Bu çalışma Biz SLO ifade plazmid için Oklahoma Üniversitesi&#39;nden Dr R. Tweten teşekkür NWA NIH hibe R37 ve R01 AI34867 GM064625 tarafından desteklenmiştir.

1.. ASM Transkripsiyonal suskunluğu <ol><li> Tohum 1.5 x 10 DMEM büyüme ortamı içinde 2 ml 5 HeLa hücreleri, 35 mm &#39;lik cam taban yemekler (MatTek) (DMEM yüksek,% 10 fetal sığır serumu (FBS), 2 mM L-glutamin,% 1 Penn-Strep ile glikoz) ve % 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C&#39;de gece boyunca inkübe edilir. </li><li> Ertesi gün, büyüme ortamı aspire ve siRNA transfeksiyon karışımı ilave edilmeden önce 2 ml DMEM düşük serum ortamında (% 4 FBS DMEM), en az 1 saat ile değiştirin. </li><li> SiRNA oligo transfeksiyon karışımı boyunca 4 tüpleri hazırlayın. Tüpler A ve C olarak, transfekte edilecek 35 mm tabak başına 250 ul Optimem indirgenmiş serumu ve 4 ul Lipofektamin RNAiMax ekleyin. Tüp B içinde, Optimem 250 ul transfekte edilecek 35 mm tabak başına, kontrol ortamı GC içeriği oligo (Kontrol siRNA) ve serum ve 8 ul (160 pmol), indirgenmiş ekleyin. Tüp D eklemek Optimem 250 ul 35 mm çanak t başına SMPD1 oligo (siASM) ait serum ve 8 ul (160 pmol) azaldıo transfekte edilebilir. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Transfeksiyon için kontrol siRNA kompleksi ve ASM siRNA tüpler C ve D tüpleri oluşturulması için A ve B bir araya getirin. 20 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe reaksiyonları. </li><li> Ilgili 35 mm cam alt yemekleri içine Kontrol siRNA ve ASM siRNA transfeksiyon reaksiyon yavaş yavaş karışımlarını, damla damla ekleyin ve 37 ° C /% 5 CO 2 inkübe. 24 saat sonrası transfeksiyon, hafifçe medya aspire ve taze DMEM büyüme medya ile değiştirin. Verimli ASM demonte için, yemekleri daha canlı görüntüleme önce yaklaşık 31 saat (toplam 55 saat) için 37 ° C /% 5 CO 2 inkübe edilmelidir. </li></ol> 2. Canlı Mikroskopi Ayıraçların hazırlanması <ol><li> Ca 2 + ve Mg2 + olmaksızın soğuk 1 x PBS içinde 100 ng / ul &#39;lik bir konsantrasyonda yeniden birleştirici gözenek oluşturucu toksin streptolizin O (SLO) içinde bir çözeltisi hazırlandı. Bu deneylerde kullanılan SLO bir constitutivel olduğukibarca Dr Rod Tweten, Oklahoma Üniversitesi tarafından sunulan aktivitesi için indirgeme maddeleri gerektirmeyen y aktif sistein mutant. Toksin E&#39;de ifade edildi E. coli BL21 DE3 ve daha önce tarif edildiği gibi 16, yerel koşullar altında arıtıldı. </li><li> FM1-43 stok solüsyonu hazırlayın: DMSO içinde süspanse FM1-43 liyofilize toz 25 mM çözüm oluşturmak için. </li><li> Çözelti A hazırlayın: 4 uM (1.5 mi MatTek tabak başına gerekli olan) bir son konsantrasyona kadar Ca 2 + soğuk DMEM FM1-43 stok çözeltisi seyreltilir ve gerektiği kadar buz üzerinde depolanır. </li><li> Çözelti B hazırlayın: 4 uM (MatTek tabak başına gerekli 1.5 mi) bir son konsantrasyona kadar Ca 2 + ve 10 mM EGTA (Ca 2 + içermeyen DMEM) olmadan soğuk DMEM FM1-43 stok çözelti sulandırarak kadar buz üzerinde saklamak gerekli. </li><li> Pre-ılık (37 ° C) Eppendorf tüpleri içinde çözüm A ve Çözelti B&#39;nin 1 ml&#39;lik eş payları. </li><li> Ca 2 + ve C ile DMEM buz çözümler tutun2 + içermeyen DMEM. </li></ol> 3. FM1-43 Tedavi SLO içine Akın ve Tedavi edilmeyen Hücreler Canlı Hücre Görüntüleme <ol><li> , Buz parçaları ile orta boy bir sığ metal kap doldurun buz ile büyük bir cam kap içine ters çevirin ve maruz kalan metal kabın, sadece alt yüzeyini terk ilave buz ilave edin. Hatta termal transfer izin vermek için açıkta kalan metal alt ıslak kağıt havlu yerleştirin. </li><li> Bir kontrol siRNA tedavi MatTek çanak (Numune 1) alın ve soğuk ıslak kağıt havlu yerleştirin. Yavaşça tüm medya aspire ve soğuk Ca 2 + ücretsiz DMEM ile 3x yıkayın. Son yıkamadan sonra, çanak tüm medya aspire. </li><li> To görüntü hücreye birleşik FM1-43 no SLO yaralama Ca 2 mevcudiyetinde (Örnek 1) ile hücrelerde +, 35 mm &#39;lik cam taban çanak merkez cam lamel soğuk Çözelti B&#39;nin 180 ul ekleyin ve 5 için inkübe dakika buz üzerinde (Tablo 1). </li&gt; <li> 37 ° C&#39;ye kadar ısıtıldı ve (sıcaklık, nem ve CO2 seviyeleri muhafaza) bir çevre bölmesi ile donatılmış bir konfokal mikroskop sahnede MatTek çanak yerleştirin. 40X NA 1.3 objektif (Nikon) bakarak görüntülenmiş olacak hücre alanını bulun. Varsa, termal sürüklenme düzeltmek için PerfectFocus veya benzer bir cihaz üzerinde açın. </li><li> Yavaşça 35 mm&#39;lik çanak tarafına önceden ısıtılmış Çözüm A 1 ml ilave edilir ve çevre odası (Tablo 1) ve kapağı yerine takın. </li><li> (Ultraview Vox Perkin Elmer dönen disk konfokal mikroskopi sisteminde Volocity) uygun görüntüleme yazılımı kullanarak her 3 saniyede 1 kare 4 dakika boyunca görüntü kazanır. FM1-43 Eksitasyon 488 nm bant geçişi ile, bir dikroik filtre kullanılarak bir 488 nm lazer hattı ile gerçekleştirilir ve emisyon ayrımcılık 527 (W55) emisyon filtre kullanımı yoluyla elde edilir. Lazer güç seviyeleri ve kamera duyarlılık 100 milisaniye görüntü pozlama elde etmek için ayarlanır. </li><li> Tekrar 3,2-3,6 bu adım 3,5 Solution B (Tablo 1) ilave edilmelidir dışında, Ca 2 + yokluğunda hiçbir SLO yaralama (Numune 2) ile kontrol siRNA ile muamele edilmiş hücrelerde FM1-43 tespit için yineleyin. </li><li> Mevcudiyetinde (Örnek 3) veya Ca 2 + yokluğu (Örnek 4), merkez cam lamel SLO ihtiva eden soğuk Çözelti B&#39;nin 180 ul ekle ya SLO yaralandı kontrol siRNA ile muamele edilmiş hücrelere FM1-43 akını ölçmek 35 mm&#39;lik cam alt çanak ve aşama 3.3 &#39;de olduğu gibi, buz üzerinde 5 dakika boyunca inkübe edin. Tekrar 3.6 ile 3.2 adım, basamak 3,5 (Tablo 1) Çözüm A veya B Çözüm ya ekleyerek ayarlayın. </li><li> Plazma zarı tamir ASM rolünü belirlemek için, tekrar tüm koşullar (Örnekler 5-8) (Tablo 1) ASM siRNA&#39;nın muamele hücreleri kullanılarak 3,2-3,6 adımları. </li><li> Üzerinde dışı rekombinant sfingomiyelinaz (SM) rolünü belirlemek için(FM1-43 akını inhibisyonu ile gösterilmiştir), plazma membran onarım kinetiği (Örnekler 9-10), SM ilave aşama 3,5 (0-50 μU) için çözelti A ya da B solüsyonu ve daha sonra canlı hücre sırasında hücrelere ilave edilir 1 ml (Tablo 1) bir toplam hacim içinde görüntüleme. </li></ol> 4. Hücreler içine FM1-43 Akın miktar tayini <ol><li> Filmler elde edilmiştir sonra, görüntü analiz yazılımı (Volocity Suite, PerkinElmer) kullanılarak FM1-43 hücre içi floresan yoğunluğunu ölçmek. Alanında her hücrenin sitozolik bölgede ilgi bir bölgeye çekmek ve video tüm çerçeveler boyunca ortalama FM1-43 floresan yoğunluğunu belirlemek için yazılım araçları geçerlidir. </li><li> Başlangıç ​​FM1-43 boyama farklılaşmaların ayarlamak için, her bir görüntü için veri zaman, flüoresan yoğunluğundaki kat artış olarak ifade edilir ve her biri farklı bir durum için grafiğe geçirilmiştir. Her bir zaman noktasında her bir bölgesinin floresansta kat artışF T hücre spesifik bir zaman noktasında ortalama floresan olan T F / F 0 olarak hesaplanan, F ve 0, t = 0 (Şekiller 1-2) de ortalama floresan olmasıdır. </li></ol>

<ol>
	<li>Heilbrunn, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The dynamics of living protoplasm. , (1956).</li><li>Chambers, R., Chambers, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Explorations into the nature of the living cell. , (1961).</li><li>Bi, G. Q., Alderton, J. M., Steinhardt, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-regulated+exocytosis+is+required+for+cell+membrane+resealing.">Calcium-regulated exocytosis is required for cell membrane resealing.</a> J. Cell Biol. 131, 1747-1758 (1995).</li><li>Miyake, K., McNeil, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle+accumulation+and+exocytosis+at+sites+of+plasma+membrane+disruption.">Vesicle accumulation and exocytosis at sites of plasma membrane disruption.</a> J. Cell Biol. 131, 1737-1745 (1995).</li><li>Steinhardt, R. A., Guoqiang, B., Alderton, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+membrane+resealing+by+a+vesicular+mechanism+similar+to+neurotransmitter+release.">Cell membrane resealing by a vesicular mechanism similar to neurotransmitter release.</a> Science. 263, 390-393 (1994).</li><li>McNeil, P. L., Vogel, S. S., Miyake, K., Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patching+plasma+membrane+disruptions+with+cytoplasmic+membrane.">Patching plasma membrane disruptions with cytoplasmic membrane.</a> J. Cell Sci. 113, 1891-1902 (2000).</li><li>Togo, T., Alderton, J. M., Bi, G. Q., Steinhardt, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+facilitated+cell+membrane+resealing.">The mechanism of facilitated cell membrane resealing.</a> J. Cell Sci. 112, 719-731 (1999).</li><li>Rodriguez, A., Webster, P., Ortego, J., Andrews, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosomes+behave+as+Ca2+-regulated+exocytic+vesicles+in+fibroblasts+and+epithelial+cells.">Lysosomes behave as Ca2+-regulated exocytic vesicles in fibroblasts and epithelial cells.</a> J. Cell Biol. 137, 93-104 (1997).</li><li>Reddy, A., Caler, E., Andrews, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+repair+is+mediated+by+Ca2+-regulated+exocytosis+of+lysosomes.">Plasma membrane repair is mediated by Ca2+-regulated exocytosis of lysosomes.</a> Cell. 106, 157-169 (2001).</li><li>Jaiswal, J. K., Andrews, N. W., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proximal+lysosomes+are+the+major+vesicles+responsible+for+calcium-dependent+exocytosis+in+nonsecretory+cells.">Membrane proximal lysosomes are the major vesicles responsible for calcium-dependent exocytosis in nonsecretory cells.</a> J. Cell Biol. 159, 625-635 (2002).</li><li>Chakrabarti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+membrane+resealing+and+autoimmune+myositis+in+synaptotagmin+VII-deficient+mice.">Impaired membrane resealing and autoimmune myositis in synaptotagmin VII-deficient mice.</a> J. Cell Biol. 162, 543-549 (2003).</li><li>Walev, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+proteins+into+living+cells+by+reversible+membrane+permeabilization+with+streptolysin-O.">Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 3185-3190 (2001).</li><li>Iacovache, I., van der Goot, F. G., Pernot, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pore+formation:+an+ancient+yet+complex+form+of+attack.">Pore formation: an ancient yet complex form of attack.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1778, 1611-1623 (2008).</li><li>Morgan, B. P., Campbell, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+recovery+of+human+polymorphonuclear+leucocytes+from+sublytic+complement+attack+is+mediated+by+changes+in+intracellular+free+calcium.">The recovery of human polymorphonuclear leucocytes from sublytic complement attack is mediated by changes in intracellular free calcium.</a> Biochem. J. 231, 205-208 (1985).</li><li>Keefe, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perforin+triggers+a+plasma+membrane-repair+response+that+facilitates+CTL+induction+of+apoptosis.">Perforin triggers a plasma membrane-repair response that facilitates CTL induction of apoptosis.</a> Immunity. 23, 249-262 (2005).</li><li>Idone, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repair+of+injured+plasma+membrane+by+rapid+Ca2+-dependent+endocytosis.">Repair of injured plasma membrane by rapid Ca2+-dependent endocytosis.</a> J. Cell Biol. 180, 905-914 (2008).</li><li>Bansal, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+membrane+repair+in+dysferlin-deficient+muscular+dystrophy.">Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy.</a> Nature. 423, 168-172 (2003).</li><li>McNeil, P. L., Miyake, K., Vogel, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endomembrane+requirement+for+cell+surface+repair.">The endomembrane requirement for cell surface repair.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 4592-4597 (2003).</li><li>Tam, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exocytosis+of+acid+sphingomyelinase+by+wounded+cells+promotes+endocytosis+and+plasma+membrane+repair.">Exocytosis of acid sphingomyelinase by wounded cells promotes endocytosis and plasma membrane repair.</a> J. Cell Biol. 189, 1027-1038 (2010).</li><li>Weisleder, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+MG53-mediated+cell+membrane+repair+using+in+vivo+and+in+vitro+systems.">Visualization of MG53-mediated cell membrane repair using in vivo and in vitro systems.</a> J. Vis. Exp. (52), e2717 (2011).</li><li>Tweten, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol-dependent+cytolysins,+a+family+of+versatile+pore-forming+toxins.">Cholesterol-dependent cytolysins, a family of versatile pore-forming toxins.</a> Infect. Immun. 73, 6199-6209 (2005).</li><li>Zha, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingomyelinase+treatment+induces+ATP-independent+endocytosis.">Sphingomyelinase treatment induces ATP-independent endocytosis.</a> J. Cell Biol. 140, 39-47 (1998).</li><li>Buckley, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crossing+three+membranes.+Channel+formation+by+aerolysin.">Crossing three membranes. Channel formation by aerolysin.</a> FEBS Lett. 307, 30-33 (1992).</li><li>Parker, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Aeromonas+toxin+proaerolysin+in+its+water-soluble+and+membrane-channel+states.">Structure of the Aeromonas toxin proaerolysin in its water-soluble and membrane-channel states.</a> Nature. 367, 292-295 .</li><li>Yamaji-Hasegawa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomerization+and+pore+formation+of+a+sphingomyelin-specific+toxin,+lysenin.">Oligomerization and pore formation of a sphingomyelin-specific toxin, lysenin.</a> J. Biol. Chem. 278, 22762-22770 (2003).</li></ol>

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarları var beyan.

Mekanik yaralanma ve plazma zarı onarımı ile ilgili önceki çalışmalar, cam boncuklar, micropipetting, kesme, tırmalama ya da kazıma bırakarak kadar, yaralama hücrelerin çeşitli mekanizmaları dayanıyordu. Tüm bu testlerin saati yerine nicel daha nitel olduğunu ve tamir mekanizması kinetikleri üzerinde kesin bir bilgi vermemiştir. Yaralanma bu formları sonra plazma zarı mühürlemek için hücrelerin yeteneği membran geçirgen olmayan boyalar, sitosolik enzim, ATP seviyeleri, ya da uzun vadede kayb?...

Bu mekanik yaralanma sonrası plazma zarı tamir bir Ca2 +-bağımlı bir işlem 1,2 olduğu yıllardır bilinmektedir. Daha sonraki çalışmalarda yara yoluyla Ca 2 + 3,4 akışı yeniden kapatılması için gerekli olan yaralanma yerinde okuyun, hücre içi veziküller ekzositozu bir güçlü işlemi tetikler gösterdi. Hücrelerin sitoplazması içine yüklenmiş bir floresan boya kaybı oranı tamir hızını değerlendirmek için kullanılır, ve yeniden mühürleme yaralanma sonrası 5 &lt;30 sn içinde tamamlanmıştır sonucuna varılmıştır. İki model başlangıçta plazma zarı tamir ekzositozu için gereksinimi açıklamak için önerilmiştir: lezyonu boyunca Ca 2 + akını geniş bir &quot;yama&quot; oluşturan, hücre içi veziküllerin başlangıçta homotipik füzyon tetikler önerdi 1) &quot;yama&quot; modeli, bu olur daha sonra yara 6 ve zar adde önerilen 2) gerilim azaltma modeli tekrar kapatılması için, plazma zarına uygulanmasıyaranın çevresinde Ca 2 +-bağımlı Ekzositoz tarafından d çift-katlı 7 doğru bağlantı kolaylaştıran, plazma zarı gerilimi azaltacaktır. Plazma membranı tamir Ca 2 + tetiklenen Ekzositoz rolü ayrıca lizozomlar yaralı hücrelerindeki eksositosizini ve plazma membranı onarım kolaylaştıran bir Ca 2 + sensor molekülü, synaptotagmin VII, içerdiğini gösteren çalışmalar ile takviye edilmiş 8,9,10,11 . Ancak, ek delil yalnız ekzositozu plazma zarı tamir teşvik için yeterli olmadığını belirtti. Plazma membranı üzerinde mekanik gözyaşı ek olarak, hücre hasarı sık rastlanan bir şekilde bakteri 12,13 veya 14,15 bağışıklık hücreleri tarafından üretilen gözenek oluşturucu toksinler tarafından permeabilizasyon olduğunu. Mekanik gözyaşı farklı olarak, gözenek oluşturucu proteinler, plazma membranı, bir membran &quot;yama&quot; uygulanarak veya reduc basitçe kapatılmalı edilemez bir kararlı, protein kaplı gözenek oluşturucu kendilerini eklemekmembran gerilimi ing. İlgi çekici çalışmalar memeli hücreleri gözenek oluşturucu proteinler ile geçirgenleştirmeden sonra plazma membran onarım için etkili bir mekanizma var, bu işlem, aynı zamanda, hücre dışı Ca2 +, 12 mevcudiyetini gerektirdiğini gösterdi. Mekanik yaralar 5 ile gözlemlediği gibi, bu bulgu, hücre yüzeyinde zar gözenek kaldırılması da hızlı bir süreç olup olmadığı sorusunu gündeme. Işlem Ca 2 + hücre dışı gerektirir ve ~ 30 saniye içinde tamamlanır: Şaşırtıcı bir şekilde, bizim son çalışmalar, gözenek oluşturucu toksinlerle permeabilize hücrelerin tekrar kapatılmasına mekanik deliklerinin onarımında çok benzer özelliklere sahip olduğunu ortaya koydu. Daha ayrıntılı olarak, bu işlem incelenmesi, son zamanlarda lizozomların Ca2 + ile düzenlenen Ekzositoz ek olarak, plazma zarı tamir asit sfingomiyelinaz (ASM), lisosomal enzim salınması tarafından tetiklenen ve esastır endositoz hızlı bir form içerir öğrendik sadece thzar gözeneklerinin e çıkarılması değil, aynı zamanda mekanik yaralar 16 tamiri için. Gözenek oluşturucu proteinler ile geçirgenleştirmeden sonra hücre yeniden birleştirilmesine kinetiklerini belirlemek için laboratuarımızda biz lazer yaralı izole kas liflerinin 17 doğru bağlantı değerlendirmek için daha önce kullanılmış olan bir canlı görüntüleme yöntemi uyarlanmıştır. Bu deney, stabil şekilde floresan yoğunluğunda artan lipid iki katmanlı dış sayfada içine intercalates lipofilik boya FM1-43, özelliklerine dayanır. Plazma membranı iki tabakalı plazma zarı hasarı tespit etmek ve 18,16,19,20 onarmak için hassas bir tahlil sağlayarak, hücre içi membranlara hücre dışı boya erişir bozulduğu zaman. Gözenek oluşturucu proteinler ile geçirgenleştirmeden sonra hücre yeniden birleştirilmesine değerlendirilmesi için bu tahlil uyarlamak için, membran kolesterolünün 21 bağlanan bakteriyel toksin streptolizin O (SLO) ile 4 ° C&#39;de hücreler önceden inkübe edilmiştir. Senkron hücrepermeabilizasyon sonra kolayca gözenek oluşumuna neden transmembran konformasyonda oligomerizasyonu ve değişim aktive ısıtılmış bir mikroskop aşamasında, orta ısınmaya buz hücreleri hareket ile elde edilebilir. Bu yaklaşımın bir avantajı, lazer yaralama ile daha önce yayınlanmış çalışmalar boyunca, daha büyük bir hücre sayısı, hücre popülasyonunun daha iyi örnekleme sağlayan, mikroskobik alan eş zamanlı olarak analiz edilebilir olmasıdır. Gözenek oluşturucu toksinler ile mekanik yaralanma ve geçirgenleştirmeden sonra görülen hücre mühürleme işlemi arasındaki mekanik benzerlikler göz önüne alındığında, biz burada açıklamak tahlil plazma zarı onarım temel sürecine dahil faktörleri diseksiyon için çok yönlü ve güçlü bir yöntem sağlar. Bir örnek olarak, bu onarım sürecinin Ca 2 + bağımlı ve bağımsız adımları belirlemek için bu tahlil kullanmak mümkün olduğunu göstermektedir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagent</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>HeLa 229 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL2-1</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM High Glucose </td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11965</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM High Glucose No Calcium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>20168</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>FM1-43</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T3163</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Optimem Reduced Serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMax</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13778</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Control medium GC content RNAi oligo</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12935300</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>SMPD1 RNAi oligo</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>HSS143988</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fetal Bovine Serum Heat-inactivated</td>
			<td>Gemini-Bioproducts</td>
			<td>100-106</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sphingomyelinase from Bacillus cereus</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7651</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>35 mm-glass bottom dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-0-14</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Material</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td>C9100-50</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Spinning disk confocal microscope</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>UltraViewVoX</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Software analysis software</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>Volocity Suite</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Environmental chamber</td>
			<td>Pathology Devices</td>
			<td>LiveCell System Chamber</td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

live imaging assay for assessing the roles of ca2+ and sphingomyelinase in the repair of pore-forming toxin wounds

Plazma zarı yaralanması sık görülen bir olaydır, ve yaralar hızla hücresel hayatta kalmasını sağlamak için tamir edilmesi gerekir. Ca 2 + akını ~ 30 saniye içinde, plazma zarı üzerinde mekanik yaraların onarım tetikleyen anahtar bir sinyal bir olaydır. Son çalışmalar, memeli hücreleri aynı zamanda gözenek endositoz ardından lizozomal enzim asit sfingomiyelinaz ekzositozu içeren bir Ca2 +-bağlı işlemde toksinler oluşturan geçirgenleştirmeden sonra plazma zarı kapatın olduğunu ortaya koydu. Burada, söz konusu toksin streptolizin O ile geçirgen hücrelerin tekrar kapatılmasına Ca2 + akışı üzerinde de hızlı ve bağımlı olduğunu göstermek için kullanılan bir yöntem tarif eder. Deney tasarımı sağlar: yaralanma olayı senkronizasyon ve görüntüleme ile, plazma membran bütünlüğünü ve lipofilik boya FM1-43 hücre zarları ile ulaştığı ölçüde miktarının hücrelerin yeteneği kesin bir kinetik ölçümü. Bu canlı tahlil also Eksojen yeteneği hassas bir değerlendirmesi plazma membran onarım hücrelerinin yeteneğini yansıtan FM1-43 akışını engellemek için bu tür sfingomiyelinaz gibi çözülebilir faktörler ilave sağlar. Bu deney, bize, enzimin eklenmesi hücre dışı Ca2 + yokluğunda permeabilize hücrelerin doğru bağlantı teşvik tarihi sfingomiyelinaz, Ca2 +-bağımlı Ekzositoz aşağı hareket ilk kez göstermektedir bırakıldı.

Lizozomal asit sfingomiyelinaz tükenmiş hücrelerde bakteriyel sfingomiyelinaz (SM) kurtarma plazma zarı onarımı düşük konsantrasyonları. FM1-43 görüntüleme deneyi kullanılarak, daha önce Ca 2 + mevcudiyetinde yaralama lizozomal enzim ASM eksikliği olan ve SLO maruz kalan hücreler, plazma zarı kusur yeniden birleştirici insan enzimi 19 hücre dışı eklenmesiyle kurtarılır sahip olduğunu göstermiştir. İnsan ASM lızozomal düşük bir pH optimumuna...

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds at JoVE.com

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Lipofilik boya FM1-43 maruz kalan hücrelerin canlı görüntüleme gözenek oluşturucu toksinler plazma membran kaldırılır hangi kinetiği tam belirlenmesini sağlar. Bu Ca 2 + gereksinimleri, sfingomiyelinaz ve plazma membranı onarım diğer faktörler değerlendirmek için kullanılabilecek bir hassas bir deneydir.

Ca Rolleri değerlendirilmesi için Görüntüleme Testi Canlı<sup&gt; 2 +</supGözenek oluşturucu Toksin yaraların tamiri&gt; ve sfingomiyelinaz

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event ...

live-imaging-assay-for-assessing-roles-ca2-sphingomyelinase-repair

Research

JoVE Journal

Biology

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

11.6K Görüntüleme.  University of Maryland.  Lipofilik boya FM1-43 maruz kalan hücrelerin canlı görüntüleme gözenek oluşturucu toksinler plazma membran kaldırılır hangi kinetiği tam belirlenmesini sağlar. Bu Ca 2 + gereksinimleri, sfingomiyelinaz ve plazma membranı onarım diğer faktörler değerlendirmek için kullanılabilecek bir hassas bir deneydir. 

Video: Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

Hazırlanması Drosophila</emAsma Bırak Protokolü kullanarak Canlı Görüntüleme> Embriyolar

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Biyoloji

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

Konfokal Mikroskop Zebra balığı Embriyonik Beyin Görüntüleme Canlı

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in live cells. Here we describe the method used in our laboratories for loading suspensions of human sperm with Ca2+-reporting dyes and measuring the fluorescence signal during physiological stimulation. Motile cells are isolated by direct swim-up and incubated under capacitating conditions for 0-24 h, depending upon the experiment. The cell-permeant AM (acetoxy methyl ester) ester form of the Ca2+-reporting dye is then added to a cell aliquot and a period of 1 h is allowed for loading of the dye into the cytoplasm. We use visible wavelength dyes to minimize photo-damage to the cells, but this means that ratiometric recording is not possible. Advantages and disadvantages of this approach are discussed. During the loading period cells are introduced into an imaging chamber and allowed to adhere to a poly-D-lysine coated coverslip. At the end of the loading period excess dye and loose cells are removed by connection of the chamber to the perfusion apparatus. The chamber is perfused continuously, stimuli and modified salines are then added to the perfusion header. Experiments are recorded by time-lapse acquisition of fluorescence images and analyzed in detail offline, by manually drawing regions of interest. Data are normalized to pre-stimulus levels such that, for each cell (or part of a cell), a graph showing the Ca2+ response as % change in fluorescence is obtained.

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Stimulus-evoked [Ca2+]i signals of individual human sperm are assessed. Motile cells are loaded with Ca2+-sensitive fluorescent dye (AM-ester method) and immobilised in a perfusable chamber. Cells are imaged by time-lapse fluorescence microscopy and stimulated via the perfusing medium. Responses of single cells (or regions) are analysed offline using Excel.

Görüntüleme Ca Teknikleri 2 + İnsan Sperm sinyal

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

Electron Spin Resonance Micro-imaging of Live Species for Oxygen Mapping

This protocol describes an electron spin resonance (ESR) micro-imaging method for three-dimensional mapping of oxygen levels in the immediate environment of live cells with micron-scale resolution1. Oxygen is one of the most important molecules in the cycle of life. It serves as the terminal electron acceptor of oxidative phosphorylation in the mitochondria and is used in the production of reactive oxygen species. Measurements of oxygen are important for the study of mitochondrial and metabolic functions, signaling pathways, effects of various stimuli, membrane permeability, and disease differentiation. Oxygen consumption is therefore an informative marker of cellular metabolism, which is broadly applicable to various biological systems from mitochondria to cells to whole organisms. Due to its importance, many methods have been developed for the measurements of oxygen in live systems. Current attempts to provide high-resolution oxygen imaging are based mainly on optical fluorescence and phosphorescence methods that fail to provide satisfactory results as they employ probes with high photo-toxicity and low oxygen sensitivity. ESR, which measures the signal from exogenous paramagnetic probes in the sample, is known to provide very accurate measurements of oxygen concentration. In a typical case, ESR measurements map the probe's lineshape broadening and/or relaxation-time shortening that are linked directly to the local oxygen concentration. (Oxygen is paramagnetic; therefore, when colliding with the exogenous paramagnetic probe, it shortness its relaxation times.) Traditionally, these types of experiments are carried out with low resolution, millimeter-scale ESR for small animals imaging. Here we show how ESR imaging can also be carried out in the micron-scale for the examination of small live samples. ESR micro-imaging is a relatively new methodology that enables the acquisition of spatially-resolved ESR signals with a resolution approaching 1 micron at room temperature2. The main aim of this protocol-paper is to show how this new method, along with newly developed oxygen-sensitive probes, can be applied to the mapping of oxygen levels in small live samples. A spatial resolution of ~30 x 30 x 100 &mu;m is demonstrated, with near-micromolar oxygen concentration sensitivity and sub-femtomole absolute oxygen sensitivity per voxel. The use of ESR micro-imaging for oxygen mapping near cells complements the currently available techniques based on micro-electrodes or fluorescence/phosphorescence. Furthermore, with the proper paramagnetic probe, it will also be readily applicable for intracellular oxygen micro-imaging, a capability which other methods find very difficult to achieve.

This protocol describes a method for micron-scale three-dimensional imaging of oxygen concentration in the immediate environment of live cells by electron spin resonance microscopy.

Elektron Spin Rezonans Oksijen Haritalama için Canlı Türlerinin Micro-görüntüleme

This protocol describes an electron spin resonance (ESR) micro-imaging method for three-dimensional mapping of oxygen levels in the immediate environment ...

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

In mammalian cells, the endoplasmic reticulum (ER) plays a key role in protein biogenesis as well as in calcium signalling1. The heterotrimeric Sec61 complex in the ER membrane provides an aqueous path for newly-synthesized polypeptides into the lumen of the ER. Recent work from various laboratories suggested that this heterotrimeric complex may also form transient Ca2+ leak channels2-8. The key observation for this notion was that release of nascent polypeptides from the ribosome and Sec61 complex by puromycin leads to transient release of Ca2+ from the ER. Furthermore, it had been observed in vitro that the ER luminal protein BiP is involved in preventing ion permeability at the level of the Sec61 complex9,10. We have established an experimental system that allows us to directly address the role of the Sec61 complex as potential Ca2+ leak channel and to characterize its putative regulatory mechanisms11-13. This system combines siRNA mediated gene silencing and live cell Ca2+ imaging13. Cells are treated with siRNAs that are directed against the coding and untranslated region (UTR), respectively, of the SEC61A1 gene or a negative control siRNA. In complementation analysis, the cells are co-transfected with an IRES-GFP vector that allows the siRNA-resistant expression of the wildtype SEC61A1 gene. Then the cells are loaded with the ratiometric Ca2+-indicator FURA-2 to monitor simultaneously changes in the cytosolic Ca2+ concentration in a number of cells via a fluorescence microscope. The continuous measurement of cytosolic Ca2+ also allows the evaluation of the impact of various agents, such as puromycin, small molecule inhibitors, and thapsigargin on Ca2+ leakage. This experimental system gives us the unique opportunities to i) evaluate the contribution of different ER membrane proteins to passive Ca2+ efflux from the ER in various cell types, ii) characterize the proteins and mechanisms that limit this passive Ca2+ efflux, and iii) study the effects of disease linked mutations in the relevant components.

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

The endoplasmic reticulum plays a key role in protein biogenesis and in calcium homeostasis. We have established an experimental system that allows us to address the role of Ca2+ leak channels and to characterize their putative regulatory mechanisms. This system involves siRNA mediated gene silencing and live cell Ca2+ imaging.

Canlı Hücre Kalsiyum Görüntüleme siRNA aracılığı ile gen susturma ile birlikte Ca tanımlar 2 + ER Membran Kaçak Kanallar ve Düzenleme Mekanizmaları

In mammalian cells, the endoplasmic reticulum (ER) plays a key role in protein biogenesis as well as in calcium signalling1. The heterotrimeric Sec61 ...

An Explant Assay for Assessing Cellular Behavior of the Cranial Mesenchyme

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the neural tube in a process known as neurulation. During neurulation, morphogenesis of the mesenchyme that underlies the neural plate is believed to drive neural fold elevation. The cranial mesenchyme is comprised of the paraxial mesoderm and neural crest cells. The cells of the cranial mesenchyme form a pourous meshwork composed of stellate shaped cells and intermingling extracellular matrix (ECM) strands that support the neural folds. During neurulation, the cranial mesenchyme undergoes stereotypical rearrangements resulting in its expansion and these movements are believed to provide a driving force for neural fold elevation. However, the pathways and cellular behaviors that drive cranial mesenchyme morphogenesis remain poorly studied. Interactions between the ECM and the cells of the cranial mesenchyme underly these cell behaviors. Here we describe a simple ex vivo explant assay devised to characterize the behaviors of these cells. This assay is amendable to pharmacological manipulations to dissect the signaling pathways involved and live imaging analyses to further characterize the behavior of these cells. We present a representative experiment demonstrating the utility of this assay in characterizing the migratory properties of the cranial mesenchyme on a variety of ECM components.

The cranial mesenchyme undergoes dramatic morphogenic movements that likely provides a driving force for elevation of the neural folds1,2. Here we describe a simple ex vivo explant assay to characterize the cellular behaviors of the cranial mesenchyme during neurulation. This assay has numerous applications including being amenable to pharmacological manipulations and live imaging analyses.

Kranial mesenchyme Hücresel Davranış Değerlendirme için bir Eksplantasyon Assay

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Apoptotik hücresi Temizliği görüntülenmesi sırasında Canlı<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyo

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Autophagy is a cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of amino acids. Autophagy is defined by the formation of double membrane structures, called autophagosomes, that sequester cytoplasm, long-lived proteins and protein aggregates, defective organelles, and even viruses or bacteria. Autophagosomes eventually fuse with lysosomes leading to bulk degradation of their content, with the produced nutrients being recycled back to the cytoplasm. Therefore, autophagy is crucial for cell homeostasis, and dysregulation of autophagy can lead to disease, most notably neurodegeneration, ageing and cancer.	
	Autophagosome formation is a very elaborate process, for which cells have allocated a specific group of proteins, called the core autophagy machinery. The core autophagy machinery is functionally complemented by additional proteins involved in diverse cellular processes, e.g. in membrane trafficking, in mitochondrial and lysosomal biology. Coordination of these proteins for the formation and degradation of autophagosomes constitutes the highly dynamic and sophisticated response of autophagy. Live cell imaging allows one to follow the molecular contribution of each autophagy-related protein down to the level of a single autophagosome formation event and in real time, therefore this technique offers a high temporal and spatial resolution.	
	Here we use a cell line stably expressing GFP-DFCP1, to establish a spatial and temporal context for our analysis. DFCP1 marks omegasomes, which are precursor structures leading to autophagosomes formation. A protein of interest (POI) can be marked with either a red or cyan fluorescent tag. Different organelles, like the ER, mitochondria and lysosomes, are all involved in different steps of autophagosome formation, and can be marked using a specific tracker dye. Time-lapse microscopy of autophagy in this experimental set up, allows information to be extracted about the fourth dimension, i.e. time. Hence we can follow the contribution of the POI to autophagy in space and time.

Time-lapse microscopy of fluorescently labeled autophagy markers allows monitoring of the dynamic autophagy response with high temporal resolution. Using specific autophagy and organelle markers in a combination of 3 different colors, we can follow the contribution of a protein to autophagosome formation in a robust spatial and temporal context.

Erken Otofaji Etkinlikler Hücre Görüntüleme Canlı: Omegasomes ve Ötesi

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Drosophila eye is widely used as a model for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic recombination technique, elegant genetic screens based on clonal analysis have led to the identification of signaling pathways involved in eye development and photoreceptor (PR) differentiation at larval stages. We describe here the Tomato/GFP-FLP/FRT method, which can be used for rapid clonal analysis in the eye of living adult Drosophila. Fluorescent photoreceptor cells are imaged with the cornea neutralization technique, on retinas with mosaic clones generated by flipase-mediated recombination. This method has several major advantages over classical histological sectioning of the retina: it can be used for high-throughput screening and has proved an effective method for identifying the factors regulating PR survival and function. It can be used for kinetic analyses of PR degeneration in the same living animal over several weeks, to demonstrate the requirement for specific genes for PR survival or function in the adult fly. This method is also useful for addressing cell autonomy issues in developmental mutants, such as those in which the establishment of planar cell polarity is affected.

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT method involves visualizing mosaic photoreceptor cells in living Drosophila. It can be used to follow individual photoreceptor cell fates in the retina for days or weeks. This method is ideal for studies of retinal degeneration and neurodegenerative diseases or photoreceptor cell development.

Mozaik Yetişkin Canlı Görüntüleme Domates / GFP-FLP / FRT Yöntemi<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotoreseptör Hücreler

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte precursors, immune cells, fibroblasts, blood vessels, and nerve projections. Although the molecular control of cell type specification and how these cells interact have been increasingly delineated, a more comprehensive understanding of these adipose-resident cells can be achieved by visualizing their distribution and architecture throughout the whole tissue. Existing immunohistochemistry and immunofluorescence approaches to analyze adipose histology rely on thin paraffin-embedded sections. However, thin sections capture only a small portion of tissue; as a result, the conclusions can be biased by what portion of tissue is analyzed. We have therefore developed an adipose tissue clearing technique, Adipo-Clear, to permit comprehensive three-dimensional visualization of molecular and cellular patterns in whole adipose tissues. Adipo-Clear was adapted from iDISCO/iDISCO+, with specific modifications made to completely remove the lipid stored in the tissue while preserving native tissue morphology. In combination with light-sheet fluorescence microscopy, we demonstrate here the use of the Adipo-Clear method to obtain high-resolution volumetric images&#160;of an entire adipose tissue.

Due to the high lipid content, adipose tissue has been challenging to visualize using traditional histological methods. Adipo-Clear is a tissue clearing technique that allows robust labeling and high-resolution volumetric fluorescent imaging of adipose tissue. Here, we describe the methods for sample preparation, pretreatment, staining, clearing, and mounting for imaging.

Adipo-Clear: Bir doku Yöntem yağ dokusu üç boyutlu görüntüleme için temizlenmesi

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...