עבודה זו נתמכה על ידי קרן המחקר של וויל וז'אן קולדוול של המרכז המקיף לסרטן באוניברסיטת מישיגן ובחלקה על ידי NIH grant CA82529 וקרן גילסון לונגנבו.

1. כתמי אלדפלור
<ol><li>הכנת דגימת תא: הכינו השעיית תא יחיד של תאים סרטניים, או מתאי גידול מתורבתים או מדגימות גידול שנקטפו זה עתה. לספור את התאים ולהתאים את השעיית התא לריכוז של 1 x 106 תאים / מיליליטר במאגר ALDEFLUOR Assay.</li>
	<li>תווית ארבע 12 מ"מ x 75 מ"מ מבחנות פוליסטירן כמו צינורות בקרה כדלקמן: #1: מוכתם, #2: ALDEFLUOR, #3: ALDEFLUOR בתוספת DEAB, ו #4: 7AAD.</li>
	<li>עבור צינורות בקרה אלה, מניחים השעיית תא 1 מ"ל לתוך #1 #4, אבל 2 מיליליטר לתוך צינור #2. מוסיפים 5 μl DEAB (מעכב ALDH) #3 הצינור ולשמור על קרח. לאחר מכן להוסיף 10 μl מופעל מצע ALDEFLUOR כדי צינור #2, לערבב ולהעביר מיד 1 מ"ל של התערובת כדי צינור #3.</li>
	<li>במקביל, להוסיף 2 μl מופעל ALDEFLUOR מצע לכל מיליון תאים לשאר התאים (מדגם צינורות) גם ב 1 x 106 תאים / מיליליטר ב ALDEFLUOR Assay Buffer.</li>
	<li>דגירה הן את 4 צינורות הבקרה ואת צינורות מדגם במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס אמבט מים.</li>
	<li>לאחר הדגירה, להוסיף 5 μl 7AAD לתוך צינור הבקרה #4, ו 1 μl 7AAD 1 x 106 תאים לצינור המדגם. דגירה 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>צנטריפוגה כל הצינורות במשך 5 דקות ב 250 x g ולהסיר supernatant.</li>
	<li>התחדשו בתאים במאגר השיאול ALDEFLUOR.</li>
	<li>בצע מיון מבוסס ציטומטריית זרימה.</li>
	<li>הגדר את שערי המיון באמצעות תאים מוכתמים ב- ALDEFLUOR שטופלו ב- DEAB כפקד שלילי ואת תאי הפרובידיום יודיד (PI) 7AAD מוכתמים לבקרת כדאיות. בהתבסס על פקדים אלה, נקבע שער כדי להבחין בין התאים ALDEFLUOR+/ALDHגבוה,D5 ו SCC7. שערים אלה ישמשו לאחר מכן כדי למיין את כל התאים לדוגמה שהוכנו לעיל עבור ALDEFLUOR +/ALDHגבוה D5 ו SCC7 תאים.</li>
</ol>2. הכנת תא גזע סרטני Lysate-דופק דנדריטי תא (CSC-TPDC) חיסון
<ol><li>המתת חסד עכברים (B6 סינגני ו- C3H, בהתאמה) באמצעות CO 2 ולבודד אתעצם הירך ועצמות השוקה.</li>
	<li>שים את העצמות 75% אתנול במשך 1 דקות בטמפרטורת החדר. ואז לשטוף את העצמות באמצעות HBSS.</li>
	<li>חותכים את הראש את העצמות ולהשתמש מחט 21 G ו 10 מ"ל מזרק לדחוף תאים לתוך צלחת.</li>
	<li>לשאוף ולפוצץ את התאים באמצעות המזרק כדי להפוך את ההשעיה תא יחיד.</li>
	<li>לאחר צנטריפוגה ב 1,500 סל"ד במשך 5 דקות, להשליך את supernatant. לאחר מכן להוסיף 5 מיליליטר RBC מאגר תמוגה כדי lysis RBC במשך 1 דקות ב 37 מעלות צלזיוס אמבט מים.</li>
	<li>ספור את מספר התא והתאם את השעיית התא לריכוז של מיליון תאים/מ"ל באמצעי מלא (CM) המכיל 10 ננוגרם/מיליליטר GM-CSF ו- 10 ng/ml IL-4.</li>
	<li>תרבית את התאים ולפצות CM בתוספת IL-4 ו GM-CSF 3 ימים לאחר מכן.</li>
	<li>ביוםהחמישי, לקצור את התאים התותבת בשלים (DC) ולהכין את מדיום בידוד DC המכיל 4.2 מיליליטר פתרון C בתוספת 1 מיליליטר אופטיפריפ צפיפות הדרגתי בינוני.</li>
	<li>להשעות את כדורי התא ב 5 מיליליטר CM. הוסף את המתלה התא על מדיום הבידוד לאט. צנטריפוגה ב-2,000 סל"ד בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>אסוף את בקרי ה- DC בין CM לבין אמצעי הבידוד. לספור את מספר התא ולהתאים את השעיית התא לריכוז של 1 מיליון תאים / מיליליטר במדיום תרבות המכיל 10 ng / ml GM-CSF ו 10 ng / ml IL-4.</li>
	<li>הכן lysates הגידול על ידי השעיית ALDHגבוה או לא ממוין D5 או SCC7 תאים בינוני תרבות כפוף חשיפות ההפשרה הקפאה מהירה ארבע פעמים ואחריו ספין ב ∼100 x g במשך 5 דקות כדי לאסוף את החלק הממברנה של lysates.</li>
	<li>כדי להכין CSC-TPDC, בקרי בקרה (DC) דופק עם lysate של תאיםגבוהים ALDH אוטולוגי. כדי להכין H-TPDC, DC דופק עם ליסקים תאים סרטניים הטרוגניים לא ממוינים. היחס בין DC לתאי הגידול lysate זהה.</li>
</ol>3. חיסון והערכת היעילות
<ol><li>לחסן עכברי B6 נורמלי בהתאמה עם 2,500 D5 CSC-TPDC או D5 H-TPDC תאים סרטניים תת עורית (s.c.). לחסן בעלי חיים רגילים C3H s.c. עם 5,000 SCC7 CSC-TPDC או SCC7 H-TPDC תאים סרטניים, בהתאמה.</li>
	<li>לאחר החיסון, אתגר את העכברים B6 עם תאים סרטניים D5 הטרוגניים i.v. המתת עכברים באמצעות CO2 20 ימים מאוחר יותר. לקצור את הריאות ולתאר גרורות ריאות.</li>
	<li>במודל SCC7, לאתגר את העכברים C3H עם תאי גידול SCC7 לא ממוינים s.c בצד השני של החיסון DC. לפקח על גודל הגידול.</li>
	<li>בסוף הניסויים המתת חסד עכברי B6 ו- C3H באמצעות CO2. ביום 34 לאחר החיסון הראשון, המתת חסד עכברים עם CO2, ובמקביל לאסוף את הטחולים של כל קבוצה עם הליך אספטי.</li>
	<li>הפעל תאי טחול T ו/או B עם אנטי-CD3 משותק בתוספת אנטי-CD28 mAbs ב- CM המכילים hrIL-2 או LPS בתוספת מיימת אנטי-CD40 (FGK45) mAb.</li>
	<li>לאחר ההפעלה, לאסוף supernatants ולהשתמש עבור ELISA assay.</li>
	<li>לבדיקת ELISA, צלחות מעיל עם נוגדנים ל-IFNγ, GM-CSF ו-IgG ב-4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>לאחר היישום של מאגר חסימה, להוסיף דגימות ותקנים דגירה בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לשטוף את הצלחת ולהוסיף נוגדן זיהוי HRP ומצע TMB עבור דגירה.</li>
	<li>למדוד את הספיגה על קורא צלחת ELISA ב 450 ננומטר בתוך 30 דקות לאחר עצירת התגובה.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Shafee, N., Smith, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+contribute+to+cisplatin+resistance+in+Brca1/p53-mediated+mouse+mammary+tumors.">Cancer stem cells contribute to cisplatin resistance in Brca1/p53-mediated mouse mammary tumors.</a> Cancer Res. 68, 3243-3250 (2008).</li><li>Nandi, S., Ulasov, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-dose+radiation+enhances+survivin-mediated+virotherapy+against+malignant+glioma+stem+cells.">Low-dose radiation enhances survivin-mediated virotherapy against malignant glioma stem cells.</a> Cancer Res. 68, 5778-5784 (2008).</li><li>Dallas, N. A., Xia, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoresistant+colorectal+cancer+cells,+the+cancer+stem+cell+phenotype,+and+increased+sensitivity+to+insulin-like+growth+factor-I+receptor+inhibition.">Chemoresistant colorectal cancer cells, the cancer stem cell phenotype, and increased sensitivity to insulin-like growth factor-I receptor inhibition.</a> Cancer Res. 69, 1951-1957 (2009).</li><li>Yamauchi, K., Yang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+cancer+metastasis+by+cyclophosphamide+pretreatment+of+host+mice:+an+opposite+effect+of+chemotherapy.">Induction of cancer metastasis by cyclophosphamide pretreatment of host mice: an opposite effect of chemotherapy.</a> Cancer Res. 68, 516-520 (2008).</li><li>Chang, A. E., Redman, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I+trial+of+tumor+lysate-pulsed+dendritic+cells+in+the+treatment+of+advanced+cancer.">A phase I trial of tumor lysate-pulsed dendritic cells in the treatment of advanced cancer.</a> Clin. Cancer Res. 8, 1021-1032 (2002).</li><li>Ito, F., Li, Q., Shreiner, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-CD137+monoclonal+antibody+administration+augments+the+antitumor+efficacy+of+dendritic+cell-based+vaccines.">Anti-CD137 monoclonal antibody administration augments the antitumor efficacy of dendritic cell-based vaccines.</a> Cancer Res. 64, 8411-8419 (2004).</li><li>Kirk, C. J., Hartigan-O'Connor, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell-dependent+antitumor+immunity+mediated+by+secondary+lymphoid+tissue+chemokine:+augmentation+of+dendritic+cell-based+immunotherapy.">T cell-dependent antitumor immunity mediated by secondary lymphoid tissue chemokine: augmentation of dendritic cell-based immunotherapy.</a> Cancer Res. 61, 2062-2070 (2001).</li><li>Ning, N., Pan, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cell+vaccination+confers+significant+antitumor+immunity.">Cancer stem cell vaccination confers significant antitumor immunity.</a> Cancer Res. 72, 1853-1864 (2012).</li><li>Ginestier, C., Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR1+blockade+selectively+targets+human+breast+cancer+stem+cells+in+vitro+and+in+xenografts.">CXCR1 blockade selectively targets human breast cancer stem cells in vitro and in xenografts.</a> J. Clin. Invest. 120, 485-497 (2010).</li><li>Carpentino, J. E., Hynes, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aldehyde+dehydrogenase-expressing+colon+stem+cells+contribute+to+tumorigenesis+in+the+transition+from+colitis+to+cancer.">Aldehyde dehydrogenase-expressing colon stem cells contribute to tumorigenesis in the transition from colitis to cancer.</a> Cancer Res. 69, 8208-8215 (2009).</li><li>Charafe-Jauffret, E., Ginestier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+cancer+cell+lines+contain+functional+cancer+stem+cells+with+metastatic+capacity+and+a+distinct+molecular+signature.">Breast cancer cell lines contain functional cancer stem cells with metastatic capacity and a distinct molecular signature.</a> Cancer Res. 69, 1302-1313 (2009).</li></ol>

STEMCELL טכנולוגיות תמכה בדמי פרסום של Open Access.

המארחים immunocompromised, כגון עכברי SCID, למנוע הערכות אימונולוגיות של CSCs בשל היעדר חסינות הסתגלות בתוך המארחים. במחקר זה, הערכנו את האימונוגניות של CSCs במארחים חיסוניים, אשר יכול לחקות באופן הדוק יותר את הגדרות המטופל. CSCs מועשרים הם אימונוגניים ויכולים לגרום לחסינות יעילה יותר להגנה מפני גידולים כאשר הליסטים שלהם נטענים ל- DCs כחיסון בהשוואה למחשבי DCs עם פעימות ליאסט של תאים סרטניים שלא נבחרו.  מבחינה מכנית, ההגנה הוענקה על ידי אינדוקציה סלקטיבית של נוגדנים תגובתי CSC ותאי T8, כמו גם ייצור של ציטוקינים מסוג 1, למשל IFNγ ו- GM-CSF.
רוב האימונותרפיות הנוכחיות, כולל חיסונים מבוססי תאים דנדריטיים והעברת תאי T מאמצים, נועדו למקד אנטיגנים מובחנים בגידולים. CSCs, אשר לא יכול לבטא אנטיגנים אלה מובחנים ולכן עשוי לברוח אלה מיקוד אימונולוגי. לעומת זאת, חיסון CSC שנועד במיוחד למקד תאי גזע סרטניים עלול להרוס אוכלוסייה מיוחדת זו של התאים הסרטניים, ובכך לשפר את היעילות הטיפולית של החיסון על ידי מניעת הישנות הגידול גרורות.
הן בתאי הגידול התרבותיים והן בגידולים שנקטפו זה עתה, זיהינו אוכלוסייה מועשרת ב- CSC על ידי ציטומטריית זרימה המבוססת על פעילות אלדהיד דהידרוגנאז גבוהה. תאיםגבוהים אלה ALDH יכול להיות מבודד על ידי מיון זרימה כדי לשמש כמקור אנטיגן דופק DC כדי ליצור CSC-TPDCs. השוואה באמצעות תאיםגבוהים ALDH מבודדים מתאי גידול מתורבת לעומת גידולים שנקטפו טריים לא הפגינו הבדל משמעותי בטווח של אינדוקציה של חסינות נגד CSC8. תוצאות אלו חשפו את הפוטנציאל להשתמש CSCs מבודדים או מתאי גידול מתורבתים או גידולים שנקטפו טריים ליישום קליני.
כדי להיות רלוונטי מבחינה קלינית, חיסון צריך להיבדק בסביבה טיפולית. ניסויים אלה מבוצעים כעת במעבדה שלנו.

תאי גזע סרטניים עמידים יחסית לכימותרפיה והקרנות קונבנציונליות1,2. מצד שני, אוכלוסייה זו של תאים עשויה להיות התאים האחראים על הישנות והתקדמות של סרטן לאחר טיפולים מסורתיים בסרטן1-4. בשל חוסר ביטוי של אנטיגנים סרטניים מובחנים על תאי גזע סרטניים, תאי גזע סרטניים עשויים לברוח התערבויות אימונולוגיות הנוכחי של טיפול בסרטן, אשר נועדו בעיקר למקד את האנטיגנים על תאים סרטניים מובחנים. לכן, פיתוח אסטרטגיות חדשות במיוחד מיקוד והרס תאי גזע סרטניים עשוי להחזיק הבטחות להגדיל את היעילות הטיפולית של הטיפול בסרטן הנוכחי. למטרה זו, בודדנו אוכלוסיות מועשרות בתאי גזע סרטניים (CSC) משני גידולים מן החי (מלנומה D5 וסרטן תאי קשקש SCC7), והשתמשנו בהם כמקור אנטיגן לדופק תאים מציגים אנטיגן (תאים דנדריטיים, DC) כדי להכין את החיסון CSC-TPDC. לאחר מכן הערכנו את חסינות האנטיטומור הנגרמת על ידי חיסון CSC-TPDC במארחים האימונו-כשירים הסיגניים, עכברי B6 ועכברי C3H בהתאמה. היעילות CSC-TPDC-induced antitumor הושווה עם החיסון DC המסורתי פעמו עם lysate מתאי גידול הטרוגניים לא ממוינים (H-TPDC), אשר שימש בעבר על ידי הקבוצה שלנו5,6, כמו גם על ידי חוקרים אחרים7 הן במחקרים פרה קליניים והן בניסויים קליניים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1022">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:405px;">ALDHEFLOUR KIT</td>
			<td style="width:399px;">Stemcell Technologies</td>
			<td style="width:219px;">1700</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:405px;">Murine IL-4</td>
			<td style="width:399px;">Pepro Tech</td>
			<td style="width:219px;">214-14</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:405px;">Murine GM-CSF</td>
			<td style="width:399px;">Pepro Tech</td>
			<td style="width:219px;">315-03</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:405px;">Mouse IFN-&#611; ELISA KIT</td>
			<td style="width:399px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:219px;">555138</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:405px;">Mouse GM-CSF ELISA KIT</td>
			<td style="width:399px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:219px;">555167</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:405px;">OptiPrep Density Gradient Medium</td>
			<td style="width:399px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">D1556</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:405px;">BD OptEIA TMB Substrated Reagent Set</td>
			<td style="width:399px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:219px;">555214</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;"></td>
			<td style="width:399px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;">Equipment</td>
			<td style="width:399px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;">BD FACS Aria Cell Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>336834</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:405px;">Kcjunior</td>
			<td style="width:399px;">Bio-Tek Instruments</td>
			<td style="width:219px;">176058</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of a novel dendritic-cell vaccine using melanoma and squamous cancer stem cells

זיהינו תא גזע סרטני (CSC)-מועשר אוכלוסיות מן מורין מלנומה D5 סינגנית C57BL/6 עכברים ואת סרטן קשקש SCC7 סינג'יני לעכברים C3H באמצעות ALDEFLUOR / ALDH כסמן, ובדק את האימונוגניות שלהם באמצעות ליזל התא כמקור של אנטיגנים דופק תאים דנדריטיים (DCs). DCs פעמו עם ALDHגבוה CSC lysates המושרה חסינות antitumor מגן גבוה משמעותית מאשר DCs פעמו עם lysates של ליסטים תאים סרטניים שלמים לא ממוינים בשני הדגמים בהגדרת גרורות ריאות ו s.c. הגדרת צמיחת הגידול, בהתאמה. תופעה זו נבעה מתגובות הומוריסטיות ומושרות על ידי CSC וכן תגובות אנטי-CSC תאיות. בפרט, טחול מבודד מהמארח נתון חיסון CSC-DC המיוצר כמות גבוהה משמעותית של IFNγ ו- GM-CSF מאשר טחול מבודד מהמארח נתון חיסון תאי גידול לא ממוין lysate פעמו-DC. תוצאות אלו תומכות במאמצים לפתח חיסון טיפולי מבוסס CSC אוטולוגי לשימוש קליני בסביבה אדג'ובנטית.

ALDEFLUOR / ALDH שימש כסמן יחיד כדי לבודד תאי גזע ממאירויות מרובות8-11. זיהינו אוכלוסיות מועשרות בתאי גזע סרטניים בשני דגמי גידולים D5 ו- SCC7 באמצעות ALDEFLUOR כסמן. זיהינו ALDEFLUOR+ תאים מורין מלנומה B16-D5 וסרטן תאים קשקש SCC7. מצאנו שתאי ALDEFLUOR+ תורמים כ-0.5% ו-5.2% בקווי התאים הגידולים D5 ו-SCC7, בהתאמה (איור 1). תאים סרטניים שנקטפו זה עתה מגידולים מבוססים נותחו כדי לאשר את קיומם של תאי ALDEFLUOR+ . כפי שמוצג גם באיור 1, היו 2.5% ו-4.2% מתאי ALDEFLUOR+ מגידולים מבוססים של Vivo D5 ו-SCC7, בהתאמה. הגידוליות ויכולת ההתחדשות העצמית של אוכלוסיותגבוהות אלה D5 ו- SCC7 ALDEFLUOR +/ALDH הוערכו במארח האימונו-כשיר הסיגני, בעכברי C57BL/6 ו- C3H, בהתאמה8.
השתמשנו lysate תא גידול לא ממוין הטרוגניים כדי דופק DC (H-TPDC) הן במחקרים שנעשו בבעלי חיים והן בניסויים קליניים5,6. כדי לבחון את האימונוגניות של CSCs, בודדנו את ה- CSCהגבוה של ALDH ופעמנו DC עם ליסק"ק שנוצר CSC-TPDC (איור 2) והשתמשנו ב- H-TPDC כבקרת חיסון קונבנציונלית לסרטן כדי לבדוק אם ל- CSC-TPDC יש השפעה מועילה במניעת צמיחת הגידול.
הערכנו את האימונוגניות של CSCs על ידי בחינת חסינות antitumor מגן המושרה על ידי CSC-TPDC. במודל D5, עכברים חיסוניים נאיביים חוסנו s.c עם CSC-TPDC או H-TPDC (באותו ליזאט: יחס DC). קבוצות בקרה קיבלו מלוחים (PBS). שבוע לאחר החיסון האחרון, העכברים אותגרו עם תאי גידול D5 לא ממוינים דרך הווריד (כלומר),והריאות נקצרו 3 שבועות לאחר מכן כדי למנות גרורות ריאות. כפי שמוצג בטבלה 1, בהשוואה לקבוצת PBS, עכברים שטופלו ב- H-TPDC פיתחו פחות גרורות ריאות. חשוב לציין, עכברים שטופלו CSC-TPDC היו באופן משמעותי פחות גרורות ריאות מאשר קבוצת חיסון H-TPDC בשני הניסויים שבוצעו. במודל SCC7, בעלי חיים רגילים C3H חוסנו s.c עם SCC7 CSC-TPDC או H-TPDC בהתאמה על האגף הימני, ואחריו מאתגר עם תאים סרטניים SCC7 לא ממוינים.c לאגף השמאלי. בהשוואה לקבוצת PBS, H-TPDC המושרה חסינות אנטי גידול צנוע נגד גידולים. עם זאת, היה עיכוב משמעותי של צמיחת הגידול בעכברים שטופלו ב- CSC-TPDC בהשוואה הן לקבוצת הביקורת והן לקבוצת H-TPDC (p<0.05, איור 3). תוצאות אלה מצביעות על כך CSCs יכול לשמש כמקור אנטיגן יעיל יותר לטעון DCs מאשר תאים סרטניים לא ממוינים מסורתיים בגרימת חסינות מגן מפני האתגר של תאים סרטניים.
כדי להבין עוד יותר את המנגנונים שבבסיס חסינות האנטי-טוטומור המגן הנצפה של CSC, קצרנו את הטחולים מבעלי החיים שנחשפו לחיסונים בוושינגטון בסוף הניסויים. תאי הטחול הופעלו לאחר מכן על-ידי אנטי-CD3/CD28/IL-2 או אנטי-CD3/CD28/IL-2 + LPS/אנטי-CD40. לאחר מכן נאספו supernatants התרבות כדי לזהות את הביטוי של ציטוקינים ונוגדנים.  היו הפקות גבוהות משמעותית של IFNγ ו- GM-CSF על ידי תאי הטחול מבעלי החיים שחוסנו עם D5 CSC-TPDC או SCC7 CSC-TPDC (איור 4). יתר על כן, היה ייצור IgG גבוה יותר באופן משמעותי (p<0.05) על ידי תאי טחול פעילים LPS/anti-CD40 שנאספו מבעלי החיים שחוסנו עם D5 CSC-TPDC או SCC7 CSC-TPDC בהשוואה ל- D5 H-TPDC או SCC7 H-TPDC. נוגדנים אלה נמצאו להיקשר D5 ו SCC7 CSCs בהתאמה, מחייב כזה יכול לגרום תמוגה CSC בנוכחות משלים8.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50561/50561fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50561/50561fig1.jpg"> איור 1. ALDHFLUOR +/ALDH אוכלוסיותגבוהות זוהו בתרבית, כמו גם לאחרונה שנקטפו מלנומה מורין D5 טריים וגידולי תא קשקש SCC7. תאים סרטניים שטופלו 50 mmol / L DEAB, מעכב ALDH ספציפי, שימשו כפקד שלילי.
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50561/50561fig1highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.</a> 
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50561/50561fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50561/50561fig2.jpg"> איור 2. דור של חיסונים מבוססי תאים דנדריטיים לתאי גזע סרטניים. להכנת CSC-TPDC ו H-TPDC, תאים דנדריטיים שמקורם במח העצם היו פעמו עם ALDHגבוה או לא ממוין תאי הגידול lysates, בהתאמה.
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50561/50561fig2highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.</a> 
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50561/50561fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50561/50561fig3.jpg"> איור 3. CSC lysate פעמו DC (CSC-TPDC) חיסון יכול לגרום יעיל יותר הגנה antitumor חסינות s.c. דגם גידול SCC7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50561/50561fig3highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.</a> 

<img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50561/50561fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50561/50561fig4.jpg"> איור 4. תגובות תאיות מערכתיות חזקות יותר במארח חיסוני מחוסן עם CSC-TPDC.  טחולים נקצרו מבעלי החיים שנחשפו לחיסון H-TPDC או CSC-TPDC, והופעלו כאמור. לאחר מכן נאספו סופרנטנטים תרבותיים לגילוי ציטוקינים באמצעות ELISA.
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50561/50561fig4highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Generation of a Novel Dendritic-cell Vaccine Using Melanoma and Squamous Cancer Stem Cells at JoVE.com

Generation of a Novel Dendritic-cell Vaccine Using Melanoma and Squamous Cancer Stem Cells

מוערך במארחים חיסוניים סינגניים, תא גזע סרטני (CSC) מבוסס תאים דנדריטיים (DC) החיסון הפגין חסינות antitumor גבוהה משמעותית מאשר חיסונים DC מסורתיים פעמו עם תאים סרטניים בתפזורת הטרוגנית.

יצירת חיסון חדשני לתאים דנדריטיים באמצעות מלנומה ותאי גזע סרטניים קשקשיים

We identified cancer stem cell (CSC)-enriched populations from murine melanoma D5 syngeneic to C57BL/6 mice and the squamous cancer SCC7 syngeneic to C3H ...

generation-novel-dendritic-cell-vaccine-using-melanoma-squamous

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.2K Views.  University of Michigan. מוערך במארחים חיסוניים סינגניים, תא גזע סרטני (CSC) מבוסס תאים דנדריטיים (DC) החיסון הפגין חסינות antitumor גבוהה משמעותית מאשר חיסונים DC מסורתיים פעמו עם תאים סרטניים בתפזורת הטרוגנית.

Video: Generation of a Novel Dendritic-cell Vaccine Using Melanoma and Squamous Cancer Stem Cells

Analysis of Pulmonary Dendritic Cell Maturation and Migration during Allergic Airway Inflammation

Dendritic cells (DCs) are the key players involved in initiation of adaptive immune response by activating antigen-specific T cells. DCs are present in peripheral tissues in steady state; however in response to antigen stimulation, DCs take up the antigen and rapidly migrate to the draining lymph nodes where they initiate T cell response against the antigen1,2. Additionally, DCs also play a key role in initiating autoimmune as well as allergic immune response3.
DCs play an essential role in both initiation of immune response and induction of tolerance in the setting of lung environment4. Lung environment is largely tolerogenic, owing to the exposure to vast array of environmental antigens5. However, in some individuals there is a break in tolerance, which leads to induction of allergy and asthma. In this study, we describe a strategy, which can be used to monitor airway DC maturation and migration in response to the antigen used for sensitization. The measurement of airway DC maturation and migration allows for assessment of the kinetics of immune response during airway allergic inflammation and also assists in understanding the magnitude of the subsequent immune response along with the underlying mechanisms.
Our strategy is based on the use of ovalbumin as a sensitizing agent. Ovalbumin-induced allergic asthma is a widely used model to reproduce the airway eosinophilia, pulmonary inflammation and elevated IgE levels found during asthma6,7. After sensitization, mice are challenged by intranasal delivery of FITC labeled ovalbumin, which allows for specific labeling of airway DCs which uptake ovalbumin. Next, using several DC specific markers, we can assess the maturation of these DCs and can also assess their migration to the draining lymph nodes by employing flow cytometry.

We describe a strategy to monitor maturation and migration of pulmonary dendritic cells in response to ovalbumin in the setting of ovalbumin induced allergic airway inflammation. This strategy can be modified to assess migration of pulmonary dendritic cells in settings of infection.

ניתוח של התבגרות ריאתי Cell Migration הדנדריטים ובמהלך דלקת אלרגית Airway

Dendritic cells (DCs) are the key players involved in initiation of adaptive immune response by activating antigen-specific T cells. DCs are present in ...

Mass Spectrometric Analysis of Glycosphingolipid Antigens

Glycosphingolipids (GSL's) belong to the glycoconjugate class of biomacromolecules, which bear structural information for significant biological processes such as embryonic development, signal transduction, and immune receptor recognition1-2. They contain complex sugar moieties in the form of isomers, and lipid moieties with variations including fatty acyl chain length, unsaturation, and hydroxylation. Both carbohydrate and ceramide portions may be basis of biological significance. For example, tri-hexosylceramides include globotriaosylceramide (Gal&alpha;4Gal&beta;4Glc&beta;1Cer) and isoglobotriaosylceramide (Gal&alpha;3Gal&beta;4Glc&beta;1Cer), which have identical molecular masses but distinct sugar linkages of carbohydrate moiety, responsible for completely different biological functions3-4. In another example, it has been demonstrated that modification of the ceramide part of alpha-galactosylceramide, a potent agonist ligand for invariant NKT cells, changes their cytokine secretion profiles and function in animal models of cancer and auto-immune diseases5. The difficulty in performing a structural analysis of isomers in immune organs and cells serve as a barrier for determining many biological functions6.
Here, we present a visualized version of a method for relatively simple, rapid, and sensitive analysis of glycosphingolipid profiles in immune cells7-9. This method is based on extraction and chemical modification (permethylation, see below Figure 5A, all OH groups of hexose were replaced by MeO after permethylation reaction) of glycosphingolipids10-15, followed by subsequent analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS) and ion trap mass spectrometry. This method requires 50 million immune cells for a complete analysis. The experiments can be completed within a week. The relative abundance of the various glycosphingolipids can be delineated by comparison to synthetic standards. This method has a sensitivity of measuring 1% iGb3 among Gb3 isomers, when 2 fmol of total iGb3/Gb3 mixture is present9.
Ion trap mass spectrometry can be used to analyze isomers. For example, to analyze the presence of globotriaosylceramide and isoglobtriaosylceramide in the same sample, one can use the fragmentation of glycosphingolipid molecules to structurally discriminate between the two (see below Figure 5). Furthermore, chemical modification of the sugar moieties (through a permethylation reaction) improves the ionization and fragmentation efficiencies for higher sensitivity and specificity, and increases the stability of sialic acid residues. The extraction and chemical modification of glycosphingolipids can be performed in a classic certified chemical hood, and the mass spectrometry can be performed by core facilities with ion trap MS instruments.

A specific and sensitive method to gain insight into the expression profile of glycosphingolipid antigens in immune organs and cells is described. The method takes advantage of the ion trap mass spectrometry allowing step-wise fragmentation of glycosphingolipid molecules for structural analysis in comparison to chemically synthesized standards.

ניתוח ספקטרומטריה של אנטיגנים Glycosphingolipid

Glycosphingolipids (GSL's) belong to the glycoconjugate class of biomacromolecules, which bear structural information for significant biological processes ...

Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay

Cryopreservation of peripheral blood leukocytes is widely used to preserve cells for immune response evaluations in clinical trials and offers many advantages for ease and standardization of immunological assessments, but detrimental effects of this process have been observed on some cell subsets, such as granulocytes, B cells, and dendritic cells 1-3. Assaying fresh leukocytes gives a more accurate picture of the in vivo state of the cells, but is often difficult to perform in the context of large clinical trials. Fresh cell assays are dependent upon volunteer commitments and timeframes and, if time-consuming, their application can be impractical due to the working hours required of laboratory personnel. In addition, when trials are conducted at multiple centers, laboratories with the resources and training necessary to perform the assays may not be located in sufficient proximity to clinical sites. To address these issues, we have developed an 11-color antibody staining panel that can be used with Trucount tubes (Becton Dickinson; San Jose, CA) to phenotype and enumerate the major leukocyte populations within the peripheral blood, yielding more robust cell-type specific information than assays such as a complete blood count (CBC) or assays with commercially-available panels designed for Trucount tubes that stain for only a few cell types. The staining procedure is simple, requires only 100 &mu;l of fresh whole blood, and takes approximately 45 minutes, making it feasible for standard blood-processing labs to perform. It is adapted from the BD Trucount tube technical data sheet (<a href="http://www.bdbiosciences.com/external_files/is/doc/tds/Package_Inserts_CE/live/web_enabled/23-3483-06_PI_Trucount tubes_CE_EN.pdf" target="_blank">version 8/2010</a>). The staining antibody cocktail can be prepared in advance in bulk at a central assay laboratory and shipped to the site processing labs. Stained tubes can be fixed and frozen for shipment to the central assay laboratory for multicolor flow cytometry analysis. The data generated from this staining panel can be used to track changes in leukocyte concentrations over time in relation to intervention and could easily be further developed to assess activation states of specific cell types of interest. In this report, we demonstrate the procedure used by blood-processing lab technicians to perform staining on fresh whole blood and the steps to analyze these stained samples at a central assay laboratory supporting a multicenter clinical trial. The video details the procedure as it is performed in the context of a clinical trial blood draw in the HIV Vaccine Trials Network (HVTN).

In this report, we demonstrate the staining and analysis steps of a phenotyping assay performed on fresh whole blood to enumerate major innate and adaptive leukocyte populations. We emphasize considerations for performing these procedures in the context of a multicenter clinical trial.

ספירה של אוכלוסיות גדולות דם היקפיות יקוציט לניסויי multicenter קליניים באמצעות Assay phenotyping דם מלא

Cryopreservation of peripheral blood leukocytes is widely used to preserve cells for immune response evaluations in clinical trials and offers many ...

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Continuous advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance imaging (MRI) have greatly improved our ability to study physiological or pathological processes in living organisms. MRI is also proving to be a valuable tool for capturing transplanted cells in vivo. Initial cell labeling strategies for MRI made use of contrast agents that influence the MR relaxation times (T1, T2, T2*) and lead to an enhancement (T1) or depletion (T2*) of signal where labeled cells are present. T2* enhancement agents such as ultrasmall iron oxide agents (USPIO) have been employed to study cell migration and some have also been approved by the FDA for clinical application. A drawback of T2* agents is the difficulty to distinguish the signal extinction created by the labeled cells from other artifacts such as blood clots, micro bleeds or air bubbles. In this article, we describe an emerging technique for tracking cells in vivo that is based on labeling the cells with fluorine (19F)-rich particles. These particles are prepared by emulsifying perfluorocarbon (PFC) compounds and then used to label cells, which subsequently can be imaged by 19F MRI. Important advantages of PFCs for cell tracking in vivo include (i) the absence of carbon-bound 19F in vivo, which then yields background-free images and complete cell selectivityand(ii) the possibility to quantify the cell signal by 19F MR spectroscopy.

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Tracking of cells using MRI has gained remarkable attention in the past years. This protocol describes the labeling of dendritic cells with fluorine (19F)-rich particles, the in vivo application of these cells, and monitoring the extent of their migration to the draining lymph node with 19F/1H MRI and 19F MRS.

נדידת תאים דנדריטים ניטור באמצעות<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H דימות תהודה מגנטית

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field 4. The use of cell-based arenavirus minigenome systems together with the ability to generate recombinant infectious arenaviruses with predetermined mutations in their genomes has facilitated the investigation of the contribution of viral determinants to the different steps of the arenavirus life cycle, as well as virus-host interactions and mechanisms of arenavirus pathogenesis 1, 3, 11 . In addition, the development of trisegmented arenaviruses has permitted the use of the arenavirus genome to express additional foreign genes of interest, thus opening the possibility of arenavirus-based vaccine vector applications 5 . Likewise, the development of single-cycle infectious arenaviruses capable of expressing reporter genes provides a new experimental tool to improve the safety of research involving highly pathogenic human arenaviruses 16 . The generation of recombinant arenaviruses using plasmid-based reverse genetics techniques has so far relied on the use of rodent cell lines 7,19 , which poses some barriers for the development of Food and Drug Administration (FDA)-licensed vaccine or vaccine vectors. To overcome this obstacle, we describe here the efficient generation of recombinant arenaviruses in FDA-approved Vero cells.

Rescue of recombinant arenaviruses from cloned cDNAs, an approach referred to as reverse genetics, allows researchers to investigate the role of specific viral gene products, as well as the contribution of their different specific domains and residues, to many different aspects of the biology of arenavirus. Likewise, reverse genetics techniques in FDA-approved cell lines (Vero) for vaccine development provides novel possibilities for the generation of effective and safe vaccines to combat human pathogenic arenaviruses.

דור של Arenavirus רקומביננטי לפיתוח חיסון בתאי Vero-FDA

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

Identifying DNA Mutations in Purified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem cells are responsible for ensuring tissue homeostasis and repair throughout life, it is reasonable to hypothesize that the stem cell population is critical for preserving genomic integrity of tissues. Therefore, significant interest has arisen in assessing the impact of endogenous and environmental factors on genomic integrity in stem cells and their progeny, aiming to understand the etiology of stem-cell based diseases.
LacI transgenic mice carry a recoverable &#955;&#160;phage vector encoding the LacI reporter system, in which the LacI gene serves as the mutation reporter. The result of a mutated LacI gene is the production of &#946;-galactosidase that cleaves a chromogenic substrate, turning it blue. The LacI reporter system is carried in all cells, including stem/progenitor cells and can easily be recovered and used to subsequently infect E. coli. After incubating infected E. coli on agarose that contains the correct substrate, plaques can be scored; blue plaques indicate a mutant LacI gene, while clear plaques harbor wild-type. The frequency of blue (among clear) plaques indicates the mutant frequency in the original cell population the DNA was extracted from. Sequencing the mutant LacI gene will show the location of the mutations in the gene and the type of mutation.
The LacI transgenic mouse model is well-established as an in vivo mutagenesis assay. Moreover, the mice and the reagents for the assay are commercially available. Here we describe in detail how this model can be adapted to measure the frequency of spontaneously occurring DNA mutants in stem cell-enriched Lin-IL7R-Sca-1+cKit++(LSK) cells and other subpopulations of the hematopoietic system.

Here we describe an in vivo mutagenesis assay for small numbers of purified hematopoietic cells using the LacI transgenic mouse model.&#160;The LacI gene can be isolated to determine the frequency, location, and type of DNA mutants&#160;spontaneously arisen or after exposure to genotoxins.

זיהוי מוטציות DNA בתאי גזע / אב המטוהר Hematopoietic

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, it is therefore important to have a quick and reliable way of measuring transcriptional activity in infected cells. Traditionally, transcription has been measured either by incorporation of radioactive nucleosides such as 3H-uridine followed by detection via autoradiography or scintillation counting, or incorporation of halogenated uridine analogs such as 5-bromouridine (BrU) followed by detection via immunostaining. The use of radioactive isotopes, however, requires specialized equipment and is not feasible in a number of laboratory settings, while the detection of BrU can be cumbersome and may suffer from low sensitivity.
The recently developed click chemistry, which involves a copper-catalyzed triazole formation from an azide and an alkyne, now provides a rapid and highly sensitive alternative to these two methods. Click chemistry is a two step process in which nascent RNA is first labeled by incorporation of the uridine analog 5-ethynyluridine (EU), followed by detection of the label with a fluorescent azide. These azides are available as several different fluorophores, allowing for a wide range of options for visualization.
This protocol describes a method to measure transcriptional suppression in cells infected with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12 using click chemistry. Concurrently, expression of viral proteins in these cells is determined by classical intracellular immunostaining. Steps 1 through 4 detail a method to visualize transcriptional suppression via fluorescence microscopy, while steps 5 through 8 detail a method to quantify transcriptional suppression via flow cytometry. This protocol is easily adaptable for use with other viruses.

This method describes the use of click chemistry to measure changes in host cell transcription after infection with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12. Results can be visualized qualitatively via fluorescence microscopy or obtained quantitatively through flow cytometry. This method is adaptable for use with other viruses.

שימוש בכימיה לחץ כדי למדוד את ההשפעה של זיהום ויראלי בסינתזת RNA Host-Cell

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

Automated Cell Enrichment of Cytomegalovirus-specific T cells for Clinical Applications using the Cytokine-capture System

The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection occurring after allogeneic hematopoietic stem-cell transplantation. Viral-specific T cells from allogeneic donors, including third party donors, can be propagated ex vivo in compliance with current good manufacturing practice (cGMP), employing repeated rounds of antigen-driven stimulation to selectively propagate desired T cells. The identification and isolation of antigen-specific T cells can also be undertaken based upon the cytokine capture system of T cells that have been activated to secrete gamma-interferon (IFN-&#947;). However, widespread human application of the cytokine capture system (CCS) to help restore immunity has been limited as the production process is time-consuming and requires a skilled operator. The development of a second-generation cell enrichment device such as CliniMACS Prodigy now enables investigators to generate viral-specific T cells using an automated, less labor-intensive system. This device separates magnetically labeled cells from unlabeled cells using magnetic activated cell sorting technology to generate clinical-grade products, is engineered as a closed system and can be accessed and operated on the benchtop. We demonstrate the operation of this new automated cell enrichment device to manufacture CMV pp65-specific T cells obtained from a steady-state apheresis product obtained from a CMV seropositive donor. These isolated T cells can then be directly infused into a patient under institutional and federal regulatory supervision. All the bio-processing steps including removal of red blood cells, stimulation of T cells, separation of antigen-specific T cells, purification, and washing are fully automated. Devices such as this raise the possibility that T cells for human application can be manufactured outside of dedicated good manufacturing practice (GMP) facilities and instead be produced in blood banking facilities where staff can supervise automated protocols to produce multiple products.

The goal of this protocol is to manufacture pathogen-specific clinical-grade T cells using a bench-top, automated, second generation cell enrichment device that incorporates a closed cytokine capture system and does not require dedicated staff or use of a GMP facility. The cytomegalovirus pp65-specific-T cells generated can be directly administered to patients.

העשרת תא אוטומטית של ציטומגלווירוס ספציפי תאי T ליישומים קליניים באמצעות מערכת ציטוקין ללכוד

The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol specifically intended to measure antigen-specific killing without an infection. This protocol is designed and describes methods to overcome these limitations by allowing for the detection of antigen-specific killing of a target cell by CD8+ T cells in vivo. This is accomplished by merging a vaccination model with a traditional CFSE-labeled target killing assay. This combination allows the researcher to assess the antigen-specific CTL potential directly and quickly as the assay is not dependent upon tumor growth or infection. In addition, the readout is based on flow cytometry and so should be readily accessible to most researchers. The major limitation of the study is identifying the timeline in vivo that is appropriate to the hypothesis being tested. Variations in antigen strength and mutations in the T cells that may result in differential cytolytic function need to be carefully assessed to determine the optimal time for cell harvest and assessment. The appropriate concentration of peptide for vaccination has been optimized for hgp10025-33 and OVA257-264, but further validation would be needed for other peptides that may be more appropriate to a given study. Overall, this protocol allows a quick assessment of killing function in vivo and can be adapted to any given antigen.

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

The goal of this protocol is to allow for detection of in vivo antigen-specific killing of a target cell in a murine model.

אין ויוו Assay גילוי של הפונקציה Cytolytic תא T אנטיגן ספציפי באמצעות מודל החיסון

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Generation of Large Numbers of Myeloid Progenitors and Dendritic Cell Precursors from Murine Bone Marrow Using a Novel Cell Sorting Strategy

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have recently been recognized to be more heterogeneous than previously appreciated. These cultures routinely contain moDC as well monocyte-derived macrophages (moMac), and even some less developed cells such as monocytes. The goal of this protocol is to provide a consistent method for identification and separation of the many cell types present in these cultures as they develop, so that their specific functions may be further investigated. The sorting strategy presented here separates cells first into four populations based on expression of Ly6C and CD115, both of which are expressed transiently by cells as they develop in GM-CSF-driven culture. These four populations include Common myeloid progenitors or CMP (Ly6C-, CD115-), granulocyte/macrophage progenitors or GMP (Ly6C+, CD115-), monocytes (Ly6C+, CD115+), and monocyte-derived macrophages or moMac (Ly6C-, CD115+). CD11c is also added to the sorting strategy to distinguish two populations within the Ly6C-, CD115- population: CMP (CD11c-) and moDC (CD11c+). Finally, two populations may be further distinguished within the Ly6C-, CD115+ population based on the level of MHC class II expression. MoMacs express lower levels of MHC class II, while a monocyte-derived DC precursor (moDP) expresses higher MHC class II. This method allows for the reliable isolation of several developmentally distinct populations in numbers sufficient for a variety of functional and developmental analyses. We highlight one such functional readout, the differential responses of these cell types to stimulation with Pathogen-Associated Molecular Patterns (PAMPs).

Here we provide a method for identifying and isolating large numbers of GM-CSF driven myeloid cells using high speed cell sorting. Five distinct populations (Common myeloid progenitors, granulocyte/macrophage progenitors, monocytes, monocyte-derived macrophages, and monocyte-derived DCs) can be identified based on Ly6C and CD115 expression.

דור מספר גדול של תאים מיאלואידים אבות ו מבשרי תא דנדריטי ממח העצם מאתר באמצעות תא הרומן מיון אסטרטגיה

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have ...