Dominic Mills Bloomsbury Kolejler Doktora Bursu (2007-2010) tarafından desteklenmiştir. Yazarlar VDC modeli gelişmekte olan onların yardım için Ozan Gündoğdu ve Abdi Elmi de teşekkür etmek istiyorum.

1. Özel 0.4 mikron Filtreler IEC Tek katmanlar Büyüme <ol><li> Dulbecco&#39;nun modifiye temel ortam, kültür, Caco-2 hücreleri (DMEM)% 10 (v / v) fetal dana serumu, 100 U / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin ve% 1 (v / v) ile gerekli olmayan amino asitler ile desteklenmiş 37 standart bir doku kültürü kuluçka °% 5 CO2 ve% 95 hava C &#39;dir. Tohum 4 x 10 5 Caco-2 0.4 mikron başına IECS filtre ve 21 gün içinde kutuplaşma büyümeye, medya 2-3 günde değişiyor. </li><li> Bir Volt-Ohm direnç metre kullanarak tek tabaka polarizasyon durumunu onaylamak için TEER ölçün. Çalışmalarda, 21 günün TEER Caco-2 bu 0.4 mikron filtre yetiştirilen hücreler 700-800 Ωcm 2&#39;dir. </li></ol> 2. C. hazırlanması jejuni ve Coculturing tahlil için Bakteriyel Orta <ol><li> VDC coculturing testinin istenen başlangıç ​​noktası önce 24 saat, C taze bir kan agar plaka hazırlamak. 37 jejuni ve inkübe ° C değişken atmosfer inkübatör mikroaerobik koşulları (% 85 N 2, 5% O 2, ve% 10 CO 2) altında. </li><li> Aynı zamanda, değişken ortam inkübatör mikroaerobik koşullar altında 37 ° C &#39;de Brucella et suyu 30 ml Preincubate. </li></ol> 3. Hazırlık ve Test öncesinde VDC Yarım Odaları Sterilizasyon <ol><li> Batırmayın VDC yarısı odaları yanı sıra O-ring ve sterilizasyon çözüm fişleri. </li><li> , Steril bir 20 ml&#39;lik şırınga kullanarak, yarı odaları hem de gaz girişleri aracılığıyla sterilizasyon çözeltisi yıkayın. Aksi takdirde, coculturing sırasında numunelerin kirlenmesine neden olabilir. </li><li> &gt; 1 saat için sterilizasyon solüsyonuna daldırılır tüm bileşenleri bırakın. </li><li> Gaz girişleri temizlemek için başka bir steril 20 ml şırınga kullanarak, temiz steril su ile durulayın. </li></ol> 4. HazırlıkBakteriyel inokulum <ol><li> C. yarım tabak hasat kan agar plağından jejuni büyüme kuluçkaya yatırılmış brusella suyu 1 ml içine önceki gün hazırladı. Bu ~ 10 10 kob / ml boyun eğmek zorundadır. </li><li> Bakteriyel koloni oluşturan birim (CFU) semiquantify ile 600 nm de bakteriyel süspansiyonun optik yoğunluğunun ölçülmesi. </li><li> Kuluçkaya yatırılmış Brucella brot 4 ml inokulum istenen seviyeye bakteri süspansiyonu ayarlayın. </li><li> Daha sonra, inokulum mevcut bakteriyel CFU sayısını ölçmek için, 48 saat boyunca, değişken bir atmosfer inkübatör içinde 37 ° C&#39;de inkübe üç tekrarlı olarak kan agar plakaları üzerine uygun dilüsyonları, kaplama, ardından, bu nihai bakteriyel süspansiyon bir seri seyreltme gerçekleştirin. </li></ol> 5. VDC ayarlama <ol><li> Tezgah üzerine VDC düz alt yarısında odasına yerleştirin. Alt yarısında odasının üzerine bir O-ring takın. </li><li> T IECS taşıyan bir filtre ayırıno bir taşıyıcı ve steril PBS 400 ul ile üç kez yıkayın. O-ring yerinde kalır emin, alt yarısı odasının üzerine filtre yerleştirin. </li><li> Yavaşça üst yarısında odasına yerine indirin. Iki yarı-odaları monte edildikten sonra, halka kelepçelerle birbirine kenetlenmiştir. Yukarı bakacak şekilde iki açıklık ile, tezgah üstüne yatay olarak VDC yerleştirin. </li><li> Apikal yarısı odasına bakteriyel inokulum 4 ml ekleyin. </li><li> Yarı bazolateral bölmeye hücre kültürü ortamı 4 ml ilave edilir. </li><li> Yarım odaları hem deliklerine sonunda parçaları yerleştirin. </li></ol> 6. Değişken Atmosfer İnkübatör içinde Gaz Manifold için VDC takılması <ol><li> Gaz manifoldu yakın değişken atmosfer kuvöz içine VDC yerleştirin. </li><li> Gaz manifoldu bağlı gaz regülatörü açın. VDC bazolateral yarısı odasına üzerindeki gaz girişine manifoldundan tüp takın. Ga takıns çıkış borusu bazolateral yarım odası üzerinde son-parça satış birine değişken atmosfer inkübatör dışında lider. </li><li> Bazolateral yarım odası üzerinde son parçalı diğer çıkış kapalı kapatın. Bu bazolateral ortamın sınırdışı yol açabilir gibi, aşırı gaz basıncı önlemek için çok yavaş açmak için bakımı, gaz manifoldu üzerinde gaz akışını açın. </li><li> Amaç 1 kabarcık her 2-5 saniye bir gaz akışı. Periyodik olarak, deney sırasında gaz akışını kontrol etmek ve gerektiğinde ayarlayın. </li></ol> 7. Kokültürü sonra VDC sökülmesi <ol><li> Uygun kokültürü süre sonra, gaz manifolduna bağlı gaz regülatörü kapatın. Manifoldunda VDC içine gaz akışını kapatın. Gaz girişi, gaz çıkışı ve VDC gelen stoper çıkarın. </li><li> Bir değişken atmosfer inkübatör VDC çıkarın. Subsequen için -80 apikal ve bazolateral süpernatanlar ve mağaza ° C çıkarınT analizi. </li><li> Halka kelepçeleri çıkarın ve yavaşça VDC parçalara ayırmak. Yarı odası ve steril bir 6-kuyulu hücre kültürü çanak transfer filtre çıkarın. Steril PBS ile 400 ul IECS üç kez yıkayın. </li><li> Etkileşim bakteri sayısının sayılması için, Triton X-100 IECS için% 0.1 içeren steril PBS içinde 400 ul (v / v) ekleyin ve IEC eritmek için, oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edilir. Daha sonra bakteriyel CFU etkileşim sayısını ölçmek için, 48 saat boyunca, değişken bir atmosfer inkübatör içinde 37 ° C&#39;de inkübe üç tekrarlı olarak kan agar plakaları üzerine uygun dilüsyonları, kaplama, ardından, bu hücre lizatından bir seri seyreltme gerçekleştirin. </li><li> Istilacı bakteri sayısının sayılması için,% 5 CO2 ve% 95 37 ° C&#39;de standart bir doku kültürü inkübatörü içinde, 2 saat boyunca inkübe IECS ve 150 ug / ml gentamisin ihtiva eden DMEM hücre kültür aracı maddesi ° C arasında 400 ul dışı bakterileri öldürmek için hava,daha sonra yukarıda adım 7.4 için olarak izleyin. </li></ol> 8. Kokültürü sonra VDC temizleme Deneylerin bir sonraki tur için steril su ve mağaza ile VDC yıkayın.

<ol>
	<li>Mills, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increase+in+Campylobacter+jejuni+invasion+of+intestinal+epithelial+cells+under+low-oxygen+coculture+conditions+that+reflect+the+in+vivo+environment.">Increase in Campylobacter jejuni invasion of intestinal epithelial cells under low-oxygen coculture conditions that reflect the in vivo environment.</a> Infect. Immun. 80, 1690-1698 (2012).</li><li>Marteyn, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+Shigella+virulence+in+response+to+available+oxygen+in+vivo.">Modulation of Shigella virulence in response to available oxygen in vivo.</a> Nature. 465, 355-358 (2010).</li><li>Dorrell, N., Wren, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+second+century+of+Campylobacter+research:+recent+advances,+new+opportunities+and+old+problems.">The second century of Campylobacter research: recent advances, new opportunities and old problems.</a> Curr. Opin. Infect. Dis. 20, 514-518 (2007).</li><li>Young, K. T., Davis, L. M., Dirita, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Campylobacter+jejuni:+molecular+biology+and+pathogenesis.">Campylobacter jejuni: molecular biology and pathogenesis.</a> Nat. Rev. Microbiol. 5, 665-679 (2007).</li><li>Hu, L., Kopecko, D. J., Nachamkin, I., Szymanski, C. M., Blaser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+17.">Chapter 17.</a> Campylobacter. , 297-313 (2008).</li><li>Everest, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiated+Caco-2+cells+as+a+model+for+enteric+invasion+by+Campylobacter+jejuni+and+C.+coli.">Differentiated Caco-2 cells as a model for enteric invasion by Campylobacter jejuni and C. coli.</a> J. Med. Microbiol. 37, 319-325 (1992).</li><li>Konkel, M. E., Hayes, S. F., Joens, L. A., Cieplak, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+the+internalization+and+intracellular+survival+of+Campylobacter+jejuni+in+human+epithelial+cell+cultures.">Characteristics of the internalization and intracellular survival of Campylobacter jejuni in human epithelial cell cultures.</a> Microb. Pathog. 13, 357-370 (1992).</li><li>Monteville, M. R., Konkel, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin-facilitated+invasion+of+T84+eukaryotic+cells+by+Campylobacter+jejuni+occurs+preferentially+at+the+basolateral+cell+surface.">Fibronectin-facilitated invasion of T84 eukaryotic cells by Campylobacter jejuni occurs preferentially at the basolateral cell surface.</a> Infect. Immun. 70, 6665-6671 (2002).</li><li>Friis, L. M., Pin, C., Pearson, B. M., Wells, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+cell+culture+methods+for+investigating+Campylobacter+invasion+mechanisms.">In vitro cell culture methods for investigating Campylobacter invasion mechanisms.</a> J. Microbiol. Methods. 61, 145-160 (2005).</li><li>Schuller, S., Phillips, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microaerobic+conditions+enhance+type+III+secretion+and+adherence+of+enterohaemorrhagic+Escherichia+coli+to+polarized+human+intestinal+epithelial+cells.">Microaerobic conditions enhance type III secretion and adherence of enterohaemorrhagic Escherichia coli to polarized human intestinal epithelial cells.</a> Environ. Microbiol. 12, 2426-2435 (2010).</li><li>Cottet, S., Corthesy-Theulaz, I., Spertini, F., Corthesy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microaerophilic+conditions+permit+to+mimic+in+vitro+events+occurring+during+in+vivo+Helicobacter+pylori+infection+and+to+identify+Rho/Ras-associated+proteins+in+cellular+signaling.">Microaerophilic conditions permit to mimic in vitro events occurring during in vivo Helicobacter pylori infection and to identify Rho/Ras-associated proteins in cellular signaling.</a> J. Biol. Chem. 277, 33978-33986 (2002).</li></ol>

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Ev sahibi hücrelerle bakteriyel patojenlerin etkileşimleri incelemek için in vitro hücre kültürü yöntemleri içinde kullanımı yaygın olarak pek çok araştırma laboratuarlarında kullanılan bir tekniktir. Bu hücre kültürü deneyleri aerobik şartlar altında gerçekleştirilir Ancak, bu in vitro modellerde doğru konak-patojen yer aldığı in vivo ortamda temsil olmayabilir. Yaygın olarak in vitro enfeksiyon modellerinde kullanılan mikroaerofilik <...

Ev sahibi hücrelerle bakteriyel patojenler etkileşimleri, in vitro hücre kültürü yöntemleri kullanılarak yoğun bir şekilde araştırılmıştır. Bu hücre kültürü deneyleri, ev sahibi hücrelere bakteriyel yapışma, konak hücre reseptörleri, yollar ve ev sahibi hücrelerin bakteri istilası sinyal konak hücrenin kimlik kullanan tüm birçok önemli gözlemler sonucu, ayrıntılı olarak incelenmiştir. Ancak bu hücre kültürü deneyleri in vivo ortamda temsil olmayabilir aerobik koşullar altında yapılmaktadır. Gastrointestinal enfeksiyonlar incelemek için kullanılan in vitro modellerinde önemli bir sınırlama yüksek oksijen seviyesi de dahil olmak üzere kültür koşulları genellikle ökaryot hücre sağkalım lehine olmasıdır. Bununla birlikte, bağırsak lümeninden koşulların hemen hemen anaerobik olacaktır. Çok düşük bir oksijen ortamında enterik patojenlerin olan ekspresyon değişikliği aerobik şartlar altında 2 enfeksiyon genlerini ifade eder. Bu nedenle, veri standart hücre kültürü modelleri m kullanılarak eldeay konak hücreleri ile bakteriyel etkileşimlerin bir yanlış göstergesidir. Campylobacter jejuni hafif ishal şiddetli enflamatuar enterit değişir bu belirtiler, dünya çapında bakteriyel akut gastroenterit önde gelen etken olduğunu. C çoğunluğu basit gastroenterit jejuni enfeksiyonları sonucu, ancak C. jejuni da Guillain-Barre sendromu (GBS) dahil olmak üzere çevresel nöropatiler, en yaygın olarak tespit bulaşıcı bir ajandır. İngiltere&#39;de, bu C&#39;nin neden enterit 500.000 &#39;den fazla vaka olduğu tahmin edilmektedir 580.000.000 £ Birleşik Krallık&#39;ın ekonomisine tahmin maliyeti jejuni enfeksiyonu her yıl. Gelişmekte olan ülkelerde, C. jejuni çocuklar arasında ölüm önde gelen nedenidir. Şüphesiz Campylobacter enfeksiyon önemi ve kapsamlı genomik-tabanlı analiz, C dahil olmak üzere araştırma yıllardır rağmen, jejuni patogenezi hala tam underst olduğunuood, Salmonella, Escherichia coli, Shigella, ve Vibrio cholerae gibi diğer enterik patojenler aksine. Uygun bir küçük hayvan modeli eksikliği bu 3 için önemli bir nedenidir. Ayrıca yaygın olarak in vitro enfeksiyon modellerinde kullanılan mikroaerofilik C çalışmak için daha uygun değildir fakültatif anaeroblar diğer enterik patojenler için daha jejuni. Iken C. jejuni istilacı patojen, C. mekanizmaları olarak kabul edilmektedir bağırsak epitel hücrelerinin jejuni işgali (IECS) hala 4,5 belirsiz. C. jejuni işgal ya mikrofilamanlar, mikrotübüller, her ikisi de bir arada ya da ikisinin de 5 bağımlı olduğu gösterilmiştir. Bu alanda karışıklık muhtemelen in vitro test koşullarında uygunsuz kullanım kaynaklanmaktadır. Farklı hücre kültürü analizlerinden bir dizi C etkileşimi araştırmak için kullanılmıştır jejuniev sahibi hücrelerle. Caco-2 6, INT 407 7, 8 ve T84 hücre hatları tüm farklı C. adhezyon ve invazyon yetenekleri incelemek için kullanılmıştır jejuni suşları. Ancak, C. için bakteriyel yapışma ve invazyon seviyeleri IECS ile jejuni diğer enterik patojenler 9 daha önemli ölçüde düşüktür. C. coculturing IECS ile jejuni, normal IECS hayatta kalması için gerekli atmosferik oksijen seviyeleri yakın koşullar altında bir CO2 inkübatör içinde gerçekleştirilir. ° C. jejuni gen ekspresyon atmosferik oksijen koşullarına göre bağırsak lümen düşük oksijen ortamda çok farklı olacaktır. Dikey bir difüzyon hücresinde (VDC) sistemi kullanımı, farklı orta ve gazı koşulları altında 1,10,11 bakteri ve konak hücrelerin kokültürü izin veren geliştirilmiştir. Bu sistem bakteri un olacak insan bağırsak koşullarını taklitçok düşük oksijen iken doku der koşulları kan akışından oksijen ile tedarik edilecektir. Özel bir 0.4 mikron filtre yetiştirilen Polarize IEC mono tabakaları bireysel bakteriyel suyu ve sırasıyla, hücre kültürü ortamı (Şekil 1) ile doldurulmuş bir apikal ve bazolateral bölmesi, oluşturma VDC içine yerleştirildi. VDC değişken bir atmosfer inkübatöründe 37% 85 N2,% 5 O2 ve% 10 CO2 içeren ° C, C için en uygun koşulların temsil yerleştirildi jejuni. Apikal bölmesi açık bıraktı ve değişken atmosfer inkübatör içinde mikroaerobik atmosfere maruz kalmış, kapalı bazolateral bölmesi iken% 5 CO 2 / basınç birikimi engelleyen bir çıkış borusu ile% 95 O 2 gaz karışımı sürekli yönetimi tarafından oksijen ile sağlanan . Bu koşullar altında, Caco-2 hücre hayatta kalması ve tek tabaka bütünlüğü transepitelyal ele izlenmesi ile doğrulanmıştır24 saat boyunca tek tabaka üzerinde ctrical direnci (TEER), apikal bölmeye düşük oksijen koşullarında apikal ve bazolateral bölmelerinin Caco-2 hücre tek ve fiziksel olarak ayrılması hayatta göstermek için. Değişken atmosfer inkübatör (Mikroaerobik koşulları) ve bir standart hücre kültürü CO 2 inkübatör (aerobik koşullarda) muhafaza VDCs içinde mono tabakaları TEER farklı atmosferik koşullar 1 altında hücre tek tabaka bütünlüğünü gösteren, anlamlı farklılık gösterdi. Mikroaerobik koşullar altında, sıkı bağlantıları mevcut ve eşit aerobik koşullarda 1 altında muhafaza hücreleri benzer bir occludin boyama deseni ile hücre sınırları arasında dağıtılır kaldı. C. etkileşimleri VDC Caco-2 ve T84 hücreleri ile jejuni bakteriyel etkileşim (yapışma ve işgali) ve işgali değerlendirerek incelenmiştir. Iki farklı ° C. jejuni yabani tip strains 1 kullanıldı. C. jejuni 11168H orijinal dizisi gerginlik NCTC11168 bir hypermotile türevidir. 11168H gerginlik bir civciv kolonizasyon modelinde çok daha yüksek kolonizasyon düzeyi gösterir ve bu nedenle konak-patojen etkileşim çalışmaları için kullanılacak uygun bir gerginlik olarak kabul edilir. 81-176 bir insan izole etmek ve en invaziv yaygın olarak incelenmiştir laboratuar suşları biridir. ° C. jejuni suşları mikroaerobik veya aerobik şartlar altında bir ya da VDC apikal bölmesine ilave edildi. Biz etkileşim ve işgali hem de yüksek oranda C için kaydedildi gözlenen mikroaerobik koşullar 1. altında jejuni. Artan ° C. jejuni etkileşimleri mikroaerobik koşullar 1 altında bakteri sayısındaki artış nedeniyle değildi. Bu veri VDC apikal bölmesinde düşük oksijen ortamında bakteri-konak ilişkileri geliştirir ve gösterir bizim hipotezi desteklediği C invaziv özellikleri jejuni incr olanBu koşullar altında hafifletti. Bu invaziv bakteriyel patojen incelemek için VDC modelinin kullanımının ilk rapor ve daha yakından in vivo durumda taklit koşullarda in vitro enfeksiyon tayinlerde performans önemini vurgulamaktadır. VDC modeli çok farklı bakteri türleri için konak-patojen etkileşimleri çalışmak için kullanılabilir.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speciality vertical diffusion system for use with Snapwell inserts</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>66-0001</td>
			<td>Manifold &#38; six Snapwell chambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caps</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>66-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-rings</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>66-0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clamps</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>66-0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snapwell filters (pore size 0.4 &#956;m)</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>3407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell ERS-2 Volt-Ohm resistance meter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MERS00002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WPA Lightwave II spectrophotometer</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>80-3003-72</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enteric bacterial invasion of intestinal epithelial cells in vitro is dramatically enhanced using a vertical diffusion chamber model

Ev sahibi hücrelerle bakteriyel patojenler etkileşimleri, in vitro hücre kültürü yöntemleri kullanılarak yoğun bir şekilde araştırılmıştır. Bu hücre kültürü deneyleri aerobik şartlar altında gerçekleştirilir Ancak, bu in vitro modellerde doğru konak-patojen yer aldığı in vivo ortamda temsil olmayabilir. Farklı orta ve gaz koşullarında bir bakteri ve konak hücrelerin kokültürü izin enfeksiyonun bir in vitro modeli geliştirdik. Dikey difüzyon hücresinde (VDC) modeli bakteriler çok düşük oksijen iken doku koşulları altında olacak insan bağırsak koşulların kan akışından oksijen ile tedarik edilecek taklit eder. Bir VDC içine Snapwell ekler yetiştirilen polarize bağırsak epitel hücre (IEC) mono tabakaları yerleştirilmesi ayrı apikal ve bazolateral bölmeleri oluşturur. Bazolateral bölmesi, hücre kültür ortamı ile doldurulmuş ve kapatılmış oksijen w ile perfüzeApikal bölmesi Hilst suyu ile doldurulur, açık tutulur ve mikroaerobik koşullar altında inkübe edildi. Caco-2 ve T84 Hem IECS hücre yaşamını ya da tek tabaka bütünlüğü üzerinde belirgin bir zararlı etki olmaksızın, bu koşullar altında VDC korunabilir. Coculturing deneyler değişik C ile gerçekleştirilir apikal bölmeye mikroaerobik koşullara jejuni, vahşi tip suş ile VDC model içinde farklı IEC hattı tekrarlanabilir aerobik kültür koşulları ile karşılaştırıldığında bir etkileşim sayısı (yaklaşık 10 kat) artış ve hücre içi (hemen hemen 100 kat) bakterilerin neden 1. VDC modeli oluşturulan ortamı daha yakından C. karşılaştığı çevre taklit eder ve insan bağırsak jejuni daha yakından in vivo gerçekte taklit eden şartlar altında in vitro enfeksiyon deneyleri gerçekleştirmek önemini vurgulamaktadır. Biz VDC modelinin kullanımının etkileşim yeni yorumlar bahis sağlayacak teklifbakteriyel patojenler ve konak hücreleri da muhtemelen bir.

Coculturing deneyler C ile gerçekleştirilen jejuni, yabani tip suşu ve apikal bölmeye mikroaerobik koşullara VDC modelinde IECS bir süre içinde aerobik kültür koşulları ile karşılaştırıldığında bir etkileşim sayısındaki artış (yaklaşık 10 kat) ve hücre içi (hemen hemen 100 kat) bakteri göstermiştir bağımlı bir şekilde 1. Bu gözlem, iki farklı C. kullanarak tekrarlanabilir olduğu jejuni yabani tip suşları (11168H ve 81-176) ve iki farkl...

Watch this Scientific Journal Video about Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model at JoVE.com

Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

Aerobik koşullarda bakteri yapışma ve işgali araştırmak için hücre kültürü deneyleri Sahne genellikle temsil edici olduğu<em&gt; In vivo</em&gt; Ortam. Bir Dikey Difüzyon Odası modeli insan patojen etkileşimleri çalışma sağlar<em&gt; Campylobacter jejuni</em&gt; Daha altında bağırsak epitel hücreleri ile<em&gt; In vivo</emKoşullar&gt; gibi, gelişmiş bakteri istilası sonucu.

Bağırsak Epitel Hücreleri Of Enterik Bakteriyel Invasion<em&gt; In Vitro</em&gt; Dramatik bir Dikey Difüzyon Odası Modeli Geliştirilmiş mı

The interactions of bacterial pathogens with host cells have been investigated extensively using in vitro cell culture methods. However as such cell ...

enteric-bacterial-invasion-intestinal-epithelial-cells-vitro-is

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

13.7K Görüntüleme.  London School of Hygiene & Tropical Medicine. Aerobik koşullarda bakteri yapışma ve işgali araştırmak için hücre kültürü deneyleri Sahne genellikle temsil edici olduğu In vivo Ortam. Bir Dikey Difüzyon Odası modeli insan patojen etkileşimleri çalışma sağlar Campylobacter jejuni Daha altında bağırsak epitel hücreleri ile In vivo gibi, gelişmiş bakteri istilası sonucu.

Video: Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. Biofilms are community-associated bacteria attached to a surface and encased in a matrix. The role of the extracellular matrix is multifaceted, including facilitating nutrient acquisition, and offers significant protection against environmental stresses (e.g. host immune responses). In an effort to acquire a better understanding as to how the bacteria within a biofilm respond to environmental stresses we have used a protocol wherein we visualize bacterial biofilms which have formed in an 8-well chamber slide. The biofilms were stained with the BacLight Live/Dead stain and examined using a confocal microscope to characterize the relative biofilm size, and structure under varying incubation conditions. Z-stack images were collected via confocal microscopy and analyzed by COMSTAT. This protocol can be used to help elucidate the mechanism and kinetics by which biofilms form, as well as identify components that are important to biofilm structure and stability.

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

This article describes the procedure for the formation and visualization of a bacterial biofilm grown within an 8-well chamber slide

8-iyi Odası Slayt in vitro Biyofilm Oluşumu

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes. In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific immune cell types, viral pathogens, parasites and bacteria can be followed in real-time within living animals 1-2. Application of bioluminescence imaging to the study of pathogens has advantages as compared to conventional strategies for analysis of infections in animal models3-4. Infections can be visualized within individual animals over time, without requiring euthanasia to determine the location and quantity of the pathogen. Optical imaging allows comprehensive examination of all tissues and organs, rather than sampling of sites previously known to be infected. In addition, the accuracy of inoculation into specific tissues can be directly determined prior to carrying forward animals that were unsuccessfully inoculated throughout the entire experiment. Variability between animals can be controlled for, since imaging allows each animal to be followed individually. Imaging has the potential to greatly reduce animal numbers needed because of the ability to obtain data from numerous time points without having to sample tissues to determine pathogen load3-4.
This protocol describes methods to visualize infections in live animals using bioluminescence imaging for recombinant strains of bacteria expressing luciferase. The click beetle (CBRLuc) and firefly luciferases (FFluc) utilize luciferin as a substrate5-6. The light produced by both CBRluc and FFluc has a broad wavelength from 500 nm to 700 nm, making these luciferases excellent reporters for the optical imaging in living animal models7-9. This is primarily because wavelengths of light greater than 600 nm are required to avoid absorption by hemoglobin and, thus, travel through mammalian tissue efficiently. Luciferase is genetically introduced into the bacteria to produce light signal10. Mice are pulmonary inoculated with bioluminescent bacteria intratracheally to allow monitoring of infections in real time. After luciferin injection, images are acquired using the IVIS Imaging System. During imaging, mice are anesthetized with isoflurane using an XGI-8 Gas Anethesia System. Images can be analyzed to localize and quantify the signal source, which represents the bacterial infection site(s) and number, respectively. After imaging, CFU determination is carried out on homogenized tissue to confirm the presence of bacteria. Several doses of bacteria are used to correlate bacterial numbers with luminescence. Imaging can be applied to study of pathogenesis and evaluation of the efficacy of antibacterial compounds and vaccines.

Methods for bioluminescence imaging of bacterial infections in living animals are decribed. Pathogens are modified to express luciferase allowing optical whole body imaging of infections in live animals. Animal models can be infected with luciferase expressing pathogens and the resulting course of disease visualized in real-time by bioluminescence imaging.

Farelerde Görüntü Bakteriyel Enfeksiyonlar Lusiferaz Kullanımı

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be applied to the study of cell invasion by virtually any culturable bacterium. The stages at which specific aspects of invasion can be studied, such as the role of actin rearrangement or caveolae, will be highlighted. Host cells are grown in flasks and when ready for use are seeded into 24-well plates containing Thermanox coverslips. Using coverslips allows subsequent removal of the cells from the wells to reduce interference from serum proteins deposited onto the sides of the wells (to which S. aureus would attach). Bacteria are grown to the required density and washed to remove any secreted proteins (e.g. toxins). Coverslips with confluent layers of endothelial cells are transferred to new 24-well plates containing fresh culture medium before the addition of bacteria. Bacteria and cells are then incubated together for the required amount of time in 5% CO2 at 37&deg;C. For S. aureus this is typically between 15-90 minutes. Thermanox coverslips are removed from each well and dip-washed in PBS to remove unattached bacteria. If total associated bacteria (adherent and internalised) are to be quantified, coverslips are then placed in a fresh well containing 0.5% Triton X-100 in PBS. Gentle pipetting leads to complete cell lysis and bacteria are enumerated by serial dilution and plating onto agar. If the number of bacteria that have invaded the cells is needed, coverslips are added to wells containing 500 &mu;l tissue culture medium supplemented with gentamicin and incubation continued for 1 h, which will kill all external bacteria. Coverslips can then be washed, cells lysed and bacteria enumerated by plating onto agar as described above. If the experiment requires direct visualisation, coverslips can be fixed and stained for light, fluorescence or confocal microscopy or prepared for electron microscopy.

A general protocol for the study of invasion of host cells by a bacterial pathogen, focusing on Staphylococcus aureus and human endothelial cells.

Bakteriyel Patojen İnsan Hücreleri Invasion

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be ...

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host cells1. These adhesins rely on interactions with host cell surface receptors or soluble proteins acting as a bridge between bacteria and host. Adhesion is a critical first step prior to invasion and/or secretion of toxins, thus it is a key event to be studied in bacterial pathogenesis. Furthermore, adhered bacteria often induce exquisitely fine-tuned cellular responses, the studies of which have given birth to the field of 'cellular microbiology'2. Robust assays for bacterial adhesion on host cells and their invasion therefore play key roles in bacterial pathogenesis studies and have long been used in many pioneer laboratories3,4. These assays are now practiced by most laboratories working on bacterial pathogenesis.
Here, we describe a standard adherence assay illustrating the contribution of a specific adhesin. We use the Escherichia coli strain 27875, a human pathogenic strain expressing the autotransporter Adhesin Involved in Diffuse Adherence (AIDA). As a control, we use a mutant strain lacking the aidA gene, 2787&Delta;aidA (F. Berthiaume and M. Mourez, unpublished), and a commercial laboratory strain of E. coli, C600 (New England Biolabs). The bacteria are left to adhere to the cells from the commonly used HEp-2 human epithelial cell line. This assay has been less extensively described before6.

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

This protocol is a simple bacterial adhesion assay consisting in counting the numbers of bacterial colony forming units that are adhered onto cultured cells. The assay is robust, independent of the adhesin studied, and numerous variations are used in most laboratories working on bacterial pathogenesis.

Bakteriyel Yapışma Memeli Epitel Hücreleri üzerine In Vitro Testi

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed to them and occasionally to pathogens. The gut-associated lymphoid tissue (GALT) play a key role for induction of the mucosal immune response to these microbes1, 2. To initiate the mucosal immune response, the mucosal antigens must be transported from the gut lumen across the epithelial barrier into organized lymphoid follicles such as Peyer's patches. This antigen transcytosis is mediated by specialized epithelial M cells3, 4. M cells are atypical epithelial cells that actively phagocytose macromolecules and microbes. Unlike dendritic cells (DCs) and macrophages, which target antigens to lysosomes for degradation, M cells mainly transcytose the internalized antigens. This vigorous macromolecular transcytosis through M cells delivers antigen to the underlying organized lymphoid follicles and is believed to be essential for initiating antigen-specific mucosal immune responses. However, the molecular mechanisms promoting this antigen uptake by M cells are largely unknown. We have previously reported that glycoprotein 2 (Gp2), specifically expressed on the apical plasma membrane of M cells among enterocytes, serves as a transcytotic receptor for a subset of commensal and pathogenic enterobacteria, including Escherichia coli and Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium), by recognizing FimH, a component of type I pili on the bacterial outer membrane 5. Here, we present a method for the application of a mouse Peyer's patch intestinal loop assay to evaluate bacterial uptake by M cells. This method is an improved version of the mouse intestinal loop assay previously described 6, 7. The improved points are as follows: 1. Isoflurane was used as an anesthetic agent. 2. Approximately 1 cm ligated intestinal loop including Peyer's patch was set up. 3. Bacteria taken up by M cells were fluorescently labeled by fluorescence labeling reagent or by overexpressing fluorescent protein such as green fluorescent protein (GFP). 4. M cells in the follicle-associated epithelium covering Peyer's patch were detected by whole-mount immunostainig with anti Gp2 antibody. 5. Fluorescent bacterial transcytosis by M cells were observed by confocal microscopic analysis. The mouse Peyer's patch intestinal loop assay could supply the answer what kind of commensal or pathogenic bacteria transcytosed by M cells, and may lead us to understand the molecular mechanism of how to stimulate mucosal immune system through M cells.

Application of a Mouse Ligated Peyer&#8217;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

M cells in a specialized follicle-associated epithelium covering Peyer&#x2019;s patches play an important role for the mucosal immunosurveillance in gut-associated lymphoid tissue. Here we described the evaluation method for bacterial transcytosis by M cells in vivo. This method provides a method to understand M-cell function in the immune system.

Fare Uygulama M hücreleri tarafından Bakteriyel Alımı değerlendirin Peyer Patch Bağırsak Loop Testi bağlandı

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Determination of Tolerable Fatty Acids and Cholera Toxin Concentrations Using Human Intestinal Epithelial Cells and BALB/c Mouse Macrophages

The positive role of fatty acids in the prevention and alleviation of non-human and human diseases have been and continue to be extensively documented. These roles include influences on infectious and non-infectious diseases including prevention of inflammation as well as mucosal immunity to infectious diseases. Cholera is an acute intestinal illness caused by the bacterium Vibrio cholerae. It occurs in developing nations and if left untreated, can result in death. While vaccines for cholera exist, they are not always effective and other preventative methods are needed. We set out to determine tolerable concentrations of three fatty acids (oleic, linoleic and linolenic acids) and cholera toxin using mouse BALB/C macrophages and human intestinal epithelial cells, respectively. We solubilized the above fatty acids and used cell proliferation assays to determine the concentration ranges and specific concentrations of the fatty acids that are not detrimental to human intestinal epithelial cell viability. We solubilized cholera toxin and used it in an assay to determine the concentration ranges and specific concentrations of cholera toxin that do not statistically decrease cell viability in BALB/C macrophages. 
We found the optimum fatty acid concentrations to be between 1-5 ng/&mu;l, and that for cholera toxin to be &lt; 30 ng per treatment. This data may aid future studies that aim to find a protective mucosal role for fatty acids in prevention or alleviation of cholera infections.

We set out to determine tolerable concentrations of three fatty acids (oleic, linoleic and linolenic acids) and cholera toxin that did not significantly and adversely affect cell survival by solubilizing the fatty acids and the toxin and using them in cell survival assays.

İnsan Bağırsak Epitel Hücreleri ve BALB / c Fare makrofajlar kullanarak Tolere edilebilir yağ asitleri ve Kolera Toksin Konsantrasyonları belirlenmesi

The positive role of fatty acids in the prevention and alleviation of non-human and  human diseases have been and continue to be extensively documented. ...

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to the infiltration of tissues with migrating inflammatory cells, primarily neutrophils.&#160;This process has the potential to be destructive to tissues if excessive or held in an unresolved state.&#160; Cocultured in vitro models can be utilized to study the unique molecular mechanisms involved in pathogen induced neutrophil trans-epithelial migration.&#160;This type of model provides versatility in experimental design with opportunity for controlled manipulation of the pathogen, epithelial barrier, or neutrophil.&#160;Pathogenic infection of the apical surface of polarized epithelial monolayers grown on permeable transwell filters instigates physiologically relevant basolateral to apical trans-epithelial migration of neutrophils applied to the basolateral surface.&#160;The in vitro model described herein demonstrates the multiple steps necessary for demonstrating neutrophil migration across a polarized lung epithelial monolayer that has been infected with pathogenic P. aeruginosa (PAO1).&#160;Seeding and culturing of permeable transwells with human derived lung epithelial cells is described, along with isolation of neutrophils from whole human blood and culturing of PAO1 and nonpathogenic K12 E. coli (MC1000).&#160; The emigrational process and quantitative analysis of successfully migrated neutrophils that have been mobilized in response to pathogenic infection is shown with representative data, including positive and negative controls.&#160;This in vitro model system can be manipulated and applied to other mucosal surfaces.&#160;Inflammatory responses that involve excessive neutrophil infiltration can be destructive to host tissues and can occur in the absence of pathogenic infections.&#160;A better understanding of the molecular mechanisms that promote neutrophil trans-epithelial migration through experimental manipulation of the in vitro coculture assay system described herein has significant potential to identify novel therapeutic targets for a range of mucosal infectious as well as inflammatory diseases.

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Neutrophil trans-epithelial migration in response to mucosal bacterial infection contributes to epithelial injury and clinical disease.&#160;An in vitro model has been developed that combines pathogen, human neutrophils, and polarized human epithelial cell layers grown on transwell filters to facilitate investigations towards unraveling the molecular mechanisms orchestrating this phenomenon.

Tüp bebek Patojen Kaynaklı Nötrofil Trans-epitel Göçünü Değerlendirmek için Coculture Tahlili

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple stages of T cell development: T cell commitment, positive selection and negative selection. However, the function of TECs in the thymus remains incompletely understood. In the article, we provide a method to isolate TEC subsets from fresh mouse thymus using a combination of mechanical disruption and enzymatic digestion. The method allows thymic stromal cells and thymocytes to be efficiently released from cell-cell and cell-extracellular matrix connections and to form a single-cell suspension. Using the isolated cells, multiparameter flow cytometry can be applied to identification and characterization of TECs and dendritic cells. Because TECs are a rare cell population in the thymus, we also describe an effective way to enrich and purify TECs by depleting thymocytes, the most abundant cell type in the thymus. Following the enrichment, cell sorting time can be decreased so that loss of cell viability can be minimized during purification of TECs. Purified cells are suitable for various downstream analyses like Real Time-PCR, Western blot and gene expression profiling. The protocol will promote research of TEC function and as well as the development of in vitro T cell reconstitution.

Here we describe an efficient method for isolation, identification, and purification of mouse thymic epithelial cells (TECs). The protocol can be utilized for studies of thymus function for normal T cell development, thymus dysfunction, and T cell reconstitution.

İzolasyon, tanımlama ve Murin Thymic Epitel Hücreleri saflaştırılması

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised patients, the elderly, and pregnant women. The most common manifestations of listeriosis in humans include meningitis, encephalitis, and fetal abortion. A significant but much less documented sequelae of invasive L. monocytogenes infection involves the heart. The death rate from cardiac illness can be up to 35% despite treatment, however very little is known regarding L. monocytogenes colonization of cardiac tissue and its resultant pathologies. In addition, it has recently become apparent that subpopulations of L. monocytogenes have an enhanced capacity to invade and grow within cardiac tissue. This protocol describes in detail in vitro and in vivo methods that can be used for assessing cardiotropism of L. monocytogenes isolates. Methods are presented for the infection of H9c2 rat cardiac myoblasts in tissue culture as well as for the determination of bacterial colonization of the hearts of infected mice. These methods are useful not only for identifying strains with the potential to colonize cardiac tissue in infected animals, but may also facilitate the identification of bacterial gene products that serve to enhance cardiac cell invasion and/or drive changes in heart pathology. These methods also provide for the direct comparison of cardiotropism between multiple L. monocytogenes strains.

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes causes fetal infections in pregnant women and meningitis in susceptible populations. Subpopulations of bacteria can colonize cardiac tissue, causing myocarditis in patients and laboratory animals. Here we present a protocol that describes how to assess L. monocytogenes cardiac cell invasion in vitro and cardiac colonization in infected animals.

Listeria monocytogenes Kullanarak Enfekte Farelerde Kültür ve Kalp Kolonizasyonunda Kardiyak Hücrelerin Bakteriyel İstilasının Değerlendirilmesi

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

Immunofluorescence Analysis of Stress Granule Formation After Bacterial Challenge of Mammalian Cells

Fluorescent imaging of cellular components is an effective tool to investigate host-pathogen interactions. Pathogens can affect many different features of infected cells, including organelle ultrastructure, cytoskeletal network organization, as well as cellular processes such as Stress Granule (SG) formation. The characterization of how pathogens subvert host processes is an important and integral part of the field of pathogenesis. While variable phenotypes may be readily visible, the precise analysis of the qualitative and quantitative differences in the cellular structures induced by pathogen challenge is essential for defining statistically significant differences between experimental and control samples. SG formation is an evolutionarily conserved stress response that leads to antiviral responses and has long been investigated using viral infections1. SG formation also affects signaling cascades and may have other still unknown consequences2. The characterization of this stress response to pathogens other than viruses, such as bacterial pathogens, is currently an emerging area of research3. For now, quantitative and qualitative analysis of SG formation is not yet routinely used, even in the viral systems. Here we describe a simple method for inducing and characterizing SG formation in uninfected cells and in cells infected with a cytosolic bacterial pathogen, which affects the formation of SGs in response to various exogenous stresses. Analysis of SG formation and composition is achieved by using a number of different SG markers and the spot detector plug-in of ICY, an open source image analysis tool.

We describe a method for the qualitative and quantitative analysis of stress granule formation in mammalian cells after the cells are challenged with bacteria and a number of different stresses. This protocol can be applied to investigate the cellular stress granule response in a wide range of host-bacterial interactions.

Memeli Hücrelerinin Bakteri Mücadelesinden Sonra Stres Granül Oluşumunun İmmünofloresan Analizi

Fluorescent imaging of cellular components is an effective tool to investigate host-pathogen interactions. Pathogens can affect many different features of ...