تسمح هذه الطريقة بمقارنة قدرات نقل الخلايا لمختلف السلالات المعادلة عبر الخلايا الظهارية المعوية المستقطبة مع تقاطعات ناضجة. هذه تقنية سهلة نسبيا لا تتطلب استخداما مكثفا للموارد أو الوقت ، وتسمح بالتحقيق في خطوة مهمة في التسبب في مرض E.coli الغازي الوليدي. سيوضح الإجراء جوش ويتلي ، مساعد باحث في مختبري.
العمل داخل خزانة السلامة الحيوية ، بذور خلايا T84 في ثقافة خلايا غشاء البولي إيثيلين تيريفثاليت إدراج Transwell. في لوحة 24 بئر مصممة لعقد إدراج Transwell ، املأ العدد المطلوب من آبار التجميع بملليلتر واحد من وسط زراعة الأنسجة أو TCM بالمضادات الحيوية. بذر هذه الإدخالات مع واحد في 10 إلى خلايا T84 الخامسة المعلقة في 500 ميكرولتر من الطب الصيني التقليدي مع المضادات الحيوية.
بعد حوالي 48 ساعة من البذر ، تحقق باستخدام المجهر الضوئي مما إذا كانت الطبقات الأحادية قد بدأت في التلاقي. كل يومين بعد البذر ، قم بقياس وتسجيل المقاومة الكهربائية عبر الظهارة أو TEER باستخدام فولت ظهاري لكل متر OM أو EVOM. قبل قياس TEER ، قم بإزالة التلوث من المسبار الكهربائي عن طريق غمره في خمسة ملليلتر من الإيثانول بنسبة 70٪ لمدة 10 إلى 15 دقيقة.
قم بإزالة المسبار ، وتخلص من الإيثانول الزائد ، واتركه يجف في الهواء داخل خزانة السلامة الحيوية لمدة 10 دقائق. اختبر EVOM والمسبار عن طريق وضع المسبار الجاف المطهر في بئر معقم يحتوي على ملليلتر واحد من الطب الصيني التقليدي مع المضادات الحيوية مع ملحق معقم بداخله يحتوي على 500 ميكرولتر من الطب الصيني التقليدي مع المضادات الحيوية. تأكد من أن قراءة EVOM أقل من 200 OM. سجل هذه القيمة الفارغة لاستخدامها في حسابات المقاومة اللاحقة.
إزالة التحقيق من أنبوب الطب الصيني التقليدي مع المضادات الحيوية. اخفض المسبار برفق في الإدخال الأول باستخدام القطب الطويل في بئر التجميع. اسمح للقطب بلمس الجزء السفلي من بئر التجميع ، لكن لا تضغط لأسفل لأن هذا قد يعطل الطبقة الأحادية الظهارية والقطب القصير داخل الإدخال.
عند الانتهاء ، قم بتطهير المسبار في الإيثانول. اطرح قيمة المقاومة الفارغة من كل قيمة تم الحصول عليها من كل إدراج يحتوي على خلايا T84. ثم اضرب المقاومة الناتجة لكل ملحق في مساحة الجزء السفلي من كل ملحق للحصول على قياس TEER النهائي.
بمجرد أن يصل TEER إلى 1000 OMs لكل سنتيمتر مربع ، تكون الطبقة الأحادية الظهارية ناضجة وجاهزة لفحوصات العدوى. مع نضوج TEER ، زود الخلايا بوسط جديد كل يوم إلى يومين. في صفيحة جديدة مكونة من 24 بئرا ، أضف ملليلترا واحدا من الطب الصيني التقليدي مع المضادات الحيوية إلى بئر واحد لكل ملحق بذر.
باستخدام ملقط معقم ، انقل الإدخالات بعناية إلى الآبار التي تم تجديدها حديثا. استبدل الوسائط في الإدخالات. قم بإزالة الوسائط القديمة من الملحقات عن طريق إمالة اللوحة ، وقم بإزالة الوسائط برفق باستخدام طرف ماصة على طول جانب الإدخال.
أضف 500 ميكرولتر من الطب الصيني التقليدي مع المضادات الحيوية إلى الإدخالات وتصور الطبقة الأحادية للتحقق من بقائها سليمة. في اليوم السابق للتجربة ، قم بقياس وتسجيل TEER. استبدل الوسط بملليلتر واحد من الطب الصيني التقليدي بدون مضادات حيوية في بئر اللوحة ، و 500 ميكرولتر في الإدخال.
خذ أنبوبا مخروطيا بحجم 15 ملليلترا مع خمسة ملليلتر من مرق الليزوجينيا المعقم أو LB ، واستخدم مزلقا معقما لتلقيح المرق بمستعمرة واحدة من سلالة الإشريكية القولونية. احتضان الثقافة بين عشية وضحاها مع تخفيف الغطاء من الأنبوب. في اليوم التالي ، أضف 250 ميكرولتر من مزرعة رطل بين عشية وضحاها إلى 25 ملليلتر من الطب الصيني التقليدي بدون مضادات حيوية في أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلتر.
احتضان الأنبوب لمدة ساعتين. قم بقياس TEER عبر كل إدراج. سجل هذه على أنها TEERs في الوقت T إلى ساعة الصفر.
انقل الإدخالات إلى الآبار في لوحة جديدة وقم بتغيير الوسائط. املأ آبار التجميع الجديدة ب 500 ميكرولتر وأدخل ب 400 ميكرولتر من الطب الصيني التقليدي بدون مضادات حيوية يدوية. الحفاظ على إدراج داخل حاضنة زراعة الأنسجة حتى وقت الإصابة.
بعد ساعتين ، قم بإزالة الثقافات البكتيرية الصباحية من شاكر وأجهزة الطرد المركزي. أعد تعليق الحبيبات في الطب الصيني التقليدي بدون مضادات حيوية. ثم استخدم مقياس الطيف الضوئي لضبط الكثافة الضوئية أو OD إلى 0.7 أو 0.9 وتخفيفه إلى تركيز 1 مليون وحدة تشكيل مستعمرة أو CFU لكل ملليلتر.
تصيب كل ملحق ب 100 ميكرولتر من اللقاح المعدل OD. لاحظ الوقت وسجله كساعة صفر. ضع المعلق البكتيري اللقاح على كمية CFU لكل ملليلتر باستخدام طريقة تخفيف الجنزير بطلاء 10 ميكرولتر من القسمة على صفيحة مثقاب LB مربعة.
كل 30 دقيقة بعد التلقيح ، املأ الآبار الجديدة ب 500 ميكرولتر من الطب الصيني التقليدي بدون مضادات حيوية ، وانقل الإدخالات إلى هذه الآبار الجديدة. اجمع الوسائط من بئر التجميع المستخدم لكل ملحق في أنبوب منفصل وضع الأنبوب على الثلج. أعد لوحة Transwell إلى الحاضنة بين النقاط الزمنية.
لكل إدراج ، اجمع بين الوسائط المجمعة من نقاط زمنية مختلفة ودوامة لفترة وجيزة. قم بطلاء الوسائط المجمعة على ألواح البريمة LB باستخدام طريقة تخفيف الجنزير لتحديد عدد البكتيريا العابرة للخلايا في أول ساعتين من التجربة. اجمع الوسائط في أربع وست ساعات.
بالإضافة إلى ذلك ، في ست ساعات ، قم بلوحة الوسائط من آبار التحكم. في ست ساعات ، قم بقياس وتسجيل TEER. بعد الحضانة بين عشية وضحاها ، عد المستعمرات البكتيرية يدويا على لوحات LB لتخفيف الجنزير.
أثناء تكاثر خلايا T84 المعقمة ، ترتفع TEERs عبر الطبقات الأحادية T84 باستمرار بمرور الوقت ، متجاوزة 1000 OMs لكل سنتيمتر مربع تقريبا بعد سبعة أيام من البذر. يظهر هنا انتقال الخلايا لعزلات E.coli الوليدية بمرور الوقت. أظهرت مقارنات متوسط قيم نقل الخلايا اختلافات ذات دلالة إحصائية بين عزلات E.coli الوليدية واحدة مقابل اثنتين في ساعتين بعد الإصابة.
في المقابل ، خضعت سلالة E.coli غير المسببة للأمراض DH5 alpha للحد الأدنى من انتقال الخلايا. تظهر هنا نتائج TEER قبل وبعد الإصابة بعزلتين سريريتين من E.coli حديثي الولادة بقدرات مختلفة على الخلايا الظهارية المعوية عبر الخلايا. يختلف معدل وكمية انتقال الخلايا بين السلالات ولكن TEER يزداد بشكل ملحوظ بعد الإصابة بكل من السلالات المسببة للأمراض مقارنة بالإدخالات غير المصابة.
يعد إجراء قياسات TEER بطريقة متسقة أمرا بالغ الأهمية للحصول على نتائج قابلة للتكرار باستخدام هذه الطريقة. من المهم جدا أيضا اتباع تقنيات معقمة صارمة لتجنب التلوث.
