هذا البروتوكول يبسط ويوضح أساليب تنفيذ الذاتي إعادة البروتين التوليف من قبل غير الخبراء. وسيساعد الوصول المحسّن إلى هذه الأساليب على إلغاء تسويق المنصة ومجموعة التطبيقات الواسعة التي تتيحها. المزايا الرئيسية لهذه التقنية هي السرعة، والفعالية من حيث التكلفة، وسهولة التفاعل التي أنشئت مقارنة مع غيرها من منصات تخليق البروتين إعادة الذاتي.
يمكن لمنصة لدينا تمكين عدد من التطبيقات بما في ذلك علم الجينوم الوظيفي، hythopertesting، أجهزة الاستشعار الحيوي، ومجموعات تعليمية، ومع تعديلات طفيفة، والهندسة الأيضية والتوسع في الشفرة الوراثية. في حين أن هذه التقنية تتطلب فقط التدريب المختبري الأساسي، يجب أن يخطط المستخدمون الجدد للتعرف على تقنيات مثل سونيكيشن للتنفيذ الناجح للبروتوكول. لبدء هذا الإجراء إعداد كافة الوسائط والخلايا e.coli الثقافة كما هو موضح في بروتوكول النص.
ضع زجاجة طرد مركزي لتر واحد في حمام ماء جليدي. مرة واحدة في الثقافات OD600 تصل إلى 3.0، صب ثقافة الخلية في زجاجة مبردة. باستخدام توازن شعاع مزدوج، إضافة المياه إلى ثانية واحدة لتر الطرد المركزي زجاجة حتى يزن نفس الأولى لخلق التوازن للطرد المركزي.
بعد ما قبل التبريد الطرد المركزي إلى أربع درجات مئوية، الطرد المركزي الزجاجات في 5، 000 غرام وعند 10 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ل بيليه الخلايا. بعد هذا، صب ببطء قبالة والتخلص من افرا. ضع بيليه الخلية على الجليد.
باستخدام ملعقة معقمة كشط بيليه الخلية من زجاجة الطرد المركزي ونقلها إلى الباردة، 50 ملليلتر أنبوب مخروطي. إضافة 30 ملليلتر من المخزن المؤقت S30 الباردة تكمل مع اثنين من المليمولار DTT و resuspend بيليه من قبل دوامة في رشقات نارية قصيرة مع فترات الراحة على الجليد حتى يتم إعادة تعليق بيليه تماما مع عدم وجود قطع. بعد هذا، استخدام آخر 50 ملليمتر أنبوب مخروطية مليئة بالماء كتوازن للطرد المركزي العينة في 5، 000 غرام و 10 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
صب قبالة والتخلص من مُندفع. Resuspend بيليه مع 20 إلى 25 ملليلتر من المخزن المؤقت S30 الباردة. جهاز طرد مركزي في 5،000 غرام و 10 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
صب بها والتخلص من مُندفع. ثم، إضافة 30 ملليلتر من S30 العازلة وإعادة تعليق بيليه باستخدام دوامة كما هو موضح سابقا. حدد ثلاثة أنابيب مخروطية وزنها مسبقاً، باردة، 50 ملليلتر.
باستخدام حشو ماصة المصلية مع ماصة معقمة، aliquot عشرة 10 ملليلتر من تعليق بيليه في كل أنبوب. أجهزة الطرد المركزي جميع الأنابيب باستخدام الأرصدة المناسبة حسب الحاجة في 5،000 غرام و 10 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بعد هذا، اسكبي واتخلص من المُنبتين الخارقين.
مسح بعناية داخل كل أنبوب وقبعة مع الأنسجة النظيفة لإزالة العازلة الوصول، مع التأكد من تجنب لمس بيليه. باستخدام توازن تحليلي، reweigh الأنابيب والإبلاغ عن الوزن بيليه النهائي لكل أنبوب. للبدء، إضافة ملليلتر واحد من S30 الباردة العازلة مع 2 ملليمولار DTT لكل غرام واحد من كتلة الخلية إلى كل بيليه.
استخدام دوامة لإعادة تعليق الكريات كما هو موضح سابقا. ثم نقل 1.4 ملليلتر من كل بيليه resuspended في منفصلة 1.5 ملليلتر Microcenter أنابيب. وضع أنبوب واحد في حمام الماء المثلج في منقار ووضع مسبار sonicator بحيث لا تلمس قيعان أو جانبي الأنبوب.
سونيكات الأنبوب مع السعة تعيين في 50٪ لمدة 45 ثانية، تليها 59 ثانية من الراحة. التأكد من إغلاق وعكس الأنابيب خلال فترات الخروج. مباشرة بعد الانتهاء من سونيكيشن، إضافة 4.5 ميكرولترات من واحد دات مول في lysate.
عكس أنبوب عدة مرات لخلط ومن ثم وضعه على الجليد. كرر هذه العملية، sonicating وإضافة DTT لكل أنبوب من الخلايا resuspended. أجهزة الطرد المركزي العينات في 18،000 ز و 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق.
بعد هذا، ماصة كل مغرور في أنبوب جديد 1.5 ملليلتر Microcentrifuge، وترك بعض supernatant وراء لضمان بيليه غير منزعج. خذ أنابيب المافق إلى منصة الهز من حاضنة واحتضان لهم في 37 درجة مئوية مع اهتزاز في 250 دورة في الدقيقة لمدة 60 دقيقة. هذا هو رد فعل الجريانة.
ثم، الطرد المركزي العينات في 10،000 غرام و4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق. إزالة كل ناظر دون إزعاج بيليه نقلها إلى أنابيب جديدة. إنشاء العديد من 100 aliliter aliquots من استخراج للتخزين.
أولا، ذوبان الحل A، الحل باء، قالب الحمض النووي، واستخراج BL21DE3، T7 RNA Polymerase، و aliquot من المياه الصف الجزيئية على الجليد. المقبل, تسمية الكمية اللازمة من أنابيب Microcentrifuge اللازمة لرد فعل CFPS. مزيج كل كاشف عن طريق الأنابيب أو دوامة، ثم إضافة الحل إلى أنبوب رد الفعل المسمى، والتأكد من عدم دوامة استخراج الخلية ولكن بدلا من ذلك عكس أنبوب لخلط.
تأكد من أن التفاعل النهائي هو مختلطة بشكل جيد والجمع بين واحد 15 ميكروليتر حبة في الجزء السفلي من كل أنبوب. احتضان كل رد فعل دون اهتزاز في 37 درجة مئوية لمدة أربع ساعات، أو في 30 درجة مئوية بين عشية وضحاها. للبدء، والحصول على 96 لوحة جيدا وتحميل 48 ميكرولترات من 0.05 الزرس الهيبس في 8 الحموضة في كل حاجة جيدة لتحديد كم.
بعد ذلك، إزالة أنابيب التفاعل من الحاضنة. خلط كل رد فعل عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا ونقل اثنين microliters من كل رد فعل في الآبار التي تحتوي على HEPES. مزيج كل جيدا عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا.
بعد تحميل جميع ردود الفعل ومختلطة، تحميل لوحة في عداد الفلورا وقياس الفلورسنت نقطة نهاية SFGFP باستخدام موجة الإثارة طول 485 نانومتر وطول موجة الانبعاثات من 510 نانومتر. استخدم منحنى قياسي تم إنشاؤه مسبقًا لتحديد تركيز GFP فائقة المجلد من قراءة الفلورسنتات التي تم الحصول عليها. في هذه الدراسة، يتم التحقيق في إعداد استخراج E.coli المستندة إلى sonication.
كريات الخلية واستخراج الخلية مستقرة في درجة مئوية 80 السلبية لمدة عام على الأقل. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخراج الخلية الخضوع على الأقل خمس دورات تجميد ذوبان دون خسارة كبيرة في الإنتاجية. ويمكن أن تتنوع بعض الخطوات في إطار هذا البروتوكول دون الإضرار بالإنتاجية الإجمالية للنظام.
وأبرزها، يمكن حصاد الخلايا ضمن نطاق 2.7 إلى 4.0 كثافة بصرية في 600 نانومتر دون تأثير كبير على إنتاجية استخراج الخلية. ومع ذلك ، فإن جودة الحمض النووي القالب هو مصدر للتباين من دفعة إلى دفعة يؤثر على الغلة الحجمية لرد فعل CFPS. يتم حل هذا عن طريق تنقية الحمض النووي عن طريق ميدي أو Maxiprep تليها خطوة إضافية لتنظيف الحمض النووي.
كما تؤثر وعاء التفاعل على الغلة الحجمية لرد فعل CFPS. زيادة في مساحة السطح إلى نسبة حجم، يؤدي إلى زيادة الغلة الحجمية. لتحسين الغلة الحجمية من رد فعل CFPS والحد من الخلايا استخراج مجموعة إلى دفعة تقلب، ينبغي إجراء المعايرة المغنيسيوم لكل إعداد استخراج جديد.
بالنسبة لمستخرجات الخلايا المكونة من 30 ملليغرام لكل ملليلتر من البروتين الكلي، فإن تركيز المغنيسيوم الأمثل وحجم استخراجه لتقليل استخدام الكاشف وتعظيم العائد الحجمي هو 10 ملليمولار وخمسة ميكرولترات على التوالي. من خلال تغيير مقياس التفاعل ، يمكن للمستخدمين متابعة طرق تتراوح بين فحص الإنتاجية العالية إلى تعبيرات أوسع نطاقًا للبروتين المستهدف. هذه التقنية توفر اثنين من المزايا الرئيسية، أولا أنه شاشات منتجات البروتين بسرعة أكبر، والثانية، فإنه يجمع من الصعب التعبير عن البروتينات.
وتشمل الأمثلة البروتينات التي هي السامة للخلايا أو تتطلب ظروف المؤكدة لوظيفتها. كما هو الحال مع أي إجراء مختبري، ينبغي التعامل مع جميع الكواشف بحذر. بالإضافة إلى ذلك، يجب أن تكون أجهزة الطرد المركزي دائما متوازنة وينبغي استخدام حماية الأذن أثناء سونيكيشن.
