وأيد دومينيك ميلز من قبل دار بلومزبري كليات دراسية لدرجة الدكتوراة (2007-2010). فإن الكتاب أود أن أشكر كل من أوزان Gundogdu وعبدي علمي لمساعدتهم في تطوير نموذج VDC.

1. نمو الطبقات الوحيدة IEC على الخاص 0.4 ميكرون مرشحات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة كاتشو-2 الخلايا في وسائل الإعلام ضروري تعديل Dulbecco ل(DMEM) تستكمل مع 10٪ (V / V) مصل العجل الجنين، و 100 U / مل البنسلين، 100 ميكروغرام / مل الستربتوميسين، و 1٪ (V / V) الأحماض الأمينية غير الأساسية في الأنسجة مستوى ثقافة حاضنة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 و 95٪ هواء. البذور 4 × 10 5 كاتشو-2 IECS في 0.4 ميكرون فلتر وتنمو لاستقطاب أكثر من 21 أيام، وتغيير وسائل الاعلام كل 2-3 أيام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس طير لتأكيد حالة استقطاب أحادي الطبقة باستخدام المقاومة فولت أوم متر. في دراساتنا، وطير من 21 يوم كاتشو-2 الخلايا المزروعة في هذه الفلاتر ميكرون 0.4 هو 700-800 Ωcm 2. </li></ol> 2. إعداد C. الصائمية ومتوسطة الجرثومي للمقايسة Coculturing <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 24 ساعة قبل المرجوة نقطة انطلاق للمقايسة coculturing VDC، وإعداد طازجة لوحة آغار الدم من C. الصائمية واحتضان عند 37 درجة مئوية تحت ظروف microaerobic (85٪ N 2، 5٪ O 2، و 10٪ CO 2) في الغلاف الجوي حاضنة متغير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في نفس الوقت، يحضن مسبقا 30 مل من مرق البروسيلا عند 37 درجة مئوية تحت ظروف microaerobic في جو الحاضنة متغير. </li></ol> 3. إعداد والتعقيم من نصف الدوائر VDC قبل الفحص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزج تماما نصف الدوائر VDC فضلا عن O-الخواتم والمقابس في حل التعقيم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام معقم 20 مل حقنة، تدفق الحل التعقيم من خلال مداخل الغاز في كلا المجلسين نصف. قد يؤدي عدم القيام بذلك يؤدي إلى تلوث العينات خلال coculturing. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترك كل مكونات مغمورة في محلول التعقيم ل&gt; 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف جميع المكونات مع الماء المعقم الطازجة، وذلك باستخدام آخر معقم 20 مل حقنة لطرد مداخل الغاز. </li></ol> 4. إعدادمن اللقاح البكتيري <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حصاد نصف طبق من C. أعدت نمو الصائمية من لوحة آغار الدم في اليوم السابق إلى 1 مل من مرق البروسيلا preincubated. هذا ينبغي أن تسفر ~ 10 10 وت م / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس الكثافة البصرية للتعليق البكتيرية في 600 نانومتر إلى semiquantify مستعمرة بكتيرية (CFUs). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط تعليق البكتيرية إلى المستوى المطلوب اللقاح في 4 مل من مرق البروسيلا preincubated. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء التخفيف المتسلسل من هذا تعليق البكتيرية النهائي تليها الطلاء من التخفيفات المناسبة على لوحات أجار الدم في ثلاث نسخ، ثم احتضان عند 37 درجة مئوية في جو الحاضنة متغير لمدة 48 ساعة لقياس عدد من CFUs البكتيرية الموجودة في اللقاح. </li></ol> 5. إعداد VDC <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع النصف السفلي غرفة شقة VDC على مقاعد البدلاء. يصلح يا الدائري على نصف الدائرة السفلي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل مرشح واحد يحمل IECS من tانه الناقل ويغسل ثلاث مرات مع 400 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني العقيمة. وضع مرشح على نصف مجلس النواب، والتأكد من يبقى يا الدائري في المكان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خفض بلطف النصف الغرفة العليا في مكانها. وحالما يتم تجميعها لمدة نصف الدوائر، المشبك معا باستخدام المشابك حلقة. وضع VDC أفقيا على أعلى مقاعد البدلاء، مع اثنين من فتحات متجهة لأعلى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة مل 4 من اللقاح البكتيري في نصف الدائرة القمي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 4 مل من مستنبت الخلية من بداية الشوط غرفة basolateral. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع القطع في نهاية فتحات في كلا المجلسين نصف. </li></ol> 6. ربط VDC إلى مشعب الغاز داخل حاضنة الجو متغير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع VDC في الغلاف الجوي حاضنة متغير على مقربة من مشعب الغاز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح منظم امدادات الغاز متصلا مشعب الغاز. نعلق الأنبوب من مشعب في مدخل الغاز على نصف غرفة basolateral من VDC. إرفاق GAق الأنابيب منفذ المؤدية للخروج من متغير جو الحاضنة إلى واحدة من منافذ في قطعة وتنتهي في نصف غرفة basolateral. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إغلاق منفذ الأخرى في قطعة وتنتهي في نصف غرفة basolateral. فتح تدفق الغاز في مشعب الغاز، مع الحرص على فتحه ببطء شديد لتجنب ضغط الغاز الزائد، وهذا يمكن أن يؤدي إلى طرد المتوسطة basolateral. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> والهدف هو تدفق الغاز من 1 فقاعة كل 2-5 ثوانى. دوري اطمئنان على تدفق الغاز خلال التجربة وتعديل إذا لزم الأمر. </li></ol> 7. تفكيك VDC بعد Coculture <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد فترة coculture المناسبة، إغلاق منظم امدادات الغاز متصلا مشعب الغاز. إغلاق تدفق الغاز في VDC في مشعب. فصل مدخل الغاز، ومنفذ الغاز وسدادة من VDC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة VDC من جو الحاضنة متغير. إزالة supernatants قمية وbasolateral وتخزينها في -80 درجة مئوية لمدة subsequenتحليل ر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المشابك خاتم واتخاذ بلطف بعيدا عن VDC. إزالة عامل التصفية من نصف الدائرة ونقل إلى 6 جيدا طبق خلية ثقافة عقيمة. غسل IECS ثلاث مرات مع 400 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني العقيمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتعداد العدد الكلي للبكتيريا التفاعل، إضافة 400 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني العقيمة التي تحتوي على 0.1٪ (V / V) تريتون X-100 إلى IECS واحتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لليز IEC. إجراء التخفيف المتسلسل من هذه الخلايا المحللة تليها الطلاء من التخفيفات المناسبة على لوحات أجار الدم في ثلاث نسخ، ثم احتضان عند 37 درجة مئوية في جو الحاضنة متغير لمدة 48 ساعة لقياس عدد من التفاعل CFUs البكتيرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتعداد العدد الكلي للبكتيريا الغازية، إضافة 400 ميكرولتر من DMEM خلية ثقافة المتوسط ​​تحتوي على 150 ميكروغرام / مل جنتاميسين إلى IECS واحتضان لمدة 2 ساعة في نسيج الثقافة حاضنة قياسية بلغت 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 و 95٪ الهواء لقتل البكتيريا خارج الخلية،ثم اتبع أما الخطوة 7.4 أعلاه. </li></ol> 8. تنظيف VDC بعد Coculture غسل VDC مع الماء المعقم ومخزن للجولة المقبلة من التجارب.

<ol>
	<li>Mills, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increase+in+Campylobacter+jejuni+invasion+of+intestinal+epithelial+cells+under+low-oxygen+coculture+conditions+that+reflect+the+in+vivo+environment.">Increase in Campylobacter jejuni invasion of intestinal epithelial cells under low-oxygen coculture conditions that reflect the in vivo environment.</a> Infect. Immun. 80, 1690-1698 (2012).</li><li>Marteyn, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+Shigella+virulence+in+response+to+available+oxygen+in+vivo.">Modulation of Shigella virulence in response to available oxygen in vivo.</a> Nature. 465, 355-358 (2010).</li><li>Dorrell, N., Wren, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+second+century+of+Campylobacter+research:+recent+advances,+new+opportunities+and+old+problems.">The second century of Campylobacter research: recent advances, new opportunities and old problems.</a> Curr. Opin. Infect. Dis. 20, 514-518 (2007).</li><li>Young, K. T., Davis, L. M., Dirita, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Campylobacter+jejuni:+molecular+biology+and+pathogenesis.">Campylobacter jejuni: molecular biology and pathogenesis.</a> Nat. Rev. Microbiol. 5, 665-679 (2007).</li><li>Hu, L., Kopecko, D. J., Nachamkin, I., Szymanski, C. M., Blaser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+17.">Chapter 17.</a> Campylobacter. , 297-313 (2008).</li><li>Everest, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiated+Caco-2+cells+as+a+model+for+enteric+invasion+by+Campylobacter+jejuni+and+C.+coli.">Differentiated Caco-2 cells as a model for enteric invasion by Campylobacter jejuni and C. coli.</a> J. Med. Microbiol. 37, 319-325 (1992).</li><li>Konkel, M. E., Hayes, S. F., Joens, L. A., Cieplak, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+the+internalization+and+intracellular+survival+of+Campylobacter+jejuni+in+human+epithelial+cell+cultures.">Characteristics of the internalization and intracellular survival of Campylobacter jejuni in human epithelial cell cultures.</a> Microb. Pathog. 13, 357-370 (1992).</li><li>Monteville, M. R., Konkel, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin-facilitated+invasion+of+T84+eukaryotic+cells+by+Campylobacter+jejuni+occurs+preferentially+at+the+basolateral+cell+surface.">Fibronectin-facilitated invasion of T84 eukaryotic cells by Campylobacter jejuni occurs preferentially at the basolateral cell surface.</a> Infect. Immun. 70, 6665-6671 (2002).</li><li>Friis, L. M., Pin, C., Pearson, B. M., Wells, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+cell+culture+methods+for+investigating+Campylobacter+invasion+mechanisms.">In vitro cell culture methods for investigating Campylobacter invasion mechanisms.</a> J. Microbiol. Methods. 61, 145-160 (2005).</li><li>Schuller, S., Phillips, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microaerobic+conditions+enhance+type+III+secretion+and+adherence+of+enterohaemorrhagic+Escherichia+coli+to+polarized+human+intestinal+epithelial+cells.">Microaerobic conditions enhance type III secretion and adherence of enterohaemorrhagic Escherichia coli to polarized human intestinal epithelial cells.</a> Environ. Microbiol. 12, 2426-2435 (2010).</li><li>Cottet, S., Corthesy-Theulaz, I., Spertini, F., Corthesy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microaerophilic+conditions+permit+to+mimic+in+vitro+events+occurring+during+in+vivo+Helicobacter+pylori+infection+and+to+identify+Rho/Ras-associated+proteins+in+cellular+signaling.">Microaerophilic conditions permit to mimic in vitro events occurring during in vivo Helicobacter pylori infection and to identify Rho/Ras-associated proteins in cellular signaling.</a> J. Biol. Chem. 277, 33978-33986 (2002).</li></ol>

ليس لدينا شيء في الكشف عنها.

استخدام في طرق زراعة الخلايا في المختبر لدراسة التفاعلات من مسببات الأمراض البكتيرية مع الخلايا المضيفة هي تقنية تستخدم على نطاق واسع في العديد من المختبرات البحثية. ولكن كما يتم تنفيذ مثل هذه المقايسات ثقافة الخلية تحت الظروف الهوائية، وهذه نماذج في ال...

وقد تم التحقيق في التفاعلات من مسببات الأمراض البكتيرية مع الخلايا المضيفة على نطاق واسع باستخدام طرق زراعة الخلايا في المختبر. استخدام مثل هذه المقايسات ثقافة الخلية، التصاق البكتيريا إلى الخلايا المضيفة، تحديد مستقبلات الخلية المضيفة، الخلية المضيفة مسارات إشارات والغزو الجرثومي للخلايا المضيفة كلها قد درس بالتفصيل، مما أدى في كثير من الملاحظات الهامة. ومع ذلك يتم تنفيذ مثل هذه المقايسات ثقافة الخلية تحت الظروف الهوائية التي قد لا تكون ممثلة للبيئة في الجسم الحي. وجود قيود كبيرة من نماذج في المختبر تستخدم لدراسة التهابات الجهاز الهضمي هو أن الظروف الثقافة بما في ذلك مستويات الاوكسجين عالية يفضلون عموما بقاء الخلية حقيقية النواة. لكن الظروف في لمعة الأمعاء سيكون اللاهوائية تقريبا. مسببات الأمراض المعوية في بيئة منخفضة الأوكسجين جدا التعبير عن الجينات الفوعة التي التعبير التغيرات في الظروف الهوائية 2. على هذا النحو، الحصول على بيانات باستخدام معيار خلية ثقافة نماذج مAY تعطي مؤشرا غير دقيق من التفاعلات البكتيرية مع الخلايا المضيفة. العطيفة الصائمية هو العامل المسبب الرئيسي لالتهاب المعدة والأمعاء الحاد الجرثومي في جميع أنحاء العالم، مع الأعراض التي تتراوح من إسهال خفيف إلى الأمعاء الالتهابية الحادة. غالبية C. الصائمية العدوى نتيجة في التهاب المعدة والأمعاء غير معقدة، لكن C. الصائمية هو أيضا وكيل المعدية الأكثر شيوعا التي تم تحديدها في اعتلال الأعصاب المحيطية بما في ذلك متلازمة غيان باريه (GBS). في المملكة المتحدة، تشير التقديرات إلى أن هناك أكثر من 500،000 حالة من حالات التهاب الأمعاء الناجم عن C. عدوى الصائمية كل عام بتكلفة يتوقع أن اقتصاد المملكة المتحدة من 580 مليون جنيه إسترليني. في العالم النامي، C. الصائمية هو السبب الرئيسي للوفيات بين الأطفال. وعلى الرغم من الأهمية التي لا جدال من عدوى العطيفة وعقود من البحث، بما في ذلك التحليل القائم على علم الجينوم شامل، C. الصائمية المرضية لا تزال تفهم سيئةالعود، وعلى النقيض من مسببات الأمراض المعوية الأخرى مثل السالمونيلا، كولاي، الشغيلة، وضمة الكوليرا. عدم وجود نموذج حيواني صغيرة مريحة هو أحد الأسباب الرئيسية لهذا 3. كما تستخدم على نطاق واسع في نماذج العدوى المختبر هي أكثر مناسبة لدراسة microaerophilic C. الصائمية من مسببات الأمراض المعوية عن الأخرى التي هي اللاهوائيات اختياري. في حين C. ومن المسلم به الصائمية كأحد العوامل الممرضة الغازية، وآليات C. غزو ​​الصائمية من الخلايا الظهارية في الأمعاء (IECS) لا تزال غير واضحة 4،5. C. وقد تبين غزو الصائمية أن تعتمد على إما microfilaments، الأنابيب الدقيقة، مزيج من الاثنين معا أو لا 5. اللبس في هذا المجال هو على الارجح بسبب استخدام غير مناسب في الظروف فحص المختبر. وقد استخدمت عدد من مختلف المقايسات ثقافة الخلية للتحقيق في تفاعلات C. الصائميةمع الخلايا المضيفة. كاتشو-2 6، وكانت جميعها تستخدم INT 407 7، وT84 8 خطوط الخلايا لدراسة التصاق وغزو قدرات مختلفة C. سلالات الصائمية. ومع ذلك، فإن مستويات التصاق البكتيريا وغزو لC. الصائمية مع IECS هي أقل بشكل كبير من مسببات الأمراض المعوية الأخرى ل9. وcoculturing من C. الصائمية مع IECS يتم تنفيذ عادة في حاضنة CO 2 في ظل ظروف قريبة من مستويات الأوكسجين في الغلاف الجوي، اللازمة لبقاء IECS. C. سوف الصائمية التعبير الجيني تكون مختلفة جدا في بيئة منخفضة الأوكسجين من تجويف الأمعاء بالمقارنة مع ظروف الأوكسجين في الغلاف الجوي. وقد تم تطوير استخدام غرفة (VDC) نظام إنتشار عمودي الذي يسمح coculture من البكتيريا والخلايا المضيفة في ظل ظروف الغاز 1،10،11 مختلف المتوسطة و. هذا النظام يحاكي ظروف في أمعاء الإنسان حيث البكتيريا ستكون الأمم المتحدةوسيتم تزويد ظروف دير منخفض جدا من الأوكسجين، بينما الأنسجة مع الأوكسجين من مجرى الدم. وضعت الطبقات الوحيدة IEC الاستقطاب نمت في الخاص 0.4 ميكرون مرشحات في VDC خلق مقصورة قمية وbasolateral، التي امتلأت بشكل فردي مع مرق البكتيرية والخلية مستنبت على التوالي (الشكل 1). وضعت VDC في الجو المتغير الحاضنة تحتوي على 85٪ N 2، 5٪ O 2، و 10٪ CO 2 عند 37 درجة مئوية، وهو ما يمثل الظروف المثلى لC. الصائمية. وقد غادر مقصورة قمية مفتوحة ومعرضة للجو microaerobic داخل الغلاف الجوي حاضنة متغير، في حين أن المقصورة basolateral مختومة تم توفيرها مع الأوكسجين من قبل الإدارة المستمر لل5٪ CO 2/95٪ O 2 خليط الغاز مع أنبوب منفذ منع تراكم الضغط . وتأكدت كاتشو-2 بقاء الخلية وسلامة أحادي الطبقة في ظل هذه الظروف من خلال رصد ايلى بطريق الظهارةالمقاومة ctrical (طير) عبر أحادي الطبقة أكثر من 24 ساعة لإثبات بقاء كاتشو-2 أحادي الطبقة الخلية الجسدية والفصل بين المقصورات قمية وbasolateral في ظل ظروف انخفاض الأكسجين في مقصورة القمي. أظهرت طير من الطبقات الوحيدة في لجان التنمية القروية المحافظة في الغلاف الجوي حاضنة متغير (شروط microaerobic) وفي ثقافة الخلية القياسية CO 2 الحاضنة (الظروف الهوائية) توجد فروق ذات دلالة، مما يدل على سلامة أحادي الطبقة الخلية تحت الظروف الجوية المختلفة 1. في ظل ظروف microaerobic، ظلت منعطفات ضيقة الحاضر وزعت بالتساوي بين حدود الخلية ونمط تلطيخ occludin مماثلة لخلايا حافظت تحت الظروف الهوائية 1. تفاعلات C. الصائمية مع كاتشو-2 و T84 الخلايا في VDC تم التحقيق من خلال تقييم التفاعل البكتيري (التصاق والغزو) والغزو. اثنين C. مختلفة الصائمية البرية من نوع straiواستخدمت NS 1. C. الصائمية 11168H هو مشتق مفرط التحرك من سلالة تسلسل الأصلي NCTC11168. يظهر سلالة 11168H مستويات أعلى بكثير الاستعمار في نموذج الاستعمار كتكوت وبالتالي تعتبر سلالة مناسبة للاستخدام للدراسات التفاعل المضيف الممرض. 81-176 هو الإنسان وعزل هي واحدة من سلالات مختبر درس على نطاق واسع معظم الغازية. C. أضيفت سلالات الصائمية إلى المقصورة قمية من VDC تحت أي ظروف microaerobic أو الهوائية. لاحظنا سجلت معدلات أعلى لكلا التفاعل وغزو لC. الصائمية في ظل ظروف microaerobic 1. زيادة C. كانت التفاعلات الصائمية لا يرجع إلى زيادة في أعداد البكتيريا في ظل ظروف microaerobic 1. تدعم هذه البيانات فرضيتنا بأن البيئة منخفضة الأوكسجين في مقصورة قمية من VDC يعزز التفاعلات البكتيريا المضيفة ويشير إلى أن خصائص الغازية من C. الصائمية هي incrخفت في ظل هذه الظروف. كان هذا هو التقرير الأول عن استخدام نموذج VDC لدراسة العوامل المسببة للأمراض البكتيرية الغازية ويسلط الضوء على أهمية أداء في فحوصات المختبر تحت ظروف العدوى التي تحاكي بشكل وثيق الوضع في الجسم الحي. نموذج VDC يمكن أن تستخدم لدراسة التفاعلات المضيف الممرض للعديد من الأنواع البكتيرية المختلفة.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speciality vertical diffusion system for use with Snapwell inserts</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>66-0001</td>
			<td>Manifold &#38; six Snapwell chambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caps</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>66-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-rings</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>66-0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clamps</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>66-0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snapwell filters (pore size 0.4 &#956;m)</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>3407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell ERS-2 Volt-Ohm resistance meter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MERS00002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WPA Lightwave II spectrophotometer</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>80-3003-72</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enteric bacterial invasion of intestinal epithelial cells in vitro is dramatically enhanced using a vertical diffusion chamber model

وقد تم التحقيق في التفاعلات من مسببات الأمراض البكتيرية مع الخلايا المضيفة على نطاق واسع باستخدام طرق زراعة الخلايا في المختبر. ولكن كما يتم تنفيذ مثل هذه المقايسات ثقافة الخلية تحت الظروف الهوائية، وهذه نماذج في المختبر قد لا تمثل بدقة في بيئة الجسم الحي الذي تفاعلات المضيف الممرض تأخذ مكان. لقد قمنا بتطوير نموذج المختبر في العدوى التي تسمح للcoculture من البكتيريا والخلايا المضيفة في ظل ظروف مختلفة والغاز المتوسطة. الدائرة إنتشار عمودي (VDC) نموذج يحاكي ظروف في أمعاء الإنسان حيث البكتيريا سيكون تحت ظروف انخفاض الأكسجين جدا في حين سيتم تزويد الأنسجة بالأوكسجين من مجرى الدم. وضع الاستقطاب الخلية (IEC) الطبقات الوحيدة الظهارية في الأمعاء نمت في إدراج Snapwell إلى VDC يخلق مقصورات قمية وbasolateral منفصلة. يتم تعبئة مقصورة basolateral مع مستنبت الخلية، ومختومة مع perfused ث الأكسجينhilst المقصورة قمية يتم تعبئة مع مرق، تبقى مفتوحة وحضنت تحت ظروف microaerobic. يمكن الحفاظ على حد سواء كاتشو-2 و T84 IECS في VDC في ظل هذه الظروف من دون أي آثار ضارة واضحة على بقاء الخلية أو سلامة أحادي الطبقة. تجارب Coculturing يؤديها مع مختلف C. الصائمية السلالات البرية من نوع وخطوط IEC مختلفة في نموذج VDC مع ظروف microaerobic في المقصورة القمي يؤدي بتكاثر إلى زيادة في عدد التفاعل (ما يقرب من 10 أضعاف) وبين الخلايا (ما يقرب من 100 أضعاف) البكتيريا مقارنة مع الظروف الثقافة الهوائية 1. البيئة التي تم إنشاؤها في نموذج VDC يحاكي بشكل وثيق على البيئة من خلال C. اجه الصائمية في أمعاء الإنسان، ويسلط الضوء على أهمية أداء في فحوصات المختبر تحت ظروف العدوى التي تحاكي بشكل وثيق في الواقع الجسم الحي. نقترح سوف أن استخدام نموذج VDC تسمح تفسيرات جديدة للتفاعلات الرهانوين مسببات الأمراض البكتيرية والخلايا المضيفة.

تجارب Coculturing يؤديها مع C. وقد أثبتت الصائمية البرية من نوع السلالة وIECS في نموذج VDC مع ظروف microaerobic في المقصورة القمي زيادة في عدد من التفاعل (ما يقرب من 10 أضعاف) وبين الخلايا (ما يقرب من 100 أضعاف) البكتيريا مقارنة مع الظروف الثقافة الهوائية في وقت واحد تعتمد الطر?...

Watch this Scientific Journal Video about Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model at JoVE.com

Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

أداء المقايسات ثقافة الخلية عن التحقيق في التصاق البكتيريا وغزو تحت الظروف الهوائية عادة ما يكون غير ممثل لل<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; بيئة. A إنتشار نموذج غرفة العمودي يسمح دراسة التفاعلات بين العوامل المسببة للأمراض البشرية<em&gt; العطيفة الصائمية</em&gt; مع الخلايا الظهارية في الأمعاء تحت أكثر<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; تشبه ظروف، مما أدى إلى تعزيز الغزو الجرثومي.

الغزو الجرثومي المعوي الخلايا الظهارية المعوية<em&gt; في المختبر</em&gt; تتعزز بشكل كبير عن طريق دائرة إنتشار عمودي الموديل

The interactions of bacterial pathogens with host cells have been investigated extensively using in vitro cell culture methods. However as such cell ...

enteric-bacterial-invasion-intestinal-epithelial-cells-vitro-is

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

13.7K Views.  London School of Hygiene & Tropical Medicine. أداء المقايسات ثقافة الخلية عن التحقيق في التصاق البكتيريا وغزو تحت الظروف الهوائية عادة ما يكون غير ممثل لل في الجسم الحي بيئة. A إنتشار نموذج غرفة العمودي يسمح دراسة التفاعلات بين العوامل المسببة للأمراض البشرية العطيفة الصائمية مع الخلايا ال...

Video: Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. Biofilms are community-associated bacteria attached to a surface and encased in a matrix. The role of the extracellular matrix is multifaceted, including facilitating nutrient acquisition, and offers significant protection against environmental stresses (e.g. host immune responses). In an effort to acquire a better understanding as to how the bacteria within a biofilm respond to environmental stresses we have used a protocol wherein we visualize bacterial biofilms which have formed in an 8-well chamber slide. The biofilms were stained with the BacLight Live/Dead stain and examined using a confocal microscope to characterize the relative biofilm size, and structure under varying incubation conditions. Z-stack images were collected via confocal microscopy and analyzed by COMSTAT. This protocol can be used to help elucidate the mechanism and kinetics by which biofilms form, as well as identify components that are important to biofilm structure and stability.

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

This article describes the procedure for the formation and visualization of a bacterial biofilm grown within an 8-well chamber slide

تشكيل بيوفيلم في المختبر في غرفة الشرائح 8 جيد

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes. In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific immune cell types, viral pathogens, parasites and bacteria can be followed in real-time within living animals 1-2. Application of bioluminescence imaging to the study of pathogens has advantages as compared to conventional strategies for analysis of infections in animal models3-4. Infections can be visualized within individual animals over time, without requiring euthanasia to determine the location and quantity of the pathogen. Optical imaging allows comprehensive examination of all tissues and organs, rather than sampling of sites previously known to be infected. In addition, the accuracy of inoculation into specific tissues can be directly determined prior to carrying forward animals that were unsuccessfully inoculated throughout the entire experiment. Variability between animals can be controlled for, since imaging allows each animal to be followed individually. Imaging has the potential to greatly reduce animal numbers needed because of the ability to obtain data from numerous time points without having to sample tissues to determine pathogen load3-4.
This protocol describes methods to visualize infections in live animals using bioluminescence imaging for recombinant strains of bacteria expressing luciferase. The click beetle (CBRLuc) and firefly luciferases (FFluc) utilize luciferin as a substrate5-6. The light produced by both CBRluc and FFluc has a broad wavelength from 500 nm to 700 nm, making these luciferases excellent reporters for the optical imaging in living animal models7-9. This is primarily because wavelengths of light greater than 600 nm are required to avoid absorption by hemoglobin and, thus, travel through mammalian tissue efficiently. Luciferase is genetically introduced into the bacteria to produce light signal10. Mice are pulmonary inoculated with bioluminescent bacteria intratracheally to allow monitoring of infections in real time. After luciferin injection, images are acquired using the IVIS Imaging System. During imaging, mice are anesthetized with isoflurane using an XGI-8 Gas Anethesia System. Images can be analyzed to localize and quantify the signal source, which represents the bacterial infection site(s) and number, respectively. After imaging, CFU determination is carried out on homogenized tissue to confirm the presence of bacteria. Several doses of bacteria are used to correlate bacterial numbers with luminescence. Imaging can be applied to study of pathogenesis and evaluation of the efficacy of antibacterial compounds and vaccines.

Methods for bioluminescence imaging of bacterial infections in living animals are decribed. Pathogens are modified to express luciferase allowing optical whole body imaging of infections in live animals. Animal models can be infected with luciferase expressing pathogens and the resulting course of disease visualized in real-time by bioluminescence imaging.

Luciferase به لالتهابات جرثومية في صورة الفئران

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be applied to the study of cell invasion by virtually any culturable bacterium. The stages at which specific aspects of invasion can be studied, such as the role of actin rearrangement or caveolae, will be highlighted. Host cells are grown in flasks and when ready for use are seeded into 24-well plates containing Thermanox coverslips. Using coverslips allows subsequent removal of the cells from the wells to reduce interference from serum proteins deposited onto the sides of the wells (to which S. aureus would attach). Bacteria are grown to the required density and washed to remove any secreted proteins (e.g. toxins). Coverslips with confluent layers of endothelial cells are transferred to new 24-well plates containing fresh culture medium before the addition of bacteria. Bacteria and cells are then incubated together for the required amount of time in 5% CO2 at 37&deg;C. For S. aureus this is typically between 15-90 minutes. Thermanox coverslips are removed from each well and dip-washed in PBS to remove unattached bacteria. If total associated bacteria (adherent and internalised) are to be quantified, coverslips are then placed in a fresh well containing 0.5% Triton X-100 in PBS. Gentle pipetting leads to complete cell lysis and bacteria are enumerated by serial dilution and plating onto agar. If the number of bacteria that have invaded the cells is needed, coverslips are added to wells containing 500 &mu;l tissue culture medium supplemented with gentamicin and incubation continued for 1 h, which will kill all external bacteria. Coverslips can then be washed, cells lysed and bacteria enumerated by plating onto agar as described above. If the experiment requires direct visualisation, coverslips can be fixed and stained for light, fluorescence or confocal microscopy or prepared for electron microscopy.

A general protocol for the study of invasion of host cells by a bacterial pathogen, focusing on Staphylococcus aureus and human endothelial cells.

غزو ​​الخلايا البشرية من قبل الممرض الجرثومي

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be ...

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host cells1. These adhesins rely on interactions with host cell surface receptors or soluble proteins acting as a bridge between bacteria and host. Adhesion is a critical first step prior to invasion and/or secretion of toxins, thus it is a key event to be studied in bacterial pathogenesis. Furthermore, adhered bacteria often induce exquisitely fine-tuned cellular responses, the studies of which have given birth to the field of 'cellular microbiology'2. Robust assays for bacterial adhesion on host cells and their invasion therefore play key roles in bacterial pathogenesis studies and have long been used in many pioneer laboratories3,4. These assays are now practiced by most laboratories working on bacterial pathogenesis.
Here, we describe a standard adherence assay illustrating the contribution of a specific adhesin. We use the Escherichia coli strain 27875, a human pathogenic strain expressing the autotransporter Adhesin Involved in Diffuse Adherence (AIDA). As a control, we use a mutant strain lacking the aidA gene, 2787&Delta;aidA (F. Berthiaume and M. Mourez, unpublished), and a commercial laboratory strain of E. coli, C600 (New England Biolabs). The bacteria are left to adhere to the cells from the commonly used HEp-2 human epithelial cell line. This assay has been less extensively described before6.

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

This protocol is a simple bacterial adhesion assay consisting in counting the numbers of bacterial colony forming units that are adhered onto cultured cells. The assay is robust, independent of the adhesin studied, and numerous variations are used in most laboratories working on bacterial pathogenesis.

الفحص في المختبر من الالتصاق الجرثومي على الخلايا الظهارية الثدييات

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed to them and occasionally to pathogens. The gut-associated lymphoid tissue (GALT) play a key role for induction of the mucosal immune response to these microbes1, 2. To initiate the mucosal immune response, the mucosal antigens must be transported from the gut lumen across the epithelial barrier into organized lymphoid follicles such as Peyer's patches. This antigen transcytosis is mediated by specialized epithelial M cells3, 4. M cells are atypical epithelial cells that actively phagocytose macromolecules and microbes. Unlike dendritic cells (DCs) and macrophages, which target antigens to lysosomes for degradation, M cells mainly transcytose the internalized antigens. This vigorous macromolecular transcytosis through M cells delivers antigen to the underlying organized lymphoid follicles and is believed to be essential for initiating antigen-specific mucosal immune responses. However, the molecular mechanisms promoting this antigen uptake by M cells are largely unknown. We have previously reported that glycoprotein 2 (Gp2), specifically expressed on the apical plasma membrane of M cells among enterocytes, serves as a transcytotic receptor for a subset of commensal and pathogenic enterobacteria, including Escherichia coli and Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium), by recognizing FimH, a component of type I pili on the bacterial outer membrane 5. Here, we present a method for the application of a mouse Peyer's patch intestinal loop assay to evaluate bacterial uptake by M cells. This method is an improved version of the mouse intestinal loop assay previously described 6, 7. The improved points are as follows: 1. Isoflurane was used as an anesthetic agent. 2. Approximately 1 cm ligated intestinal loop including Peyer's patch was set up. 3. Bacteria taken up by M cells were fluorescently labeled by fluorescence labeling reagent or by overexpressing fluorescent protein such as green fluorescent protein (GFP). 4. M cells in the follicle-associated epithelium covering Peyer's patch were detected by whole-mount immunostainig with anti Gp2 antibody. 5. Fluorescent bacterial transcytosis by M cells were observed by confocal microscopic analysis. The mouse Peyer's patch intestinal loop assay could supply the answer what kind of commensal or pathogenic bacteria transcytosed by M cells, and may lead us to understand the molecular mechanism of how to stimulate mucosal immune system through M cells.

Application of a Mouse Ligated Peyer&amp;#8217;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

M cells in a specialized follicle-associated epithelium covering Peyer&#x2019;s patches play an important role for the mucosal immunosurveillance in gut-associated lymphoid tissue. Here we described the evaluation method for bacterial transcytosis by M cells in vivo. This method provides a method to understand M-cell function in the immune system.

Ligated تطبيق ماوس الفحص باير لتصحيح حلقة لتقييم امتصاص الأمعاء البكتيرية بواسطة خلايا M

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Determination of Tolerable Fatty Acids and Cholera Toxin Concentrations Using Human Intestinal Epithelial Cells and BALB/c Mouse Macrophages

The positive role of fatty acids in the prevention and alleviation of non-human and human diseases have been and continue to be extensively documented. These roles include influences on infectious and non-infectious diseases including prevention of inflammation as well as mucosal immunity to infectious diseases. Cholera is an acute intestinal illness caused by the bacterium Vibrio cholerae. It occurs in developing nations and if left untreated, can result in death. While vaccines for cholera exist, they are not always effective and other preventative methods are needed. We set out to determine tolerable concentrations of three fatty acids (oleic, linoleic and linolenic acids) and cholera toxin using mouse BALB/C macrophages and human intestinal epithelial cells, respectively. We solubilized the above fatty acids and used cell proliferation assays to determine the concentration ranges and specific concentrations of the fatty acids that are not detrimental to human intestinal epithelial cell viability. We solubilized cholera toxin and used it in an assay to determine the concentration ranges and specific concentrations of cholera toxin that do not statistically decrease cell viability in BALB/C macrophages. 
We found the optimum fatty acid concentrations to be between 1-5 ng/&mu;l, and that for cholera toxin to be &lt; 30 ng per treatment. This data may aid future studies that aim to find a protective mucosal role for fatty acids in prevention or alleviation of cholera infections.

We set out to determine tolerable concentrations of three fatty acids (oleic, linoleic and linolenic acids) and cholera toxin that did not significantly and adversely affect cell survival by solubilizing the fatty acids and the toxin and using them in cell survival assays.

تقرير من الأحماض الدهنية المسموح وتركيزات ذيفان الكوليرا عن طريق خلايا الإنسان الظهارية في الأمعاء وBALB / ج الضامة ماوس

The positive role of fatty acids in the prevention and alleviation of non-human and  human diseases have been and continue to be extensively documented. ...

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to the infiltration of tissues with migrating inflammatory cells, primarily neutrophils.&#160;This process has the potential to be destructive to tissues if excessive or held in an unresolved state.&#160; Cocultured in vitro models can be utilized to study the unique molecular mechanisms involved in pathogen induced neutrophil trans-epithelial migration.&#160;This type of model provides versatility in experimental design with opportunity for controlled manipulation of the pathogen, epithelial barrier, or neutrophil.&#160;Pathogenic infection of the apical surface of polarized epithelial monolayers grown on permeable transwell filters instigates physiologically relevant basolateral to apical trans-epithelial migration of neutrophils applied to the basolateral surface.&#160;The in vitro model described herein demonstrates the multiple steps necessary for demonstrating neutrophil migration across a polarized lung epithelial monolayer that has been infected with pathogenic P. aeruginosa (PAO1).&#160;Seeding and culturing of permeable transwells with human derived lung epithelial cells is described, along with isolation of neutrophils from whole human blood and culturing of PAO1 and nonpathogenic K12 E. coli (MC1000).&#160; The emigrational process and quantitative analysis of successfully migrated neutrophils that have been mobilized in response to pathogenic infection is shown with representative data, including positive and negative controls.&#160;This in vitro model system can be manipulated and applied to other mucosal surfaces.&#160;Inflammatory responses that involve excessive neutrophil infiltration can be destructive to host tissues and can occur in the absence of pathogenic infections.&#160;A better understanding of the molecular mechanisms that promote neutrophil trans-epithelial migration through experimental manipulation of the in vitro coculture assay system described herein has significant potential to identify novel therapeutic targets for a range of mucosal infectious as well as inflammatory diseases.

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Neutrophil trans-epithelial migration in response to mucosal bacterial infection contributes to epithelial injury and clinical disease.&#160;An in vitro model has been developed that combines pathogen, human neutrophils, and polarized human epithelial cell layers grown on transwell filters to facilitate investigations towards unraveling the molecular mechanisms orchestrating this phenomenon.

في المختبر المقايسة المشتركة لتقييم الهجرة العدلية المستحثة المسببة للأمراض عبر الظهارية

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised patients, the elderly, and pregnant women. The most common manifestations of listeriosis in humans include meningitis, encephalitis, and fetal abortion. A significant but much less documented sequelae of invasive L. monocytogenes infection involves the heart. The death rate from cardiac illness can be up to 35% despite treatment, however very little is known regarding L. monocytogenes colonization of cardiac tissue and its resultant pathologies. In addition, it has recently become apparent that subpopulations of L. monocytogenes have an enhanced capacity to invade and grow within cardiac tissue. This protocol describes in detail in vitro and in vivo methods that can be used for assessing cardiotropism of L. monocytogenes isolates. Methods are presented for the infection of H9c2 rat cardiac myoblasts in tissue culture as well as for the determination of bacterial colonization of the hearts of infected mice. These methods are useful not only for identifying strains with the potential to colonize cardiac tissue in infected animals, but may also facilitate the identification of bacterial gene products that serve to enhance cardiac cell invasion and/or drive changes in heart pathology. These methods also provide for the direct comparison of cardiotropism between multiple L. monocytogenes strains.

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes causes fetal infections in pregnant women and meningitis in susceptible populations. Subpopulations of bacteria can colonize cardiac tissue, causing myocarditis in patients and laboratory animals. Here we present a protocol that describes how to assess L. monocytogenes cardiac cell invasion in vitro and cardiac colonization in infected animals.

تقييم الغزو البكتيري لخلايا القلب في الثقافة والاستعمار القلب في الفئران المصابة باستخدام monocytogenes الليستيريا

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

Immunofluorescence Analysis of Stress Granule Formation After Bacterial Challenge of Mammalian Cells

Fluorescent imaging of cellular components is an effective tool to investigate host-pathogen interactions. Pathogens can affect many different features of infected cells, including organelle ultrastructure, cytoskeletal network organization, as well as cellular processes such as Stress Granule (SG) formation. The characterization of how pathogens subvert host processes is an important and integral part of the field of pathogenesis. While variable phenotypes may be readily visible, the precise analysis of the qualitative and quantitative differences in the cellular structures induced by pathogen challenge is essential for defining statistically significant differences between experimental and control samples. SG formation is an evolutionarily conserved stress response that leads to antiviral responses and has long been investigated using viral infections1. SG formation also affects signaling cascades and may have other still unknown consequences2. The characterization of this stress response to pathogens other than viruses, such as bacterial pathogens, is currently an emerging area of research3. For now, quantitative and qualitative analysis of SG formation is not yet routinely used, even in the viral systems. Here we describe a simple method for inducing and characterizing SG formation in uninfected cells and in cells infected with a cytosolic bacterial pathogen, which affects the formation of SGs in response to various exogenous stresses. Analysis of SG formation and composition is achieved by using a number of different SG markers and the spot detector plug-in of ICY, an open source image analysis tool.

We describe a method for the qualitative and quantitative analysis of stress granule formation in mammalian cells after the cells are challenged with bacteria and a number of different stresses. This protocol can be applied to investigate the cellular stress granule response in a wide range of host-bacterial interactions.

تحليل المناعي من الإجهاد الحبيبية تشكيل بعد تحدي البكتيريا من خلايا الثدييات

Fluorescent imaging of cellular components is an effective tool to investigate host-pathogen interactions. Pathogens can affect many different features of ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing activity by assessing the ability of antibodies in serum to bind to bacteria and activate complement. This complement activation results in the lysis and killing of the target bacteria. These assays are valuable because they go beyond quantifying antibody production to elucidate the biological functions that these antibodies have, allowing researchers to study the role that antibodies may play in preventing infection. SBAs have been used to study immune responses for many human pathogens, but there is no widely accepted methodology for Shigella at present. Historically, SBAs have been very labor-intensive, requiring many time-consuming steps to accurately quantify surviving bacteria. This protocol describes a simple, robust, and high-throughput assay that measures functional antibodies specific for Shigella in serum in vitro. The method described here offers many advantages over traditional SBAs, including the use of frozen bacterial stocks, 96 well assay plates, a micro-culture system, and automated colony-counting. All of these modifications make this assay less labor-intensive and more high-throughput. This protocol is simpler and faster to perform than traditional SBAs while still using simple technologies and readily available reagents. The protocol has been successfully applied in multiple independent laboratories and the assay is robust and reproducible. The assay can be used to assess immune responses in pre-clinical as well as clinical studies. Quantifying shigellacidal antibody titers both before and after antigen exposure (either by immunization or infection) allows for a broader understanding of how functional antibody responses are generated and their contribution to protective immunity. The development of this standardized, well-characterized assay may greatly facilitate Shigella vaccine design.

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Here we present a protocol to measure Shigellacidal activity of antibodies in serum. Serum is mixed with bacteria and exogenous complement, incubated, and the reaction mixture is plated on agar plates. Viable bacteria form colonies which are counted, using an automated colony enumerator, and used to determine the bactericidal titer.

الفائق دوسنتاريا-مقايسة جراثيم معينة

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...