وقد دعم هذا العمل صندوق ويل وجين كالدويل للأبحاث الممنوحة من مركز جامعة ميشيغان الشامل للسرطان، وجزؤا من منحة المعاهد القومية للصحة CA82529 ومؤسسة جيلسون لونغنباو.

1. ALDEFLUOR تلطيخ
<ol><li>إعداد عينة الخلية: إعداد تعليق خلية واحدة من الخلايا السرطانية، إما من الخلايا السرطانية المستزرعة أو من عينات الورم الطازجة. عد الخلايا وضبط تعليق الخلية إلى تركيز 1 × 106 خلايا / مل في ALDEFLUOR المقايسة المخزن المؤقت.</li>
	<li>تسمية أربعة أنابيب اختبار البوليسترين 12 ملم × 75 ملم كما أنابيب التحكم على النحو التالي: #1: غير ملطخة، #2: ALDEFLUOR، #3: ALDEFLUOR بالإضافة إلى دياب، #4: 7AAD.</li>
	<li>بالنسبة لأنابيب التحكم هذه، ضع تعليق الخلية 1 مل في #1 #4، ولكن 2 مل في #2 الأنبوب. إضافة 5 ميكرولتر دياب (مثبط ALDH) في أنبوب #3 والحفاظ على الجليد. ثم إضافة 10 ميكرولتر تنشيط الركيزة ALDEFLUOR أنبوب #2، مزيج ونقل فورا 1 مل من الخليط إلى أنبوب #3.</li>
	<li>في الوقت نفسه، إضافة 2 ميكرولتر تنشيط الركيزة ALDEFLUOR لكل مليون خلية إلى بقية الخلايا (أنابيب العينة) أيضا في 1 × 106 خلايا / مل في ALDEFLUOR المقيس العازلة.</li>
	<li>احتضان كل من أنابيب التحكم 4 وأنابيب العينة لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية حمام مائي.</li>
	<li>بعد الحضانة، أضف 5 ميكرولتر 7AAD إلى أنبوب التحكم #4، و1 ميكرولتر 7AAD 1 × 106 خلايا إلى أنبوب العينة. حضانة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية.</li>
	<li>أجهزة الطرد المركزي جميع الأنابيب لمدة 5 دقائق في 250 × ز وإزالة supernatant.</li>
	<li>إعادة الإنفاق الخلايا في ALDEFLUOR المقادير المقايسة المخزن المؤقت.</li>
	<li>إجراء الفرز القائم على قياس التدفق الخلوي.</li>
	<li>تعيين بوابات الفرز باستخدام ALDEFLUOR الخلايا الملطخة تعامل مع DEAB والتحكم السلبي و يوديد البروبيديوم (PI) 7AAD- الخلايا الملطخة للسيطرة على البقاء. وبناء على هذه الضوابط، تم إنشاء بوابة للتمييز بين ALDEFLUOR + / ALDHعالية،D5 وخلايا SCC7. سيتم استخدام هذه البوابات بعد ذلك لفرز جميع الخلايا عينة أعدت أعلاه ل ALDEFLUOR + / ALDHعالية D5 و SCC7 الخلايا.</li>
</ol>2. إعداد لقاح الخلايا الجذعية السرطانية Lysate-pulse الخلايا التدينية (CSC-TPDC)
<ol><li>فئران القتل الرحيم (Syngeneic B6 و C3H، على التوالي) باستخدام CO2 وعزل عظام عظم الفخذ والساق.</li>
	<li>وضع العظام في الإيثانول 75٪ لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة. ثم غسل العظام باستخدام HBSS.</li>
	<li>قطع الرأس العظام واستخدام إبرة 21 G ومحقنة 10 مل لدفع الخلايا في طبق.</li>
	<li>أسبيرات وتفجير الخلايا باستخدام الحقنة لجعل تعليق خلية واحدة.</li>
	<li>بعد الطرد المركزي في 1500 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق، تجاهل supernatant. ثم إضافة 5 مل تحلل RBC العازلة لتحلل RBC لمدة 1 دقيقة في 37 °C حمام مائي.</li>
	<li>عد عدد الخلايا وضبط تعليق الخلية إلى تركيز 1 مليون خلية / مل في المتوسطة كاملة (CM) التي تحتوي على 10 نانوغرام / مل GM-CSF و 10 نانوغرام / مل IL-4.</li>
	<li>ثقافة الخلايا وتعويض CM بالإضافة إلى IL-4 وجنرال موتورز-CSF 3 أيام في وقت لاحق.</li>
	<li>في اليومالخامس، احصد الخلايا التشجرية غير الناضجة (DCs) واستعد وسيط عزل DC الذي يحتوي على محلول 4.2 مل C بالإضافة إلى 1 مل متوسط تدرج كثافة OptiPrep.</li>
	<li>تعليق الكريات الخلية في 5 مل CM. إضافة تعليق الخلية على العزلة المتوسطة ببطء. جهاز طرد مركزي عند 2000 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>جمع DCs بين CM والعزلة المتوسطة. عد عدد الخلايا وضبط تعليق الخلية إلى تركيز 1 مليون خلية / مل في المتوسطة الثقافة التي تحتوي على 10 نانوغرام / مل GM-CSF و 10 نانوغرام / مل IL-4.</li>
	<li>إعداد lysates الورم عن طريق تعليق ALDHعالية أو غير مفرزة D5 أو SCC7 الخلايا في المتوسطة الثقافة وتخضع للتعرض السريع تجميد ذوبان أربع مرات تليها تدور في ∼100 × ز لمدة 5 دقائق لجمع جزء الغشاء من اللسحات.</li>
	<li>لإعداد CSC-TPDC، نبض DCs مع lysate من ALDH الخلاياالعالية ذاتية. لإعداد H-TPDC، نبض DC مع lysate الخلايا السرطانية غير المتجانسة غير المشتتة. نسبة DC إلى lysate الخلايا السرطانية هي نفسها.</li>
</ol>3. التطعيم وتقييم فعالية
<ol><li>تطعيم الفئران B6 العادية على التوالي مع 2500 D5 CSC-TPDC أو D5 H-TPDC الخلايا السرطانية تحت الجلد(ق.c.). تطعيم الحيوانات C3H العادية ق.c. مع 5000 SCC7 CSC-TPDC أو SCC7 H-TPDC الخلايا السرطانية، على التوالي.</li>
	<li>بعد التطعيم، تحدي الفئران B6 مع الخلايا السرطانية D5 غير متجانسة أي القتل الرحيم الفئران باستخدام CO2 20 أيام في وقت لاحق. حصاد الرئتين وعدد الانبثاث الرئة.</li>
	<li>في نموذج SCC7 ، تحدي فئران C3H مع خلايا ورم SCC7 غير المفحصة .c على الجانب الآخر من لقاح DC. مراقبة حجم الورم.</li>
	<li>في نهاية التجارب القتل الرحيم الفئران B6 و C3H باستخدامثانيأكسيد الكربون . في اليوم 34 بعد اللقاح الأول ، قتل الفئران معثانيأكسيد الكربون ، وفي الوقت نفسه جمع الطحال من كل مجموعة مع إجراء مطهر.</li>
	<li>تنشيط الطحال T و / أو B الخلايا مع شل الحركة المضادة للCD3 بالإضافة إلى مكافحة CD28 mAbs في CM التي تحتوي على hrIL-2 أو LPS بالإضافة إلى مكافحة CD40 (FGK45) استسقاء ماب.</li>
	<li>بعد التنشيط، جمع المضادات الفائقة واستخدامها في الفحص ELISA.</li>
	<li>بالنسبة إلى فحص ELISA، لوحات المعطف مع الأجسام المضادة لIFNа، GM-CSF وIgG عند درجة حرارة 4 °C O/N.</li>
	<li>بعد تطبيق العازلة حجب، إضافة عينات ومعايير واحتضان في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>غسل لوحة وإضافة الأجسام المضادة الكشف HRP وركيزة TMB لاحتضان.</li>
	<li>قياس الامتصاص على قارئ لوحة ELISA في 450 نانومتر في غضون 30 دقيقة بعد وقف رد الفعل.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Shafee, N., Smith, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+contribute+to+cisplatin+resistance+in+Brca1/p53-mediated+mouse+mammary+tumors.">Cancer stem cells contribute to cisplatin resistance in Brca1/p53-mediated mouse mammary tumors.</a> Cancer Res. 68, 3243-3250 (2008).</li><li>Nandi, S., Ulasov, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-dose+radiation+enhances+survivin-mediated+virotherapy+against+malignant+glioma+stem+cells.">Low-dose radiation enhances survivin-mediated virotherapy against malignant glioma stem cells.</a> Cancer Res. 68, 5778-5784 (2008).</li><li>Dallas, N. A., Xia, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoresistant+colorectal+cancer+cells,+the+cancer+stem+cell+phenotype,+and+increased+sensitivity+to+insulin-like+growth+factor-I+receptor+inhibition.">Chemoresistant colorectal cancer cells, the cancer stem cell phenotype, and increased sensitivity to insulin-like growth factor-I receptor inhibition.</a> Cancer Res. 69, 1951-1957 (2009).</li><li>Yamauchi, K., Yang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+cancer+metastasis+by+cyclophosphamide+pretreatment+of+host+mice:+an+opposite+effect+of+chemotherapy.">Induction of cancer metastasis by cyclophosphamide pretreatment of host mice: an opposite effect of chemotherapy.</a> Cancer Res. 68, 516-520 (2008).</li><li>Chang, A. E., Redman, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I+trial+of+tumor+lysate-pulsed+dendritic+cells+in+the+treatment+of+advanced+cancer.">A phase I trial of tumor lysate-pulsed dendritic cells in the treatment of advanced cancer.</a> Clin. Cancer Res. 8, 1021-1032 (2002).</li><li>Ito, F., Li, Q., Shreiner, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-CD137+monoclonal+antibody+administration+augments+the+antitumor+efficacy+of+dendritic+cell-based+vaccines.">Anti-CD137 monoclonal antibody administration augments the antitumor efficacy of dendritic cell-based vaccines.</a> Cancer Res. 64, 8411-8419 (2004).</li><li>Kirk, C. J., Hartigan-O'Connor, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell-dependent+antitumor+immunity+mediated+by+secondary+lymphoid+tissue+chemokine:+augmentation+of+dendritic+cell-based+immunotherapy.">T cell-dependent antitumor immunity mediated by secondary lymphoid tissue chemokine: augmentation of dendritic cell-based immunotherapy.</a> Cancer Res. 61, 2062-2070 (2001).</li><li>Ning, N., Pan, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cell+vaccination+confers+significant+antitumor+immunity.">Cancer stem cell vaccination confers significant antitumor immunity.</a> Cancer Res. 72, 1853-1864 (2012).</li><li>Ginestier, C., Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR1+blockade+selectively+targets+human+breast+cancer+stem+cells+in+vitro+and+in+xenografts.">CXCR1 blockade selectively targets human breast cancer stem cells in vitro and in xenografts.</a> J. Clin. Invest. 120, 485-497 (2010).</li><li>Carpentino, J. E., Hynes, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aldehyde+dehydrogenase-expressing+colon+stem+cells+contribute+to+tumorigenesis+in+the+transition+from+colitis+to+cancer.">Aldehyde dehydrogenase-expressing colon stem cells contribute to tumorigenesis in the transition from colitis to cancer.</a> Cancer Res. 69, 8208-8215 (2009).</li><li>Charafe-Jauffret, E., Ginestier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+cancer+cell+lines+contain+functional+cancer+stem+cells+with+metastatic+capacity+and+a+distinct+molecular+signature.">Breast cancer cell lines contain functional cancer stem cells with metastatic capacity and a distinct molecular signature.</a> Cancer Res. 69, 1302-1313 (2009).</li></ol>

دعمت STEMCELL Technologies رسوم النشر المفتوح.

ويحول المضيفون الذين يعانون من نقص المناعة، مثل فئران SCID، دون إجراء تقييمات مناعية لمركبات الكربون الكلورية فلورية بسبب الافتقار إلى المناعة التكيفية داخل المضيفين. في هذه الدراسة، قمنا بتقييم المناعة من CSCs في المضيفين المناعة، والتي يمكن أن تحاكي عن كثب إعدادات المريض. تعتبر مركبات الكربون الكلورية فلورية المخصبة مناعية ويمكن أن تحفز على مناعة وقائية أكثر فعالية للورم عندما يتم تحميل اللسات الخاصة بها إلى DCs كلقاح مقارنة بخلايا الورم غير المحددة التي تنبض بالخلايا.  ومن الناحية الميكانيكية، منحت الحماية عن طريق الاستقراء الانتقائي للأجسام المضادة التفاعلية CSC والخلايا التائية8 وكذلك إنتاج السيتوكين من النوع 1، مثل IFNο و GM-CSF.
معظم العلاجات المناعية الحالية، بما في ذلك اللقاحات القائمة على الخلايا التغصنية ونقل الخلايا التائية بالتبني، مصممة لاستهداف المستضدات المتمايزة للورم. ولذلك فإن مراكز مكافحة الإصابة بالشلل، التي قد لا تعبر عن هذه المستضدات المتمايزة، قد تفلت من هذه الاستهدافات المناعية. وعلى النقيض من ذلك، فإن لقاح CSC المصمم لاستهداف الخلايا الجذعية السرطانية على وجه التحديد قد يدمر هذه المجموعة الخاصة من الخلايا السرطانية، وبالتالي يحسن الفعالية العلاجية للقاح عن طريق منع انتكاس الورم والانبثاث.
في كل من الخلايا السرطانية المستزرعة والأورام التي تم حصادها حديثا ، حددنا السكان المخصبين ب CSC عن طريق قياس التدفق الخلوي استنادا إلى نشاط ألدهيد ديهيدروجيناز العالي. يمكن عزل هذه الخلاياالعالية ALDH عن طريق فرز التدفق لاستخدامها كمصدر مستضد لنبض DC لتوليد CSC-TPDCs. المقارنة باستخدام ALDH الخلاياالعالية المعزولة عن الخلايا السرطانية المستزرعة مقابل الأورام التي تم حصادها حديثا أظهرت عدم وجود فرق كبير في مصطلح تحريض المناعة المضادة CSC8. وكشفت هذه النتائج عن إمكانية استخدام CSCs معزولة إما عن الخلايا السرطانية المستزرعة أو من الأورام التي تم حصادها حديثا للتطبيق السريري.
لكي يكون اللقاح ذا صلة سريرية، يجب فحصه في بيئة علاجية. ويجري الآن إجراء هذه التجارب في مختبرنا.

الخلايا الجذعية السرطانية هي مقاومة نسبيا للعلاج الكيميائي التقليدي والعلاج الإشعاعي1,2. من ناحية أخرى، قد يكون هذا السكان من الخلايا الخلايا المسؤولة عن الانتكاس وتطور السرطان بعد علاجات السرطان التقليدية1-4. بسبب عدم التعبير عن مستضدات الورم المتمايزة على الخلايا الجذعية السرطانية ، قد تفلت الخلايا الجذعية السرطانية من التدخلات المناعية الحالية للعلاج للسرطان ، والتي تم تصميمها في الغالب لاستهداف المستضدات على الخلايا السرطانية المتمايزة. لذلك، قد يحمل وضع استراتيجيات جديدة تستهدف الخلايا الجذعية السرطانية وتدميرها وعودا بزيادة الفعالية العلاجية لعلاج السرطان الحالي. وتحقيقا لهذه الغاية، قمنا بعزل مجموعات الخلايا الجذعية السرطانية المخصبة من ورمين حيوانيين (سرطان الجلد D5 وسرطان الخلايا الحرشفية SCC7)، واستخدمناها كمصدر مستضد لنبض خلايا تقديم المستضد (الخلايا التغصنية، DC) لإعداد لقاح CSC-TPDC. ثم قمنا بتقييم مناعة مضادة للورم الناجمة عن لقاح CSC-TPDC في مضيفي الكومبييت المناعي السينغيني والفئران B6 والفئران C3H على التوالي. تمت مقارنة فعالية مضاد التومور الناجم عن CSC-TPDC مع لقاح DC التقليدي النابض بالليست من الخلايا السرطانية غير المتجانسة غير المحصنة (H-TPDC) ، والذي سبق استخدامه من قبل مجموعتنا5،6، وكذلك من قبل محققين آخرين7 في كل من الدراسات قبل السريرية وفي التجارب السريرية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1022">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:405px;">ALDHEFLOUR KIT</td>
			<td style="width:399px;">Stemcell Technologies</td>
			<td style="width:219px;">1700</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:405px;">Murine IL-4</td>
			<td style="width:399px;">Pepro Tech</td>
			<td style="width:219px;">214-14</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:405px;">Murine GM-CSF</td>
			<td style="width:399px;">Pepro Tech</td>
			<td style="width:219px;">315-03</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:405px;">Mouse IFN-&#611; ELISA KIT</td>
			<td style="width:399px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:219px;">555138</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:405px;">Mouse GM-CSF ELISA KIT</td>
			<td style="width:399px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:219px;">555167</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:405px;">OptiPrep Density Gradient Medium</td>
			<td style="width:399px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">D1556</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:405px;">BD OptEIA TMB Substrated Reagent Set</td>
			<td style="width:399px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:219px;">555214</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;"></td>
			<td style="width:399px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;">Equipment</td>
			<td style="width:399px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;">BD FACS Aria Cell Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>336834</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:405px;">Kcjunior</td>
			<td style="width:399px;">Bio-Tek Instruments</td>
			<td style="width:219px;">176058</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of a novel dendritic-cell vaccine using melanoma and squamous cancer stem cells

حددنا الخلايا الجذعية السرطانية (CSC) الغنية من المورين الميلانوما D5 syngeneic إلى C57BL/6 الفئران والسرطان الحرشفي SCC7 syngeneic إلى الفئران C3H باستخدام ALDEFLUOR / ALDH كعلامة، واختبار المناعة باستخدام تحلل الخلية كمصدر للمضادات لنبض الخلايا المستنعرة (DCs). DCs نبض مع ALDHعالية CSC lysates تسبب أعلى بكثير مناعة مضادة للورم واقية من DCs نبض مع lysates من ليسات الخلايا السرطانية كلها غير مفرزة في كل من النماذج وفي وضع الانبثاث الرئة وs.c. وضع نمو الورم، على التوالي. وكانت هذه الظاهرة بسبب الاستجابات الفكاهية الناجمة عن لقاح CSC وكذلك الاستجابات الخلوية المضادة ل CSC. على وجه الخصوص ، أنتجت الطحال المعزولة عن المضيف الخاضع للقاح CSC-DC كمية أعلى بكثير من IFNγ و GM-CSF من الخلايا الطحال المعزولة عن المضيف التي تخضع للقاح خلايا الورم غير المفرزة. تدعم هذه النتائج الجهود الرامية إلى تطوير لقاح علاجي قائم على CSC للاستخدام السريري في بيئة مساندة.

ALDEFLUOR /ALDH وقد استخدمت كعلامة واحدة لعزل الخلايا الجذعية في الأورام الخبيثة متعددة8-11. حددنا مجموعات الخلايا الجذعية المخصبة بالسرطان في نموذجين للورم D5 و SCC7 باستخدام ALDEFLUOR كعلامة. اكتشفنا ALDEFLUOR + الخلايا في سرطان الجلد مورين B16-D5 وسرطان الخلايا الحرشفية SCC7. وجدنا أن ALDEFLUOR + الخلايا تسهم ما يقرب من 0.5٪ و 5.2٪ في خطوط الخلايا السرطانية D5 و SCC7 المستزرعة، على التوالي (الشكل 1). تم تحليل الخلايا السرطانية التي تم حصادها حديثا من الأورام الراسخة لتأكيد وجود خلايا ALDEFLUOR+ . كما هو مبين أيضا في الشكل 1، كان هناك 2.5 ٪ و 4.2 ٪ من خلايا ALDEFLUOR + من في الجسم الحي أنشئت D5 و SCC7 الأورام ، على التوالي. تم تقييم الورم وقدرة التجديد الذاتي لهذه الفئاتالسكانية العالية D5 و SCC7 ALDEFLUOR +/ALDH في مضيف النجيم المناعي السينغي ، فئران C57BL/6 و C3H ، على التوالي8.
لقد استخدمنا غير متجانسة غير المفرغة خلية الورم lysate لنبض DC (H-TPDC) سواء في الدراسات الحيوانية والتجارب السريرية5,6. لدراسة المناعة من CSCs، قمنا بعزل ALDHعالية CSC ونبض DC مع lysate من CSCs لتوليد CSC-TPDC (الشكل 2) واستخدم H-TPDC كتحكم لقاح السرطان التقليدية لاختبار ما إذا كان CSC-TPDC له أي تأثير مفيد في منع نمو الورم.
قمنا بتقييم المناعة من CSCs من خلال فحص المناعة المضادة للورم الوقائي الناجمة عن CSC-TPDC. في نموذج D5 ، تم تطعيم الفئران ذات القدرة المناعية الساذجة .c مع CSC-TPDC أو H-TPDC (بنفس النسبة: DC). تلقت مجموعات التحكم المالحة (PBS). بعد أسبوع واحد من اللقاح الأخير ، تم تحدي الفئران بخلايا ورم D5 غير مفرزة عن طريق الوريد(أي v.) ، وتم حصاد الرئتين بعد 3 أسابيع لتعداد الانبثاث الرئوي. كما هو مبين في الجدول 1، مقارنة مع مجموعة PBS ، الفئران المعالجة ب H-TPDC طورت انبثاث الرئة أقل. والأهم من ذلك أن الفئران التي عولجت ب CSC-TPDC كان لديها نقائل رئوية أقل بكثير من مجموعة لقاح H-TPDC في كلتا التجربتين. في نموذج SCC7 ، تم تطعيم C3H العادية .c مع SCC7 CSC-TPDC أو H-TPDC على التوالي على الجناح الأيمن ، تليها تحدي مع خلايا ورم SCC7 غير المفحذة .c في الجناح الأيسر. بالمقارنة مع مجموعة PBS، H-TPDC المستحثة متواضعة المضادة للورم الحصانة ضد نمو الورم. ومع ذلك، كان هناك تثبيط كبير لنمو الورم في الفئران التي عولجت مع CSC-TPDC بالمقارنة مع كل من مجموعة التحكم ومجموعة H-TPDC (p<0.05، الشكل 3). وتشير هذه النتائج إلى أنه يمكن استخدام مركبات الكربون الكلورية فلورية كمصدر مستضد أكثر فعالية لتحميل الخلايا السرطانية من الخلايا السرطانية التقليدية غير المفحوسة في تحفيز المناعة الوقائية ضد تحدي الخلايا السرطانية.
لمزيد من الفهم للآليات الكامنة وراء المناعة الوقائية المضادة للورم التي يسببها CSC ، حصدنا الطحال من الحيوانات التي خضعت لتطعيمات DC في نهاية التجارب. ثم تم تنشيط خلايا الطحال بواسطة مكافحة CD3/CD28/IL-2 أو المضادة CD3/CD28/IL-2 + LPS/ANTI-CD40. ثم تم جمع المضادات الثقافية للكشف عن التعبير عن السيتوكينات والأجسام المضادة.  كانت هناك إنتاجات أعلى بكثير من IFNа و GM-CSF من قبل خلايا الطحال من الحيوانات التي تم تطعيمها مع D5 CSC-TPDC أو SCC7 CSC-TPDC(الشكل 4). وعلاوة على ذلك، كان هناك بشكل ملحوظ (p<0.05) إنتاج IgG أعلى من قبل LPS/ANTI-CD40 خلايا الطحال المنشط التي تم جمعها من الحيوانات التي تم تطعيمها مع D5 CSC-TPDC أو SCC7 CSC-TPDC مقارنة مع D5 H-TPDC أو SCC7 H-TPDC. وتبين أن هذه الأجسام المضادة ترتبط بمركبات الكربون الكلورية فلورية D5 وSCC7 على التوالي، ويمكن أن يؤدي هذا الربط إلى تحلل CSC في وجود مكمل8.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50561/50561fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50561/50561fig1.jpg"> الشكل 1 - الأرقام 1- الأرقام 1 تم الكشف عن ALDHFLUOR +/ALDHارتفاع السكان في المستزرعة وكذلك حصادها حديثا الطازجة مورين D5 سرطان الجلد وأورام الخلايا الحرشفية SCC7. تم استخدام الخلايا السرطانية المعالجة ب 50 ملليمول / لتر DEAB ، وهو مثبط ALDH محدد ، كعنصر تحكم سلبي.
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50561/50561fig1highres.jpg" target="_blank">انقر هنا لعرض صورة أكبر.</a> 
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50561/50561fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50561/50561fig2.jpg"> الشكل 2 - الأرقام 2- الأرقام التي تم توليد لقاحات الخلايا الجذعية السرطانية القائمة على الخلايا التشعبية. لإعداد CSC-TPDC و H-TPDC، تم نبض الخلايا التغصنية المشتقة من نخاع العظم مع ALDHعالية أو ليسات الخلايا السرطانية غير المفحوبة، على التوالي.
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50561/50561fig2highres.jpg" target="_blank">انقر هنا لعرض صورة أكبر.</a> 
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50561/50561fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50561/50561fig3.jpg"> الشكل 3 - الأرقام 3- الأرقام التي يمكن أن يمكن أن يحفز لقاح CSC lysate pulsed DC (CSC-TPDC) على مناعة وقائية مضادة للورم أكثر فعالية في .c. نموذج الورم SCC7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50561/50561fig3highres.jpg" target="_blank">انقر هنا لعرض صورة أكبر.</a> 

<img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50561/50561fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50561/50561fig4.jpg"> الشكل 4 - الأرقام 4- الأرقام التي تم ال استجابات خلوية نظامية أكثر فعالية في المضيف التنافسي المناعي الذي تم تطعيمه مع CSC-TPDC.  تم حصاد الطحال من الحيوانات التي تعرضت للتطعيم H-TPDC أو CSC-TPDC ، وتم تنشيطها على النحو المشار إليه. ثم تم جمع المضادات الثقافية للكشف عن السيتوكين باستخدام ELISA.
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50561/50561fig4highres.jpg" target="_blank">انقر هنا لعرض صورة أكبر.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Generation of a Novel Dendritic-cell Vaccine Using Melanoma and Squamous Cancer Stem Cells at JoVE.com

Generation of a Novel Dendritic-cell Vaccine Using Melanoma and Squamous Cancer Stem Cells

أظهر لقاح الخلايا الجذعية السرطانية (CSC) القائم على الخلايا التشعبية (DC) الذي تم تقييمه في مضيفي الخلايا المناعية النجينية مناعة مضادة للورم أعلى بكثير من لقاحات DC التقليدية النابضة بخلايا الورم السائبة غير المتجانسة.

جيل من لقاح جديد للخلايا التشجرية باستخدام الميلانوما والخلايا الجذعية السرطانية الحرشفية

We identified cancer stem cell (CSC)-enriched populations from murine melanoma D5 syngeneic to C57BL/6 mice and the squamous cancer SCC7 syngeneic to C3H ...

generation-novel-dendritic-cell-vaccine-using-melanoma-squamous

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.2K Views.  University of Michigan. أظهر لقاح الخلايا الجذعية السرطانية (CSC) القائم على الخلايا التشعبية (DC) الذي تم تقييمه في مضيفي الخلايا المناعية النجينية مناعة مضادة للورم أعلى بكثير من لقاحات DC التقليدية النابضة بخلايا الورم السائبة غير المتجانسة.

Video: Generation of a Novel Dendritic-cell Vaccine Using Melanoma and Squamous Cancer Stem Cells

Analysis of Pulmonary Dendritic Cell Maturation and Migration during Allergic Airway Inflammation

Dendritic cells (DCs) are the key players involved in initiation of adaptive immune response by activating antigen-specific T cells. DCs are present in peripheral tissues in steady state; however in response to antigen stimulation, DCs take up the antigen and rapidly migrate to the draining lymph nodes where they initiate T cell response against the antigen1,2. Additionally, DCs also play a key role in initiating autoimmune as well as allergic immune response3.
DCs play an essential role in both initiation of immune response and induction of tolerance in the setting of lung environment4. Lung environment is largely tolerogenic, owing to the exposure to vast array of environmental antigens5. However, in some individuals there is a break in tolerance, which leads to induction of allergy and asthma. In this study, we describe a strategy, which can be used to monitor airway DC maturation and migration in response to the antigen used for sensitization. The measurement of airway DC maturation and migration allows for assessment of the kinetics of immune response during airway allergic inflammation and also assists in understanding the magnitude of the subsequent immune response along with the underlying mechanisms.
Our strategy is based on the use of ovalbumin as a sensitizing agent. Ovalbumin-induced allergic asthma is a widely used model to reproduce the airway eosinophilia, pulmonary inflammation and elevated IgE levels found during asthma6,7. After sensitization, mice are challenged by intranasal delivery of FITC labeled ovalbumin, which allows for specific labeling of airway DCs which uptake ovalbumin. Next, using several DC specific markers, we can assess the maturation of these DCs and can also assess their migration to the draining lymph nodes by employing flow cytometry.

We describe a strategy to monitor maturation and migration of pulmonary dendritic cells in response to ovalbumin in the setting of ovalbumin induced allergic airway inflammation. This strategy can be modified to assess migration of pulmonary dendritic cells in settings of infection.

تحليل الرئوي نضوج خلية شجيري والهجرة خلال التهاب الشعب الهوائية التحسسي

Dendritic cells (DCs) are the key players involved in initiation of adaptive immune response by activating antigen-specific T cells. DCs are present in ...

Mass Spectrometric Analysis of Glycosphingolipid Antigens

Glycosphingolipids (GSL's) belong to the glycoconjugate class of biomacromolecules, which bear structural information for significant biological processes such as embryonic development, signal transduction, and immune receptor recognition1-2. They contain complex sugar moieties in the form of isomers, and lipid moieties with variations including fatty acyl chain length, unsaturation, and hydroxylation. Both carbohydrate and ceramide portions may be basis of biological significance. For example, tri-hexosylceramides include globotriaosylceramide (Gal&alpha;4Gal&beta;4Glc&beta;1Cer) and isoglobotriaosylceramide (Gal&alpha;3Gal&beta;4Glc&beta;1Cer), which have identical molecular masses but distinct sugar linkages of carbohydrate moiety, responsible for completely different biological functions3-4. In another example, it has been demonstrated that modification of the ceramide part of alpha-galactosylceramide, a potent agonist ligand for invariant NKT cells, changes their cytokine secretion profiles and function in animal models of cancer and auto-immune diseases5. The difficulty in performing a structural analysis of isomers in immune organs and cells serve as a barrier for determining many biological functions6.
Here, we present a visualized version of a method for relatively simple, rapid, and sensitive analysis of glycosphingolipid profiles in immune cells7-9. This method is based on extraction and chemical modification (permethylation, see below Figure 5A, all OH groups of hexose were replaced by MeO after permethylation reaction) of glycosphingolipids10-15, followed by subsequent analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS) and ion trap mass spectrometry. This method requires 50 million immune cells for a complete analysis. The experiments can be completed within a week. The relative abundance of the various glycosphingolipids can be delineated by comparison to synthetic standards. This method has a sensitivity of measuring 1% iGb3 among Gb3 isomers, when 2 fmol of total iGb3/Gb3 mixture is present9.
Ion trap mass spectrometry can be used to analyze isomers. For example, to analyze the presence of globotriaosylceramide and isoglobtriaosylceramide in the same sample, one can use the fragmentation of glycosphingolipid molecules to structurally discriminate between the two (see below Figure 5). Furthermore, chemical modification of the sugar moieties (through a permethylation reaction) improves the ionization and fragmentation efficiencies for higher sensitivity and specificity, and increases the stability of sialic acid residues. The extraction and chemical modification of glycosphingolipids can be performed in a classic certified chemical hood, and the mass spectrometry can be performed by core facilities with ion trap MS instruments.

A specific and sensitive method to gain insight into the expression profile of glycosphingolipid antigens in immune organs and cells is described. The method takes advantage of the ion trap mass spectrometry allowing step-wise fragmentation of glycosphingolipid molecules for structural analysis in comparison to chemically synthesized standards.

تحليل الطيفي الشامل من المستضدات Glycosphingolipid

Glycosphingolipids (GSL's) belong to the glycoconjugate class of biomacromolecules, which bear structural information for significant biological processes ...

Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay

Cryopreservation of peripheral blood leukocytes is widely used to preserve cells for immune response evaluations in clinical trials and offers many advantages for ease and standardization of immunological assessments, but detrimental effects of this process have been observed on some cell subsets, such as granulocytes, B cells, and dendritic cells 1-3. Assaying fresh leukocytes gives a more accurate picture of the in vivo state of the cells, but is often difficult to perform in the context of large clinical trials. Fresh cell assays are dependent upon volunteer commitments and timeframes and, if time-consuming, their application can be impractical due to the working hours required of laboratory personnel. In addition, when trials are conducted at multiple centers, laboratories with the resources and training necessary to perform the assays may not be located in sufficient proximity to clinical sites. To address these issues, we have developed an 11-color antibody staining panel that can be used with Trucount tubes (Becton Dickinson; San Jose, CA) to phenotype and enumerate the major leukocyte populations within the peripheral blood, yielding more robust cell-type specific information than assays such as a complete blood count (CBC) or assays with commercially-available panels designed for Trucount tubes that stain for only a few cell types. The staining procedure is simple, requires only 100 &mu;l of fresh whole blood, and takes approximately 45 minutes, making it feasible for standard blood-processing labs to perform. It is adapted from the BD Trucount tube technical data sheet (<a href="http://www.bdbiosciences.com/external_files/is/doc/tds/Package_Inserts_CE/live/web_enabled/23-3483-06_PI_Trucount tubes_CE_EN.pdf" target="_blank">version 8/2010</a>). The staining antibody cocktail can be prepared in advance in bulk at a central assay laboratory and shipped to the site processing labs. Stained tubes can be fixed and frozen for shipment to the central assay laboratory for multicolor flow cytometry analysis. The data generated from this staining panel can be used to track changes in leukocyte concentrations over time in relation to intervention and could easily be further developed to assess activation states of specific cell types of interest. In this report, we demonstrate the procedure used by blood-processing lab technicians to perform staining on fresh whole blood and the steps to analyze these stained samples at a central assay laboratory supporting a multicenter clinical trial. The video details the procedure as it is performed in the context of a clinical trial blood draw in the HIV Vaccine Trials Network (HVTN).

In this report, we demonstrate the staining and analysis steps of a phenotyping assay performed on fresh whole blood to enumerate major innate and adaptive leukocyte populations. We emphasize considerations for performing these procedures in the context of a multicenter clinical trial.

تعداد خلايا الدم البيضاء الكبرى الطرفية بالسكان الدم للمحاكمات متعددة المراكز السريرية باستخدام الدم الكامل الفحص Phenotyping

Cryopreservation of peripheral blood leukocytes is widely used to preserve cells for immune response evaluations in clinical trials and offers many ...

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Continuous advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance imaging (MRI) have greatly improved our ability to study physiological or pathological processes in living organisms. MRI is also proving to be a valuable tool for capturing transplanted cells in vivo. Initial cell labeling strategies for MRI made use of contrast agents that influence the MR relaxation times (T1, T2, T2*) and lead to an enhancement (T1) or depletion (T2*) of signal where labeled cells are present. T2* enhancement agents such as ultrasmall iron oxide agents (USPIO) have been employed to study cell migration and some have also been approved by the FDA for clinical application. A drawback of T2* agents is the difficulty to distinguish the signal extinction created by the labeled cells from other artifacts such as blood clots, micro bleeds or air bubbles. In this article, we describe an emerging technique for tracking cells in vivo that is based on labeling the cells with fluorine (19F)-rich particles. These particles are prepared by emulsifying perfluorocarbon (PFC) compounds and then used to label cells, which subsequently can be imaged by 19F MRI. Important advantages of PFCs for cell tracking in vivo include (i) the absence of carbon-bound 19F in vivo, which then yields background-free images and complete cell selectivityand(ii) the possibility to quantify the cell signal by 19F MR spectroscopy.

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Tracking of cells using MRI has gained remarkable attention in the past years. This protocol describes the labeling of dendritic cells with fluorine (19F)-rich particles, the in vivo application of these cells, and monitoring the extent of their migration to the draining lymph node with 19F/1H MRI and 19F MRS.

رصد هجرة الخلايا الجذعية باستخدام<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H التصوير بالرنين المغناطيسي

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field 4. The use of cell-based arenavirus minigenome systems together with the ability to generate recombinant infectious arenaviruses with predetermined mutations in their genomes has facilitated the investigation of the contribution of viral determinants to the different steps of the arenavirus life cycle, as well as virus-host interactions and mechanisms of arenavirus pathogenesis 1, 3, 11 . In addition, the development of trisegmented arenaviruses has permitted the use of the arenavirus genome to express additional foreign genes of interest, thus opening the possibility of arenavirus-based vaccine vector applications 5 . Likewise, the development of single-cycle infectious arenaviruses capable of expressing reporter genes provides a new experimental tool to improve the safety of research involving highly pathogenic human arenaviruses 16 . The generation of recombinant arenaviruses using plasmid-based reverse genetics techniques has so far relied on the use of rodent cell lines 7,19 , which poses some barriers for the development of Food and Drug Administration (FDA)-licensed vaccine or vaccine vectors. To overcome this obstacle, we describe here the efficient generation of recombinant arenaviruses in FDA-approved Vero cells.

Rescue of recombinant arenaviruses from cloned cDNAs, an approach referred to as reverse genetics, allows researchers to investigate the role of specific viral gene products, as well as the contribution of their different specific domains and residues, to many different aspects of the biology of arenavirus. Likewise, reverse genetics techniques in FDA-approved cell lines (Vero) for vaccine development provides novel possibilities for the generation of effective and safe vaccines to combat human pathogenic arenaviruses.

جيل من الفيروسة الرملية المؤتلف استحداث اللقاحات وافقت عليها الهيئة في خلايا فيرو

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

Identifying DNA Mutations in Purified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem cells are responsible for ensuring tissue homeostasis and repair throughout life, it is reasonable to hypothesize that the stem cell population is critical for preserving genomic integrity of tissues. Therefore, significant interest has arisen in assessing the impact of endogenous and environmental factors on genomic integrity in stem cells and their progeny, aiming to understand the etiology of stem-cell based diseases.
LacI transgenic mice carry a recoverable &#955;&#160;phage vector encoding the LacI reporter system, in which the LacI gene serves as the mutation reporter. The result of a mutated LacI gene is the production of &#946;-galactosidase that cleaves a chromogenic substrate, turning it blue. The LacI reporter system is carried in all cells, including stem/progenitor cells and can easily be recovered and used to subsequently infect E. coli. After incubating infected E. coli on agarose that contains the correct substrate, plaques can be scored; blue plaques indicate a mutant LacI gene, while clear plaques harbor wild-type. The frequency of blue (among clear) plaques indicates the mutant frequency in the original cell population the DNA was extracted from. Sequencing the mutant LacI gene will show the location of the mutations in the gene and the type of mutation.
The LacI transgenic mouse model is well-established as an in vivo mutagenesis assay. Moreover, the mice and the reagents for the assay are commercially available. Here we describe in detail how this model can be adapted to measure the frequency of spontaneously occurring DNA mutants in stem cell-enriched Lin-IL7R-Sca-1+cKit++(LSK) cells and other subpopulations of the hematopoietic system.

Here we describe an in vivo mutagenesis assay for small numbers of purified hematopoietic cells using the LacI transgenic mouse model.&#160;The LacI gene can be isolated to determine the frequency, location, and type of DNA mutants&#160;spontaneously arisen or after exposure to genotoxins.

تحديد الطفرات الحمض النووي في الخلايا الجذعية المكونة للدم تنقية / السلف

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, it is therefore important to have a quick and reliable way of measuring transcriptional activity in infected cells. Traditionally, transcription has been measured either by incorporation of radioactive nucleosides such as 3H-uridine followed by detection via autoradiography or scintillation counting, or incorporation of halogenated uridine analogs such as 5-bromouridine (BrU) followed by detection via immunostaining. The use of radioactive isotopes, however, requires specialized equipment and is not feasible in a number of laboratory settings, while the detection of BrU can be cumbersome and may suffer from low sensitivity.
The recently developed click chemistry, which involves a copper-catalyzed triazole formation from an azide and an alkyne, now provides a rapid and highly sensitive alternative to these two methods. Click chemistry is a two step process in which nascent RNA is first labeled by incorporation of the uridine analog 5-ethynyluridine (EU), followed by detection of the label with a fluorescent azide. These azides are available as several different fluorophores, allowing for a wide range of options for visualization.
This protocol describes a method to measure transcriptional suppression in cells infected with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12 using click chemistry. Concurrently, expression of viral proteins in these cells is determined by classical intracellular immunostaining. Steps 1 through 4 detail a method to visualize transcriptional suppression via fluorescence microscopy, while steps 5 through 8 detail a method to quantify transcriptional suppression via flow cytometry. This protocol is easily adaptable for use with other viruses.

This method describes the use of click chemistry to measure changes in host cell transcription after infection with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12. Results can be visualized qualitatively via fluorescence microscopy or obtained quantitatively through flow cytometry. This method is adaptable for use with other viruses.

باستخدام الكيمياء فوق لقياس تأثير عدوى فيروسية في خلية المضيف RNA التجميعي

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

Automated Cell Enrichment of Cytomegalovirus-specific T cells for Clinical Applications using the Cytokine-capture System

The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection occurring after allogeneic hematopoietic stem-cell transplantation. Viral-specific T cells from allogeneic donors, including third party donors, can be propagated ex vivo in compliance with current good manufacturing practice (cGMP), employing repeated rounds of antigen-driven stimulation to selectively propagate desired T cells. The identification and isolation of antigen-specific T cells can also be undertaken based upon the cytokine capture system of T cells that have been activated to secrete gamma-interferon (IFN-&#947;). However, widespread human application of the cytokine capture system (CCS) to help restore immunity has been limited as the production process is time-consuming and requires a skilled operator. The development of a second-generation cell enrichment device such as CliniMACS Prodigy now enables investigators to generate viral-specific T cells using an automated, less labor-intensive system. This device separates magnetically labeled cells from unlabeled cells using magnetic activated cell sorting technology to generate clinical-grade products, is engineered as a closed system and can be accessed and operated on the benchtop. We demonstrate the operation of this new automated cell enrichment device to manufacture CMV pp65-specific T cells obtained from a steady-state apheresis product obtained from a CMV seropositive donor. These isolated T cells can then be directly infused into a patient under institutional and federal regulatory supervision. All the bio-processing steps including removal of red blood cells, stimulation of T cells, separation of antigen-specific T cells, purification, and washing are fully automated. Devices such as this raise the possibility that T cells for human application can be manufactured outside of dedicated good manufacturing practice (GMP) facilities and instead be produced in blood banking facilities where staff can supervise automated protocols to produce multiple products.

The goal of this protocol is to manufacture pathogen-specific clinical-grade T cells using a bench-top, automated, second generation cell enrichment device that incorporates a closed cytokine capture system and does not require dedicated staff or use of a GMP facility. The cytomegalovirus pp65-specific-T cells generated can be directly administered to patients.

الآلي إثراء خلية من الفيروس المضخم للخلايا محددة خلايا T للتطبيقات السريرية باستخدام نظام خلوى التقاط

The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol specifically intended to measure antigen-specific killing without an infection. This protocol is designed and describes methods to overcome these limitations by allowing for the detection of antigen-specific killing of a target cell by CD8+ T cells in vivo. This is accomplished by merging a vaccination model with a traditional CFSE-labeled target killing assay. This combination allows the researcher to assess the antigen-specific CTL potential directly and quickly as the assay is not dependent upon tumor growth or infection. In addition, the readout is based on flow cytometry and so should be readily accessible to most researchers. The major limitation of the study is identifying the timeline in vivo that is appropriate to the hypothesis being tested. Variations in antigen strength and mutations in the T cells that may result in differential cytolytic function need to be carefully assessed to determine the optimal time for cell harvest and assessment. The appropriate concentration of peptide for vaccination has been optimized for hgp10025-33 and OVA257-264, but further validation would be needed for other peptides that may be more appropriate to a given study. Overall, this protocol allows a quick assessment of killing function in vivo and can be adapted to any given antigen.

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

The goal of this protocol is to allow for detection of in vivo antigen-specific killing of a target cell in a murine model.

في فيفو الفحص للكشف عن وظيفة محددة مستضد تي خلية عن استخدام نموذج التطعيم

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Generation of Large Numbers of Myeloid Progenitors and Dendritic Cell Precursors from Murine Bone Marrow Using a Novel Cell Sorting Strategy

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have recently been recognized to be more heterogeneous than previously appreciated. These cultures routinely contain moDC as well monocyte-derived macrophages (moMac), and even some less developed cells such as monocytes. The goal of this protocol is to provide a consistent method for identification and separation of the many cell types present in these cultures as they develop, so that their specific functions may be further investigated. The sorting strategy presented here separates cells first into four populations based on expression of Ly6C and CD115, both of which are expressed transiently by cells as they develop in GM-CSF-driven culture. These four populations include Common myeloid progenitors or CMP (Ly6C-, CD115-), granulocyte/macrophage progenitors or GMP (Ly6C+, CD115-), monocytes (Ly6C+, CD115+), and monocyte-derived macrophages or moMac (Ly6C-, CD115+). CD11c is also added to the sorting strategy to distinguish two populations within the Ly6C-, CD115- population: CMP (CD11c-) and moDC (CD11c+). Finally, two populations may be further distinguished within the Ly6C-, CD115+ population based on the level of MHC class II expression. MoMacs express lower levels of MHC class II, while a monocyte-derived DC precursor (moDP) expresses higher MHC class II. This method allows for the reliable isolation of several developmentally distinct populations in numbers sufficient for a variety of functional and developmental analyses. We highlight one such functional readout, the differential responses of these cell types to stimulation with Pathogen-Associated Molecular Patterns (PAMPs).

Here we provide a method for identifying and isolating large numbers of GM-CSF driven myeloid cells using high speed cell sorting. Five distinct populations (Common myeloid progenitors, granulocyte/macrophage progenitors, monocytes, monocyte-derived macrophages, and monocyte-derived DCs) can be identified based on Ly6C and CD115 expression.

توليد عدد كبير من فروعه النقوي وسلائف الخلايا الجذعية من نخاع العظام مورين باستخدام خلية رواية فرز استراتيجية

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have ...