המחברים מבקשים להודות למייקל גולדברג להכנת פתרון siRNA התייצב והת&#39;ר טובין לעזרתה עם בעלי החיים. מחקר זה מומן על ידי משרד ההגנה האמריקאי פרס ממציא W81XWH-08-1-0,659 לDEI. הכשרת דוקטורט של SK נתמכה על ידי קרן סוזן G קומן (KG101329). המחברים מבקשים להודות לקריסטין ג&#39;ונסון להכנת סכמטי.

1. הכנת פתרון הזרקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 0.2% צבע כחול אוונס בופר פוספט (PBS) או תמיסה מימית אחרת של עניין. צבע חיוני זה שימושי להערכת ההצלחה של זריקות intraductal והוא מומלץ כסיוע להדמיה בעת פיתוח מומחיות בטכניקה. </li></ol> הנפח הנדרש יהיה תלוי במספר והמיקום של הבלוטות להיות מוזרק. כל 10 בלוטות החלב של נקבות עכברים ניתן להזריק אך בשל גודל הבלוטה הקטן יותר, זוגות בלוטת 1 ו -5 מוזרקים בדרך כלל עם 10 μl של פתרון. כל זוגות החלב אחרים מוזרקים עם 20 μl. כרכים אלה יש בם כדי למלא את עץ ductal כולו. 2. הכנה לפני ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את משקל הגוף של כל עכבר. כמו בכל המחקרים פרה, צריכים להיות במעקב משקולות בעלי החיים באופן קבוע (שבוע או יותר פעמיים) כדי להעריך את הרעילות פוטנציאלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי מ &#39;האוז באמצעות תא isoflurane וליישם חומר סיכה העין. במהלך הליך עכברים ימשיכו להיות מורדמים באמצעות ריכוז 2-4% בשאיפה של isoflurane בחמצן באמצעות חרטומו. לפקח בזהירות את העכבר לשינויים בקצב נשימה, התאמת רמת isoflurane בהתאם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק meloxicam (5-10 מ&quot;ג / קילוגרם) תת עורי לפני ההליך כמו שיכוך כאבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל קרם להסרת שיער מעל לדלפק לאזור הפטמה. חכה 5 דקות ולהסיר בעדינות את שיער פזור עם המוליך כותנה קצה בתנועות מעגליות. הסר את הקרם באמצעות מגבות נייר לחות הרטובות עם מים חמים. גילוח אינו מומלץ בשל הסיכון לפגיעה בפטמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אבטח את העכבר תחת stereoscope בעדינות על ידי מקליט את הגפיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתרי הזרקה נקיים עם מטליות אלכוהול. </li></ol> 3. הזרקת intraductal <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתר פטמות מתאימות להיות מוזרקים תחת stereoscope. השתמש קנס מיקרו ביתור תינניותZers כדי להסיר כל עור מת שמכסה את הפתח הפטמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען 10-20 μl של פתרון הזרקה לתוך מזרק 50 μl עם מחט רכזת מתכת 33 G המודבק. לפעמים, לאחר הזרקה, כמויות קטנות (μl 1 או פחות) יכולות לדלוף החוצה של הפטמה על תלישת המחט. לכן, מומלץ להזריק 11 או 21 μl בהתאמה כדי להסביר את ההפסד הפוטנציאלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחזיק את הפטמה בעדינות עם פינצטה העדינה ולהרים אותו מעט כדי למקם אותו להזרקה. אין צורך לחתוך את הפטמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק את הפתרון לאט כדי למזער את הנזק אפשרי שנגרם על ידי נע במהירות נוזל בתוך לומן ductal. שיעור ההזרקה יש לשמור על כ 40 μl / min. </li></ol> 4. טיפול לאחר ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב באתר ההזרקה. לא צריך להיות שום סימנים של טראומה לאזור הפטמה או רקמות שמסביב. נפיחות באזור המקיף את הפטמה סבירה מצביעה Rathe הזרקת כרית שומן החלבr מאשר הזרקה intraductal מוצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את בעלי החיים מהחרטום ולעבור לכלוב נפרד להתאוששות. מניחים את הכלוב תחת מנורת חום כדי למנוע היפותרמיה ולסייע בהתאוששות. עכברים הם שוכנו ביחידים ויהיו תחת פיקוח הדוק עד שהם יחזרו להכרה וניידות. </li></ol> 5. ניתוח של רקמות בלוטת החלב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם השלמת המחקר, עכברים מורדמים על ידי נקע בצוואר הרחם הבא 2 CO גז דחוס בתא בידוד. בלוטות החלב הם נכרת ועשויות לשמש להכנת הר שלמה 11, היסטולוגיה, או RNA ובידוד חלבון. </li></ol>

<ol>
	<li>Dooley, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ductal+lavage+for+detection+of+cellular+atypia+in+women+at+high+risk+for+breast+cancer.">Ductal lavage for detection of cellular atypia in women at high risk for breast cancer.</a> J Natl Cancer Inst. 93, 1624-1632 (2001).</li><li>Jacobs, L., Sukumar, S., Stearns, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraductal+therapy+for+the+prevention+of+breast+cancer.">Intraductal therapy for the prevention of breast cancer.</a> Curr Opin Investig Drugs. 11, 646-652 (2011).</li><li>King, B. L., Love, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intraductal+approach+to+the+breast:+raison+d'etre.">The intraductal approach to the breast: raison d'etre.</a> Breast Cancer Res. 8, 206 (2006).</li><li>Murata, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ductal+access+for+prevention+and+therapy+of+mammary+tumors.">Ductal access for prevention and therapy of mammary tumors.</a> Cancer Res. 66, 638-645 (2006).</li><li>Stearns, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+and+clinical+evaluation+of+intraductally+administered+agents+in+early+breast+cancer.">Preclinical and clinical evaluation of intraductally administered agents in early breast cancer.</a> Sci Transl Med. 3, 106ra108 (2011).</li><li>Flanagan, M., Love, S., Hwang, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Status+of+Intraductal+Therapy+for+Ductal+Carcinoma+in+Situ.">Status of Intraductal Therapy for Ductal Carcinoma in Situ.</a> Curr Breast Cancer Rep. 2, 75-82 (2010).</li><li>Nguyen, D. -. A., Beeman, N., Lewis, M., Schaack, J., Neville, M. C., Ip, M. M., Asch, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in mammary gland biology and breast cancer research. , 259-270 (2000).</li><li>Behbod, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intraductal+human-in-mouse+transplantation+model+mimics+the+subtypes+of+ductal+carcinoma+in+situ.">An intraductal human-in-mouse transplantation model mimics the subtypes of ductal carcinoma in situ.</a> Breast Cancer Res. 11, R66 (2009).</li><li>Bu, W., Xin, L., Toneff, M., Li, L., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus+vectors+for+stably+introducing+genes+into+mammary+epithelial+cells+in+vivo.">Lentivirus vectors for stably introducing genes into mammary epithelial cells in vivo.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 14, 401-404 (2009).</li><li>Reddy, J. P., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RCAS-TVA+system+for+introduction+of+oncogenes+into+selected+somatic+mammary+epithelial+cells+in+vivo.">The RCAS-TVA system for introduction of oncogenes into selected somatic mammary epithelial cells in vivo.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 14, 405-409 (2009).</li><li>Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+mammary+gland+development+and+function+in+mouse+models.">Evaluation of mammary gland development and function in mouse models.</a> J. Vis. Exp. , e2828 (2011).</li></ol>

יש הסופרים אין גילויים פיננסיים.

עכברים הטרנסגניים ונוקאאוט הם כלים רב ערך ללימוד תפקיד vivo של גנים בודדים בסרטן השד. עם זאת, זה יקר וכדי לייצר בעלי חיים אלה גוזלים זמן ומציאת הגן היא בדרך כלל בכל מקום שלעתים מונע אותנו מההכרה בהשפעות הספציפיות של גן, כי בבלוטת החלב. לכן, מציאה ממוקדת הייתי להקל על בעיות של תופעות לוואי שאינם ספציפיות ורעילות באיברים אחרים. הזרקת intraductal של siRNA מוצגת כאן מאפשרת מציאה הגן המקומית בבלוטת החלב בעכבר. זוהי שיטה מהירה למשלוח תרופות ממוקדת ומקומי לבלוטת החלב אינו מוגבלת למשלוח siRNA. כגון משלוח סמים בלוטה ספציפית החלב ימנע תופעות לוואי נוקבות ורעיל לאיברים אחרים ומאפשר לחקר שינויים גנטיים בנקודות זמן ספציפיות במהלך התפתחות בלוטת החלב והיווצרות גידול סרטנית בשד. אין עדות לסיחלקיקי RNA בבלוטות שאינן מוזרקות, בכבד או באיברים אחרים המספקים ראיות נוספות לכך ששיטה זו מציגה דרך מועדפת למציאת גן מקומית בבלוטת החלב. יתר על כן, ניתן לחזור על זריקות intraductal שבועיות או דו שבועית במשך כמה חודשים, כדי לאפשר לניטור ארוך טווח של סוכנים טיפוליים. טכניקה זו פותחת את האפשרות למנסה לאמוד את מסירת intraductal של חומרים כימיים שונים לצינוריות החלב בעכבר. התקדמות במשלוח מקומי במודלי עכבר מאופיינים היטב צריכה להאיץ את היישום של לא פולשנית, ממוקד אסטרטגיות טיפוליות בבני אדם.

בלוטת החלב בעכבר מורכבת מעץ ductal-מכתשיים מורכבים המתכנס לתוך צינור מרכזי בפטמה. בעכברים, כמו גם בני אדם, רוב הגידולים בשד מקורם בתאי האפיתל המצפים את צינוריות החלב. טיפולים זמינים הנוכחיים כוללים כימותרפיה לוריד, קרינה, וניתוח. טיפולי intraductal מקומיים נחקרו 1-3 ומציעים יתרונות משמעותיים במונחים של השפעות רעילות וצד מופחתים. עם זאת, כמה אתגרים להישאר לפני אלה יכולים להיות מיושמים באופן נרחב יותר. היכולת לבצע הליכים דומים בבלוטת החלב בעכבר מאפשרת האפיון של התערבויות intraductal. כאן אנו מציגים שיטה לא פולשנית למשלוח של חומרים כימיים ישירות לתוך צינור החלב העכבר. משלוח intraductal של תרופות כימותרפיות בשתי חולות סרטן השד ומודלי עכבר יש בעבר הוכח כיעיל ביותר ללא עדותרעילות מערכתית או histopathological לטווח ארוך משתנה 3-6. יתר על כן, הזרקה של תאי גידול ואספקת וקטור lentiviral של אונקוגנים הוכחו בעבר להיות ריאלי באמצעות הזרקת intraductal 7-10. בנוסף למשלוח סמים, הליך זה הוא שימושי להשתקה מקומית של גנים בלוטת החלב באמצעות הזרקת intraductal של siRNA. הזרקה של כמויות קטנות של פתרון siRNA היא יעילה מבלי לשנות את האנטומיה ופיזיולוגיה של בלוטת החלב. במעבדה שלנו יש לנו לאחרונה הראו השתקה מוצלחת של גנים מתווך מרכזיים בעכברים הטרנסגניים כי באופן ספונטני לפתח גידולי החלב וכתוצאה מכך מניעת התקדמות גידול (ברוק ואח&#39;., לא פורסם). אנחנו כבר מסוגלים לחזור על זריקות דו שבועיות לאותו פטמות עד 7 פעמים במרווחים של 2 שבועות ללא נזק לרקמות גלויות או רעיל. יכולות להיות מתוזמן זריקות intraductal בעכבר בוגר כדי לטפל בdevelאירועי opmentally ספציפיים רלוונטיים להתפתחות בלוטת החלב במהלך הריון, הנקה, ופוף או למקד שלבים מאוחר יותר במהלך התפתחות גידול והתקדמות. נקבות בתולה צעירות כמו 8 שבועות של גיל כבר הזריקו הלא פולשני במעבדה שלנו.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>2-4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>meloxicam</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>5-10 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evans blue dye</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E2129-10G</td>
			<td>0.2% in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hair removing cream</td>
			<td>Veet</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Choose sensitive option</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereoscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi DV4</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro-dissecting tweezers</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>rs-4976</td>
			<td>With a 0.10 x 0.06 mm tip made of dumostar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7637-01</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>33-gauge needle</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7803-05</td>
			<td>point style 4, 12 degree bevel (standard)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siGLO cyclophilin B control siRNA</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>D-001610-01-05</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intraductal injection for localized drug delivery to the mouse mammary gland

במסמך זה אנו מתארים פרוטוקול, כדי לספק חומרים כימיים שונים לבלוטת החלב בעכבר באמצעות זריקות intraductal. משלוח סמים מקומי ולדפוק למטה של ​​גנים באפיתל החלב כבר קשה להשיג בשל חוסר מיקוד המולקולות מתאימות שאינן תלויים בשלבי התפתחות, כמו הריון והנקה. בזאת, אנו מתארים טכניקה למסירה מקומית של חומרים כימיים לבלוטת החלב בכל שלב בבגרות באמצעות הזרקת intraductal לפטמות של עכברים. ניתן לבצע הזריקות בעכברים חיים, תחת הרדמה, ולאפשר אספקת סמים לא פולשנית ומקומית לבלוטת החלב. יתר על כן, ניתן לחזור על הזריקות במשך כמה חודשים מבלי לפגוע בפטמה. צבעים חיוניים כגון אוונס הכחול מועילים מאוד ללמוד את הטכניקה. על זריקת intraductal של הצבע הכחול, עץ ductal כל הופך לגלוי לעין. יתר על כן, חומרים כימיים שכותרתו fluorescently גם לאפשרהדמיה והפצה בתוך בלוטת החלב. טכניקה זו ניתנת להתאמה למגוון רחב של תרכובות כולל siRNA, תרופות כימותרפיות, ומולקולות קטנות.

הפטמות יכולות להיות מקומיות בקלות באמצעות סטראו פעם שיער הוסר באזור המקיף אותו (איור 1 א). כדי לשלוט בטכניקת ההזרקה, מומלץ להזריק צבע כחול אוונס ולפקח על התקינות של הבלוטה (איורים 1B ו-C). גישה זו מאפשרת גם לקביעת כמויות המתאימות להיות מוזרק לתוך כל בלוטה כאחד מבחינה ויזואלית יכול להעריך אם הצבע מגיע למערכת כולה ductal (1C דמויות ו2A). תמונה של התמונה הכחולה אוונס מוזרק לאחר מכן ניתן להשוות לרכוב כל בלוטת החלב, שבו עץ ductal כולו מוכתם בצבע אלום קרמיין (איור 2). אנא שים לב כי חוסניו של שיטת הזרקה זה תלויים מאוד במפעיל. לדוגמא, ניקוב הצינור יגרום לזריקת כרית שומן החלב והזרקת הפתרון מהירה מדי עלולה לגרום נזק cel אפיתל ductalls ולעורר תגובה דלקתית. הזרקת intraductal מוצלחת מאפשרת משלוח הסמים המקומיים לבלוטת החלב ומפחיתה את תופעות הלוואי שאינם ספציפיות נצפו לעתים קרובות בדרך אחרת. תמונה לדוגמה של בלוטה הוזרקה מתויגת fluorescently siRNA מיקוד cyclophilin (גנים שאינם חיוניים) מוצג באיור 3. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/50692/50692fig1.jpg" /> איור 1. בלוטת החלב מפשעתי מוזרקת דרך הפטמה עם צבע כחול אוונס. א) מראה של הפטמה לפני הזרקה ו-B) לאחר הזרקה עם 20 צבע כחול μl אוונס. אין נזק או נפיחות רקמות הוא ציין. C) עם הפתיחה בעור, הצבע מאפשר הדמיה של עץ ductal החלב כולו. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/50692/50692fig2.jpg" /> איור 2. כל הר הניתוח של אוונס הכחול בבלוטת jected. א) תמונה מייצגת של בלוטה גזור נכרתה מן החי והתפשטה על גבי זכוכית מייד לאחר הזרקה. ב &#39;) מכתים הר שלם של אותו בלוטה עם צבע ארגמן לאחר שומן כבר פונתה. השוואה עם) מאשרת כי הפתרון המוזרק ממלא את עץ ductal החלב והבלוטה היא מבחינה אנטומית בשלמותה. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/50692/50692fig3.jpg" /> איור 3. תמונת משלוח intraductal של siRNA ניאון. נציג של דגימת רקמה טריות, נכרתה 48 postinjection שעה.

Watch this Scientific Journal Video about Intraductal Injection for Localized Drug Delivery to the Mouse Mammary Gland at JoVE.com

Intraductal Injection for Localized Drug Delivery to the Mouse Mammary Gland

פרוטוקול למשלוח intraductal לא פולשנית של חומרים כימיים מימיים לבלוטת החלב בעכבר מתואר. השיטה מנצלת הזרקה מקומית לפטמות של בלוטות החלב מיקוד צינוריות החלב באופן ספציפי. טכניקה זו ניתנת להתאמה למגוון רחב של תרכובות כולל siRNA, תרופות כימותרפיות ומולקולות קטנות.

הזרקת intraductal עבור משלוח סמים מקומיים לעכבר החלב בלוטת

Herein we describe a protocol to deliver various reagents to the mouse mammary gland via intraductal injections. Localized drug delivery and knock-down of ...

intraductal-injection-for-localized-drug-delivery-to-mouse-mammary

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

34.8K Views.  Boston Children's Hospital and Harvard Medical School.  פרוטוקול למשלוח intraductal לא פולשנית של חומרים כימיים מימיים לבלוטת החלב בעכבר מתואר. השיטה מנצלת הזרקה מקומית לפטמות של בלוטות החלב מיקוד צינוריות החלב באופן ספציפי. טכניקה זו ניתנת להתאמה למגוון רחב של תרכובות כולל siRNA, תרופות כימותרפיות ומ...

Video: Intraductal Injection for Localized Drug Delivery to the Mouse Mammary Gland

Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of dome shaped cell structures referred to as mammospheres 1. The HC11 cell line has been employed as a model system for the study of regulation of mammary lactogenic differentiation both in vitro and in vivo 2. The HC11 cells differentiate and synthesize milk proteins in response to treatment with lactogenic hormones. Following the growth of HC11 mouse mammary epithelial cells to confluence, lactogenic differentiation was induced by the addition of a combination of lactogenic hormones including dexamethasone, insulin, and prolactin, referred to as DIP. The HC11 cells induced to differentiate were photographed at times up to 120 hours post induction of differentiation and the number of mammospheres that appeared in each culture was enumerated. The size of the individual mammospheres correlates with the degree of differentiation and this is depicted in the images of the differentiating cells.

HC11 lactogenic differentiation can be characterized by the formation of domed structures referred to as mammospheres. The structures can be enumerated by phase contrast microscopy to aid in quantifying lactogenic differentiation.

תאים אפיתל עכבר החלב טופס Mammospheres במהלך התמיינות Lactogenic

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of ...

Phosphopeptide Analysis of Rodent Epididymal Spermatozoa

Spermatozoa are quite unique amongst cell types. Although produced in the testis, both nuclear gene transcription and translation are switched off once the pre-cursor round cell begins to elongate and differentiate into what is morphologically recognized as a spermatozoon. However, the spermatozoon is very immature, having no ability for motility or egg recognition. Both of these events occur once the spermatozoa transit a secondary organ known as the epididymis. During the ~12 day passage that it takes for a sperm cell to pass through the epididymis, post-translational modifications of existing proteins play a pivotal role in the maturation of the cell. One major facet of such is protein phosphorylation. In order to characterize phosphorylation events taking place during sperm maturation, both pure sperm cell populations and pre-fractionation of phosphopeptides must be established. Using back flushing techniques, a method for the isolation of pure spermatozoa of high quality and yield from the distal or caudal epididymides is outlined. The steps for solubilization, digestion, and pre-fractionation of sperm phosphopeptides through TiO2 affinity chromatography are explained. Once isolated, phosphopeptides can be injected into MS to identify both protein phosphorylation events on specific amino acid residues and quantify the levels of phosphorylation taking place during the sperm maturation processes.

Proteomic analysis of any cell type is highly dependent on both purity and pre-fractionation of the starting material in order to de-complexify the sample prior to liquid chromatography mass spectrometry (MS). By using back-flushing techniques, pure spermatozoa can be obtained from rodents. Following digestion, phosphopeptides can be enriched using TiO2.

ניתוח Phosphopeptide של מכרסמים epididymal תאים-זרע

Spermatozoa are quite unique amongst cell types. Although produced in the testis, both nuclear gene transcription and translation are switched off once ...

Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple method for the immune detection of proteins, the mouse lactating mammary gland being taken as an example. A protocol for the preparation of the tissue samples, especially concerning the dissection of mouse mammary gland, tissue fixation and frozen tissue sectioning, are detailed. A standard protocol to perform indirect immunofluorescence, including an optional antigen retrieval step, is also presented. The observation of the labeled tissue sections as well as image acquisition and post-treatments are also stated. This procedure gives a full overview, from the collection of animal tissue to the cellular localization of a protein. Although this general method can be applied to other tissue samples, it should be adapted to each tissue/primary antibody couple studied.

The indirect immunofluorescence protocol described in this article allows the detection and the localization of proteins in the mouse mammary gland. A complete method is given to prepare mammary gland samples, to perform immunohistochemistry, to image the tissue sections by fluorescence microscopy, and to reconstruct images.

Immunofluorescence עקיף על סעיפים קפואים של עכבר בלוטת החלב

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple ...

A Comparative Study of Drug Delivery Methods Targeted to the Mouse Inner Ear: Bullostomy Versus Transtympanic Injection

We present two minimally invasive microsurgical techniques in rodents for specific drug delivery into the middle ear so that it may reach the inner ear. The first procedure consists of perforation of the tympanic bulla, termed bullostomy; the second one is a transtympanic injection. Both emulate human clinical intratympanic procedures.
Chitosan-glycerophosphate (CGP) and Ringer&#180;s Lactate buffer (RL) were used as biocompatible vehicles for local drug delivery. CGP is a nontoxic biodegradable polymer widely used in pharmaceutical applications. It is a viscous liquid at RT&#160;but it congeals to a semi solid phase at body temperature. RL is an isotonic solution used for intravenous administrations in humans. A small volume of this vehicle is precisely placed on the Round Window (RW) niche by means of a bullostomy. A transtympanic injection fills the middle ear and allows less control but broader access to the inner ear.
The safety profiles of both techniques were studied and compared by using functional and morphological tests. Hearing was evaluated by registering the Auditory Brainstem Response (ABR) before and several times after microsurgery. The cytoarchitecture and preservation level of cochlear structures were studied by conventional histological techniques in paraformaldehyde-fixed and decalcified cochlear samples. In parallel, unfixed cochlear samples were taken and immediately frozen to analyze gene expression profiles of inflammatory markers by quantitative Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR).
Both procedures are suitable as drug delivery methods into the mouse middle ear, although transtympanic injection proved to be less invasive compared to bullostomy.

A Comparative Study of Drug Delivery Methods Targeted to the Mouse Inner Ear: Bullostomy Versus Transtympanic Injection

Two microsurgery approaches for local drug delivery to the inner ear are described here and compared in terms of impact on hearing parameters, cochlear cytoarchitecture and expression of inflammatory markers.

מחקר השוואתי של שיטות שיגור תרופות אל האוזן הפנימית עכבר: Bullostomy<em&gt; Versus</em&gt; הזרקת Transtympanic

We present two minimally invasive microsurgical techniques in rodents for specific drug delivery into the middle ear so that it may reach the inner ear. ...

Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal architecture. Here, a small pocket below the skin was created using Mayo scissors, allowing separation of the glands within the subcutaneous tissue from the underlying peritoneum. Visualization of the glands was aided by the use of 3.5x-R surgical micro loupes. The pelt was inverted and pinned back allowing identification of the intact mammary fat pads. Each of the #4 abdominal glands was bluntly dissected by sliding the scalpel blade laterally between the subcutaneous layer and the glands. Immediately post-harvest, glands were placed in 10% neutral buffered formalin for subsequent tissue processing. Excision of the entire gland is advantageous because it primarily eliminates the risk of excluding important tissue-wide interactions between ductal epithelial cells and other microenvironmental cellular populations that could be missed in a partial biopsy. One drawback of the methodology is the use of serial sections from fixed tissues which limits analyses of ductal morphogenesis and protein expression to discrete locations within the gland. As such, changes in ductal architecture and protein expression in 3 dimensions (3D) is not readily obtainable. Overall, the technique is applicable to studies requiring whole intact murine mammary glands for downstream investigations such as developmental ductal morphogenesis or breast cancer.

Here, we present a protocol for the isolation of whole, intact mouse mammary glands to investigate extracellular matrix (ECM) expression and ductal morphology. Mouse #4 abdominal glands were extracted from 8-10 week old female nulliparous mice, fixed in neutral buffered formalin, sectioned and stained using immunohistochemistry for ECM proteins.

בידוד של בלוטות מוגדלות ללא פגע, כל עכבר לניתוח של בלוטת מורפולוגיה וביטוי מטריצה חוץ-תאית

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal ...

Partial Bile Duct Ligation in the Mouse: A Controlled Model of Localized Obstructive Cholestasis

In rodents, complete bile duct ligation (cBDL) of the common bile duct is an established surgical technique for studying obstructive cholestasis and bile duct proliferation. However, long-term experiments can lead to increased morbidity and mortality. In select mouse strains with underlying liver disease, meaningful comparisons can be made even with ligation of a single lobe of the liver, which can reduce animal losses and expenses. Here, we describe partial bile duct ligation (pBDL) in the mouse, in which only the left hepatic bile duct is ligated, causing biliary obstruction in the left lobe but not the remaining lobes. With careful microsurgical technique, pBDL experiments can be cost-effective, since the unligated lobe serves as an internal control to the ligated lobes, when subjected to the same conditions in the same animal. Unlike cBDL, a separate sham-operated control group is not necessary. pBDL is highly useful to directly compare localized versus systemic effects of cholestasis and other retained bile components. pBDL can also be repurposed as a novel method to investigate mechanisms related to medications and cell migration.

Here, we present partial bile duct ligation as a surgical model of liver injury and regeneration in rodents.

צינור המרה חלקית מצדו העכבר: מודל מבוקרת של מקומי חסימתית לחסימת מרה תוך כבדית

In rodents, complete bile duct ligation (cBDL) of the common bile duct is an established surgical technique for studying obstructive cholestasis and bile ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current blastocyst injection protocol. Here we report that a simple rotation of the embryo, and injection through Trans-Inner cell mass (TICM) increased the percentage of chimeric mice from 31% to 50%, with no additional equipment or further specialized training. 26 different inbred clones, and 35 total clones were injected over a period of 9 months. There was no significant difference in either pregnancy rate or recovery rate of embryos between traditional injection techniques and TICM. Therefore, without any major alteration in the injection process and a simple positioning of the blastocyst and injecting through the ICM, releasing the ES cells into the blastocoel cavity can potentially improve the quantity of chimeric production and subsequent germline transmission.

Here we present a protocol to increase chimera production without the use of new equipment. A simple orientation change of the embryo for injection can increase the number of embryos produced, and potentially reduce the timeline to germline transmission.

תא הטרנס-הפנימית המוני הזרקה של תאי גזע עובריים מוביל שיעור גבוה יותר של Chimerism

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

Bovine Mammary Gland Biopsy Techniques

Bovine mammary gland biopsies allow researchers to collect tissue samples to study cell biology including gene expression, histological analysis, signaling pathways, and protein translation. This article describes two techniques for biopsy of the bovine mammary gland (MG). Three healthy Holstein dairy cows were the subjects. Before biopsies, cows were milked and subsequently restrained in a cattle chute. An analgesic (flunixin meglumine, 1.1 to 2.2 mg/kg of body weight) was administered via jugular intravenous [IV] injection 15-20 min prior to biopsy. For standing sedation, xylazine hydrochloride (0.01-0.05 mg/kg of body weight) was injected via the coccygeal vessels 5-10 min before the procedure. Once adequately sedated, the biopsy site was aseptically prepared and locally anaesthetized with 6 mL of 2% lidocaine hydrochloride via subcutaneous injection. Using aseptic technique, a 2 to 3 cm vertical incision was made using a number 10 scalpel. Core and needle biopsy tools were used. The core biopsy tool was attached to a cordless drill and inserted into the MG tissue through the incision using a clock-wise drill action. The needle biopsy tool was manually inserted into the incision site. Immediately after the procedure, an assistant applied pressure on the incision site for 20 to 25 min using a sterile towel to achieve hemostasis. Stainless steel surgical staples were used to oppose the skin incision. The staples were removed 10 days post-procedure. The main advantages of core and needle biopsies is that both approaches are minimally invasive procedures that can be safely performed in healthy cows. Milk yield following the biopsy was unaffected. These procedures require a short recovery time and result in fewer risks of complications. Specific limitations may include bleeding after the biopsy and infection on the biopsy site. Applications of these techniques include tissue collection for clinical diagnosis and research purposes, such as primary cell culture.

This article presents a bovine mammary gland biopsy using core and needle biopsy tools. Harvested tissue can be used for cell culture or to assess mammary physiology and metabolism including gene expression, protein expression, protein modifications, immunohistochemistry, and metabolite concentrations.

טכניקות ביופסיה בלוטת חלב שור

Bovine mammary gland biopsies allow researchers to collect tissue samples to study cell biology including gene expression, histological analysis, ...

Intravital Subcellular Microscopy of the Mammary Gland

The mammary gland constitutes a model par excellence for investigating epithelial functions, including tissue remodeling, cell polarity, and secretory mechanisms. During pregnancy, the gland expands from a primitive ductal tree embedded in a fat pad to a highly branched alveolar network primed for the formation and secretion of colostrum and milk. Post-partum, the gland supplies all the nutrients required for neonatal survival, including membrane-coated lipid droplets (LDs), proteins, carbohydrates, ions, and water. Various milk components, including lactose, casein micelles, and skim-milk proteins, are synthesized within the alveolar cells and secreted from vesicles by exocytosis at the apical surface. LDs are transported from sites of synthesis in the rough endoplasmic reticulum to the cell apex, coated with cellular membranes, and secreted by a unique apocrine mechanism. Other preformed constituents, including antibodies and hormones, are transported from the serosal side of the epithelium into milk by transcytosis. These processes are amenable to intravital microscopy because the mammary gland is a skin gland and, therefore, directly accessible to experimental manipulation. In this paper, a facile procedure is described to investigate the kinetics of LD secretion in situ, in real-time, in live anesthetized mice. Boron-dipyrromethene (BODIPY)665/676&#160;or monodansylpentane are used to label the neutral lipid fraction of transgenic mice, which either express soluble EGFP (enhanced green fluorescent protein) in the cytoplasm, or a membrane-targeted peptide fused to either EGFP or tdTomato. The membrane-tagged fusion proteins serve as markers of cell surfaces, and the lipid dyes resolve LDs &#8805; 0.7 &#181;m. Time-lapse images can be recorded by standard laser scanning confocal microscopy down to a depth of 15-25 &#181;m or by multiphoton microscopy for imaging deeper in the tissue. The mammary gland may be bathed with pharmacological agents or fluorescent dyes throughout the surgery, providing a platform for acute experimental manipulations as required.

<meta charset="utf8"></head><body>מיקרוסקופיה תת-תאית תוך חיונית של בלוטת החלב

The present protocol describes a facile technique for the intravital imaging of the lactating mouse mammary gland by laser scanning confocal and multiphoton microscopy.

מיקרוסקופיה תת-תאית תוך חיונית של בלוטת החלב

The mammary gland constitutes a model par excellence for investigating epithelial functions, including tissue remodeling, cell polarity, and secretory ...