المؤلفون ممتنون لزملائهم وموظفي المختبرات في الحاضر والماضي التي دعمت تطوير هذه التقنية. يتم اعتماد مختبر SP من قبل المعهد الكندي للبحوث الصحية غرانت التشغيل MOP-84473 وألبرتا حلول يبتدع الصحة (بتمويل من مؤسسة التراث ألبرتا للصندوق الهبات للبحوث الطبية). وأيد موانئ دبي من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح MD001091-01-02 وGM068855.

1. إعداد الثقافات البكتيرية، أدوات، والكواشف (DAY 1، بعد الظهر) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في وقت متأخر بعد الظهر، تطعيم 1-5 مل مرق LB تعقيمها في العقيمة (على سبيل المثال، 100 × 13 ملم) أنابيب الاختبار الزجاجية البورسليكات مع قسامة صغيرة من البكتيريا (إي كولاي أو ضمة الكوليرا). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين أنابيب الاختبار تلقيح في طبلة بكرة يضم عند 37 درجة مئوية درجة الحرارة (غرفة دافئة أو الحاضنة)، بدوره على طبل الدوارة بسرعة عالية، واحتضان O / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد رش خلية في شكل &quot;عصا الهوكي&quot; من قضيب عن طريق تسخين الزجاج منتصف قضيب في لهب الموقد بنسن حتى يخفف من الزجاج ومن ثم توجيه ينحني برفق مع ملاقط أو كماشة إلى 135 ° زاوية . تسخين قضيب مرة أخرى في نقطة الوسط بين نهاية وأول منعطف وثنيه في زاوية 45 درجة إلى الداخل (في الاتجاه المعاكس من أول منعطف). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد LB-أجار دون المضادات الحيوية وتصب في أطباق بتري في إعدادبروتوكول electrocompetence، وLB-أجار لوحات تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة (وفقا لعلامة مقاومة على ناقلات إلى أن electroporated)، وتخزينها في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد تصفية تعقيمها 2 مم CaCl 2 حل لV. الكوليرا، أو الأوتوكلاف DDH 2 O لE. القولونية، وتخزينها في 4 درجات مئوية. </li></ol> 2. نمو البكتيريا Electrocompetent (DAY 2، صباح) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسليم 100 ميكرولتر من ثقافة O / N البكتيرية على كل لوحة LB أجار، ويمكن أيضا أن تستخدم الأسهم الجلسرين المجمدة وتسليمها على طبق مباشرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تراجع الهوكي على شكل عصا خلية رش في 100٪ ETOH، واستنزاف لفترة وجيزة وحرق ETOH المتبقية لتعقيم أنه قبل استخدامها وانتشارها. نشر ثقافة 100 ميكرولتر O / N البكتيرية بالتساوي مع رش الخلايا العقيمة الزجاج والتأكد من عدم تعطيل (استراحة) سطح أجار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحة في 37 درجة مئوية لمدة 4-6 ساعة، أو حتى في الحديقة رقيقة من نمو البكتيريا تكونيأتي تمييزها. الخلايا هي الأكفأ عندما بنشاط متزايد. </li></ol> 3. إعداد الخلايا البكتيرية Electrocompetent (DAY 2، بعد الظهر) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حصاد البكتيريا مع حلقة بتلقيح العقيمة التأكد من عدم اختراق أو كسر سطح أجار. واحد 2 مم الشامل البكتيرية كافية لتحول واحد. عادة، وهذا يتطلب كشط سطح العشب رقيقة مع حلقة بتلقيح مرتين أو ثلاث مرات. عدة عينات (عادة ما بين 4-6) يمكن جمعها من نفس اللوحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend والشامل البكتيرية في 1 مل من الجليد الباردة 2 مم CaCl 2 (لضمة الكوليرا) أو العقيمة DDH 2 O (للكولاي) وتخلط جيدا حتى عدم وجود كتل واضحة، والحفاظ على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي كل تعليق البكتيرية لمدة 5 دقائق عند 5،000 x ج في microcentrifuge المبردة تعيين إلى 4 درجة مئوية، أو في microcentrifuge تخزينها في غرفة باردة لتعيين 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل طاف، resuspإنهاء بيليه البكتيرية في نفس الحجم من الجليد الباردة 2 مم CaCl 2 أو العقيمة DDH 2 O، وكرر الخطوة الطرد المركزي كما فعلت من قبل مرتين أكثر ليصبح المجموع ثلاثة يغسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف، في resuspend، ومن ثم تخفيف بيليه البكتيرية بدقة في 40 ميكرولتر الجليد الباردة 2 مم CaCl 2 أو العقيمة DDH 2 O والحفاظ على الجليد. </li></ol> 4. تحول البكتيريا Electrocompetent (DAY 2، بعد الظهر) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تضيف ما يصل إلى 1 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد (في ما يصل إلى 1 ميكرولتر المياه أو عازلة تريس، EDTA) إلى 40 ميكرولتر تعليق البكتيرية ونقل هذا الخليط في قبل المبردة، معقمة 0.2 سم كفيت الفجوة. يجب أن يكون تركيز الملح في عينة من الحمض النووي منخفضة لذلك، لأنها سوف تساهم في الانحناء للنبض في الخطوة التالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج كفيت في غرفة التثقيب الكهربائي وحدة تحكم النبض، وelectroporate في 1.8 كيلو فولت، 25 μF. يجب أن يكون ثابتا وقت ~ 5.0 ميللي ثانية، وينبغي أن يحدث أي الانحناء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتعافى سريعا تعليق الخلية عن طريق إعادة التعليق في 1 مل مرق LB ونقل إلى تعقيمها سابقا أنبوب اختبار الزجاج البورسليكات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمح للخلايا لاسترداد التي يحتضنها في ظل ظروف النمو الخلوية (في طبلة بكرة) عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة دون اختيار المضادات الحيوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة البكتيريا على معدة مسبقا لوحات أجار LB بحضور وكيل انتقائية مناسبة (المضادات الحيوية)، واحتضان عند 37 درجة CO / N. إذا تحولت البكتيريا مع تركيز عال من ناقلات تنقيته (0.1-1 ميكروغرام البلازميد supercoiled)، وتقديم 10 ميكرولتر من ثقافة البكتيرية على حافة لوحة LB أجار ومع العقيمة متتالية حلقة بتلقيح للمستعمرات معزولة باستخدام طريقة خط رباعي. إذا تم تحويل خليط الربط، تسليم 100 ميكرولتر من ثقافة البكتيرية على كل لوحة أجار وانتشاره بالتساوي مع رش خلية الزجاج معقمة. </li></ol> وإذا كانت ثابتة الوقت قصير (يكونمنخفضة 3.5 ميللي ثانية)، أو النبض يؤدي إلى الانحناء، ثم إعادة يعجل-عينة الحمض النووي، ويغسل مع 70٪ ETOH مرتين لإزالة الأملاح قبل التجفيف وإعادة التعليق في TE العازلة.

<ol>
	<li>Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+mouse+lyoma+cells+by+electroporation+in+high+electric+fields.">Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields.</a> EMBO J. 1 (7), 841-845 (1982).</li><li>Dower, W. J., Miller, J. F., Ragsdale, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+transformation+of+E.+coli+by+high+voltage+electroporation.">High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation.</a> Nucleic Acids Res. 16 (13), 6127-6145 (1988).</li><li>Taketo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+transfection+of+Escherichia+coli+by+electroporation.">DNA transfection of Escherichia coli by electroporation.</a> Biochim. Biophys. Acta. 949 (3), 318-324 (1988).</li><li>Fiedler, S., Wirth, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+bacteria+with+plasmid+DNA+by+electroporation.">Transformation of bacteria with plasmid DNA by electroporation.</a> Anal. Biochem. 170 (1), 38-44 (1988).</li><li>O'Callaghan, D., Charbit, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+transformation+of+Salmonella+typhimurium+and+Salmonella+typhi+by+electroporation.">High efficiency transformation of Salmonella typhimurium and Salmonella typhi by electroporation.</a> Mol. Gen. Genet. 223 (1), 156-158 (1990).</li><li>Hamashima, H., Nakano, T., Tamura, S., Arai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+Vibrio+parahaemolyticus,+Vibrio+alginolyticus,+and+Vibrio+cholerae+non+O-1+with+plasmid+DNA+by+electroporation.">Genetic transformation of Vibrio parahaemolyticus, Vibrio alginolyticus, and Vibrio cholerae non O-1 with plasmid DNA by electroporation.</a> Microbiol. Immunol. 34 (8), 703-708 (1990).</li><li>Grones, J., Turna, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+microorganisms+with+the+plasmid+vector+with+the+replicon+from+pAC1+from+Acetobacter+pasteurianus.">Transformation of microorganisms with the plasmid vector with the replicon from pAC1 from Acetobacter pasteurianus.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 206 (3), 942-947 (1995).</li><li>Allen, S. P., Blaschek, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation-induced+transformation+of+intact+cells+of+Clostridium+perfringens.">Electroporation-induced transformation of intact cells of Clostridium perfringens.</a> Appl. Environ. Microbiol. 54, 2322-2324 (1988).</li><li>Belliveau, B. H., Trevors, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Bacillus+cereus+vegetative+cells+by+electroporation.">Transformation of Bacillus cereus vegetative cells by electroporation.</a> Appl. Environ. Microbiol. 55, 1649-1652 (1989).</li><li>Chassy, B. M., Flickinger, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Lactobacillus+casei+by+electroporation.">Transformation of Lactobacillus casei by electroporation.</a> FEMS Microbiol. Lett. 44, 173-177 (1987).</li><li>Dunny, G. M., Lee, L. N., LeBlanc, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+electroporation+and+cloning+vector+system+for+gram-positive+bacteria.">Improved electroporation and cloning vector system for gram-positive bacteria.</a> Appl. Environ. Microbiol. 57 (4), 1194-1201 (1991).</li><li>Micheletti, P. A., Sment, K. A., Konisky, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+coenzyme+M-auxotrophic+mutant+and+transformation+by+electroporation+in+Methanococcus+voltae.">Isolation of a coenzyme M-auxotrophic mutant and transformation by electroporation in Methanococcus voltae.</a> J. Bacteriol. 173 (11), 3414-3418 (1991).</li><li>Schleper, C., Kubo, K., Zillig, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+particle+SSV1+from+the+extremely+thermophilic+archaeon+Sulfolobus+is+a+virus:+demonstration+of+infectivity+and+of+transfection+with+viral+DNA.">The particle SSV1 from the extremely thermophilic archaeon Sulfolobus is a virus: demonstration of infectivity and of transfection with viral DNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (16), 7645-7649 (1992).</li><li>Aune, T. E., Aachmann, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodologies+to+increase+the+transformation+efficiencies+and+the+range+of+bacteria+that+can+be+transformed.">Methodologies to increase the transformation efficiencies and the range of bacteria that can be transformed.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 85 (5), 1301-1313 (2010).</li><li>Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids.">Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> J. Mol. Biol. 166, 557 (1983).</li><li>Unterweger, D., Kitaoka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+Type+VI+Secretion+System+Expression+Gives+Vibrio+cholerae+Intra-+and+Interspecific+Competitive+Advantages.">Constitutive Type VI Secretion System Expression Gives Vibrio cholerae Intra- and Interspecific Competitive Advantages.</a> PLoS One. 7 (10), e48320 (2012).</li></ol>

لا الإفصاحات قابلة للتطبيق.

كفاءة التحول يخضع لمجموعة متنوعة من العوامل بغض النظر عن الطريقة المستخدمة لإعداد الخلايا المختصة. تطبيق متغيرات مماثلة لهذه الطريقة، ويجب توخي الحذر الشديد أنه بمجرد أن يتم حصاد الخلايا من لوحة آغار بحيث يتم الحفاظ على درجة حرارة ثابتة الباردة (لا تزيد عن 4 درجات مئوية). العشب البكتيرية يجب بنشاط متزايد في وقت جمع؛ يجب أن تكون الخلايا في مرحلة منتصف لوغاريتمي من النمو. نوعية الحمض النووي (أي تلوث من الأملاح) يؤثر كفاءة التحول. على وجه التحديد، عندما تستخدم هذا الأسلوب، لا ينبغي أن كسر أجار أجار في كأجزاء كفيت سوف يسبب الانحناء للنبض. وترتبط معظم المشاكل التي واجهتها مع هذه التقنية مع قضيتين؛ جمع البكتيريا خلال نافذة السليم لوقت من لوحة أجار عندما يتم بنشاط متزايد. سوف جمعها في وقت قريب جدا تسفر عن أعداد الخلايا غير كافية وسوف تجعلكشط قبالة لوحة LB أجار محبطة لأن &quot;pellicule&quot; أنها تشكل من الصعب أن يقلع سطح اللوحة. البكتيريا جمع فوات الأوان ستنخفض بشكل كبير اختصاصها. سوف نافذة الوقت تختلف بطبيعة الحال اعتمادا على كثافة اللقاح مطلية على لوحات أجار LB. الخطوة الحاسمة الثانية هي للحفاظ على البكتيريا الباردة (4 ° C) من لحظة يتم رفعها من لوحة آغار ومعلق في 2 و CaCl أو [ده 2 O حتى ومطلي انهم على أجار LB التالية التحول. ينبغي للأنابيب microfuge التي تحتوي على البكتيريا، وcuvettes عازلة تكون قبل المبردة وأبقى على الجليد في جميع الأوقات حتى يتم مطلي البكتيريا. ومع ذلك، يمكن أن تنشأ مشاكل إضافية عندما ده العقيمة 2 O 2 و CaCl أو تحتوي على راسب أو ملوثة. لهذا السبب نحن نوصي لإعداد هذا كاشف الطازجة. ومما يسهل استكشاف الأخطاء وإصلاحها عن طريق التحول بما في ذلك الضوابط عند تحويل باcteria المقدمة المختصة بأي طريقة. وهناك سيطرة سلبية تتكون من مجموعة من البكتيريا غير المختصة حولت مطلي على صفيحة أجار LB التي تحتوي على علامة انتقائية مساعدة بسرعة تحديد ما إذا كانت المضادات الحيوية على لوحة فعالة. وسوف تحول السيطرة الإيجابية مع إعداد البلازميد معروفة من نوعية جيدة وكمية إيواء نفس علامة انتقائية كما العينة التجريبية تكون مفيدة في تحديد ما إذا كانت البكتيريا هي المختصة ولكن أيضا ما إذا كان الحمض النووي التجريبية حولت كافية في كمية أو نوعية. مزايا هذه التقنية هي متعددة؛ طريقة يمكن القيام بها خلال اليوم نفسه الذي يتم التخطيط لهذا التحول. لقد وجدنا أن الأسهم الجلسرين البكتيرية المجمدة قد تكون مطلية مباشرة على أجار LB دون أي خسارة في electrocompetence، ونحن قد فعلت ذلك في حالات &quot;الطوارئ&quot; (بعد نسيان لبدء الثقافة بين عشية وضحاها قبل يوم واحد). على الرغم من أننا لا يمكن أن اختبار البريدسلالة جدا معروفة، أي E. كولاي أو V. وكانت سلالة الكوليرا التي يمكن تحويلها من قبل التثقيب الكهربائي قابلة للهذا البروتوكول في أيدينا. تقنية سريع وفعال، وعوائد الكفاءة التحول مماثلة لتلك التي تم الحصول عليها من إعداد البكتيريا electrocompetent توظيف الطرق التقليدية. الأسلوب يلغي شرط للسرعة العالية الطرد المركزي والدوارات المرتبطة بها، شاكر حاضنة المدارية والدلاء الطرد المركزي معقمة (حاويات)، وكميات كبيرة من العازلة تعقيمها. على الرغم من أن جدول الكواشف محددة والمعدات شاملة تماما، فإن معظم المختبرات التي تنفذ التثقيب الكهربائي يكون معظم، إن لم يكن كل، هذه المواد متاحة بالفعل. ربما الأهم من ذلك، هذه التقنية يمكن تطبيقها بسهولة لتوليد سلالات مختبر محددة electrocompetent مع الخلفيات متحولة بسرعة. نحن لا علم له بأي قيود هذه التقنية لأنها حلت محل الطريقة التقليدية في إعداد كهربائيtrocompetent البكتيريا في مختبراتنا. نفذت نتائج تجاربنا هو موضح هنا خارجا مع خلايا electrocompetent الطازجة المنتجة مع الطريقة التقليدية التي تم تخزينها في -80 درجة مئوية لمدة لا تزيد عن 1 في الاسبوع. ومع ذلك، والأسهم المجمدة خلية electrocompetent تفقد الكفاءة والجدوى أو على مدى فترات طويلة من التخزين. لدينا بروتوكول يسمح مختصرة إعداد الخلايا electrocompetent الطازجة في اليوم نفسه ومن المخطط التحول دون القلق بشأن عمر الأوراق المالية والتي قد تؤدي إلى انخفاض العائد المحولة. نحن لم حاولت تخزين الخلايا electrocompetent أنتجت باستخدام طريقة سريعة للاستخدام في يوم آخر لأن ذلك لم يكن ضروريا. في حين لم تظهر هنا، وكفاءة الخلايا electrocompetent إعدادها باستخدام طريقتنا السريع كافية لمخاليط ربط. التحولات ذكرت لغير O1 V. الكوليرا في مقال نشر مؤخرا من قبل Unterweger وآخرون.وأجريت 17 من أصل باستخدام البكتيريا electrocompetent من خلال طريقة وصفها هنا (باستثناء تلك التي قامت بها الاقتران) أعدت. هذه التقنية تتيح للباحثين بتحويل سلالات متحولة مع الخلفيات بسرعة وفعالية دون الحاجة إلى إعداد دفعات كبيرة من الخلايا. يمكن تكييفها هذا التحضير السريع للبكتيريا طريقة electrocompetent إلى بدائيات النوى الأخرى التي ثبت أن تكون قابلة للالتثقيب الكهربائي من حيث المبدأ من إعداد والإعدادات التثقيب الكهربائي ستكون نفس تلك البروتوكولات التقليدية.

منذ ان &#39;تأسيسها في أوائل 1980s 1، أصبح التثقيب الكهربائي تقنية البيولوجيا الجزيئية لا يتجزأ، من المحتمل واحدة الأسلوب الأكثر شيوعا المستخدمة لتحويل / بالنقل الخلايا الحية مع الأحماض النووية دائري أو خطي. وضعت أصلا لترنسفكأيشن من الخلايا حقيقية النواة 1، تم تكييفها التثقيب الكهربائي في وقت لاحق لتحويل E. القولونية 2، 3. في علم الجراثيم، أصبحت التثقيب الكهربائي معيار المختبر، وقد تم تعديلها لتحويل مجموعة واسعة من البكتيريا سالبة الجرام بما في ذلك الزائفة 4، 5 السالمونيلا، الضمات 6، Serratiae، وشيغيلات 7؛ المطثيات إيجابية الجرام 8، 9 البكتيريا، البكتريا المكونة 10 والمكورات المعوية 11. وقد ثبت حتى بعض العتائق قابلة للتحويل عن طريق التثقيب الكهربائي، بما في ذلك Methanococci </م 12&gt; وSulfolobus الأنواع 13. لإجراء استعراض شامل يرجى الرجوع إلى لغزة وAachmann 14. كفاءة التحول عن طريق التثقيب الكهربائي يقال 10-20 أضعاف أعلى من الكفاءة الكيميائية أو الحرارة صدمة 2. ومع ذلك، مثل الكثير من البكتيريا إعداد لاختصاص الكيميائية على النحو الأمثل من قبل دوغلاس هاناهان في 1980s 15، كما يجب أن تكون مستعدة لتكون خلايا electrocompetent. التثقيب الكهربائي هو وسيلة سريعة وفعالة للتحول البكتيرية، والتي تتطلب البكتيريا electrocompetent، الحمض النووي النقي، وحدة تحكم نبض من شأنها أن توفر الدافع الكهربائية، وغرفة تستوعب cuvettes المتاح الصغيرة التي تعمل بمثابة القطب. لفترة وجيزة، يتم خلط الباردة، والبكتيريا المختصة مع الحمض النووي البلازميد، تعرض لنبض عالية الجهد في كوفيت، معلق في وسائط النمو، المحتضنة في 30-37 درجة مئوية لمدة 30-45 دقيقة، ثم مطلي على المتوسط ​​نصف صلبة (المغذيات آجار لوحات) مع APPRopriate المضادات الحيوية انتقائية. وعلى النقيض من الخطوة النبض، وإعداد electrocompetent E. يبقى القولونية إجراء متعددة الأجزاء التي تتم عادة في كميات كبيرة. لفترة وجيزة، تم تلقيح ثقافة بين عشية وضحاها من البكتيريا إلى دورق مخروطي مع 100 مل إلى 1 لتر مرق لوريا (LB)، ونمت إلى مرحلة منتصف لوغاريتمي النمو (OD 600 من &lt;1.0)، وتعرض ليغسل المسلسل مع غير معقمة الأيونية عازلة أو الماء المقطر المزدوج ([ده 2 O) في خفض كميات في 4 درجات مئوية. يجب توخي الحذر الشديد للحفاظ على الخلايا الباردة في جميع أنحاء الإجراء بأكمله ومنع التلوث. هذا يتطلب استخدام الدلاء الطرد المركزي تعقيمها ومخازن غير الأيونية أو [ده 2 O، حاضنة شاكر المداري، كمية كبيرة عالية السرعة المبردة الطرد المركزي ومجموعة من الدوارات. ومعلق البكتيريا أخيرا في حجم صغير من العازلة تستكمل مع 10٪ الجلسرين وaliquoted في ~ 40 مجلدات ميكرولتر، ذوي الخوذات البيضاءيتم تخزين معنوى في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام. تخزين درجات الحرارة المنخفضة غالبا ما يؤدي إلى انخفاض كفاءة التحول بسبب فقدان جدوى مع مرور الوقت. الخلايا البكتيرية Electrocompetent وتتوفر أيضا من مجموعة متنوعة من المصادر التجارية ولكن فقط لعدد محدود من (غالبا ما تكون ناقصة إعادة التركيب) E. سلالات القولونية استخداما باعتبارها الدولة المضيفة لنشر مجموعة واسعة من البلازميدات. ونتيجة لذلك تعتمد على أساليب الباحثين في المنزل لإعداد هذه السلالات الخاصة / المسوخ للتحول. بديل، بروتوكول سريعة وفعالة لإعداد electrocompetent E. وقد القولونية قيد الاستخدام من قبل عدد قليل من المختبرات الجراثيم الجزيئية لبعض الوقت الآن، ولقد تم تمديد للبكتيريا سلبية الغرام إضافية، في حالة V. لدينا الكوليرا. لا يمكن تحديد المنشئ للبروتوكول كما تم تحسين من قبل باحثين آخرين مع مرور الوقت. طريقة المقدمة هنا قد استخدمت في المختبر لديناالمنشأ منذ ما يقرب من عقدين من الزمن، وذلك هو هدفنا لمشاركة هذه بروتوكول مفيدة مع أقراننا.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser Module</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-2668</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser Cuvette Chamber</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-2669</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrocuvettes (0.2 cm gap)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-2082</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13 x 100 mm Pyrex Rimless Culture Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>70820-13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13 mm Culture Tube Closures</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-04500-00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 x 250 mm Glass Rod</td>
			<td>Lab Source</td>
			<td>11381D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Petri Dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-757-12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roller Drum Motor Assembly</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>M1053-4004</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roller Drum for 13 x 100 mm Culture Tubes</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>M1053-0306</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma Chemicals</td>
			<td>C5670</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, anhydrous/denatured</td>
			<td>Sigma Chemicals</td>
			<td>227649</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculating Loop</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>MP182-5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Microcentrifuge 5451 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22621425</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen Burner</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-917Q</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth MILLER</td>
			<td>EMD</td>
			<td>1.10285.0500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S25127</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid protocol for preparation of electrocompetent escherichia coli and vibrio cholerae

أصبح التثقيب الكهربائي وهي طريقة تستخدم على نطاق واسع لبسرعة وكفاءة تقديم دنا غريب في مجموعة واسعة من الخلايا. أصبح Electrotransformation الأسلوب المفضل لإدخال الحمض النووي في بدائيات النوى التي ليست مختصة بشكل طبيعي. التثقيب الكهربائي هو أسلوب التحول السريع والكفاءة، وتبسيط ذلك، بالإضافة إلى تنقية الحمض النووي والبكتيريا المختصة، يتطلب متاحة تجاريا الجينات تحكم النبض وcuvettes. وعلى النقيض من الخطوة النبض، وإعداد الخلايا electrocompetent هو مضيعة للوقت وكثيفة العمالة التي تنطوي جولات متكررة من الطرد المركزي ويغسل في خفض حجم العقيمة، والماء البارد، أو مخازن غير الأيونية كميات كبيرة من الثقافات نمت لمرحلة منتصف لوغاريتمي من النمو. يمكن حفظ الوقت والجهد من خلال شراء خلايا electrocompetent من مصادر تجارية، ولكن اختيار يقتصر على استخداما E. سلالات مختبر القولونية. نحن هنا لنشر السريع وطريقة فعالة لإعداد electrocompetent E. كولاي، والتي تم استخدامها من قبل في مختبرات علم الجراثيم لبعض الوقت، يمكن تكييفها لV. الكوليرا وغيرها من بدائيات النوى. في حين أننا لا نستطيع التأكد من أن الفضل في تطوير تقنية الأصلي، ونحن هنا مما يجعلها متاحة للمجتمع العلمي.

أجرينا مجموعة من التحولات مع E. القولونية وV. الكوليرا لمقارنة كفاءة تحويل منهجيتنا السريع مع التكيف للأسلوب (التقليدية) وصفت في الأصل من قبل الميراث وآخرون. 2 لإعداد البكتيريا electrocompetent. لتنفيذ إعداد التقليدية من الخلايا المختصة، تم تلقيح 500 مل LB في 2 L-دورق مخروطي سعة 500 ميكرولتر مع الثقافة بين عشية وضحاها من E. القولونية DH5α أو V. الكوليرا O395، المحتضنة في شاكر المداري (215 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية) وتحصد في OD 600 من بين 0.5-1.0. تم تبريد القارورة على الجليد والثقافات طرد في الدوار قبل المبردة في 4،000 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. ومعلق الكريات الخلايا بدقة في 500 مل من الجليد الباردة 2 مم CaCl 2 لV. الكوليرا وده 2 O لE. القولونية، وطرد مرة أخرى في ظل نفس الظروف. الجولات اللاحقة من إعادة تعليق لنفذت د الطرد المركزي في خفض حجم 200 مل و 100 مجلدا التأكد ظلت الثقافة المبردة في 4 درجات مئوية. أخيرا، تم إجراء إعادة تعليق والطرد المركزي في حجم 10 مل من الجلسرين مع 10٪. كان بيليه معلق النهائي في 2 مل 10٪ الجلسرين وجمدت 40 ميكرولتر مأخوذة في -80 درجة مئوية وتخزينها لا تزيد عن أسبوع واحد قبل التثقيب الكهربائي. كانت الظروف التثقيب الكهربائي بما في ذلك إعدادات النبض وحجم كفيت متطابقة لكل من الأنواع البكتيرية في جميع electroporations بغض النظر عن طريقة إعداد الخلايا المختصة. وكان الفرق الوحيد أننا نفذت يغسل في DDH 2 O الباردة لE. القولونية والباردة 2 مم CaCl 2 لV. الكوليرا. يبين الجدول 1 النتائج من البكتيريا تحويلها من قبل التثقيب الكهربائي مماثل ولكن المقدمة المختصة إما مع بروتوكول السريع أو مع الطريقة التقليدية. استخدمناها O395 سلالة DH5α وكما هو شائعتستخدم لاي، ممثل سلالات V. الكوليرا وE. القولونية على التوالي، ويمكن الحصول على نتائج مماثلة مع سلالات أخرى من نفس النوع (وإن لم يكن قد تم اختبار كل سلالة واحدة)، ومن المرجح تكييفها مع غيرها من البكتيريا سلبية الغرام، وربما بعده. لضمان أن أعداد الخلايا متساوية كانت موجودة في كل دفعة نابض، وكان يتم تجميع البكتيريا electrocompetent إنشاؤها باستخدام الأسلوب السريع على جمع ومختلطة، وأبقى معلقة متجانس، وaliquoted في 40 مجلدات ميكرولتر قبل فترة وجيزة إلى التثقيب الكهربائي. تم علاج البكتيريا Electrocompetent إنشاؤها باستخدام الطريقة التقليدية بالمثل قبل تجميد في 40 ميكرولتر مأخوذة. بعد تسليم النبض، علقت كل دفعة من 40 ميكرولتر البكتيريا electroporated إلى 400 ميكرولتر LB والمخففة متسلسل 01:10. كانت مطلية مائة ميكرولتر من كل تخفيف على LB أجار في وجود 100 ميكروغرام / مل الأمبيسلين وانتشر استخدام رش خلية زجاجية معقمةوالمحتضنة في 37 درجة مئوية خلال الليل. لتحديد العدد الكلي للبكتريا تستخدم في كل تحول، 40 مجلدات ميكرولتر من البكتيريا electrocompetent من كل دفعة على استعداد تم تخفيفه بشكل متسلسل، ومطلي على LB أجار دون المضادات الحيوية مماثل في نفس الوقت. تم electroporated احد قسامة من البكتيريا تعامل على قدم المساواة من كل دفعة مع 1 ميكرولتر تريس، EDTA (TE) العازلة ولكن من دون الحمض النووي (التحول وهمية)، مخففة متسلسل ومطلي على LB أجار دون المضادات الحيوية لتقدير عدد الخلايا فقدت من تسليم نبض كهربائي. أخيرا، جرى الاختلاف إضافية واحدة لتجربة لتحديد ما إذا كانت 30 دقيقة حضانات عند 37 درجة مئوية في 1 مل LB بعد أن التثقيب الكهربائي ولكن قبل الطلاء على LB-أجار تؤثر على الانتعاش من الخلايا المتحولة. تم تعداد الوحدات تشكيل مستعمرة (CFUs) في اليوم التالي. لهذه التجربة قمنا بتوظيف pUC18، البلازميد المختبر المشتركة، ودفعات من البكتيريا المختصة تتألف منpproximately 10 8 CFUs للخلايا التي أعدت باستخدام الطريقة التقليدية و 10 7 CFUs للخلايا التي أعدت باستخدام بروتوكول السريع. التثقيب الكهربائي وحدها (دون DNA) خفضت CFUs قابلة للحياة من خلال 10-100 أضعاف بغض النظر عن الطريقة المستخدمة لإعداد الخلايا electrocompetent. كما هو مبين في الجدول رقم 1، وكان العائد المحولة داخل 10 -10 6 7 CFUs / ميكروغرام من الحمض النووي في نطاق ثلاث تجارب تكرار (الانحرافات المعيارية بين قوسين) لE. القولونية (DH5α) وV. الكوليرا (O395) على التوالي باستخدام التقليدية، وطريقة إعداد أطول لخلية electrocompetent. ظهرت العائد المحولة انخفضت 10 أضعاف إلى 10 -10 5 6 CFUs / ميكروغرام من الحمض النووي في ثلاث تجارب تكرار (الانحراف المعياري بين قوسين) لE. القولونية وV. الكوليرا على التوالي باستخدام طريقة سريعة. لهذا السبب قررنا أن نسبة البكتيريا تحول بقسمة CFUs حولتقبل استرداد عدد من CFUs من &quot;التحولات وهمية&quot; (بدون البلازميد) من دفعات مماثلة إلا من الخلايا المختصة. كانت نسبة البكتيريا داخل حولت سجل واحد (2،5-9،4٪) بغض النظر عن طريقة التحضير والأنواع تحول (الجدول 1 الأرقام بين قوسين). وتشير هذه النتائج إلى أن كفاءة طريقة سريعة هو مشابه لذلك من الإجراء أطول التقليدية إعداد الخلايا المختصة وأن سلالات ممثل ضمة الكوليرا وكولاي قابلة بالمثل على الإجراء السريع. وجدنا أن كفاءة التحول، لالبلازميدات مثل pUC18 إيواء أشرطة β-اكتاماز، لا يتأثر الانتعاش مرة 30 دقيقة في مرق LB. تم العثور على نفس العدد من transformants سواء كانت مطلية الخلايا LB أجار في وجود الأمبيسلين مباشرة، وبعد التثقيب الكهربائي، أو ما إذا سمح لهم وقت الانتعاش 30-45 دقيقةفي مرق LB عند 37 درجة مئوية قبل الطلاء. النتائج التي توصلنا إليها أن الأمبيسلين المقاومة لا يتطلب ثمرة في ظل ظروف غير انتقائية يوحي بأن β-اكتاماز التعبير يحدث بسرعة كافية على التحول. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن أجرينا التخفيفات المسلسل من البكتيريا نابض في مرق LB، والتي قد ساهمت في التعافي من الصدمات الكهربائية والشروع في التعبير الجيني. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/50684/50684fig1.jpg" /> الشكل 1. تصوير بياني لمنهجية إعداد السريع للبكتيريا electrocompetent. بعد 4-6 ساعة (تبعا لكثافة قائح) أعداد كافية من البكتيريا التي يمكن جمعها لتنفيذ 4-6 التحولات من نفس واحدة LB لوحة أجار. لضمان عدد متساو من الخلايا المختصة لكل وحدة تخزين النهائي ليتم electroporated، تم جمعها من البكتيريا لوحة آغار LB المجمعة في البداية وغسلها معا ثم آلiquoted في 40 مجلدات ميكرولتر اعتمادا على حجم الكرية (كانت مخففة الكريات أكبر في حجم أكبر القسمة على 40 ميكرولتر). <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="3"> عدد من مقاومة للأمبيسيلين الحمض النووي transformants / ميكروغرام (transformants المقاوم للالأمبيسلين تعافى [٪]) </td></tr><tr><td> سلالة </td><td> الطريقة التقليدية </td><td> طريقة سريعة </td></tr><tr><td> كولاي (DH5α) </td><td> 2.3 × 10 6 (± 7.3 × 10 5) [9.4٪] </td><td> 3 × 10 6 (± 7.1 × 10 5) [2.5٪] </td></tr><tr><td> ضمة الكوليرا (O395) </td><td> 4 × 10 7 (± 1.7 × 10 7) [5٪] </td><td> 6.7 × 10 5 (± 2.1 × 10 5) [3.3٪] </td></tr></tbody></table> الجدول 1. كفاءة التحول في ميكروغرام من الحمض النووي (pUC18) من electrocompetent بacteria من الطريقة التقليدية مقارنة مع طريقة سريعة أعدت. ونفذت جميع التحولات خارجا مع 500 نانوغرام pUC18 الحمض النووي (DNA ~ supercoiled 80٪ كما تصور بنسبة 1٪ الاغاروز الكهربائي للهلام) وكانت مخففة الخلايا electroporated متسلسل 10 أضعاف في مرق LB قبل الطلاء لكفو على LB-أجار مع المضادات الحيوية. ضوابط البكتيريا غير electroporated والبكتيريا دون electroporated البلازميد، المخفف متسلسل ومطلي على LB أجار دون المضادات الحيوية نفذت لكل مجموعة من التحولات لتحديد العدد الكلي للبكتيريا قابلة للحياة قبل وبعد يتقطع. تمثل الضوابط electroporated خط الأساس لفي المئة من البكتيريا قادرة على البقاء تحولت بنجاح.

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae at JoVE.com

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

التثقيب الكهربائي هو طريقة تستخدم عادة لإدخال الحمض النووي في البكتيريا في عملية تعرف باسم التحول. البروتوكولات التقليدية لإعداد الخلايا electrocompetent هي مضيعة للوقت وكثيفة العمالة. توضح هذه المقالة بديلة وسريعة، وسيلة فعالة لإعداد الخلايا electrocompetent المستخدمة حاليا من قبل بعض المختبرات.

بروتوكول السريع لإعداد Electrocompetent<em&gt; كولاي</em&gt; و<em&gt; ضمة الكوليرا</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

rapid-protocol-for-preparation-electrocompetent-escherichia-coli

Research

JoVE Journal

Biology

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

76.3K Views.  University of Texas Brownsville.  التثقيب الكهربائي هو طريقة تستخدم عادة لإدخال الحمض النووي في البكتيريا في عملية تعرف باسم التحول. البروتوكولات التقليدية لإعداد الخلايا electrocompetent هي مضيعة للوقت وكثيفة العمالة. توضح هذه المقالة بديلة وسريعة، وسيلة فعالة لإعداد الخلايا el...

Video: Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Vibrio cholerae: Model Organism to Study Bacterial Pathogenesis - Interview

ضمة الكوليرا : النموذجي لدراسة الكائنات البكتيرية إمراض -- مقابلة

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme acid stresses including passage through the mammalian stomach where the pH can fall to as low as pH 1 - 22. To enable such a broad range of acidic pH survival, E. coli possesses four different inducible amino acid decarboxylases that decarboxylate their substrate amino acids in a proton-dependent manner thus raising the internal pH. The decarboxylases include the glutamic acid decarboxylases GadA and GadB3, the arginine decarboxylase AdiA4, the lysine decarboxylase LdcI5, 6 and the ornithine decarboxylase SpeF7. All of these enzymes utilize pyridoxal-5'-phospate as a co-factor8 and function together with inner-membrane substrate-product antiporters that remove decarboxylation products to the external medium in exchange for fresh substrate2. In the case of LdcI, the lysine-cadaverine antiporter is called CadB. Recently, we determined the X-ray crystal structure of LdcI to 2.0 &#197;, and we discovered a novel small-molecule bound to LdcI the stringent response regulator guanosine 5'-diphosphate,3'-diphosphate (ppGpp) 14. The stringent response occurs when exponentially growing cells experience nutrient deprivation or one of a number of other stresses9. As a result, cells produce ppGpp which leads to a signaling cascade culminating in the shift from exponential growth to stationary phase growth10. We have demonstrated that ppGpp is a specific inhibitor of LdcI 14. Here we describe the lysine decarboxylase assay, modified from the assay developed by Phan et al.11, that we have used to determine the activity of LdcI and the effect of pppGpp/ppGpp on that activity. The LdcI decarboxylation reaction removes the &alpha;-carboxy group of L-lysine and produces carbon dioxide and the polyamine cadaverine (1,5-diaminopentane)5. L-lysine and cadaverine can be reacted with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid (TNBS) at high pH to generate N,N'-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-cadaverine) and N,N&#8242;-bistrinitrophenyllysine (TNP-lysine), respectively11. The TNP-cadaverine can be separated from the TNP-lysine as the former is soluble in organic solvents such as toluene while the latter is not (See Figure 1). The linear range of the assay was determined empirically using purified cadaverine.

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

The activity of the inducible lysine decarboxylase is monitored by reacting the substrate L-lysine and the product cadaverine with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid to form adducts that have differential solubility in toluene.

على الفحص لقياس نشاط القولونية محرض يسين Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

ارتفاع المناولة فحص النشاط Endoglucanase الفطرية في القولونية</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Phenotypes are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While physical interactions can indicate which bacterial proteins are associated as complexes, they do not necessarily reveal pathway-level functional relationships1. GI screens, in which the growth of double mutants bearing two deleted or inactivated genes is measured and compared to the corresponding single mutants, can illuminate epistatic dependencies between loci and hence provide a means to query and discover novel functional relationships2. Large-scale GI maps have been reported for eukaryotic organisms like yeast3-7, but GI information remains sparse for prokaryotes8, which hinders the functional annotation of bacterial genomes. To this end, we and others have developed high-throughput quantitative bacterial GI screening methods9, 10.
Here, we present the key steps required to perform quantitative E. coli Synthetic Genetic Array (eSGA) screening procedure on a genome-scale9, using natural bacterial conjugation and homologous recombination to systemically generate and measure the fitness of large numbers of double mutants in a colony array format. Briefly, a robot is used to transfer, through conjugation, chloramphenicol (Cm) - marked mutant alleles from engineered Hfr (High frequency of recombination) 'donor strains' into an ordered array of kanamycin (Kan) - marked F- recipient strains. Typically, we use loss-of-function single mutants bearing non-essential gene deletions (e.g. the 'Keio' collection11) and essential gene hypomorphic mutations (i.e. alleles conferring reduced protein expression, stability, or activity9, 12, 13) to query the functional associations of non-essential and essential genes, respectively. After conjugation and ensuing genetic exchange mediated by homologous recombination, the resulting double mutants are selected on solid medium containing both antibiotics. After outgrowth, the plates are digitally imaged and colony sizes are quantitatively scored using an in-house automated image processing system14. GIs are revealed when the growth rate of a double mutant is either significantly better or worse than expected9. Aggravating (or negative) GIs often result between loss-of-function mutations in pairs of genes from compensatory pathways that impinge on the same essential process2. Here, the loss of a single gene is buffered, such that either single mutant is viable. However, the loss of both pathways is deleterious and results in synthetic lethality or sickness (i.e. slow growth). Conversely, alleviating (or positive) interactions can occur between genes in the same pathway or protein complex2 as the deletion of either gene alone is often sufficient to perturb the normal function of the pathway or complex such that additional perturbations do not reduce activity, and hence growth, further. Overall, systematically identifying and analyzing GI networks can provide unbiased, global maps of the functional relationships between large numbers of genes, from which pathway-level information missed by other approaches can be inferred9.

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Systematic, large-scale synthetic genetic (gene-gene or epistasis) interaction screens can be used to explore genetic redundancy and pathway cross-talk. Here, we describe a high-throughput quantitative synthetic genetic array screening technology, termed eSGA that we developed for elucidating epistatic relationships and exploring genetic interaction networks in Escherichia coli.

رسم خرائط الشبكات الوظيفية البكتيرية والممرات في<em&gt; كولاي</em&gt; استخدام المصفوفات الوراثية الاصطناعية

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

تحديد بروتين في مجمعات<em&gt; كولاي</em&gt; استخدام المتعاقبة تنقية تقارب الببتيد في تركيبة مع جنبا إلى جنب الطيف الكتلي

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for expressing proteins and genetic circuits in a controlled manner as well as for providing a prototyping environment for synthetic biology.2,3 To achieve the latter goal, cell-free expression systems that preserve endogenous Escherichia coli transcription-translation mechanisms are able to more accurately reflect in vivo cellular dynamics than those based on T7 RNA polymerase transcription. We describe the preparation and execution of an efficient endogenous E. coli based transcription-translation (TX-TL) cell-free expression system that can produce equivalent amounts of protein as T7-based systems at a 98% cost reduction to similar commercial systems.4,5 The preparation of buffers and crude cell extract are described, as well as the execution of a three tube TX-TL reaction. The entire protocol takes five days to prepare and yields enough material for up to 3000 single reactions in one preparation. Once prepared, each reaction takes under 8 hr from setup to data collection and analysis. Mechanisms of regulation and transcription exogenous to E. coli, such as lac/tet repressors and T7 RNA polymerase, can be supplemented.6 Endogenous properties, such as mRNA and DNA degradation rates, can also be adjusted.7 The TX-TL cell-free expression system has been demonstrated for large-scale circuit assembly, exploring biological phenomena, and expression of proteins under both T7- and endogenous promoters.6,8 Accompanying mathematical models are available.9,10 The resulting system has unique applications in synthetic biology as a prototyping environment, or "TX-TL biomolecular breadboard."

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

This five-day protocol outlines all steps, equipment, and supplemental software necessary for creating and running an efficient endogenous Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system from scratch. With reagents, the protocol takes 8 hours or less to setup a reaction, collect, and process data.

بروتوكولات لتنفيذ و<em&gt; كولاي</em&gt; وبناء خلية الحرة TX-TL نظام التعبير عن علم الأحياء الاصطناعية

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. coli O157:H7 by targeting ORF Z3276. With this assay, we can detect as low as a few copies of the genome of DNA of E. coli O157:H7. The sensitivity and specificity of the assay were confirmed by intensive validation tests with a large number of E. coli O157:H7 strains (n = 369) and non-O157 strains (n = 112). Furthermore, we have combined propidium monoazide (PMA) procedure with the newly developed qPCR protocol for selective detection of live cells from dead cells. Amplification of DNA from PMA-treated dead cells was almost completely inhibited in contrast to virtually unaffected amplification of DNA from PMA-treated live cells. Additionally, the protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for an easy and consistent handling of a large number of samples. This method is expected to have an impact on accurate microbiological and epidemiological monitoring of food safety and environmental source.

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A qPCR assay was developed for detection of Escherichia coli O157:H7 targeting a unique genetic marker, Z3276. The qPCR was combined with propidium monoazide (PMA) treatment for live cell detection. This protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for easy and consistent handling of numerous samples

الكشف عن لايف<em&gt; كولاي</em&gt; O157: H7 من قبل خلايا PMA-QPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble unimers below a characteristic transition temperature and aggregating into micron-scale coacervates above their transition temperature. The design of elastin-like polypeptides at the genetic level permits precise control of their sequence and length, which dictates their thermal properties. Elastin-like polypeptides are used in a variety of applications including biosensing, tissue engineering, and drug delivery, where the transition temperature and biopolymer architecture of the ELP can be tuned for the specific application of interest. Furthermore, the lower critical solution temperature phase transition behavior of elastin-like polypeptides allows their purification by their thermal response, such that their selective coacervation and resolubilization allows the removal of both soluble and insoluble contaminants following expression in Escherichia coli. This approach can be used for the purification of elastin-like polypeptides alone or as a purification tool for peptide or protein fusions where recombinant peptides or proteins genetically appended to elastin-like polypeptide tags can be purified without chromatography. This protocol describes the purification of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions and discusses basic characterization techniques to assess the thermal behavior of pure elastin-like polypeptide products.

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are stimulus-responsive biopolymers with applications ranging from recombinant protein purification to drug delivery. This protocol describes the purification and characterization of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions from Escherichia coli using their lower critical solution temperature phase transition behavior as a simple alternative to chromatography.

تنقية الكروماتوغرافي من غير البروتينية المؤتلف الإيلاستين مثل والإنشطار مع الببتيدات والبروتينات من<em&gt; كولاي</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

الأخضر الفلورسنت القائم على البروتين التعبير فحص غشاء البروتينات في<em&gt; الإشريكية القولونية</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in vitro. In particular, we show that the poor solubility of Escherichia coli DNA polymerase III &#949; subunit (featuring 3&#8217;-5&#8217; exonuclease activity) is highly improved when the same protein is co-expressed with the &#945; and &#952; subunits (featuring DNA polymerase activity and stabilizing &#949;, respectively). We also show that protein co-expression in E. coli can be used to efficiently test the competence of subunits from different bacterial species to associate in a functional protein complex. We indeed show that the &#945; subunit of Deinococcus radiodurans DNA polymerase III can be co-expressed in vivo with the &#949; subunit of E. coli. In addition, we report on the use of protein co-expression to modulate mutation frequency in E. coli. By expressing the wild-type &#949; subunit under the control of the araBAD promoter (arabinose-inducible), and co-expressing the mutagenic D12A variant of the same protein, under the control of the lac promoter (inducible by isopropyl-thio-&#946;-D-galactopyranoside, IPTG), we were able to alter the E. coli mutation frequency using appropriate concentrations of the inducers arabinose and IPTG. Finally, we discuss recent advances and future challenges of protein co-expression in E. coli.

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

Protein co-expression is a powerful alternative to the reconstitution in vitro of protein complexes, and is of help in performing biochemical and genetic tests in vivo. Here we report on the use of protein co-expression in Escherichia coli to obtain protein complexes, and to tune the mutation frequency of cells.

فوائد متعددة الأوجه من البروتين المشارك في التعبير<em&gt; الإشريكية القولونية</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...