فإن الكتاب أود أن أشكر مايكل غولدبرغ لإعداد استقرت حل سيرنا وهيذر توبين لمساعدتها مع الحيوانات. وقد تم تمويل هذه الدراسة من قبل وزارة الدفاع جائزة مبتكر W81XWH-08-1-0659 لDEI. وأيد تدريب ما بعد الدكتوراه من SK من قبل مؤسسة سوزان كومن G (KG101329). فإن الكتاب أود أن أشكر كريستين جونسون لإعداد التخطيطي.

1. إعداد حقن الحل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 0.2٪ ايفانز صبغة زرقاء في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) أو غيرها من محلول مائي من الفائدة. هذه الصبغة الحيوية مفيد لتقييم نجاح الحقن ينترادوكتال وينصح كوسيلة مساعدة عند وضع التصور الخبرة في هذه التقنية. </li></ol> فإن حجم المطلوبة تعتمد على عدد ومواقع الغدد ليتم حقنه. ويمكن حقن كل 10 الغدد الثديية من إناث الفئران ولكن نظرا لحجم الغدة أصغر حجما، وأزواج الغدة 1 و 5 وعادة ما يتم حقن مع 10 ميكرولتر من الحل. يتم حقن كل الأزواج الثديية الأخرى مع 20 ميكرولتر. هذه الكميات تكفي لملء شجرة الأقنية بأكمله. 2. التحضير قبل الجراحة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسجيل وزن الجسم كل الماوس. كما هو الحال مع جميع الدراسات قبل السريرية، ينبغي رصد أوزان الحيوانات بانتظام (مرتين في الأسبوع أو أكثر) لتقييم السمية المحتملة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير م[أوس] باستخدام غرفة isoflurane وتطبيق مواد التشحيم والعين. أثناء الإجراء سيستمر الفئران أن استنشاق باستخدام تخدير تركيز 2-4٪ من isoflurane والأكسجين في طريق مخروط الأنف. ترصد بدقة الماوس لإجراء تغييرات في معدل التنفس، وتعديل مستوى isoflurane وفقا لذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن ميلوكسيكام (5-10 ملغ / كلغ) تحت الجلد قبل الإجراء وتسكين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق أكثر من وصفة كريم إزالة الشعر إلى منطقة الحلمة. انتظر 5 دقائق وبلطف إزالة الشعر فضفاض مع قضيب من القطن طرف باستخدام حركة دائرية. إزالة كريم باستخدام مناشف ورقية مبللة المبللة بماء دافئ. لا ينصح الحلاقة نظرا لخطر الإضرار الحلمات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأمين الماوس تحت المجسام عن طريق تسجيل بلطف أسفل الأطراف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مواقع الحقن النظيفة مع مسحات الكحول. </li></ol> 3. حقن ينترادوكتال <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد موقع الحلمات المناسبة ليتم حقنه تحت المجسام. استخدام غرامة الجزئي تشريح-tweezers لإزالة أي الجلد الميتة التي تغطي افتتاح الحلمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحمل 10-20 ميكرولتر من محلول الحقن في حقنة 50 ميكرولتر مع 33 G محور إبرة معدنية الملصقة. في بعض الأحيان، وبعد حقن كميات صغيرة (1 ميكرولتر أو أقل) يمكن أن يتسرب من الحلمة عند سحب الإبرة. وبالتالي، فمن المستحسن لحقن 11 أو 21 ميكرولتر على التوالي لحساب الخسارة المحتملة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عقد الحلمة برفق مع ملاقط غرامة ورفعه قليلا لوضعه للحقن. فإنه ليس من الضروري لخفض الحلمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن المحلول ببطء لتقليل الأضرار المحتملة الناجمة عن التحرك بسرعة السوائل داخل شمعة الأقنية. ينبغي الحفاظ على معدل الحقن في حوالي 40 ميكرولتر / دقيقة. </li></ol> 4. رعاية ما بعد الجراحة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مراقبة موقع الحقن. ينبغي أن يكون هناك أي علامات للصدمة إلى منطقة الحلمة أو الأنسجة المحيطة بها. تورم في المنطقة المحيطة بالحلمة المرجح يدل على وسادة الثديية الدهون حقن راذهص من حقن ينترادوكتال ناجحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الحيوان من مخروط الأنف والانتقال إلى قفص منفصل لتحقيق الانتعاش. وضع القفص تحت مصباح الحرارة لمنع انخفاض حرارة الجسم والمساعدة في الانتعاش. ويعيش الفئران منفردة وسيتم مراقبتها عن كثب حتى يستعيد وعيه والتنقل. </li></ol> 5. تحليل الغدة الثديية الأنسجة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند الانتهاء من الدراسة، والموت الرحيم الفئران عن طريق خلع عنق الرحم التالية CO 2 الغاز المضغوط في غرفة العزل. يتم استئصال الغدد الثديية، ويمكن استخدامه لإعداد جبل كامل 11، الأنسجة، أو RNA والبروتين العزلة. </li></ol>

<ol>
	<li>Dooley, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ductal+lavage+for+detection+of+cellular+atypia+in+women+at+high+risk+for+breast+cancer.">Ductal lavage for detection of cellular atypia in women at high risk for breast cancer.</a> J Natl Cancer Inst. 93, 1624-1632 (2001).</li><li>Jacobs, L., Sukumar, S., Stearns, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraductal+therapy+for+the+prevention+of+breast+cancer.">Intraductal therapy for the prevention of breast cancer.</a> Curr Opin Investig Drugs. 11, 646-652 (2011).</li><li>King, B. L., Love, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intraductal+approach+to+the+breast:+raison+d'etre.">The intraductal approach to the breast: raison d'etre.</a> Breast Cancer Res. 8, 206 (2006).</li><li>Murata, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ductal+access+for+prevention+and+therapy+of+mammary+tumors.">Ductal access for prevention and therapy of mammary tumors.</a> Cancer Res. 66, 638-645 (2006).</li><li>Stearns, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+and+clinical+evaluation+of+intraductally+administered+agents+in+early+breast+cancer.">Preclinical and clinical evaluation of intraductally administered agents in early breast cancer.</a> Sci Transl Med. 3, 106ra108 (2011).</li><li>Flanagan, M., Love, S., Hwang, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Status+of+Intraductal+Therapy+for+Ductal+Carcinoma+in+Situ.">Status of Intraductal Therapy for Ductal Carcinoma in Situ.</a> Curr Breast Cancer Rep. 2, 75-82 (2010).</li><li>Nguyen, D. -. A., Beeman, N., Lewis, M., Schaack, J., Neville, M. C., Ip, M. M., Asch, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in mammary gland biology and breast cancer research. , 259-270 (2000).</li><li>Behbod, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intraductal+human-in-mouse+transplantation+model+mimics+the+subtypes+of+ductal+carcinoma+in+situ.">An intraductal human-in-mouse transplantation model mimics the subtypes of ductal carcinoma in situ.</a> Breast Cancer Res. 11, R66 (2009).</li><li>Bu, W., Xin, L., Toneff, M., Li, L., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus+vectors+for+stably+introducing+genes+into+mammary+epithelial+cells+in+vivo.">Lentivirus vectors for stably introducing genes into mammary epithelial cells in vivo.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 14, 401-404 (2009).</li><li>Reddy, J. P., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RCAS-TVA+system+for+introduction+of+oncogenes+into+selected+somatic+mammary+epithelial+cells+in+vivo.">The RCAS-TVA system for introduction of oncogenes into selected somatic mammary epithelial cells in vivo.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 14, 405-409 (2009).</li><li>Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+mammary+gland+development+and+function+in+mouse+models.">Evaluation of mammary gland development and function in mouse models.</a> J. Vis. Exp. , e2828 (2011).</li></ol>

والكتاب ليس لديهم الإفصاحات المالية.

المعدلة وراثيا وخروج المغلوب الفئران هي أدوات لا تقدر بثمن لدراسة دور الجينات في الجسم الحي الفردية في سرطان الثدي. ومع ذلك، فإنه مكلف وتوليد هذه الحيوانات تستغرق وقتا طويلا وضربة قاضية الجين هو عادة في كل مكان ما يحول دون لنا في بعض الأحيان من التعرف على آثار محددة من هذا الجين على الغدة الثديية. وبالتالي، فإن ضربة قاضية استهدفت تخفيف القضايا من الآثار الجانبية والسميات غير محددة في الأجهزة الأخرى. حقن ينترادوكتال من سيرنا المعروضة هنا تمكن ضربة قاضية الجينات المترجمة في الماوس الغدة الثديية. بل هو طريقة سريعة لتسليم المخدرات المستهدفة والمترجمة إلى الغدة الثديية لا تقتصر على تسليم سيرنا. مثل هذا الثديية تسليم المخدرات الغدة محددة غير محددة يتجنب الآثار الجانبية والسمية إلى أعضاء أخرى، ويسمح لدراسة التعديلات الجينات في نقطة زمنية محددة خلال التنمية الغدة الثديية وتشكيل الورم الثدي. ليس هناك أي دليل من الاشتراكيةجزيئات الحمض النووي الريبي في الغدد غير حقن، والكبد أو الأجهزة الأخرى التي تقدم دليلا إضافيا على أن يقدم هذا الأسلوب وسيلة مفضلة للالمترجمة ضربة قاضية الجينات في الغدة الثديية. وعلاوة على ذلك، فإن حقن ينترادوكتال يمكن أن تتكرر أسبوعيا أو كل أسبوعين على مدى عدة أشهر للسماح لرصد طويل الأجل من العوامل العلاجية. هذه التقنية يفتح إمكانية لمعايرة تسليم ينترادوكتال من مختلف الكواشف إلى القنوات الثديية الماوس. يجب التقدم في تسليم المترجمة في نماذج الماوس جيدا اتسم تسريع تطبيق غير الغازية، استهدفت الاستراتيجيات العلاجية في البشر.

وتتألف الغدة الثديية الماوس من شجرة الأقنية السنخية المعقدة التي يتقاطع في القناة المركزية في الحلمة. في الفئران، وكذلك البشر، فإن غالبية أورام الثدي تنشأ في الخلايا الظهارية المبطنة لقنوات الحليب. وتشمل العلاجات المتاحة حاليا العلاج الكيميائي عن طريق الوريد، والإشعاع، والجراحة. تم استكشاف علاجات موضعية ينترادوكتال 1-3 وتقدم مزايا كبيرة من حيث انخفاض السمية والآثار الجانبية. ومع ذلك، لا تزال هناك العديد من التحديات أمام هذه يمكن تطبيقها على نطاق أوسع. القدرة على تنفيذ إجراءات مماثلة في الغدة الثديية الماوس يسهل توصيف تدخلات ينترادوكتال. ونحن هنا نقدم وسيلة غير الغازية لتسليم الكواشف مباشرة في الماوس الثديية لاصق. وقد سبق أن أظهرت تسليم ينترادوكتال من العلاج الكيميائي وكلاء في كل من مرضى سرطان الثدي ونماذج الماوس لتكون فعالة للغاية مع عدم وجود دليل علىسمية جهازية أو التشريحية المرضية على المدى الطويل يغير 3-6. علاوة على ذلك، وقد ثبت أن حقن الخلايا السرطانية وlentiviral تسليم ناقلات الجينات المسرطنة في السابق ليكون ممكنا عن طريق الحقن ينترادوكتال 7-10. بالإضافة إلى تقديم الأدوية، وهذا الإجراء مفيد لإسكات الجينات المحلية من الغدة الثديية من خلال حقن ينترادوكتال من سيرنا. حقن كميات صغيرة من محلول سيرنا فعالة دون تغيير علم التشريح وعلم وظائف الأعضاء من الغدة الثديية. في المختبر لدينا أظهرنا مؤخرا إسكات ناجحة من الجينات سيط رئيسي في الفئران المعدلة وراثيا التي تتطور بشكل عفوي الأورام الثديية الناتجة في الوقاية من الأورام التقدم (بروك وآخرون، غير منشورة). كنا قادرين على تكرار الحقن كل أسبوعين في نفس الحلمات تصل إلى 7 مرات في فترات 2 أسابيع مع عدم وجود تلف الأنسجة مرئية أو سمية. حقن ينترادوكتال يمكن توقيتها في الماوس الكبار لمعالجة جمعةالأحداث opmentally محددة ذات الصلة بالتنمية الغدة الثديية أثناء الحمل والرضاعة، وارتداد أو لاستهداف مراحل لاحقة خلال تطور الورم والتقدم. عذراء الإناث يتجاوزن 8 أسابيع من العمر وقد تم حقن غير جراحية في مختبرنا.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>2-4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>meloxicam</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>5-10 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evans blue dye</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E2129-10G</td>
			<td>0.2% in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hair removing cream</td>
			<td>Veet</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Choose sensitive option</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereoscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi DV4</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro-dissecting tweezers</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>rs-4976</td>
			<td>With a 0.10 x 0.06 mm tip made of dumostar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7637-01</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>33-gauge needle</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7803-05</td>
			<td>point style 4, 12 degree bevel (standard)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siGLO cyclophilin B control siRNA</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>D-001610-01-05</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intraductal injection for localized drug delivery to the mouse mammary gland

هنا نحن تصف بروتوكول لتقديم مختلف الكواشف الغدة الثديية للفأر عن طريق الحقن ينترادوكتال. وكانت العقاقير الموضعية وتدق إلى أسفل من الجينات داخل الظهارة الثديية من الصعب تحقيق ذلك بسبب عدم وجود جزيئات تستهدف المناسبة التي هي مستقلة عن مراحل النمو مثل الحمل والرضاعة. هنا، نحن تصف تقنية لتسليم المترجمة من الكواشف إلى الغدة الثديية في أي مرحلة في مرحلة البلوغ عن طريق الحقن ينترادوكتال في الحلمات من الفئران. الحقن يمكن أن يؤديها على الفئران الحية، تحت التخدير، والسماح لتسليم المخدرات غير الغازية والمترجمة إلى الغدة الثديية. علاوة على ذلك، يمكن تكرار الحقن على مدى عدة أشهر دون الإضرار الحلمة. الأصباغ الحيوية مثل ايفانز الأزرق هي مفيدة جدا لتعلم هذه التقنية. عند حقن ينترادوكتال من الصبغة الزرقاء، يصبح شجرة الأقنية بأكملها مرئية للعين. علاوة على ذلك، الكواشف fluorescently المسمى تسمح أيضا للالتصور والتوزيع داخل الغدة الثديية. هذه التقنية قابلة للتكيف لمجموعة متنوعة من المركبات بما في ذلك سيرنا، وكلاء العلاج الكيميائي، والجزيئات الصغيرة.

الحلمات يمكن أن تكون مترجمة بسهولة باستخدام stereomicroscope مرة واحدة تمت إزالة الشعر في المنطقة المحيطة به (الشكل 1A). لإتقان تقنية الحقن، فمن المستحسن لحقن صبغة زرقاء ايفانز ومراقبة سلامة الغدة (الأرقام 1B و C). هذا النهج يسمح أيضا لتحديد أحجام مناسبة ليتم حقنه في كل غدة واحدة يمكن تقييم ما إذا كان بصريا الصبغة يصل النظام بأكمله الأقنية (أرقام 1C و2A). صورة من حقن ايفانز صورة الأزرق ثم يمكن مقارنة كاملة محمولة على الغدة الثديية، التي اتسخت شجرة الأقنية كامل مع كارمين الشب صبغ (الشكل 2B). يرجى ملاحظة أن متانة هذه الطريقة حقن تعتمد بشكل كبير على مشغل الشبكة. على سبيل المثال، تثقيب القناة سيؤدي إلى منصة الدهون الثديية الحقن وحقن حل سريع جدا قد يؤدي إلى تلف سل الظهارية الأقنيةليرة سورية وإثارة استجابة التهابية. حقن ينترادوكتال ناجحة يمكن تسليم المخدرات المترجمة إلى الغدة الثديية، ويقلل كثيرا ما لوحظ خلاف ذلك الآثار الجانبية غير محددة. صورة مثال على الغدة حقنوا الموسومة fluorescently سيرنا استهداف cyclophilin (الجينات غير الضرورية) هو مبين في الشكل (3). <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/50692/50692fig1.jpg" /> الشكل 1. حقن الغدة الثديية الأربية من خلال الحلمة مع ايفانز صبغة زرقاء. A) مظهر الحلمة قبل الحقن وB) بعد الحقن مع 20 ميكرولتر ايفانز صبغة زرقاء. ويلاحظ أي تورم أو تلف الأنسجة. C) عند فتح الجلد، يسمح الصبغة التصور من شجرة الأقنية الثديية بأكمله. <img alt="الرقم 2" src="/files/ftp_upload/50692/50692fig2.jpg" /> الشكل 2. كله يشن تحليل ايفانز في الزرقاءالغدة jected. A) قد تم مسح صورة الممثل من غدة تشريح رفعه من الحيوان وانتشرت على شريحة زجاجية مباشرة بعد الحقن. B) كامل تلطيخ جبل من نفس الغدة مع اللون القرمزي بعد صبغ الدهون. مقارنة مع A) يؤكد أن الحل حقن يملأ شجرة الأقنية اللبنية والغدة سليمة تشريحيا. <img alt="الرقم 3" src="/files/ftp_upload/50692/50692fig3.jpg" /> الرقم 3. تسليم ينترادوكتال من سيرنا الفلورسنت. صورة الممثل من عينة الأنسجة الطازجة ورفعه 48 ساعة تال للحقن.

Watch this Scientific Journal Video about Intraductal Injection for Localized Drug Delivery to the Mouse Mammary Gland at JoVE.com

Intraductal Injection for Localized Drug Delivery to the Mouse Mammary Gland

يوصف بروتوكول لتسليم ينترادوكتال غير الغازية من الكواشف مائي في الغدة الثديية الماوس. طريقة يستفيد من الحقن الموضعي في الحلمات من الغدد الثديية التي تستهدف القنوات الثديية على وجه التحديد. هذه التقنية قابلة للتكيف لمجموعة متنوعة من المركبات بما في ذلك سيرنا، وكلاء العلاج الكيميائي والجزيئات الصغيرة.

حقن ينترادوكتال لتسليم المخدرات المترجمة إلى ماوس الغدة الثديية

Herein we describe a protocol to deliver various reagents to the mouse mammary gland via intraductal injections. Localized drug delivery and knock-down of ...

intraductal-injection-for-localized-drug-delivery-to-mouse-mammary

Research

JoVE Journal

Biology

34.7K Views.  Boston Children's Hospital and Harvard Medical School.  يوصف بروتوكول لتسليم ينترادوكتال غير الغازية من الكواشف مائي في الغدة الثديية الماوس. طريقة يستفيد من الحقن الموضعي في الحلمات من الغدد الثديية التي تستهدف القنوات الثديية على وجه التحديد. هذه التقنية قابلة للتكيف لمجموعة متنوعة من المرك...

Video: Intraductal Injection for Localized Drug Delivery to the Mouse Mammary Gland

Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of dome shaped cell structures referred to as mammospheres 1. The HC11 cell line has been employed as a model system for the study of regulation of mammary lactogenic differentiation both in vitro and in vivo 2. The HC11 cells differentiate and synthesize milk proteins in response to treatment with lactogenic hormones. Following the growth of HC11 mouse mammary epithelial cells to confluence, lactogenic differentiation was induced by the addition of a combination of lactogenic hormones including dexamethasone, insulin, and prolactin, referred to as DIP. The HC11 cells induced to differentiate were photographed at times up to 120 hours post induction of differentiation and the number of mammospheres that appeared in each culture was enumerated. The size of the individual mammospheres correlates with the degree of differentiation and this is depicted in the images of the differentiating cells.

HC11 lactogenic differentiation can be characterized by the formation of domed structures referred to as mammospheres. The structures can be enumerated by phase contrast microscopy to aid in quantifying lactogenic differentiation.

الخلايا الظهارية الثديية شكل الماوس Mammospheres خلال التمايز المولد للبن

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of ...

Changes in Mammary Gland Morphology and Breast Cancer Risk in Rats

Studies in rodent models of breast cancer show that exposures to dietary/hormonal factors during the in utero and pubertal periods, when the mammary gland undergoes extensive modeling and re-modeling, alter susceptibility to carcinogen-induced mammary tumors. Similar findings have been described in humans: for example, high birthweight increases later risk of developing breast cancer, and dietary intake of soy during childhood decreases breast cancer risk. It is thought that these prenatal and postnatal dietary modifications induce persistent morphological changes in the mammary gland that in turn modify breast cancer risk later in life. These morphological changes likely reflect epigenetic modifications, such as changes in DNA methylation, histones and miRNA expression that then affect gene transcription . In this article we describe how changes in mammary gland morphology can predict mammary cancer risk in rats. Our protocol specifically describes how to dissect and remove the rat abdominal mammary gland and how to prepare mammary gland whole mounts. It also describes how to analyze mammary gland morphology according to three end-points (number of terminal end buds, epithelial elongation and differentiation) and to use the data to predict risk of developing mammary cancer.

Our protocol describes how to dissect the rat abdominal mammary gland and how to prepare mammary gland whole mounts. It also describes how to analyze mammary gland morphology using three end-points (number of terminal end buds, epithelial elongation and differentiation) and to use these results to predict mammary cancer risk in rats which were exposed to dietary modifications in utero or during prepuberty.

التغيرات في الغدة الثديية المورفولوجيا واحتمال الاصابة بسرطان الثدي في الفئران

Studies in rodent models of breast cancer show that exposures to dietary/hormonal factors during the in utero and pubertal periods, when the mammary gland ...

Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves composed of a number of terminal duct lobular units made of secretory alveoli and converging ducts1. In mice, a similar architecture is observed at pregnancy in which ducts and alveoli are interspersed within the connective tissue stroma. The mouse mammary gland epithelium is a tree like system of ducts composed of two layers of cells, an inner layer of luminal cells surrounded by an outer layer of myoepithelial cells denoted by the confines of a basement membrane2. At birth, only a rudimental ductal tree is present, composed of a primary duct and 15-20 branches. Branch elongation and amplification start at the beginning of puberty, around 4 weeks old, under the influence of hormones3,4,5. At 10 weeks, most of the stroma is invaded by a complex system of ducts that will undergo cycles of branching and regression in each estrous cycle until pregnancy2. At the onset of pregnancy, a second phase of development begins, with the proliferation and differentiation of the epithelium to form grape-shaped milk secretory structures called alveoli6,7. Following parturition and throughout lactation, milk is produced by luminal secretory cells and stored within the lumen of alveoli. Oxytocin release, stimulated by a neural reflex induced by suckling of pups, induces synchronized contractions of the myoepithelial cells around the alveoli and along the ducts, allowing milk to be transported through the ducts to the nipple where it becomes available to the pups 8. Mammary gland development, differentiation and function are tightly orchestrated and require, not only interactions between the stroma and the epithelium, but also between myoepithelial and luminal cells within the epithelium9,10,11. Thereby, mutations in many genes implicated in these interactions may impair either ductal elongation during puberty or alveoli formation during early pregnancy, differentiation during late pregnancy and secretory activation leading to lactation12,13. In this article, we describe how to dissect mouse mammary glands and assess their development using whole mounts. We also demonstrate how to evaluate myoepithelial contractions and milk ejection using an ex-vivo oxytocin-based functional assay. The effect of a gene mutation on mammary gland development and function can thus be determined in situ by performing these two techniques in mutant and wild-type control mice.

This method describes how to dissect and assess mammary gland development and function from mice. Excised mammary glands are assessed for the degree of development using whole mount while milk ejection is evaluated using an oxytocin-based myoepithelial cell contraction assay.

تقييم التنمية وظيفة الغدة الثديية في نماذج الماوس

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves ...

Phosphopeptide Analysis of Rodent Epididymal Spermatozoa

Spermatozoa are quite unique amongst cell types. Although produced in the testis, both nuclear gene transcription and translation are switched off once the pre-cursor round cell begins to elongate and differentiate into what is morphologically recognized as a spermatozoon. However, the spermatozoon is very immature, having no ability for motility or egg recognition. Both of these events occur once the spermatozoa transit a secondary organ known as the epididymis. During the ~12 day passage that it takes for a sperm cell to pass through the epididymis, post-translational modifications of existing proteins play a pivotal role in the maturation of the cell. One major facet of such is protein phosphorylation. In order to characterize phosphorylation events taking place during sperm maturation, both pure sperm cell populations and pre-fractionation of phosphopeptides must be established. Using back flushing techniques, a method for the isolation of pure spermatozoa of high quality and yield from the distal or caudal epididymides is outlined. The steps for solubilization, digestion, and pre-fractionation of sperm phosphopeptides through TiO2 affinity chromatography are explained. Once isolated, phosphopeptides can be injected into MS to identify both protein phosphorylation events on specific amino acid residues and quantify the levels of phosphorylation taking place during the sperm maturation processes.

Proteomic analysis of any cell type is highly dependent on both purity and pre-fractionation of the starting material in order to de-complexify the sample prior to liquid chromatography mass spectrometry (MS). By using back-flushing techniques, pure spermatozoa can be obtained from rodents. Following digestion, phosphopeptides can be enriched using TiO2.

تحليل Phosphopeptide من القوارض بربخي المني

Spermatozoa are quite unique amongst cell types. Although produced in the testis, both nuclear gene transcription and translation are switched off once ...

Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple method for the immune detection of proteins, the mouse lactating mammary gland being taken as an example. A protocol for the preparation of the tissue samples, especially concerning the dissection of mouse mammary gland, tissue fixation and frozen tissue sectioning, are detailed. A standard protocol to perform indirect immunofluorescence, including an optional antigen retrieval step, is also presented. The observation of the labeled tissue sections as well as image acquisition and post-treatments are also stated. This procedure gives a full overview, from the collection of animal tissue to the cellular localization of a protein. Although this general method can be applied to other tissue samples, it should be adapted to each tissue/primary antibody couple studied.

The indirect immunofluorescence protocol described in this article allows the detection and the localization of proteins in the mouse mammary gland. A complete method is given to prepare mammary gland samples, to perform immunohistochemistry, to image the tissue sections by fluorescence microscopy, and to reconstruct images.

المناعي غير المباشر على أقسام المجمدة من الماوس الغدة الثديية

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple ...

A Comparative Study of Drug Delivery Methods Targeted to the Mouse Inner Ear: Bullostomy Versus Transtympanic Injection

We present two minimally invasive microsurgical techniques in rodents for specific drug delivery into the middle ear so that it may reach the inner ear. The first procedure consists of perforation of the tympanic bulla, termed bullostomy; the second one is a transtympanic injection. Both emulate human clinical intratympanic procedures.
Chitosan-glycerophosphate (CGP) and Ringer&#180;s Lactate buffer (RL) were used as biocompatible vehicles for local drug delivery. CGP is a nontoxic biodegradable polymer widely used in pharmaceutical applications. It is a viscous liquid at RT&#160;but it congeals to a semi solid phase at body temperature. RL is an isotonic solution used for intravenous administrations in humans. A small volume of this vehicle is precisely placed on the Round Window (RW) niche by means of a bullostomy. A transtympanic injection fills the middle ear and allows less control but broader access to the inner ear.
The safety profiles of both techniques were studied and compared by using functional and morphological tests. Hearing was evaluated by registering the Auditory Brainstem Response (ABR) before and several times after microsurgery. The cytoarchitecture and preservation level of cochlear structures were studied by conventional histological techniques in paraformaldehyde-fixed and decalcified cochlear samples. In parallel, unfixed cochlear samples were taken and immediately frozen to analyze gene expression profiles of inflammatory markers by quantitative Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR).
Both procedures are suitable as drug delivery methods into the mouse middle ear, although transtympanic injection proved to be less invasive compared to bullostomy.

A Comparative Study of Drug Delivery Methods Targeted to the Mouse Inner Ear: Bullostomy Versus Transtympanic Injection

Two microsurgery approaches for local drug delivery to the inner ear are described here and compared in terms of impact on hearing parameters, cochlear cytoarchitecture and expression of inflammatory markers.

دراسة مقارنة بين المخدرات طرق التسليم المستهدفة إلى الأذن ماوس الداخلية: Bullostomy<em&gt; مقابل</em&gt; بطريق غشاء الطبل حقن

We present two minimally invasive microsurgical techniques in rodents for specific drug delivery into the middle ear so that it may reach the inner ear. ...

Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal architecture. Here, a small pocket below the skin was created using Mayo scissors, allowing separation of the glands within the subcutaneous tissue from the underlying peritoneum. Visualization of the glands was aided by the use of 3.5x-R surgical micro loupes. The pelt was inverted and pinned back allowing identification of the intact mammary fat pads. Each of the #4 abdominal glands was bluntly dissected by sliding the scalpel blade laterally between the subcutaneous layer and the glands. Immediately post-harvest, glands were placed in 10% neutral buffered formalin for subsequent tissue processing. Excision of the entire gland is advantageous because it primarily eliminates the risk of excluding important tissue-wide interactions between ductal epithelial cells and other microenvironmental cellular populations that could be missed in a partial biopsy. One drawback of the methodology is the use of serial sections from fixed tissues which limits analyses of ductal morphogenesis and protein expression to discrete locations within the gland. As such, changes in ductal architecture and protein expression in 3 dimensions (3D) is not readily obtainable. Overall, the technique is applicable to studies requiring whole intact murine mammary glands for downstream investigations such as developmental ductal morphogenesis or breast cancer.

Here, we present a protocol for the isolation of whole, intact mouse mammary glands to investigate extracellular matrix (ECM) expression and ductal morphology. Mouse #4 abdominal glands were extracted from 8-10 week old female nulliparous mice, fixed in neutral buffered formalin, sectioned and stained using immunohistochemistry for ECM proteins.

عزل الغدد الثديية الماوس سليمة، وكلها لتحليل التعبير المصفوفة خارج الخلية ومورفولوجية الغدة

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal ...

Partial Bile Duct Ligation in the Mouse: A Controlled Model of Localized Obstructive Cholestasis

In rodents, complete bile duct ligation (cBDL) of the common bile duct is an established surgical technique for studying obstructive cholestasis and bile duct proliferation. However, long-term experiments can lead to increased morbidity and mortality. In select mouse strains with underlying liver disease, meaningful comparisons can be made even with ligation of a single lobe of the liver, which can reduce animal losses and expenses. Here, we describe partial bile duct ligation (pBDL) in the mouse, in which only the left hepatic bile duct is ligated, causing biliary obstruction in the left lobe but not the remaining lobes. With careful microsurgical technique, pBDL experiments can be cost-effective, since the unligated lobe serves as an internal control to the ligated lobes, when subjected to the same conditions in the same animal. Unlike cBDL, a separate sham-operated control group is not necessary. pBDL is highly useful to directly compare localized versus systemic effects of cholestasis and other retained bile components. pBDL can also be repurposed as a novel method to investigate mechanisms related to medications and cell migration.

Here, we present partial bile duct ligation as a surgical model of liver injury and regeneration in rodents.

ربط القناة الصفراوية الجزئي في الماوس: نموذج الخاضعة لركود صفراوي معرقلة مترجمة

In rodents, complete bile duct ligation (cBDL) of the common bile duct is an established surgical technique for studying obstructive cholestasis and bile ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current blastocyst injection protocol. Here we report that a simple rotation of the embryo, and injection through Trans-Inner cell mass (TICM) increased the percentage of chimeric mice from 31% to 50%, with no additional equipment or further specialized training. 26 different inbred clones, and 35 total clones were injected over a period of 9 months. There was no significant difference in either pregnancy rate or recovery rate of embryos between traditional injection techniques and TICM. Therefore, without any major alteration in the injection process and a simple positioning of the blastocyst and injecting through the ICM, releasing the ES cells into the blastocoel cavity can potentially improve the quantity of chimeric production and subsequent germline transmission.

Here we present a protocol to increase chimera production without the use of new equipment. A simple orientation change of the embryo for injection can increase the number of embryos produced, and potentially reduce the timeline to germline transmission.

حقن الخلية الداخلية عبر كتلة من الخلايا الجذعية الجنينية يؤدي إلى ارتفاع في أسعار تشيميريسم

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

Bovine Mammary Gland Biopsy Techniques

Bovine mammary gland biopsies allow researchers to collect tissue samples to study cell biology including gene expression, histological analysis, signaling pathways, and protein translation. This article describes two techniques for biopsy of the bovine mammary gland (MG). Three healthy Holstein dairy cows were the subjects. Before biopsies, cows were milked and subsequently restrained in a cattle chute. An analgesic (flunixin meglumine, 1.1 to 2.2 mg/kg of body weight) was administered via jugular intravenous [IV] injection 15-20 min prior to biopsy. For standing sedation, xylazine hydrochloride (0.01-0.05 mg/kg of body weight) was injected via the coccygeal vessels 5-10 min before the procedure. Once adequately sedated, the biopsy site was aseptically prepared and locally anaesthetized with 6 mL of 2% lidocaine hydrochloride via subcutaneous injection. Using aseptic technique, a 2 to 3 cm vertical incision was made using a number 10 scalpel. Core and needle biopsy tools were used. The core biopsy tool was attached to a cordless drill and inserted into the MG tissue through the incision using a clock-wise drill action. The needle biopsy tool was manually inserted into the incision site. Immediately after the procedure, an assistant applied pressure on the incision site for 20 to 25 min using a sterile towel to achieve hemostasis. Stainless steel surgical staples were used to oppose the skin incision. The staples were removed 10 days post-procedure. The main advantages of core and needle biopsies is that both approaches are minimally invasive procedures that can be safely performed in healthy cows. Milk yield following the biopsy was unaffected. These procedures require a short recovery time and result in fewer risks of complications. Specific limitations may include bleeding after the biopsy and infection on the biopsy site. Applications of these techniques include tissue collection for clinical diagnosis and research purposes, such as primary cell culture.

This article presents a bovine mammary gland biopsy using core and needle biopsy tools. Harvested tissue can be used for cell culture or to assess mammary physiology and metabolism including gene expression, protein expression, protein modifications, immunohistochemistry, and metabolite concentrations.