的测定法提供了解剖参与质膜修复的基本过程的因素非常灵活和强大的方法。作为一个例子，我们表明，它有可能使用该测定，以确定在修复过程中的Ca 2 +依赖性和独立的步骤。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagent</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>HeLa 229 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL2-1</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM High Glucose </td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11965</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM High Glucose No Calcium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>20168</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>FM1-43</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T3163</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Optimem Reduced Serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMax</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13778</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Control medium GC content RNAi oligo</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12935300</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>SMPD1 RNAi oligo</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>HSS143988</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fetal Bovine Serum Heat-inactivated</td>
			<td>Gemini-Bioproducts</td>
			<td>100-106</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sphingomyelinase from Bacillus cereus</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7651</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>35 mm-glass bottom dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-0-14</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Material</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td>C9100-50</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Spinning disk confocal microscope</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>UltraViewVoX</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Software analysis software</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>Volocity Suite</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Environmental chamber</td>
			<td>Pathology Devices</td>
			<td>LiveCell System Chamber</td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

live imaging assay for assessing the roles of ca2+ and sphingomyelinase in the repair of pore-forming toxin wounds

细胞膜损伤是一种常见的事件，伤口必须迅速修复，以确保细胞存活。的Ca 2 +的内流，触发机械创伤的修复上内〜30秒质膜中的关键信号传导事件。最近的研究表明，与透孔形成在一个的Ca 2 +依赖性的过程，涉及溶酶体酶酸性鞘磷脂酶随后孔隙的内吞作用的胞外分泌的毒素后的哺乳动物细胞也重新密封的质膜。在这里，我们描述了用于证明细胞毒素链球菌溶血素Ô透的再密封也是快速和依赖的Ca 2 +内流的方法。该法的设计允许伤害事件的同步和细胞的成像，恢复细胞膜的完整性，并通过量化其liphophilic染料FM1-43达到细胞内膜的程度的能力的精确动力学测量。这活法阿尔斯O允许的外源能力的评估敏感添加可溶性因子如鞘磷脂酶抑制FM1-43大量涌入，反映细胞的修复他们的质膜的能力。该测定法允许我们表明：第一次，鞘磷脂酶的作用的Ca 2 +的依赖性胞吐作用的下游，由于胞外加入酶促进细胞透化在不存在的Ca 2 +的再密封。

低浓度的细菌鞘磷脂（SM）的救援细胞膜修复细胞贫溶酶体酸性鞘磷脂酶。 用FM1-43的成像方法，我们以前表明，细胞缺乏的溶酶体酶ASM和暴露于SLO伤人中的Ca 2 +的存在下具有质膜缺陷是由细胞外加入的重组人酶19的获救。由于人溶酶体ASM具有低的pH最佳值，我们研究是否重新密封也可以恢复增加的SM从蜡状芽孢杆菌 （Sigma公司），它是在中性pH下完全有活性...

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Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

细胞暴露于所述亲脂性染料FM1-43的实时成像可以精确测定由该成孔毒素从质膜除去动力学。这是一个敏感的测定法可以用于评估要求的Ca 2 +，鞘磷脂和其它因素对质膜修复。

实时成像检测方法的评估钙的作用<sup&gt; 2 +</sup&gt;和鞘磷脂酶在成孔毒素伤口的修复

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event ...

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Biology

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

11.6K 次观看.  University of Maryland. 细胞暴露于所述亲脂性染料FM1-43的实时成像可以精确测定由该成孔毒素从质膜除去动力学。这是一个敏感的测定法可以用于评估要求的Ca 2 +，鞘磷脂和其它因素对质膜修复。 