1. إعداد أقطاب ومحلول ملحي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد المالحة الفسيولوجية والأقطاب قبل أن يتم تشريح الحيوان. يتكون الحل علقة رينغر مما يلي: 115.3 مم كلوريد الصوديوم، 1.8 مم CaCl 2، 4.0 ملي بوكل، 10 ملي تريس / حمض الماليك أو HEPES. ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الأسلاك حج-CL بواسطة غمس سلك الفضة تنظيفها في كمية صغيرة من المبيض لمدة 20 دقيقة أو حتى السلك لديها الانتهاء من الرمادي الداكن على نحو سلس. يغسل السلك بالماء المقطر قبل استخدام. ثم ضع السلك إلى صاحب micropipette ان السدادات الى مكبر للصوت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الزجاج الكهربائي حادة من الزجاج البورسليكات باستخدام مجتذب ماصة. يجب أن تكون المقاومة الكهربائي بناء على أمر من 20 MΩ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الردم ماصة مع 3 M البوتاسيوم محلول خلات وضعه في حيز صاحب micropipette. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للإلكترود خارج الخلية إعداد ماصة الزجاج الحادة كما هو موضح أعلاه، وكسر غيض مرة أخرى من قبلفرك ماصة حادة أخرى بالقرب من حافة حادة. ثم اطلاق النار تلميع غيض بحيث لا المسيل للدموع أدوات الوصل. سوف أقطاب خارج الخلية البلاستيك أيضا العمل طالما هناك اتصالات جيدة بين القطب والعصب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج القطب تسجيل خارج الخلية إلى صاحب micropipette (مع سلك حج-CL) التي يتم تركيبها مع أنبوب المطاط وحقنة لشفط. استخدام حقنة لرسم المالحة في القطب على الأقل إلى مستوى السلك الفضة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الجهاز (مكبر للصوت والمعزل التحفيز) والمعلمات تسجيل البرنامج عن طريق اتباع دليل لديك وحدة تسجيل إشارة محددة. انظر Leksrisawat وآخرون. 22 لعرض التفاصيل حول المعدات المستخدمة في التجارب المذكورة أدناه. </li></ol> 2. بطني العقدة تشريح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح علقة في سيليكون طبق كبير مبطنة المطاط الصناعي مع حل علقة رينغر. إذا امتدت الحيوان طوليا وسوفيكون من الأسهل لإزالة الحبل البطني العصب (انظر الشكل 1A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع # 10 أو # 11 حجم مشرط، وجعل شق طولي مع تخفيضات الضحلة جدا في خط الوسط بطني. حوالي منتصف 2/3rd من قطع بطني هو مبين في الشكل 1B. ليس محاولة لقطع طريق تخزين الأسود (الجيب الدم البطنية) حتى يتم فتح بالكامل الحيوان وامتدت الجيوب الأنفية الدم دون مكامن الخلل. هذه الجيوب الأنفية الدم يمتد على طول هذا الحيوان على طول خط الوسط بطني. يرد VNC داخل هذه الأوعية الدموية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد أن تم قطع الجلد كامل طول الحيوان استخدام مقص القزحية الجميلة إلى نيك الجيب الدم (الشكل 2). تنزلق شفرة واحدة من مقص القزحية الجميلة تحت الجيوب الأنفية وزيادة طفيفة في شفرة لفصلها عن الأنسجة العصبية. قطع الجيوب الأنفية طول VNC مع تجنب الجذور العصبية والأعصاب قطعي، أو أدوات الوصل بين العقد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المقبل، وإزالة جزء من الحبل البطني العصب بواسطةقطع الجذور البعيدة إلى حيث ينضم إلى الأوعية الدموية الجذور. كرر هذه العملية لكل عقدة على طول الحبل البطني العصب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل جزء من واحد أو اثنين من العقد إلى طبق بتري أصغر. في العقد أو العقدة واحد يحتاج إلى أن يعلق مشدود مع بعض الركود. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دبوس أدوات الوصل والجذور بحيث يتم امتدت غمد العقدة الدبقية قليلا لمنع أجسام الخلايا العصبية من التحرك عندما التخوزق من خلال غمد الدبقية والخلايا العصبية في المصالح. يجب وضع دبابيس من خلال الجيوب الأنفية الأسود عن جذور وفي منتصف أدوات الوصل اثنين لتقليل الضرر من المحاور (الشكل 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع طبق بتري مع إعداد تحت المجهر وثبته مع الشمع في أسفل الإناء لمنع الحركة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التركيز بعناية شعاع الضوء باستخدام مرآة ومكثف الضوء على رؤية الخلايا العصبية كما في الشكل 4A (كما هو موضح في الشكل تخطيطي 4B </stرونغ&gt;). لاحظ اثنين من الخلايا رتزيوس كبيرة في وسط العقدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لجعل تسجيل داخل الخلايا من Rz مشاهدة، T، P، والخلايا العصبية N، وضع بعناية غيض من القطب على خلية من الفائدة وخفض بلطف غيض حتى ينظر إلى الدمل في غمد الدبقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اضغط على حامل قطب كهربائي أو مناور (بعناية فائقة) بحيث القطب غيض &quot;الملوثات العضوية الثابتة&quot; في الخلية من الفائدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن نبضات قصيرة (30-40 ميللي ثانية) من التيار الموجب (1-10 غ) في الخلية لاستحضار إمكانات العمل. </li></ol> 3. زراعة الخلايا العصبية من العقدة إعداد بطني <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دبوس الجانب البطني العقد حتى في صحن نظيف تحتوي على L-15 مع مصل العجل الجنين (FCS) (الشكل 3). دبوس الجذور بحيث يتم تمدد العقد قليلا كما فعلت أعلاه للحصول على تسجيلات داخل الخلايا. مع مقص غرامة، نيك الكبسولة الدبقية في نهاية واحدة، والانزلاق مقص شفرة واحدة تحت الكبسولة، ثم قص عبر كبسولة الدبقيةكما هو مبين في الشكل 5A. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر قسامة من كولاجيناز / Dispase إلى الطبق ومكان على شاكر لمدة 15 دقيقة. فحص الخلايا عن طريق تحريك سائل الإعلام والثقافة حول أجسام الخلايا عرضة للخطر. العودة الخلايا لشاكر لمدة 15 دقيقة أو أكثر أخرى حتى الخلايا يخرج مع الحد الأدنى من الشفط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ماصة تعلق على حقنة لاستخراج بلطف الخلايا من العقدة. النار تلميع غيض ماصة بحيث يكون أكبر قليلا من قطر جسم الخلية. لخلايا Rz مشاهدة في علقة الكبار، ينبغي أن يكون قطرها حوالي 50 ميكرون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مجموعة متنوعة من الماصات بأقطار مختلفة دون خيوط وهذا يقلل من فرص الخلايا الشائكة داخل ماصة. تخزين ماصات في زجاجة تحتوي على 80٪ من الإيثانول (ETOH) باستخدام القطن الكرة في أسفل لحماية نصائح من التقطيع. تذكر لغسل ETOH من ماصة مع المتوسط ​​قبل الشفط الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد العلاج الانزيم، تغسلالمتوسطة مع L-15 (مع FCS) 2X التي تحتوي على الانزيم. تحديد الخلايا من الفائدة ورسم لهم بلطف في ماصة عن طريق سحب المحقنة (الشكل 6A). أداء الخلايا يستنشق في طبق آخر والذي يحتوي على L-15 (مع FCS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حتى الآن، كانت كلها إجراءات غير معقمة. نفذ الخطوات التالية في غطاء العقيمة. وضع 3-4 قطرات كبيرة من معقم L-15 (مع FCS) في مواقع مختلفة داخل طبق بتري معقمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة الخلايا في واحدة من قطرات قبل الذكر، وتهب حول لهم في الانخفاض لغسلها. كرر هذا في سلسلة في 3 أو 4 قطرات من المتوسط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الخلايا في طبق بتري نظيفة مليئة L-15 (مع FCS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا لمدة 1-24 ساعة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك الخلايا النظيفة يمكن مطلي. من خلال ترك الخلايا لبضع ساعات أو بين عشية وضحاها المصفوفة خارج الخلية يأتي قبالة بسهولة. لوحة الخلايا على الفور لتوليد العمليات لفترة أطول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الركيزة العقيمة إلى معطف دي microwell<html> ش واتركه حتى يجف تماما (بين عشية وضحاها) قبل زراعة التجارب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد أن تم المغلفة الطبق، وغسل الطبق برفق مع الماء المعقم وبعد ذلك مع كمية صغيرة من متوسطة L-15. تذكر أن استخدام الحل L-15 دون FCS وأضاف للسماح للخلايا على الانضمام إلى الطبق. وسيلة يمكن تغيير بلطف لL-15 مع FCS بعد انضمت الخلايا إلى الركيزة. إذا كانت الخلايا لاستخدامها بعد ساعات قليلة من الطلاء، ثم التحول على المدى المتوسط ​​إلى L-15 مع FCS ليست ضرورية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الخلايا بجانب بعضها البعض في وقت والطلاء للحث على synaptogenesis السريع (الشكل 6B). بعد 24 ساعة قياس النشاط الفسيولوجي في أزواج من الخلايا العصبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام تقنيات الكهربية داخل الخلايا لتسجيل RP أو ردود متشابك في أزواج مثقف الخلايا (الخلايا العصبية من خلال تحفيز 1 إلكترود وسجل داخل الخلايا الاستجابات من الخلايا المقترنة باستخدام الخلايا القطب 2). </li></ol>عنوان &quot;&gt; 4. العقدة الجسم إعداد ستريت <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دبوس الجانب الظهري علقة أسفل في طبق مبطنة المطاط الصناعي كما هو موضح أعلاه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دبوس الجلد على جانب واحد مع الجذور على الجانب الآخر من العقدة مقطوعة (7A الشكل، تضخيم في الشكل 7B) أو جعل نافذة على الجانب البطني من علقة أكثر من العقدة (الشكل 7C) مع كل جذور للجسم الجدار سليمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الحصول على تسجيل داخل الخلايا مستقرة في واحدة من الخلايا الحسية (T، P، N) استخدام قضيب الزجاج الصغيرة التي تم إطلاق النار مصقول لمسة خفيفة على الجلد في نفس القطاع. إذا كانت الخلايا العصبية التي سجلت من هو الخلية N ثم سوف تحتاج المزيد من الضغوط ليتم تطبيقها على الجلد. في معظم الحالات، سوف الخلية N تستجيب فقط إذا تم مقروص الجلد مع ملاقط. لهذا السبب يجب أن يحاكم هذه الخلايا مشاركة واحدة قد يؤدي إلى تلف الجلد أو تهجير إعادة ترميز داخل الخلايا بواسطة إزعاج إعداد في مثل هذه الطريقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ينبغي للمرء أن يكونقادرة على رسم الجلد بسرعة والعقدة مع تفاصيل كافية أن خريطة واحدة حيث تطرق يمكن استخدامها لتحديد مجال تقبلا للعصبون معينة. بعد تسجيل أكبر عدد ممكن من الخلايا T و P ممكن على كلا الجانبين من العقدة محاولة الخلايا N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل فحص ما إذا كان لديها عمليات الخلايا العصبية الحسية التي تنتقل عبر أدوات الوصل بطريقة أو منقاري الذيلية ومن ثم الخروج جذور في الجزء المجاور للجلد، وأدوات الوصل بين العقد ويمكن خفض وحقول تقبلا إعادة النظر في ما يخص انتشار الكشف. في الأساس واحدة تدرس ما إذا كان هناك أي خسارة في مجال تقبلا. </li></ol> 5. حقن الأصباغ نيون <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد العقدة علقة كما هو موضح أعلاه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء مسرى مكروي مع حل لوسيفر الصفراء-CH (3.0٪) وكلوريد الليثيوم (300 ملم). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أسعد واحدة من الخلايا الحسية أو خلايا Rz مشاهدة على الجانب البطني من العقدة كما هو موضحأعلاه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن صبغة في الخلية عن طريق تمرير تيار السلبية (3NA) من خلال القطب لمدة 15 دقيقة. تعيين مدة النبضة إلى 100 ميللي ثانية وتردد إلى 2 هرتز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصور الخلايا العصبية مليئة الصبغة التي كتبها مثيرة الصبغة مع مصباح الزئبق وتصفية مجموعة FITC / GFP. </li></ol>

<ol>
	<li>Fuchs, P. A., Nicholls, J. G., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+properties+and+selective+connexions+of+identified+leech+neurones+in+culture.">Membrane properties and selective connexions of identified leech neurones in culture.</a> J Physiol. 316, 203-223 (1981).</li><li>Ready, D. F., Nicholls, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identified+neurones+isolated+from+leech+CNS+make+selective+connections+in+culture.">Identified neurones isolated from leech CNS make selective connections in culture.</a> Nature. 281, 67-69 (1979).</li><li>Blackshaw, S. E., Muller, K. J., Nicholls, J. G., Stent, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neurobiology of the Leech. , 51-78 (1981).</li><li>Drapeau, P., Sanchez-Armass, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+processing+and+selection+of+the+responses+to+serotonin+during+reinnervation+of+an+identified+leech+neuron.">Parallel processing and selection of the responses to serotonin during reinnervation of an identified leech neuron.</a> J Neurobiol. 20, 312-325 (1989).</li><li>Garcia, U., Grumbacher-Reinert, S., Bookman, R., Reuter, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+Na++and+K++currents+in+soma,+axons,+and+growth+cones+of+leech+Retzius+neurones+in+culture.">Distribution of Na+ and K+ currents in soma, axons, and growth cones of leech Retzius neurones in culture.</a> J. Exp. Biol. , 1-17 (1990).</li><li>Cooper, R. L., Miguel Fernandez, d. e., Adams, F., B, W., Nicholls, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse+formation+inhibits+expression+of+calcium+currents+in+purely+postsynaptic+cells.">Synapse formation inhibits expression of calcium currents in purely postsynaptic cells.</a> Proc. R. Soc. B-Biol. Sci. , 217-222 (1992).</li><li>Liu, Y., Nicholls, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steps+in+the+development+of+chemical+and+electrical+synapses+by+pairs+of+identified+leech+neurons+in+culture.">Steps in the development of chemical and electrical synapses by pairs of identified leech neurons in culture.</a> Proc. R. Soc. B-Biol. Sci. , 236-253 (1989).</li><li>Fernandez de Miguel, F., Cooper, R. L., Adams, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptogenesis+and+calcium+current+distribution+in+cultured+leech+neurons.">Synaptogenesis and calcium current distribution in cultured leech neurons.</a> Proc. R. Soc. B-Biol. Sci. 247, 215-221 (1992).</li><li>Briggman, K. L., Kristan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional+pattern-generating+circuits.">Multifunctional pattern-generating circuits.</a> Annu. Rev. Neurosci. 31, 271-294 (2008).</li><li>Macagno, E. R., Muller, K. J., Deriemer, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+axons+and+synaptic+connections+by+touch+sensory+neurons+in+the+leech+central+nercoys+system.">Regeneration of axons and synaptic connections by touch sensory neurons in the leech central nercoys system.</a> J. Neurosci. 5, 2510-2521 (1985).</li><li>Becker, T., Macagno, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CNS+control+of+a+critical+period+for+peripheral+induction+of+central+neurons+in+the+leech.">CNS control of a critical period for peripheral induction of central neurons in the leech.</a> Development. 116, 427-434 (1992).</li><li>Marin-Burgin, A., Kristan, W. B., French, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Synapses+to+behavior:+Development+of+a+sensory-motor+circuit+in+the+leech.">From Synapses to behavior: Development of a sensory-motor circuit in the leech.</a> Dev. Neurobiol. 68, 779-787 (2008).</li><li>Kristan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Neurobiology+of+Swimming+in+the+leech.">The Neurobiology of Swimming in the leech.</a> Trends Neurosci. 6, 84-88 (1983).</li><li>Brodfuehrer, P. D., Friesen, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+stimulation+to+undulation:+a+neuronal+pathway+for+the+control+of+swimming+in+the+leech.">From stimulation to undulation: a neuronal pathway for the control of swimming in the leech.</a> Science. 234, 1002-1004 (1986).</li><li>Arbas, E. A., Calabrese, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slow+oscillations+of+membrane+potential+in+interneurons+that+control+heartbeat+in+the+medicinal+leech.">Slow oscillations of membrane potential in interneurons that control heartbeat in the medicinal leech.</a> J. Neurosci. 7, 3953-3960 (1987).</li><li>Ching, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Synaptogenesis between identified neurons. , (1995).</li><li>Kristan, W. B., Eisenhart, F. J., Johnson, L. A., French, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+neuronal+circuits+and+behaviors+in+the+medicinal+leech.">Development of neuronal circuits and behaviors in the medicinal leech.</a> Brain Res. Bull. 53, 561-570 (2000).</li><li>French, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junction+expression+is+required+for+normal+chemical+synapse+formation.">Gap junction expression is required for normal chemical synapse formation.</a> J. Neurosci. 30, 15277-15285 (2010).</li><li>Li, Q., Burrell, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+forms+of+long-term+depression+in+a+polysynaptic+pathway+in+the+leech+CNS:+one+NMDA+receptor-dependent+and+the+other+cannabinoid-dependent.">Two forms of long-term depression in a polysynaptic pathway in the leech CNS: one NMDA receptor-dependent and the other cannabinoid-dependent.</a> J. Comp. Physiol. A Neuroethol. Sens. Neural Behav. Physiol. 195, 831-841 (2009).</li><li>Nicholls, J. G., Baylor, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+modalities+and+receptive+fields+of+sensory+neurons+in+CNS+of+the+leech.">Specific modalities and receptive fields of sensory neurons in CNS of the leech.</a> J. Neurophysiol. 31, 740-756 (1968).</li><li>Yau, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptive+fields,+geometry+and+conduction+block+of+sensory+neurones+in+the+central+nervous+system+of+the+leech.">Receptive fields, geometry and conduction block of sensory neurones in the central nervous system of the leech.</a> J. Physiol. 263, 513-538 (1976).</li><li>Leksrisawat, B., Cooper, A. S., Gilberts, A. B., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+receptor+organs+in+the+crayfish+abdomen:+a+student+laboratory+exercise+in+proprioception.">Muscle receptor organs in the crayfish abdomen: a student laboratory exercise in proprioception.</a> J. Vis. Exp. (45), e2323 (2010).</li><li>Crisp, K. M., Mesce, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+the+central+pattern+generator:+amine+modulation+of+decision-making+neural+pathways+descending+from+the+brain+of+the+medicinal+leech.">Beyond the central pattern generator: amine modulation of decision-making neural pathways descending from the brain of the medicinal leech.</a> J. Exp. Biol. 209, (2006).</li><li>Puhl, J. G., Mesce, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+activates+the+motor+pattern+for+crawling+in+the+medicinal+leech.">Dopamine activates the motor pattern for crawling in the medicinal leech.</a> J. Neurosci. 28, 4192-4200 (2008).</li><li>Crisp, K. M., Gallagher, B. R., Mesce, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+contributing+to+the+dopamine+induction+of+crawl-like+bursting+in+leech+motoneurons.">Mechanisms contributing to the dopamine induction of crawl-like bursting in leech motoneurons.</a> J. Exp. Biol. 215, 3028-3036 (2012).</li><li>Macagno, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+a+medicinal+leech+transcriptome+database+and+its+application+to+the+identification+of+leech+homologs+of+neural+and+innate+immune+genes.">Construction of a medicinal leech transcriptome database and its application to the identification of leech homologs of neural and innate immune genes.</a> BMC Genomics. 11, 407 (2010).</li><li>Kandarian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+medicinal+leech+genome+encodes+21+innexin+genes:+different+combinations+are+expressed+by+identified+central+neurons.">The medicinal leech genome encodes 21 innexin genes: different combinations are expressed by identified central neurons.</a> Dev. Genes Evol. 222, 29-44 (2012).</li><li>Shefi, O., Simonnet, C., Groisman, A., Macagno, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+RNAi+and+ectopic+gene+expression+in+the+medicinal+leech.">Localized RNAi and ectopic gene expression in the medicinal leech.</a> J. Vis. Exp. (14), e697 (2008).</li><li>Firme, C. P., Natan, R. G., Yazdani, N., Macagno, E. R., Baker, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectopic+expression+of+select+innexins+in+individual+central+neurons+couples+them+to+pre-existing+neuronal+or+glial+networks+that+express+the+same+innexin.">Ectopic expression of select innexins in individual central neurons couples them to pre-existing neuronal or glial networks that express the same innexin.</a> J. Neurosci. 32, 14265-14270 (2012).</li><li>Siddall, M. E., Trontelj, P., Utevsky, S. Y., Nkamany, M., Macdonald, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+molecular+data+demonstrate+that+commercially+available+medicinal+leeches+are+not+Hirudo+medicinalis.">Diverse molecular data demonstrate that commercially available medicinal leeches are not Hirudo medicinalis.</a> Proc. Biol. Sci. 274, 1481-1487 (2007).</li></ol>

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

وكان الغرض من هذه المجموعة من التجارب 1) لتعليم ويحمل المبادئ الأساسية للتسجيلات داخل الخلايا من الخلايا العصبية يمكن تحديدها و2) التعرف على الأشكال المميزة من الإشارات الكهربائية التي يمكن أن تنشأ من هذه الأنواع العصبية معينة باستخدام العلق الكبار. هناك تاريخ غني من التحقيقات باستخدام علقة للتحقيقات العصبية والبحث جار في معالجة مسائل الدوائر العصبية وتنظيم الجينات خلال التنمية، وكذلك خلال إصلاح وتجديد متشابك 10. تعديل العمليات العصبية، لا سيما من خلال مسارات أمين الاحيائية، وقد تم أيضا اتجاه البحوث الناجحة في علقة. بإضافة الدوبامين وكلاء الدوائية الأخرى إلى الجهاز العصبي من خلال محلول ملحي، وقد تبين أن ينظم الشبكات العصبية الدوبامين المشاركة في 23 و أنماط السلوك الحركي للالزحف 24،25 صنع القرار. هذا النهج التجريبي هو المبسطةلو (وغير مكلفة) طريقة لدمج التشكيل في المختبر التدريس، وتعديل التركيبة الأيونية للمحلول ملحي هو وسيلة فعالة لتعليم المعادلات نرنست وغولدمان هودجكين-كاتز. لتكون ناجحة مع الاستعدادات العقدة فمن المهم أن يكون العقدة مشدود قبل محاولة لكزة سوما مع القطب داخل الخلايا. وإلا فإن سوما سوف تتحرك عند الضغط لأسفل على حزمة الدبقية. بالإضافة إلى ذلك، عندما desheathing العقدة لإزالة الخلايا العصبية للثقافة، وتجنب المنطقة من اهتمام عندما قطع عبر العقدة حتى لا تتضرر SOMAS كما تتم إزالتها. أيضا، الحضانة المفرطة في الإنزيمات قد يؤدي في الخلايا العصبية كونها هشة جدا بحيث لا يمكن إزالتها. أنها تتطلب بعض التجربة والخطأ لتحقيق فترة حضانة مثالية لأن كل دفعة من الانزيمات هي مختلفة قليلا في أعمالهم. مزيد من التحقيقات لتحسين سائل الإعلام والثقافة يمكن أن تحسن هذه التقنية. فاريالعوامل الأوس، مثل وجود الأنسولين، والسكريات، أو عوامل نمو يمكن دراستها لصيانة أطول من الثقافات. لتحديد ما إذا كان الحفاظ على الخلايا قدرتها على تجميع أجهزة الإرسال، مثل تخليق السيروتونين في الخلايا Rz مشاهدة، وتلطيخ أحمر محايدة يمكن تطبيقها على تسمية العمليات هرمون السيروتونين. الغزو دبقية أيضا إلى النسيج المصاب وتجديد يمكن قياسها كميا بواسطة البقع النووية يوما بعد الاصابة. على الرغم من أن هذا المستحضر له فوائد عديدة لتقدمه في دراسة التجديد والإصلاح، فضلا عن الدوائر العصبية، وتحديد الدوائية والجزيئية لمختلف أنواع فرعية مستقبلات في نقاط الاشتباك العصبي لم تتميز بشكل كامل. تسلسل مكتبة العلامة أعرب متاح 26، ويجري حاليا تجميع الجينوم الطبية علقة 27، ولكن القيد الرئيسي في علقة مقارنة ببعض الاستعدادات النموذج هو القدرة على تعديل الجينات في الجينوم للانتقائية في أنواع معينة من الخلايا. في الأجنة روقد تناولت الحد له عن طريق حقن الحمض النووي أو الرنا المزدوج الجديلة لتنظيم التعبير الجيني 28. وقد تم مؤخرا استخدام تقنية مدفع الجينات للتعبير عن connexin اللافقارية (innexin) البروتينات في الخلايا العصبية علقة. تعبير عن innexin من العلقة verbana (HVE-inx6) كافية لتشكيل تقاطعات الفجوة خارج الرحم في علقة الطبية 29. علقة أو الطبية H. لويزة كما انها كانت 30 من المؤكد أن تقدم فهمنا للعلم وظائف الأعضاء وتطور من نقاط الاشتباك العصبي الكهربائي على مدى السنوات القليلة المقبلة.

إعداد علقة مفيد للتحقيق وظيفة يمكن تحديدها (الحسية والحركية وبين الخلايا العصبية داخل الجهاز العصبي المركزي الحيوان (CNS). الخاصية مفيدة من الخلايا العصبية علقة هو أن شكل امكانات العمل وممتلكاتهم الفيزيائية الحيوية هي سمة ل نظرا نوع من الخلايا (أي P، N، T، Rz مشاهدة). الخلايا العصبية وعلاوة على ذلك يمكن إزالتها من الحيوان والمثقف في وسيلة مناسبة في الخلايا التي تحافظ على خصائصها الكهربائية لطالما 45 يوما 1،2. وهناك ميزة متميزة من العقدة علقة لتعلم كيفية جعل التسجيلات الكهربية هو أن الخلايا مميز وموثوق بها مرتبة في العقدة في النمط الذي يسمح تحديد أنواع الخلايا متميزة من العقدة إلى العقدة ومن الحيوان الى الحيوان. وأشار الموقع الفريد ومورفولوجيا الخلايا العصبية في العقد علقة بواسطة رتزيوس في وقت مبكر من 1891 3. المعرفة من الالهوية الإلكترونية وظيفة الخلايا العصبية هو مفيد للتحقيق في الدوائر العصبية وبإجراء تجارب مع نوع من الخلايا معين. ويرجع ذلك إلى somata كبيرة نسبيا من الخلايا العصبية ضمن العقدة تكون مرئية مع مجهر تشريح، وsomata يمكن مخوزق انتقائي مع microelectrodes لتسجيل ممتلكاتهم الكهربائية. ويمكن حقن الأصباغ والجزيئات الكبيرة إلى الخلايا الفردية وخصائص القناة التي يدرسها المشبك التصحيح. وقد تم تحديد التيارات الأيونية التي تؤدي إلى أشكال مختلفة من إمكانات العمل المميزة في مختلف الخلايا العصبية 4-7. من التحقيقات في نمط تعصيب والمتفرعة من الخلايا العصبية الفردية داخل الجهاز العصبي المركزي، وقد استنسخت الاتصالات متشابك في الثقافة مع الخلايا العصبية التي تم تحديدها 2،8. وقد وفرت دراسات في العقد علقة ثاقبة في تطوير الدوائر الوظيفية التي يمكن قياسها مع الكهربية وكذلك مع مصنعونالبريد سلوك الحيوان الدراسات. وقد عمل الجهاز العصبي المركزي علقة أيضا تمهيدا للتحقيق قيمة الآليات التي تشارك مع إصلاح الخلايا العصبية والتجديد في الحيوان كله وفي الثقافة 4-6،9-12. في أدمغة الثدييات بل هو مهمة شاقة لتفسير السلوك من حيث الخصائص وصلات الخلايا العصبية التي تم تحديدها الفردية. من حيث المبدأ يمكن للمرء أن يأمل أن دراسة أنظمة أقل تعقيدا مثل علقة يمكن أن تساعد على تحديد الآليات الأساسية المستخدمة في الحيوانات العليا. الاتصالات التي تستخدم التي تكمن وراء وجود نمط السباحة 13،14 والنظمية من القلب 15 وقد اتسمت جيدا في علقة. قدرة بعض الخلايا العصبية علقة لتشكيل كل من الاتصالات الكهربائية والكيميائية للفضول. بعض الاتصالات هي ثنائية الاتجاه حين أن البعض الآخر أحادي الاتجاه ثنائي الاتجاه ولكن كيميائيا كهربائيا 7. فهم اتصالات متشابك داخل الحيوان فضلا عن إعادة نفس الطباع(ه) من اتصالات في صحن الثقافة هي أدوات قوية للتحقيق في synaptogenesis 16-18 وكذلك التنميط الدوائية من نقاط الاشتباك العصبي 19. تقنيات التسجيل وتحفيز الخلايا الموصوفة هنا توفر أساسا لفحوصات الدوائية والبحوث في neuroethology والتنمية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تشريح قطعي الحبل البطني العصب مع رقعة من الجلد معصب. مع القدرة على الحفاظ على رقعة من الجلد والخلايا العصبية على قيد الحياة، وحقول تقبلا الحسية يمكن بحثها من خلال تسجيل الإشارات الكهربائية من خلايا الجسم (أي سوما) من الخلايا العصبية الحسية داخل العقدة في البطن منها في الجهاز العصبي المركزي. وبالتالي يمكن للمرء أن تقييم حساسية النهايات الحسية من خلال تطبيق درجات متفاوتة من القوة على الجلد وتعيين حقول تقبلا: لمسة خفيفة، والضغط، والضارة (مؤلمة) محفزات 20،21. ميزة هذا علقة إعداد العقدة الجلد هو أن كاليفورنيا واحدةن رسم خريطة الحقل تشريحيا تقبلا وتتبع العمليات العصبية إلى الخلايا العصبية التي تم تحديدها مرة واحدة ويتم تسجيل الاستجابات الكهربائية. التجارب علقة الثلاث المذكورة أدناه يمكن أن تكتمل كل عدة مرات مع عينة واحدة، مما يجعل هذا وحدة نمطية التدريس فعالة من حيث التكلفة للمختبرات الأكاديمية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="256">
	<colgroup>
		<col span="4" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:64px;">Sylgard</td>
			<td style="width:64px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:64px;">&#160;182 silicone kit</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;P9333&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;C5670&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Tris/maleic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Bleach&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>To chloride silver wire</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">NaOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;221465&#160;</td>
			<td>To adjust pH</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;H1758</td>
			<td>To adjust pH</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="3" height="21" style="height:21px;">CULTURING MATERIALS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Name of the Reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Collagenase/Dispase</td>
			<td>Boehringer Mannheim&#160;</td>
			<td>&#160;269-638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Leibovitz L-15 with L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>041-01415H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="43" rowspan="2" style="height:43px;">Fetal calf serum</td>
			<td>Ready Systems Ag&#160;</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">04-001</td>
		</tr>
		<tr height="102">
			<td height="102" style="height:102px;">D-Glucose-Monohydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Gentamycin sulfate&#160;</td>
			<td>any&#160; supplier</td>
			<td></td>
			<td>10 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>043-0503H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>3375</td>
			<td>Free acid, crystalline</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Concanavalin A Type IV</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>C 2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Poly-L-Lysine Hydrobromide</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P 7890</td>
			<td>MW 15-30,000</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">&#160;Microwell plate, 60 x 10 &#956;l</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>3034</td>
			<td>Flat bottom, 10 in a bag</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Material Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Dissecting tools</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>&#160;assortment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Intracellular electrode probe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Faraday cage</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Insect Pins</td>
			<td>Fine Science Tools, Inc</td>
			<td>&#160;26001-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Dissecting microscope (100X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Fiber optic lamp</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Small adjustable mirror</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To direct light beam toward the preparation.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Glass electrodes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;CLS7095B5X</td>
			<td>Box of 200, Suction electrodes</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Micromanipulator</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>&#160;MD4-M3-R</td>
			<td>&#160;Can fix for base or on a metal rod</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Raised preparation stand</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Silver wire (10/1,000 inch)</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>&#160;782500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Computer</td>
			<td>any company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">AC/DC differential amplifier</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>Model 3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">PowerLab 26T</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td>&#160;27T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Head stage</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Comes with AC/DC amplifier</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">LabChart7</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Electrical leads</td>
			<td>any company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Glass tools&#160;</td>
			<td>make yourself</td>
			<td></td>
			<td>For manipulating nerves</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Cable and connectors</td>
			<td>any company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Pipettes with bulbs&#160;</td>
			<td>&#160;Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>&#160;13-711-7</td>
			<td>Box of 500</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Beakers</td>
			<td>any company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Wax or modeling clay</td>
			<td>any company or local stores</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Stimulator</td>
			<td>Grass Instruments</td>
			<td>SD9 or S88</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="43" rowspan="2" style="height:43px;">Plastic tip for suction electrode</td>
			<td rowspan="2">local hardware store (Watt&#8217;s brand)</td>
			<td rowspan="2">&#188; inch OD x 0.170 inch ID</td>
			<td>Cut in small pieces. Pull out over a flame and cut back the tip to the correct size.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intracellular recording, sensory field mapping, and culturing identified neurons in the leech, hirudo medicinalis

علقة المياه العذبة، العلقة medicinalis، هو كائن نموذج متعدد الاستعمالات التي استخدمت لمعالجة المسائل العلمية في مجالات الفسيولوجيا العصبية، neuroethology، والبيولوجيا التطورية. الهدف من هذا التقرير هو تعزيز أساليب فنية تجريبية من نظام علقة في مادة واحدة من شأنها أن تكون ذات فائدة للفسيولوجي ذوي الخبرة في غيرها من الاستعدادات الجهاز العصبي، أو لطلاب البيولوجيا مع خبرة قليلة أو معدومة الكهربية. ونحن لشرح كيفية تشريح علقة لتسجيل داخل الخلية من الدوائر العصبية التي تم تحديدها في العقدة. المقبل نظهر كيف يمكن إزالة الخلايا الفردية من وظيفة معروفة من العقدة ليكون مثقف في طبق بيتري، وكيفية تسجيل من تلك الخلايا العصبية في الثقافة. ثم نحن لشرح كيفية إعداد رقعة من الجلد معصب لاستخدامها لرسم خرائط حقول الحسية أو الحركية. لا تزال تستخدم على نطاق واسع هذه الاستعدادات علقة لمعالجة الخصائص الكهربائية الأساسية من الشبكه العصبيةكانساس، والسلوك synaptogenesis، و، والتنمية. بل هي أيضا وحدة التدريب المناسب لعلم الأعصاب أو علم وظائف الأعضاء مختبرات التدريس.

وتتميز تسجيلات داخل الخلايا من الخلايا العصبية الحسية في العقدة علقة كتبها متميزة آثار الجهد وقتهم هو مبين في الشكل 4C. ويستريح المحتملة غشاء الخلية في الخلايا علقة العقدة صحي هو -45 إلى -60 بالسيارات. إذا الامكانيات هي أصغر (أقل سلبية) ينبغي للمرء تغيير الزجاج الكهربائي، أو إذا كانت المحتملة لا تزال منخفضة، والانتقال إلى مقطع آخر من الحبل العصبية. إمكانات العمل العفوي مع السعة الصغيرة قد يشير إلى أن القطب هو في الخلايا العصبية الحركية. إذا كان هذا يحدث في الجدار العقدة الجسم على حقن الحالية يمكن استخدامها لتحديد ما إذا كانت الخلايا العصبية يعصب أي من العضلات لا تزال تعلق على الجلد. الخلايا العصبية الحركية بالطوق نصب (AE) هو على الجانب البطني من العقدة (الشكل 4B)، وأنه سيتسبب للحلقة (التلال أو شرائح) لترتفع من خلال تفعيل العضلات الناصبة بالطوق. ينبغي حقن الحالية في الخلايا الحسية استحضار إمكانات العملق مع الطول الموجي مميزة هو مبين في الشكل 4C. إذا كان الطول الموجي تبدو مختلفة يمكن أن تكون راجعة إلى الجسر غير متوازن أو التعويض السعة الإزاحة. ينبغي للمرء أن يتشاور دليل الذي يرافق وحدة اكتساب إشارة للحصول على تفاصيل حول كيفية تحقيق التوازن بين الجسر داخل الخلية. لاحظ القطع الأثرية التحفيز في بداية ونهاية البقول الحالية في الشكل 4C. هذه هي الطريقة التي ننظر التحف عند الجسر هو متوازن. ثقافات الأولية من الخلايا العصبية من العقدة علقة تشكيل نقاط الاشتباك العصبي الكهربائية والكيميائية في الطبق. في البداية الخصائص الكهربائية للخلايا المستزرعة ليست بالضبط نفس كما هي الحال في الجسم الحي. ولكن بعد أيام قليلة من الدوافع لا يمكن تمييزها تقريبا من تلك التي تم تسجيلها في العقدة. ويتجلى هذا في الشكل 6C مع زوج من الخلايا Rz مشاهدة. بعد 7 ساعة في الثقافة واتساع إمكانات متشابك 1-2 بالسيارات. بعد 56 ساعة في الثقافة سيكانت إمكانات naptic أكبر من 10 بالسيارات (آثار الأعلى في الشكل 6C). شكل إمكانات العمل يتغير أيضا بعد 56hr في الثقافة. في ظل ظروف وصفها هذه الخلايا قابلة للبقاء لعدة أيام. يمكن البرهنة الاتصالات بين الخلايا من خلال تحفيز الجذور العصبية أو أدوات الوصل وتسجيل من الخلايا العصبية في العقدة. تحفيز هذه الأعصاب يولد إمكانات متشابك قوية وإمكانات العمل في خلايا العقدة مختلفة. وسجلت آثار في الشكل 8B من خلية رتزيوس في العقدة التي تم إزالتها من الحيوان ويعلق في طبق. وقد أثار التتبع السوداء من قبل التحفيز دون العتبي تطبيقها مع إلكترود خارج الخلية إلى الضام. زيادة الجهد التحفيز تسبب في خلية لاطلاق النار إمكانات العمل (التتبع الحمراء). الأصباغ أو البيروكسيداز الفجل الفلورسنت يمكن حقنها في هذه الخلايا لدراسة التشكل. تم حقن وسيفر الأصفر إلى Rz مشاهدةالخلايا العصبية عن طريق تمرير تيار كهربائي من خلال السلبية. بديل هو لحقن الصبغة باستخدام نفث من ضغط الهواء. يبين الشكل 9A الصبغة بعد وقت قصير من بدء الحقن. بعد ثلاثين دقيقة الصبغة بالفعل قد تنتشر في جذور الأعصاب (الشكل 9B). نوع من الصبغة يعتمد على التطبيق، وتستخدم الأصباغ الوزن الجزيئي صغيرة مثل التي يمكن أن تمر من خلال تقاطعات الفجوة لتحديد نقاط الاشتباك العصبي الكهربائي. <img alt="الشكل 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig1.jpg" width="600px" /> الشكل 1. . بطني تشريح علقة (A) هو الحيوان دبس بدقة الجانب بطني حتى في طبق مبطنة المطاط الصناعي مليئة علقة المالحة (B) A شق الضحلة التي تمتد الأمامي: يتكون المحور الخلفي الجانبي فقط إلى خط الوسط لتجنب إتلاف الأعصاب الحبل. الجيب الدم الأسود (والذي إحتوىنانوثانية الحبل البطني العصب) يمكن بسهولة أن ينظر إليها. ملاحظة العقدة يتعرض واحد هو أن البيض مقارنة مع غمد. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig1highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر</a> . <img alt="الرقم 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig2.jpg" width="600px" /> الشكل 2. تشريح الجيب السوداء. والأوعية الدموية (السهم) يجب أن تقطع بعناية على جانب واحد لفضح الحبل البطني العصب (سهم مزدوج). ترك شرائح الأوعية الدموية سليمة حول الجذور قطعي لاستخدامها بوصفها مقبض لمعالجة الحبل البطني العصب عند نقل بين تشريح والأطباق تسجيل. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig2highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر</a> . <img alt="الرقم 3"FO: محتوى العرض = &quot;3in&quot; سرك = &quot;/ files/ftp_upload/50631/50631fig3.jpg&quot; العرض = &quot;400px&quot; /&gt; الرقم 3. قسم المعزولة من الحبل البطني العصب. التدبيس الحبل البطني العصب بواسطة شظايا الأوعية الدموية المتبقية على جذور وقطعي في نهايات من أدوات الوصل قطعي يعرض العقد للتسجيلات الكهربية. A مشدود تمتد من العقد يسمح احد لرؤية أجسام الخلايا تحديدها وسوف تسمح لاختراق أسهل من غمد الدبقية مع الزجاج الكهربائي حادة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig3highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر</a> . <img alt="الرقم 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig4.jpg" width="600px" /> الشكل 4. التشريح الخلوية من العقدة علقة (أ) من الناحية المثالية الخلايا رتزيوس (R) وأجسام الخلايا الكبيرة الأخرى (P الصحافةلدى عودتهم، وسوف T-تعمل باللمس، N-مسبب للألم، AE-بالطوق الناصبة) تكون مرئية بوضوح إذا تم تعيين المجهر والمكثف تضيء بشكل صحيح. (B) عرض تخطيطي من الخلايا في العقدة. سوف الاختلافات الطفيفة في موقع SOMAS تحدث في كل عقدة بسبب كيفية امتدت العقدة ودبس مشدود. إمكانات (C) العمل المسجلة من سوما من هذه الخلايا العصبية لديها الطول الموجي مميزة. وقد أثار هذه المسامير عن طريق حقن الحالية إيجابية في الخلية (نبض مربع تتراكب آثار الجهد من الوقت). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig4highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر</a> . <img alt="الرقم 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig5.jpg" width="600px" /> الرقم 5. Desheathing العقدة لإزالة أجسام الخلايا الفردية. (A) وغمد الدبقيةيجب أن تقطع بعناية عبر العقدة لتجنب الخلايا الضارة من الفائدة. الخط الأحمر يشير إلى وجود قطع لتجنب ضرب سوما من الخلايا العصبية Rz مشاهدة. فتح غمد يعطي الإنزيمات الهضمية الوصول إلى مصفوفة الأنسجة الضامة. (B) أجسام الخلايا الصحية انتفاخ الخروج من العقدة بعد أن تم فتح غمد الدبقية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig5highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر</a> . <img alt="الرقم 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig6.jpg" width="600px" /> سوف يتم يستنشق الرقم 6. زراعة الخلايا العصبية من العقدة علقة. (A) خلايا من العقدة باستخدام micropipette ونقل إلى صحن يحتوي سائل الإعلام والثقافة. (B) وضع خلايا متعددة بالقرب من بعضها البعض زيادة معدل synaptogenesis بين الخلايا العصبية يمكن تحديدها. هنا ستووقد شكلت النواب اثنين من الخلايا العصبية في المشبك. (C) الخلايا العصبية في الثقافة المعرض خصائص كهربائية مختلفة قليلا. تظهر أعلى آثار إمكانات متشابك أثار من خلال تحفيز الخلايا المجاورة 7 ساعة و 56 ساعة بعد أن تم مطلي الخلايا. وقد أثار آثار أسفل عن طريق حقن الحالي مباشرة إلى واحدة من الخلايا Rz مشاهدة. ملاحظة الزيادة في السعة المحتملة متشابك وتغيير في العمل الموجي المحتملة بعد 56 ساعة في الثقافة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig6highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر</a> . <img alt="الرقم 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig7.jpg" width="600px" /> الرقم 7. علقة العقدة الجسم إعداد الجدار لحقول تقبلا رسم الخرائط. (A) نهج واحد هو إزالة قسم كامل من جدار الجسم مع العقد 1-3. هنا جذور على جانب واحد وبوقد يعلق قطع التابعين والعقدة إلى الجانب (B) A معلقة من العقدة في أعلى التكبير. (C) وثمة نهج آخر هو خلق نافذة صغيرة في جدار الجسم وسجل من العقد سليمة حين تعيين حقل تقبلا (DG) كل من الخلايا العصبية الحسية يسلك استجابة مميزة لحافز الميكانيكية. (D) لمسة ضوء يثير النشاط في خلايا T ولكن ليس في خلايا P أو N (E) واستجابة الخلايا T يغلق ردا على أقوى المحفزات، مما يتيح وسيلة لتفعيل الخلية P. كما يحصل التحفيز الخلايا N أقوى يصبح المنشط (FG). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig7highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر</a> . <img alt="الرقم 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig8.jpg" width="600px" /> الارقام ..ه 8. النشاط مستدعى في العقدة علقة. التحفيز خارج الخلية من أدوات الوصل يمكن استخدامها لدفع انتقال متشابك في الحبل العصبية. (A) ويتم ذلك عن طريق ربط القطب الشفط إلى واحدة من أدوات الوصل وتطبيق الجهد الصغيرة. القطب الزجاج الحادة (السهم) ويمكن رؤية التخوزق خلية رتزيوس في العقدة. (B) آثار الجهد لمرة وتظهر قطعة أثرية التحفيز تليها متشابك المحتملة (الأسود)، وإمكانات العمل (الحمراء). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig8highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة أكبر الصورة</a> . <img alt="الرقم 9" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig9.jpg" width="600px" /> الرقم 9. حقن الصبغة في الخلايا العصبية علقة. (A) ويمكن حقن وسيفر الصفراء في سوما عن طريق تمرير ترو الحاليلاف تسجيل مسرى مكروي. ويمكن بعد ذلك مصباح الزئبق وFITC تصفية مجموعة استخدامها لتصور مضان. وقد تنتشر (B) صبغ في Rz مشاهدة محاور حوالي 30 دقيقة بعد الحقن. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig9highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر</a> .

Watch this Scientific Journal Video about Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis at JoVE.com

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

توضح هذه المقالة ثلاث الاستعدادات الجهاز العصبي باستخدام العلق: تسجيل داخل الخلايا من الخلايا العصبية في العقد البطنية، زراعة الخلايا العصبية من العقد البطنية، وتسجيل من رقعة من الجلد معصب لتعيين حقول الحسية.

تسجيل داخل الخلايا، الحسي الميداني رسم الخرائط، والخلايا العصبية التي تم تحديدها في المستنزف، العلقة الطبية</i

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of ...

intracellular-recording-sensory-field-mapping-culturing-identified

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

19.5K Views.  University of Kentucky.  توضح هذه المقالة ثلاث الاستعدادات الجهاز العصبي باستخدام العلق: تسجيل داخل الخلايا من الخلايا العصبية في العقد البطنية، زراعة الخلايا العصبية من العقد البطنية، وتسجيل من رقعة من الجلد معصب لتعيين حقول الحسية. 

Video: Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and other social interactions. The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy to conduct, and reliable method to assay olfactory function at the level of the olfactory epithelium. Since the 1956 description of the EOG by Ottoson in frogs1, the EOG recording has been applied in many vertebrates including salamanders, rabbits, rats, mice, and humans (reviewed by Scott and Scott-Johnson, 2002, ref. 2). The recent advances in genetic modification in mice have rekindled interest in recording the EOG for physiological characterization of olfactory function in knock-out and knock-in mice. EOG recordings have been successfully applied to demonstrate the central role of olfactory signal transduction components3-8, and more recently to characterize the contribution of certain regulatory mechanisms to OSN responses9-12.
Odorant detection occurs at the surface of the olfactory epithelium on the cilia of OSNs, where a signal transduction cascade leads to opening of ion channels, generating a current that flows into the cilia and depolarizes the membrane13. The EOG is the negative potential recorded extracellularly at the surface of the olfactory epithelium upon odorant stimulation, resulting from a summation of the potential changes caused by individual responsive OSNs in the recording field2. Comparison of the amplitude and kinetics of the EOG thus provide valuable information about how genetic modification and other experimental manipulations influence the molecular signaling underlying the OSN response to odor. 
Here we describe an air-phase EOG recording on a preparation of mouse olfactory turbinates. Briefly, after sacrificing the mouse, the olfactory turbinates are exposed by bisecting the head along the midline and removing the septum. The turbinate preparation is then placed in the recording setup, and a recording electrode is placed at the surface of the olfactory epithelium on one of the medial turbinates. A reference electrode is electrically connected to the tissue through a buffer solution. A continuous stream of humidified air is blown over the surface of the epithelium to keep it moist. The vapor of odorant solutions is puffed into the stream of humidified air to stimulate the epithelium. Responses are recorded and digitized for further analysis.

The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy-to-conduct, and reliable way of assessing olfactory function at the level of the olfactory epithelium. This protocol describes a recording setup, mouse tissue preparation, data collection, and basic data analysis.

تحليل الردود من الخلايا العصبية الحسية الشمية ماوس باستخدام تسجيل Electroolfactogram الهواء المرحلة

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and ...

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and learning and memory. There are four known families of PKC isoforms in vertebrates: classical PKCs (&alpha;, &beta;I, &beta;II and &gamma;), novel type I PKCs (&#949; and &eta;), novel type II PKCs (&delta; and &theta;), and atypical PKCs (&zeta; and &iota;). The classical PKCs are activated by Ca2+ and diacylclycerol (DAG), while the novel PKCs are activated by DAG, but are Ca2+-independent. The atypical PKCs are activated by neither Ca2+ nor DAG. In Aplysia californica, our model system to study memory formation, there are three nervous system specific PKC isoforms one from each major class, namely the conventional PKC Apl I, the novel type I PKC Apl II and the atypical PKC Apl III. PKCs are lipid-activated kinases and thus activation of classical and novel PKCs in response to extracellular signals has been frequently correlated with PKC translocation from the cytoplasm to the plasma membrane. Therefore, visualizing PKC translocation in real time in live cells has become an invaluable tool for elucidating the signal transduction pathways that lead to PKC activation. For instance, this technique has allowed for us to establish that different isoforms of PKC translocate under different conditions to mediate distinct types of synaptic plasticity and that serotonin (5HT) activation of PKC Apl II requires production of both DAG and phosphatidic acid (PA) for translocation 1-2. Importantly, the ability to visualize the same neuron repeatedly has allowed us, for example, to measure desensitization of the PKC response in exquisite detail 3. In this video, we demonstrate each step of preparing Sf9 cell cultures, cultures of Aplysia sensory neurons have been described in another video article 4, expressing fluorescently tagged PKCs in Sf9 cells and in Aplysia sensory neurons and live-imaging of PKC translocation in response to different activators using laser-scanning microscopy.

In this video, we demonstrate visualization of PKC translocation in living cells using fluorescently tagged PKCs.

تصوير الحية إزفاء PKC في Sf9 خلايا في الخلايا العصبية والحسية Aplysia

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and ...

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. Caged compounds are molecules made physiologically inactive by a chemical cage that can be broken by a flash of ultraviolet light. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged compounds for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons. The process of olfactory transduction (Figure 1) takes place in the cilia of olfactory sensory neurons, where odorant binding to receptors leads to the increase of cAMP that opens cyclic nucleotide-gated (CNG) channels2. Ca entry through CNG channels activates Ca-activated Cl channels. We show how to dissociate neurons from the mouse olfactory epithelium3 and how to activate CNG channels or Ca-activated Cl channels by photolysis of caged cAMP4 or caged Ca5. We use a flash lamp6,7 to apply ultraviolet flashes to the ciliary region to uncage cAMP or Ca while patch-clamp recordings are taken to measure the current in the whole-cell voltage-clamp configuration8-11.

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged cAMP or caged Ca for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons.

فلاش التحلل الضوئي للمركبات محبوس في سيليا من العصبونات الحسية الشمية

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated. Thus, simultaneous recordings of neuronal activity and behavior are essential to correlate brain activity to behavior. For such behavioral analyses, the fruit fly, Drosophila melanogaster, allows us to incorporate genetically encoded calcium indicators such as GCaMP1, to monitor neuronal activity, and to use sophisticated genetic manipulations for optogenetic or thermogenetic techniques to specifically activate identified neurons2-5. Use of a thermogenetic technique has led us to find critical neurons for feeding behavior (Flood et al., under revision). As a main part of feeding behavior, a Drosophila adult extends its proboscis for feeding6 (proboscis extension response; PER), responding to a sweet stimulus from sensory cells on its proboscis or tarsi. Combining the protocol for PER7 with a calcium imaging technique8 using GCaMP3.01, 9, I have established an experimental system, where we can monitor activity of neurons in the feeding center &#x2013; the suboesophageal ganglion (SOG), simultaneously with behavioral observation of the proboscis. I have designed an apparatus ("Fly brain Live Imaging and Electrophysiology Stage": "FLIES") to accommodate a Drosophila adult, allowing its proboscis to freely move while its brain is exposed to the bath for Ca2+ imaging through a water immersion lens. The FLIES is also appropriate for many types of live experiments on fly brains such as electrophysiological recording or time lapse imaging of synaptic morphology. Because the results from live imaging can be directly correlated with the simultaneous PER behavior, this methodology can provide an excellent experimental system to study information processing of neuronal networks, and how this cellular activity is coupled to plastic processes and memory.

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

The fruit fly, Drosophila melanogaster, extends its proboscis for feeding, responding to a sugar stimulus from its proboscis or tarsus. I have combined observations of the proboscis extension response (PER) with a calcium imaging technique, allowing us to monitor the activity of neurons in the brain, simultaneously with behavioral observation.

في وقت واحد من تسجيل إشارات الكالسيوم من الخلايا العصبية التي تم تحديدها وسلوك التغذية من ذبابة الفاكهة السوداء البطن</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

الفلورسنت وصفها الوراء يسمح لخارج الخلية المستهدفة واحدة وحدة التسجيل من الخلايا العصبية التي تم تحديدها<em&gt; في الجسم الحي</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be performed in an intact brain preparation where the neural circuitry of the CNS remains intact. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with green fluorescent protein for identification in the intact brain. Fish have multiple populations of GnRH neurons, and their functions are dependent on their location in the brain and the GnRH gene that they express1 . We have focused our demonstration on GnRH3 neurons located in the terminal nerves (TN) associated with the olfactory bulbs using the intact brain of transgenic medaka fish (Figure 1B and C). Studies suggest that medaka TN-GnRH3 neurons are neuromodulatory, acting as a transmitter of information from the external environment to the central nervous system; they do not play a direct role in regulating pituitary-gonadal functions, as do the well-known hypothalamic GnRH1 neurons2, 3 .The tonic pattern of spontaneous action potential firing of TN-GnRH3 neurons is an intrinsic property4-6, the frequency of which is modulated by visual cues from conspecifics2 and the neuropeptide kisspeptin 15. In this video, we use a stable line of transgenic medaka in which TN-GnRH3 neurons express a transgene containing the promoter region of Gnrh3 linked to enhanced green fluorescent protein7 to show you how to identify neurons and monitor their electrical activity in the whole brain preparation6.

In this video, we will demonstrate how to record electrical activity from identified single neurons in a whole brain preparation, which preserves complex neural circuits. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with a fluorescent protein for identification in the intact brain preparation.

تسجيل النشاط الكهربائي من الخلايا العصبية التي تم تحديدها في الدماغ سليمة من الأسماك المعدلة وراثيا

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

كله من جبل Immunolabeling الشم مستقبلات الخلايا العصبية في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الهوائي

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

A Guide to In vivo Single-unit Recording from Optogenetically Identified Cortical Inhibitory Interneurons

A major challenge in neurophysiology has been to characterize the response properties and function of the numerous inhibitory cell types in the cerebral cortex. We here share our strategy for obtaining stable, well-isolated single-unit recordings from identified inhibitory interneurons in the anesthetized mouse cortex using a method developed by Lima and colleagues1. Recordings are performed in mice expressing Channelrhodopsin-2 (ChR2) in specific neuronal subpopulations. Members of the population are identified by their response to a brief flash of blue light. This technique &#8211; termed &#8220;PINP&#8221;, or Photostimulation-assisted Identification of Neuronal Populations &#8211; can be implemented with standard extracellular recording equipment. It can serve as an inexpensive and accessible alternative to calcium imaging or visually-guided patching, for the purpose of targeting extracellular recordings to genetically-identified cells. Here we provide a set of guidelines for optimizing the method in everyday practice. We refined our strategy specifically for targeting parvalbumin-positive (PV+) cells, but have found that it works for other interneuron types as well, such as somatostatin-expressing (SOM+) and calretinin-expressing (CR+) interneurons.

A Guide to In vivo Single-unit Recording from Optogenetically Identified Cortical Inhibitory Interneurons

Here we describe our strategy for obtaining stable, well-isolated single-unit recordings from identified inhibitory interneurons in the anesthetized mouse cortex. Neurons expressing ChR2 are identified by their response to blue light. The method uses standard extracellular recording equipment, and serves as an inexpensive alternative to calcium imaging or visually-guided patching.

دليل ل<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; تسجيل وحدة واحدة من التي تم تحديدها Optogenetically القشرية التثبيطي Interneurons

A major challenge in neurophysiology has been to characterize the response properties and function of the numerous inhibitory cell types in the cerebral ...

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of olfactory-driven behaviors and their modulation. These coding properties depend heavily on the initial interaction between odor molecules and the olfactory receptor (OR) expressed in the OSNs. The identity, specificity and ligand spectrum of the expressed OR are critical. The probability to find the ligand of the OR expressed in an OSN chosen randomly within the epithelium is very low. To address this challenge, this protocol uses genetically tagged mice expressing the fluorescent protein GFP under the control of the promoter of defined ORs. OSNs are located in a tight and organized epithelium lining the nasal cavity, with neighboring cells influencing their maturation and function. Here we describe a method to isolate an intact olfactory epithelium and record through patch-clamp recordings the properties of OSNs expressing defined odorant receptors. The protocol allows one to characterize OSN membrane properties while keeping the influence of the neighboring tissue. Analysis of patch-clamp results yields&#160;a precise quantification of ligand/OR interactions, transduction pathways and pharmacology, OSNs&#39; coding properties and their modulation at the membrane level.&#160;

Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.

مثقب تسجيل التصحيح، المشبك من الماوس العصبونات الحسية الشمية في الظهارة العصبية السليمة: التحليل الوظيفي من الخلايا العصبية التي تم تحديدها إبداء الرائحة مستقبلات

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell's receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator's experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.

الطريقة الكهربية لالردود تسجيل بين الخلايا الجهد ل<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; خلايا مستقبلة للضوء وInterneurons إلى النور المحفزات<em&gt; في فيفو</em