وقد تم تمويل هذه الدراسة من المنح التي منحت لRLM من المجلس الوطني للصحة والبحوث الطبية في استراليا (منحة # 606658).

1. الثقافة الخلية (3-7 أيام قبل الجمعية BBB) 1.1. الأولية خلايا الدماغ البشري البطانية الاوعية الدموية الدقيقة (BECS) تم الحصول عليها تجاريا BECS. تم إنتاج الخلايا عن طريق التفكك dispase من الأنسجة الطبيعية قشرة الدماغ البشري، وقدمت المجمدة في مرور 3 (&lt;12 الأضعاف السكان). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التحتية: السفن معطف الأنسجة الثقافة مع &quot;عامل مرفق&quot; وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صيانة الخلية: الحفاظ على BECS في المحتوية على مصل المتوسطة كاملة. للتجريب والثقافة في BECS كاملة خالية من مصل المتوسطة. الحفاظ على خلايا في ترطيب 5٪ CO 2، 21٪ O 2 حاضنة عند 37 درجة مئوية ملاحظة: كبديل لالكواشف المتخصصة، 0.1٪ (ث / ت) حل الجيلاتين يمكن أن تكون بمثابة كاشف طلاء حين تستكمل مع 15 ملي DMEM/F-12 HEPES، 10٪ (V / V) مصل العجل الجنين (FCS)، 2 مم L-الجلوتامين، 50 ميكروغرام/ مل جنتاميسين، 20 ميكروغرام / مل الهيبارين و 20 ميكروغرام / مل الخلايا البطانية تكملة النمو يمكن استخدامها لصيانة BEC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> زراعة الفرعية للتجريب: BECS متموجة سبليت بنسبة 1:03 حتي 1:06، اعتمادا على الوقت المقصود للاستخدام المقبل (3-7 أيام). تغيير متوسطة صيانة كل 3 أيام. استخدام BECS تصل إلى 15 الممرات. </li></ol> 1.2. SVG الإنسان الجنين Astroglial الخط الخلوي SVG خلايا الجنين astroglial الإنسان 22 ومستمدة في الأصل من الثقافات الأولية من دماغ الجنين البشري يتحول مع تكرار نقص القردي فيروس 40. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الصيانة: خلايا الثقافة SVG في الحد الأدنى المتوسطة الأساسية مع محلول ملحي متوازن ايرل تستكمل مع 20٪ (V / V) FCS (نسبة المصل نفسها المستخدمة للحفاظ على الخلايا الأبوية الأولية 22)، 2 مم L-الجلوتامين، 50 U / البنسلين مل و 50 ميكروغرام / مل الستربتوميسين. الحفاظ على خلايا في ترطيب 5٪ CO 2، 21٪ O 2 </الفرعية&gt; حاضنة عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> زراعة الفرعية للتجريب: SVGs متموجة سبليت بنسبة 1:05 حتي 1:10، اعتمادا على الوقت المقصود للاستخدام المقبل (3-7 أيام). ليس مطلوبا إزالة التربسين نظرا لنسبة عالية من المصل في المتوسط. تغيير المتوسطة كل 3 أيام. استخدام ما يصل إلى 20 SVGs الممرات. </li></ol> 2. التجمع وCoculturing من الإنسان في المختبر النموذجي BBB (يوم 0) التعليق: تم إعداد الإنسان في المختبر نموذج الاتصال BBB وفقا لبروتوكولات نشرت 13،23، مع بعض التعديلات. 2.1. طلاء إدراجات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع إدراج الأنسجة ثقافة (6.5 ملم في القطر مع البوليستر غشاء يسهل اختراقها، 3 ميكرون مسام الحجم) في الآبار لتزويد 24 لوحة جيدا. معطف السطح اللمعية من إدراج <s> </s> بين عشية وضحاها في ترطيب الحاضنة 37 درجة مئوية مع الفئران الكولاجين الأول (20 ميكروغرام / سم 2، و 50 ميكرولتر من 132 ميكروغرام/ مل الكولاجين أنا في حامض الخليك 0.02٪ في المياه الملة، س (MQH 2 O)). غسل إدراج مرة واحدة (سواء من الجانب مجافي اللمعة واللمعية) مع MQH 2 O لإزالة حمض المتبقية. ملاحظة: قبو غشاء الشعيرات الدموية في الدماغ لا يحتوي على الكولاجين أنا ولكن أساسا laminins، الإسوية نوع الكولاجين الرابع، nidogens، والبروتيوغليكان كبريتات heparan 9. لهذا السبب، فإن بعض الباحثين الاستفادة من وكلاء طلاء مثل الكولاجين الرابع، فبرونيكتين 13، أو Matrigel (العلوم البيولوجية دينار بحريني) 16 لBBB النمذجة أكثر واقعية. </li></ol> 2.2. SVGs البذر على الجانب السفلي (مجافي اللمعة) غشاء السطح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عكس إدراج وتناسب بلطف حول حافة الغشاء المسامي قطعة قصيرة من مرونة أنابيب السيليكون (&quot;الأنابيب الخارجية&quot;؛ ~ 10 مم طويل، 8 ملم القطر الداخلي و 1.6 مم الجدار)، وخلق أساسا الجديدة أعلى بكثير من سطح مجافي اللمعة (الشكل 2A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الجانب السفلي من إدراج نيس إلى أن تكون مختومة لتجنب تسرب سائل الإعلام. الأولى، إعداد المكونات (الشكل 2A و 2B) مصنوعة من أنابيب السيليكون (وهو ما يسمى &quot;أنابيب داخلية&quot;؛ ~ 8 ملم طويلة، 3.2 مم القطر الداخلي و 1.6 مم الجدار؛ الشكل 2B)، مختومة في نهاية واحدة مع البلاستيك ختم مخروط (~ 3mm من طويلة؛ أعده قطع الجزء السفلي من سلسلة من ردود الفعل 0.2 مل البلمرة (PCR) أنبوب؛ الشكل 2B)، وهذا المخروط الأختام ليس فقط لمعة الأنابيب الداخلية، ولكن أيضا يوسع حافته لتركيب أكثر تشددا في إدراج. المقبل، وذلك باستخدام ملقط معقم، تضاف المكونات سيليكون في تجويف اللمعية وتقدم عليه حتى تصل إلى ما يصل إلى 1-2 مم ~ من الغشاء (الشكل 2A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المقبل، البذور 4 × 10 4 خلايا SVG في 200 ميكرولتر SVG الصيانة المتوسطة (حد ذاتهاكشن 1.2.2 أعلاه) مباشرة في سيليكون أعلى بكثير من سطح الغشاء مجافي اللمعة (الشكل 2A). تسمح SVGs الالتزام لمدة لا تقل عن 4 ساعة في الحاضنة. ملاحظة: للحفاظ على العقم نقل إدراج تجميعها في اثنين من بين 6 لوحات جيدة (لوحة واحدة مقلوب على الآخر؛ الشكل 2C) لتقليل التعرض للهواء غير المرشحة أثناء العملية. تغسل أنابيب السيليكون والمقابس في الإيثانول وتعقيمها لاستخدامها لاحقا. ملاحظة: استخدام المقابس (القسم 2.2.2) فقط من أجل إدراج مع مسام غشاء أحجام أكبر من 1 ميكرون. الأغشية مع قطر المسام ≤ 1 ميكرومتر نادرا ما تسرب وتتطلب سوى تركيب أنابيب السيليكون الخارجية (القسم 2.2.1). بالإضافة إلى ذلك، بعض وكلاء طلاء أخرى من الكولاجين الأول (انظر الملاحظة إلى القسم 2.1) قد منع التسرب حتى من خلال 3 ميكرون المسام. تحديد هذا تجريبيا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل رصد حالة تمسك الخلايا النجمية الخاص بك، البذور بالتوازي في96 جيدا وحدة تخزين متطابقة القياسية للخلايا نجمية التعليق. هذا جيد لديه مساحة نفس 6.5 ملم إدراج (0.33 سم 2) ويسمح التصور أسهل من الخلايا عن طريق التخلص من النقيض المجهر غشاء إدراج. عند مراقبة التقيد كافية من نجمية في السيطرة 96 جيدا، والخلايا النجمية انضمت كاف أيضا لغشاء إدراج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما الخلايا النجمية انضمت بما فيه الكفاية في السيطرة 96 جيدا، ونقل المجالس الإدراج إلى نسيج الثقافة هود (انظر الملاحظة أعلاه) وبلطف إزالة أنابيب السيليكون الخارجية والمقابس. العودة إلى إدراج العادي (أي تستقيم) التوجه إلى الآبار التي تحتوي على 800 ميكرولتر الموردة / جيد من BEC المتوسطة الصيانة (القسم 1.1.2 أعلاه). </li></ol> 2.3. البذر من BECS في غرفة اللمعية فوق النجمية البذور 2X10 4 BECS في 200 ميكرولتر على سطح اللمعية المغلفة الكولاجين وإعادة INSEالمحطة المذكورة في الحاضنة. 2.4. Coculturing Coculture يدرج SVG / BEC المصنف لمدة 3 أيام في BEC المتوسطة دون تغير وسائل الاعلام قبل التجريب. 3. التجريب مع نموذج BBB الإنسان (يوم 3) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحفيز الخلايا في المختبر BBB غسل الأولى عن طريق استبدال وسائل الإعلام ومجافي اللمعة اللمعية مع 600 ميكرولتر و 100 ميكرولتر من المصل خالية BECS المتوسطة، على التوالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح المتوسطة اللمعية مرة أخرى واستبدالها مع 100 ميكرولتر من المصل خالية المتوسطة مع عوامل محفزة. ملاحظة: إذا كان مطلوبا التحفيز للغرفة مجافي اللمعة (لتنشيط في المختبر BBB من المقصورة نجمي)، نضح المتوسطة مجافي اللمعة واستبدالها مع 600 من المجاهدين مصل المتوسطة الحرة مع تحفيز وكلاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختبار كل المجموعة التجريبية في ثلاث نسخ (وبالتالي، إذا تم تنفيذ التحفيز اللمعية، الأمر الذي يتطلب 3 × 100 ميكرولتر، نوصي تمييع إعادة<html> وكلاء لتركيزات النهائي في 350 ميكرولتر من المصل خالية المتوسطة لكل مجموعة للحد من الأخطاء pipetting لبين الآبار). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء paracellular القياسية و / أو فحوصات النفاذية العابر للخلايا من استشفاف المسمى 16،24 (لهذا الأخير نستخدم ثيوسيانات فلوريسئين (FITC)، مترافق الزلال) و / أو قياس طير 13،16،25 كما هو موضح سابقا. </li></ol> لحساب التقلبات في نفاذية خط الأساس بين التجارب، وتحليل التغيرات في النفاذية النسبية لإدراج المغلفة دون الخلايا (التي هي بمثابة مرجعية لنفاذية القصوى) وإلى المجموعة التي عولجت مركبة باستخدام الصيغة: نفاذية (٪ من حد أقصى) = ( قيمة نفاذية إدراج التجريبية - متوسط ​​قيمة نفاذية مجموعة مركبة) / (قيمة نفاذية إدراج فارغة - متوسط ​​قيمة نفاذية مجموعة المركبات) X 100. 4. التصور من خلايا الأغشية المسامية على الإقليم الشمالي &quot;&gt; تعليق: الخلايا غير ملوثين على الأغشية إدراج يصعب مراقبة من قبل الطوري أو تدخل الفرق النقيض (DIC) المجهري منذ غشاء غير شفاف تماما ويتداخل مع انتقال الضوء للتعامل مع هذه القضية وضعنا إجراءات تلطيخ مختلفة من الخلايا على. إدراج، والذي يعزز إلى حد كبير مظهر الخلية على الغشاء. عموما، وصمة عار على الأغشية إدراج في حين لا تزال تعلق على إدراج، في الآبار. يجب إزالة الأغشية فقط في نهاية الإجراء تلطيخ لأغراض التركيب. 4.1. الهيماتوكسيلين تلطيخ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح تدرج مع الثلج الباردة 4٪ (ث / ت) بارافورمالدهيد (PFA) في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS، 130 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 10 ملي نا 2 هبو 4، 10 ملم ناه 2 ص 4، ودرجة الحموضة 7.2) لمدة 20 دقيقة. يغسل مرة واحدة في برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غمر إدراج في حل الهيماتوكسيلين 0.1٪ ماير لمدة 2 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل بلطف إدراج مع ماء الصنبور (عن طريق غمر خصوصياتERT في دورق يحتوي على ماء الصنبور وpipetting بلطف المياه الزائدة خارج). نقل إدراج إلى حل سكوت ماء الصنبور (2 غرام / لتر NaHCO 3 و 20 جرام / لتر MgSO 4) ل~ 20 ثانية حتى يتطور اللون الأزرق المطلوب. غسل إدراج مرة أخرى مع ماء الصنبور (القسم 4.1.3). ويمكن إدخال ليوزين وصمة عار اختياري هنا عن طريق غمس إدراج في 1٪ محلول يوزين لمدة 10 ثانية تليها غسل ماء الصنبور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الهواء الجاف غشاء إدراج. باستخدام مشرط (قطع حول حافة الغشاء) إزالة الغشاء وتركيبها على شريحة زجاجية للتصوير مشرق الميدان ملاحظة: إذا تم استخدام دي-N-butylphthalateinxylene (DPX) تصاعد المتوسطة غسل إدراج مع الإيثانول بنسبة 100٪ تليها الزيلين قبل إزالة وتركيب الغشاء. </li></ol> 4.2. المسح الضوئي المجهر الإلكتروني (SEM) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح تدرج مع الثلج الباردة 4٪ (ث / ت) PFA في برنامج تلفزيوني لمدة 20min. يغسل ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد إصلاح الأغشية لمدة 30 دقيقة في 1٪ (ث / ت) رباعي أكسيد الأوزميوم في MQH 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل إدراج في الماء (القسم 4.1.3) ويذوى في تصاعد التدرج الايثانول (50٪، 70٪، 90٪ لمدة 5 دقائق لكل منهما، ثم 3X مع الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 10 دقيقة في الفاصل الزمني). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> علاج إدراج المجففة مع خليط من hexamethyldisilazane (HMDS): الإيثانول (1:2 ثم 2:01 لمدة 5 دقائق). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> علاج إدراج مع 100٪ HMDS لمدة 5 دقائق، والهواء الجاف وتخزينها في ظل ظروف المجفف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الغشاء باستخدام مشرط (قطع حول حافة الغشاء). دراسة الأغشية بواسطة المجهر الإلكتروني. </li></ol> 4.3. المناعي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح تدرج مع الثلج الباردة 4٪ (ث / ت) PFA في برنامج تلفزيوني لمدة 20 دقيقة، ويغسل مرة واحدة في المياه المالحة تريس مخزنة (TBS، و 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7.6، 154 ملي مول كلوريد الصوديوم، 0.22 ميكرون تصفية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء المناعية للخلايا على الغشاء إدراج كما هو موضح سابقا 26. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الغشاء باستخدام مشرط (قطع حول حافة الغشاء) وتركيبها على آغالشريحة معشوقة مع مضان المتوسطة المتزايدة. فحص الغشاء بواسطة المجهر الفلورسنت. </li></ol>

<ol>
	<li>Hawkins, B. T., Davis, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+barrier/neurovascular+unit+in+health+and+disease.">The blood-brain barrier/neurovascular unit in health and disease.</a> Pharmacol. Rev. 57, 173-185 (2005).</li><li>Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+the+blood-brain+barrier.">Structure and function of the blood-brain barrier.</a> Neurobiol. Dis. 37, 13-25 (2010).</li><li>Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+barrier+in+health+and+chronic+neurodegenerative+disorders.">The blood-brain barrier in health and chronic neurodegenerative disorders.</a> Neuron. 57, 178-201 (2008).</li><li>Vivien, D., Gauberti, M., Montagne, A., Defer, G., Touze, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+tissue+plasminogen+activator+on+the+neurovascular+unit:+from+clinical+data+to+experimental+evidence.">Impact of tissue plasminogen activator on the neurovascular unit: from clinical data to experimental evidence.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 31, 2119-2134 (2011).</li><li>Stewart, P. A., Wiley, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+nervous+tissue+induces+formation+of+blood-brain+barrier+characteristics+in+invading+endothelial+cells:+a+study+using+quail--chick+transplantation+chimeras.">Developing nervous tissue induces formation of blood-brain barrier characteristics in invading endothelial cells: a study using quail--chick transplantation chimeras.</a> Dev. Biol. 84, 183-192 (1981).</li><li>Janzer, R. C., Raff, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+induce+blood-brain+barrier+properties+in+endothelial+cells.">Astrocytes induce blood-brain barrier properties in endothelial cells.</a> Nature. 325, 253-257 (1987).</li><li>Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-endothelial+interactions+at+the+blood-brain+barrier.">Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier.</a> Nat. Rev. Neurosci. 7, 41-53 (2006).</li><li>Dalkara, T., Gursoy-Ozdemir, Y., Yemisci, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+microvascular+pericytes+in+health+and+disease.">Brain microvascular pericytes in health and disease.</a> Acta Neuropathol. 122, 1-9 (2011).</li><li>Engelhardt, B., Sorokin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+and+the+blood-cerebrospinal+fluid+barriers:+function+and+dysfunction.">The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction.</a> Semin. Immunopathol. 31, 497-511 (2009).</li><li>Girouard, H., Iadecola, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurovascular+coupling+in+the+normal+brain+and+in+hypertension,+stroke,+and+Alzheimer+disease.">Neurovascular coupling in the normal brain and in hypertension, stroke, and Alzheimer disease.</a> J. Appl. Physiol. 100, 328-335 (2006).</li><li>Deli, M. A., Abraham, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+studies+on+in+vitro+blood-brain+barrier+models:+physiology,+pathology,+and+pharmacology.">Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: physiology, pathology, and pharmacology.</a> Cell. Mol. Neurobiol. 25, 59-127 (2005).</li><li>Booth, R., Kim, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+microfluidic+in+vitro+model+of+the+blood-brain+barrier+(muBBB).">Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (muBBB).</a> Lab Chip. 12, 1784-1792 (2012).</li><li>Gaillard, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+functional+characterization+of+an+in+vitro+model+of+the+blood-brain+barrier,+comprising+a+co-culture+of+brain+capillary+endothelial+cells+and+astrocytes.">Establishment and functional characterization of an in vitro model of the blood-brain barrier, comprising a co-culture of brain capillary endothelial cells and astrocytes.</a> Eur. Pharm. Sci. 12, 215-222 (2001).</li><li>Hurwitz, A. A., Berman, J. W., Rashbaum, W. K., Lyman, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+fetal+astrocytes+induce+the+expression+of+blood-brain+barrier+specific+proteins+by+autologous+endothelial+cells.">Human fetal astrocytes induce the expression of blood-brain barrier specific proteins by autologous endothelial cells.</a> Brain Res. 625, 238-243 (1993).</li><li>Demeuse, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalized+coculture+of+rat+brain+endothelial+cells+and+astrocytes:+a+syngenic+model+to+study+the+blood-brain+barrier.">Compartmentalized coculture of rat brain endothelial cells and astrocytes: a syngenic model to study the blood-brain barrier.</a> J. Neurosci. Methods. 121, 21-31 (2002).</li><li>Coisne, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+syngenic+in+vitro+blood-brain+barrier+model:+a+new+tool+to+examine+inflammatory+events+in+cerebral+endothelium.">Mouse syngenic in vitro blood-brain barrier model: a new tool to examine inflammatory events in cerebral endothelium.</a> Lab. Invest. 85, 734-746 (2005).</li><li>Cohen-Kashi Malina, K., Cooper, I., Teichberg, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Closing+the+gap+between+the+in+vivo+and+in+vitro+blood-brain+barrier+tightness.">Closing the gap between the in vivo and in vitro blood-brain barrier tightness.</a> Brain Res. 1284, 12-21 (2009).</li><li>Kroll, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+the+blood-brain+barrier+by+glucocorticoids+and+the+cells+of+the+neurovascular+unit.">Control of the blood-brain barrier by glucocorticoids and the cells of the neurovascular unit.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 1165, 228-239 (2009).</li><li>Cucullo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalized+human+brain+endothelial+cells+and+flow-based+vascular+modeling:+a+marriage+of+convenience+for+rational+neurovascular+studies.">Immortalized human brain endothelial cells and flow-based vascular modeling: a marriage of convenience for rational neurovascular studies.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 28, 312-328 (2008).</li><li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+of+endothelial+and+astrocyte+cocultures:+in+vitro+blood-brain+barrier+models+for+drug+delivery+studies.">Permeability of endothelial and astrocyte cocultures: in vitro blood-brain barrier models for drug delivery studies.</a> Ann. Biomed. Eng. 38, 2499-2511 (2010).</li><li>Antonic, A., Sena, E., Donnan, G., Howells, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+In+Vitro+Models+of+Ischaemic+Stroke:+a+Test+Bed+for+Translation.">Human In Vitro Models of Ischaemic Stroke: a Test Bed for Translation.</a> Transl. Stroke Res. 3, 306-309 (2012).</li><li>Major, E. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+line+of+human+fetal+glial+cells+that+supports+JC+virus+multiplication.">Establishment of a line of human fetal glial cells that supports JC virus multiplication.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 1257-1261 (1985).</li><li>Eugenin, E. A., Berman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine-dependent+mechanisms+of+leukocyte+trafficking+across+a+model+of+the+blood-brain+barrier.">Chemokine-dependent mechanisms of leukocyte trafficking across a model of the blood-brain barrier.</a> Methods. 29, 351-361 (2003).</li><li>Dehouck, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+transfer+across+the+blood-brain+barrier:+correlation+between+in+vitro+and+in+vivo+models.">Drug transfer across the blood-brain barrier: correlation between in vitro and in vivo models.</a> J. Neurochem. 58, 1790-1797 (1992).</li><li>Perriere, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Puromycin-based+purification+of+rat+brain+capillary+endothelial+cell+cultures.+Effect+on+the+expression+of+blood-brain+barrier-specific+properties.">Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties.</a> J. Neurochem. 93, 279-289 (2005).</li><li>Niego, B., Samson, A. L., Petersen, K. U., Medcalf, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombin-induced+activation+of+astrocytes+in+mixed+rat+hippocampal+cultures+is+inhibited+by+soluble+thrombomodulin.">Thrombin-induced activation of astrocytes in mixed rat hippocampal cultures is inhibited by soluble thrombomodulin.</a> Brain Res. 1381, 38-51 (2011).</li><li>Ma, S. H., Lepak, L. A., Hussain, R. J., Shain, W., Shuler, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+endothelial+and+astrocyte+co-culture+model+of+the+blood-brain+barrier+utilizing+an+ultra-thin,+nanofabricated+silicon+nitride+membrane.">An endothelial and astrocyte co-culture model of the blood-brain barrier utilizing an ultra-thin, nanofabricated silicon nitride membrane.</a> Lab Chip. 5, 74-85 (2005).</li><li>Niego, B., Freeman, R., Puschmann, T. B., Turnley, A. M., Medcalf, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=t-PA-specific+modulation+of+a+human+BBB+model+involves+plasmin-mediated+activation+of+the+Rho-kinase+pathway+in+astrocytes.">t-PA-specific modulation of a human BBB model involves plasmin-mediated activation of the Rho-kinase pathway in astrocytes.</a> Blood. , (2012).</li><li>Deli, M. A., Abraham, C. S., Niwa, M., Falus, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N,N-diethyl-2-[4-(phenylmethyl)phenoxy]ethanamine+increases+the+permeability+of+primary+mouse+cerebral+endothelial+cell+monolayers.">N,N-diethyl-2-[4-(phenylmethyl)phenoxy]ethanamine increases the permeability of primary mouse cerebral endothelial cell monolayers.</a> Inflamm. Res. 52, 39-40 (2003).</li><li>Su, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+PDGF-CC+by+tissue+plasminogen+activator+impairs+blood-brain+barrier+integrity+during+ischemic+stroke.">Activation of PDGF-CC by tissue plasminogen activator impairs blood-brain barrier integrity during ischemic stroke.</a> Nat. Med. 14, 731-737 (2008).</li><li>Yepes, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-type+plasminogen+activator+induces+opening+of+the+blood-brain+barrier+via+the+LDL+receptor-related+protein.">Tissue-type plasminogen activator induces opening of the blood-brain barrier via the LDL receptor-related protein.</a> J. Clin. Invest. 112, 1533-1540 (2003).</li><li>Abu Fanne, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+permeability+and+tPA-mediated+neurotoxicity.">Blood-brain barrier permeability and tPA-mediated neurotoxicity.</a> Neuropharmacology. 58, 972-980 (1016).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipoprotein+receptor-mediated+induction+of+matrix+metalloproteinase+by+tissue+plasminogen+activator.">Lipoprotein receptor-mediated induction of matrix metalloproteinase by tissue plasminogen activator.</a> Nat. Med. 9, 1313-1317 (2003).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+hemorrhagic+transformation+after+tissue+plasminogen+activator+reperfusion+therapy+for+ischemic+stroke.">Mechanisms of hemorrhagic transformation after tissue plasminogen activator reperfusion therapy for ischemic stroke.</a> Stroke. 35, 2726-2730 (2004).</li><li>Donnan, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+better+use+of+thrombolytic+therapy+in+acute+ischemic+stroke.">How to make better use of thrombolytic therapy in acute ischemic stroke.</a> Nat. Rev. Neurol. 7, 400-409 (2011).</li><li>Acheampong, P., Ford, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacokinetics+of+alteplase+in+the+treatment+of+ischaemic+stroke.">Pharmacokinetics of alteplase in the treatment of ischaemic stroke.</a> Expert Opin. Drug Metab. Toxicol. 8, 271-281 (2012).</li><li>Derex, L., Nighoghossian, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracerebral+haemorrhage+after+thrombolysis+for+acute+ischaemic+stroke:+an+update.">Intracerebral haemorrhage after thrombolysis for acute ischaemic stroke: an update.</a> J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry. 79, 1093-1099 (2008).</li><li>Garber, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stroke+treatment--light+at+the+end+of+the+tunnel.">Stroke treatment--light at the end of the tunnel.</a> Nat. Biotechnol. 25, 838-840 (2007).</li><li>Liebeskind, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversing+Stroke+in+the+2010s.">Reversing Stroke in the 2010s.</a> Stroke. 40, 3156-3158 (2009).</li><li>Weksler, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier-specific+properties+of+a+human+adult+brain+endothelial+cell+line.">Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line.</a> FASEB J. 19, 1872-1874 (2005).</li><li>Song, L., Pachter, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+murine+brain+microvascular+endothelial+cells+that+maintain+expression+and+cytoskeletal+association+of+tight+junction-associated+proteins.">Culture of murine brain microvascular endothelial cells that maintain expression and cytoskeletal association of tight junction-associated proteins.</a> In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 39 (2003), 313-320 (2003).</li><li>Steiner, O., Coisne, C., Engelhardt, B., Lyck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+immortalized+bEnd5+and+primary+mouse+brain+microvascular+endothelial+cells+as+in+vitro+blood-brain+barrier+models+for+the+study+of+T+cell+extravasation.">Comparison of immortalized bEnd5 and primary mouse brain microvascular endothelial cells as in vitro blood-brain barrier models for the study of T cell extravasation.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 31, 315-327 (2011).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

الأبحاث الطبية في أمراض الدماغ يعاني صعوبة كبيرة متعدية. في مجال السكتة الدماغية الحادة، على سبيل المثال، العديد من الأدوية التي أظهرت وعدا كبيرا في النماذج الحيوانية فشلت في العيادة 38،39. أسباب هذه النتائج المخيبة للآمال متنوعة وتشمل الخيانة من أنظمة الاختبا?...

بي بي بي هي واجهة المتخصصة بين الدورة الدموية الطرفية والجهاز العصبي المركزي، والمسؤولة بشكل حاسم للحفاظ على الارقاء الدماغ. ويضم خلايا الدماغ متميزة البطانية الاوعية الدموية الدقيقة (BECS) والتي تتأثر وظيفيا من قبل عدد قليل من المكونات الخلوية وديكي (أدناه) لتشكيل بوابة ضيقة والحيوية في الدماغ. في ظل الظروف الفسيولوجية وBBB يقيد مرور خلايا الدم، مكونات البلازما والمواد الضارة، وكلها يمكن أن تكون أعصاب، إلى الدماغ. في موازاة ذلك، BBB يتبادل انتقائي الأيونات والمواد المغذية (الجلوكوز والأحماض الأمينية) الأساسية ومنتجات النفايات الأيضية بين الدماغ والدورة الدموية للحفاظ على البيئة بدقة 1،2 الدماغ. في السنوات الأخيرة هو أنه أصبح واضحا أن فشل BBB يحدث في مجموعة متنوعة من الأمراض المزمنة في المخ، مثل الأمراض العصبية أو ذات الصلة التهابات (مثل مرض الزهايمر وmultiplه التصلب، على التوالي) 3، وكذلك في الحالات الحادة مثل السكتة الدماغية 4. وبفعل خصائص فريدة من نوعها BBB من الخلايا البطانية في الدماغ (BECS) إلى حد كبير البيئة الدماغي على 5، وعلى وجه الخصوص من قبل الخلايا النجمية 6،7. هناك فهم متزايد بأن غيرها من أنواع الخلايا، مثل pericytes 8، الخلايا العصبية والخلايا الدبقية الصغيرة 1،3، فضلا عن الغشاء القاعدي 9، ودعم BECS وتشكل معا وحدة وظيفية تسمى &quot;وحدة وعائية عصبية&quot; (NVU) والتي في وقت واحد الأزواج العصبية مطالب الأيضية إلى الشعيرات الدموية التي تزود 10. إشراك BBB في حالات المرضية وراء العديد من المحاولات لتطوير في نماذج BBB المختبر للمساعدة في البحوث المتعلقة BBB-11،12. تهدف هذه النماذج إلى تقليد أقرب مكان ممكن في الجسم الحي خصائص BBB وفقا لمبدأ NVU. في المختبر </م&gt; نماذج BBB تعتمد عموما على أحادي الطبقة من BECS تشكيل ضيق تقاطع (أساسا من الأبقار 13، الإنسان 14، 15 الفئران، والماوس 16، والخنازير 17،18 أصول)، مثقف على غشاء يسهل اختراقها مع الخلايا النجمية دعم (على نطاق واسع مراجعتها من قبل ديلي وآخرون 2005 11). يمكن زراعتها الخلايا النجمية في ظروف عدم الاتصال على الجزء السفلي من نسيج الثقافة جيدا، وفصلها عن BECS (المزروعة على السطح العلوي للغشاء) من مستنبت بعد التواصل مع BECS عبر العوامل القابلة للذوبان 16. في نماذج أكثر تقدما والتي تشبه أفضل بنية التشريحية للBBB في الجسم الحي، تتم المحافظة على الخلايا النجمية في ظروف الاتصال ومثقف مباشرة على الجانب الآخر من الغشاء على مقربة من BECS 13،15،17 (الشكل 1). هذا التكوين يتيح الاتصال الجسدي بين BECS والخلايا النجمية، التي أنشئت عندما مشروع النجميةعملياتها من خلال غشاء يسهل اختراقها. الأهم من ذلك، لجهة اتصال وفيا لتحدث المسام ينبغي ≥ 1μm في القطر، ومنذ نهاية نجمي قدم لا يمكن أن تمر من خلال المسام أحجام أصغر (أي 0.4 ميكرون) 14،15. وخاصة، وأثبتت أنظمة الاتصال BBB في بعض الدراسات لتكون متفوقة على نظيراتها عدم الاتصال بهم بشأن مقاومتهم عبر البطانية الكهربائية (طير) والقيم نفاذية البطانية من مختلف استشفاف 13،17،18. وأضاف بعدا إضافيا من تدفق وسائل الاعلام مؤخرا في عدد من نماذج في المختبر BBB لتطبيق قوى القص إلى البطانة لمحاكاة أقرب من الأوعية الدموية في الدماغ 12،19. واحدة للتغلب على عقبة الفنية عند إنشاء نموذج الاتصال BBB هو البذر من الخلايا النجمية ضد الجاذبية على سطح مجافي اللمعة للغشاء يسهل اختراقها. البروتوكولات السابقة 13،20، حيث كانت المصنفة الخلايا النجمية ببساطة في قطرة من وسائل الاعلام على رأس من فيإدراج verted، سمحت مرات البذر قصيرة فقط (أي 10 دقيقة أو 13 ساعة 2 20) والتي تم العثور عليها في أيدينا غير كافية لمرفق الخلايا السليمة. باستخدام هذه الطريقة الأساسية، وهي فترة أطول مرفق نجمية يتطلب مراقبة مستمرة من قبل إدراج افتتاح متكررة من الحاضنة (يسبب تقلبات في درجة الحرارة، ودرجة الحموضة والرطوبة)، وأيضا عرضة للبذر الخلية متفاوتة بسبب تسرب سائل الإعلام من خلال المسام، وخاصة إذا يعملون المسام أكبر من 1 ميكرون. هنا، نحن تصف بروتوكول العامة لإعداد نموذج الاتصال BBB. ويشمل الإجراء لدينا طريقة بديلة لخلية البذر على إدراج المقلوب، الذي يتناول القيود المذكورة أعلاه. يسمح أسلوب الالتزام دون عائق من الخلايا النجمية على سطح غشاء مجافي اللمعة، في حاضنة معايرتها، لفترة ممتدة من الزمن. ونتيجة لذلك، يتم التوصل إلى بذر موحدة من الخلايا النجمية مما يزيد جودة حاجزويقلل من الاختلافات بين نفاذية القاعدية إدراج. مثل استخدام الخلايا البشرية من المهم للبحوث ذات الصلة الإنسان 21، علينا أن نظهر في هذه المقالة بالإضافة إلى استخدام محددة من تركيبة جديدة من BECS الإنسان الابتدائية وخلدت الخلايا النجمية الإنسان لإنشاء BBB نموذج الاتصال البشري مع قدرة عالية الإنتاجية الفرز . منذ عرض من الخلايا في أغشية مسامية يمكن أن يكون صعبا، ونحن أيضا تقنيات تلطيخ التفاصيل التي يمكن أن تساعد في تحديد نقطة التقاء ومورفولوجيا الخلايا على أغشية مسامية. أخيرا، ونحن مثالا كيف يمكن استخدام لدينا نموذج BBB الإنسان لدراسة تأثير الأنسجة من نوع منشط البلازمينوجين (ر-PA) - جلطة خرق انزيم التي هي بمثابة الخيار الوحيد لعلاج السكتة الدماغية الحادة - على BBB.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="863">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Attachment Factor</td>
			<td style="width:193px;">Cell-Systems Corporation</td>
			<td style="width:171px;">4Z0-210</td>
			<td style="width:243px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Brain microvascular endothelial cells (BECs), primary, human</td>
			<td style="width:193px;">Cell-Systems Corporation</td>
			<td style="width:171px;">ACBRI 376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Complete medium</td>
			<td style="width:193px;">Cell-Systems Corporation</td>
			<td style="width:171px;">4Z0-500</td>
			<td style="width:243px;">Supplemented with CSC JetFuel</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Complete serum-free medium</td>
			<td style="width:193px;">Cell-Systems Corporation</td>
			<td style="width:171px;">SF-4Z0-500</td>
			<td style="width:243px;">Supplemented with CSC RocketFue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">DMEM/F-12 with 15 mM HEPES</td>
			<td style="width:193px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:171px;">11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Endothelial cells growth supplement (from bovine origin)</td>
			<td style="width:193px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:171px;">E2759-15MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">External silicone tubing</td>
			<td style="width:193px;">Watson-Marlow</td>
			<td style="width:171px;">913.A080.016</td>
			<td style="width:243px;">Pumpsil brand, 8 mm internal diameter, 1.6 mm wall</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Foetal calf serum</td>
			<td style="width:193px;">Lonza</td>
			<td style="width:171px;">14-501F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Gentamycin sulfate</td>
			<td style="width:193px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:171px;">15750-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Heparin sodium</td>
			<td style="width:193px;">Pfizer</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:243px;">1,000 U/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Hexamethyldisilazane (HMDS)</td>
			<td style="width:193px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:171px;">H4875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Human brain microvascular endothelial cells</td>
			<td style="width:193px;">Cell-Systems Corporation</td>
			<td style="width:171px;">ACBRI 376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Internal silicone tubing</td>
			<td style="width:193px;">Watson-Marlow</td>
			<td style="width:171px;">913.A032.016</td>
			<td style="width:243px;">Pumpsil brand, 3.2 mm internal diameter, 1.6 mm wall</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:193px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:171px;">25030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Mayer&#8217;s hematoxylin solution</td>
			<td style="width:193px;">Amber Scientific</td>
			<td style="width:171px;">MH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Minimum essential medium with Earle&#8217;s balanced salt solution</td>
			<td style="width:193px;">HyClone Laboratories</td>
			<td style="width:171px;">SH30244.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:193px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:171px;">15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Rat collagen I</td>
			<td style="width:193px;">Trevigen</td>
			<td style="width:171px;">3440-100-01</td>
			<td style="width:243px;">Cultrex brand</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:257px;">Tissue culture inserts</td>
			<td style="width:193px;">Corning Life Sciences</td>
			<td style="width:171px;">3472</td>
			<td style="width:243px;">Transwell brand, 6.5 mm in diameter, with polyester porous membrane, 3 &#181;m pore-size</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improved method for the preparation of a human cell-based, contact model of the blood-brain barrier

وتضم حاجز الدم في الدماغ (BBB) ​​الشعيرات الدموية في الدماغ ولكن غير منفذة للتكيف التي تتحكم بإحكام البيئة الدماغ. وقد ضمنا فشل BBB في مسببات العديد من الأمراض في الدماغ، وخلق الحاجة إلى تنمية الموارد البشرية في نماذج BBB المختبر للمساعدة في البحوث ذات الصلة سريريا. من بين العديد من النماذج BBB صفها حتى الآن، وهو ثابت (بدون تدفق)، اتصل BBB النموذج، حيث يتم cocultured الخلايا النجمية والخلايا البطانية الدماغ (BECS) على طرفي نقيض من غشاء يسهل اختراقها، برزت تبسيط النظام حتى الآن لمحاكاة أصيلة BBB مع قدرة إنتاجية عالية الفرز. مع ذلك الجيل من هذا القبيل نموذج تحديات التقنية قليلة. هنا، نحن تصف بروتوكول لإعداد BBB نموذج الاتصال البشري باستخدام تركيبة جديدة من BECS الإنسان الأولية والخلايا النجمية الإنسان خلد. على وجه التحديد، ونحن من التفصيل طريقة مبتكرة لخلية البذر على إدراج مقلوب وكذلك تحديد INSERتقنيات تلطيخ ر ومثالا كيف نستخدم نموذجنا للبحوث المتعلقة BBB-.

من أجل إنشاء الإنسان، نموذج الاتصال BBB كان علينا أن زراعة SVGs وBECS على الأغشية التي يسهل اختراقها مع 3 ميكرون مسام الحجم، كما هو موضح للسماح بمرور نجمية نهاية القدمين للاتصال مع الخلايا البطانية 14،15،27،28. ويتضح تمثيل التخطيطي للنموذج الاتصال كاملة في الشكل 1</st...

Watch this Scientific Journal Video about Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier at JoVE.com

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

إنشاء نماذج الإنسان من حاجز الدم في الدماغ (BBB) ​​يمكن أن تستفيد من البحث في الظروف الدماغ المرتبطة فشل BBB. نحن هنا وصف تقنية محسنة لإعداد نموذج BBB الاتصال، والذي يسمح coculturing من الخلايا النجمية والخلايا البطانية الإنسان الدماغ على طرفي نقيض من غشاء يسهل اختراقها.

تحسين طريقة لإعداد القائم على الخليوي، الاتصال نموذج الإنسان من حاجز الدم في الدماغ

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

improved-method-for-preparation-human-cell-based-contact-model-blood

Research

JoVE Journal

Bioengineering

16.2K Views.  Monash University.  إنشاء نماذج الإنسان من حاجز الدم في الدماغ (BBB) ​​يمكن أن تستفيد من البحث في الظروف الدماغ المرتبطة فشل BBB. نحن هنا وصف تقنية محسنة لإعداد نموذج BBB الاتصال، والذي يسمح coculturing من الخلايا النجمية والخلايا البطانية الإنسان الدماغ على طرفي نقيض ...

Video: Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform to study protein-protein and protein-lipid interactions3, monitor drug delivery4,5, and encapsulation4. Phospholipids naturally create curved lipid bilayers, distinguishing itself from a micelle.6 Liposomes are traditionally classified by size and number of bilayers, i.e. large unilamellar vesicles (LUVs), small unilamellar vesicles (SUVs) and multilamellar vesicles (MLVs)7. In particular, the preparation of homogeneous liposomes of various sizes is important for studying membrane curvature that plays a vital role in cell signaling, endo- and exocytosis, membrane fusion, and protein trafficking8. Several groups analyze how proteins are used to modulate processes that involve membrane curvature and thus prepare liposomes of diameters &lt;100 - 400 nm to study their behavior on cell functions3. Others focus on liposome-drug encapsulation, studying liposomes as vehicles to carry and deliver a drug of interest9. Drug encapsulation can be achieved as reported during liposome formation9. Our extrusion step should not affect the encapsulated drug for two reasons, i.e. (1) drug encapsulation should be achieved prior to this step and (2) liposomes should retain their natural biophysical stability, securely carrying the drug in the aqueous core. These research goals further suggest the need for an optimized method to design stable sub-micron lipid vesicles.
Nonetheless, the current liposome preparation technologies (sonication10, freeze-and-thaw10, sedimentation) do not allow preparation of liposomes with highly curved surface (i.e. diameter &lt;100 nm) with high consistency and efficiency10,5, which limits the biophysical studies of an emerging field of membrane curvature sensing. Herein, we present a robust preparation method for a variety of biologically relevant liposomes.
Manual extrusion using gas-tight syringes and polycarbonate membranes10,5 is a common practice but heterogeneity is often observed when using pore sizes &lt;100 nm due to due to variability of manual pressure applied. We employed a constant pressure-controlled extrusion apparatus to prepare synthetic liposomes whose diameters range between 30 and 400 nm. Dynamic light scattering (DLS)10, electron microscopy11 and nanoparticle tracking analysis (NTA)12 were used to quantify the liposome sizes as described in our protocol, with commercial polystyrene (PS) beads used as a calibration standard. A near linear correlation was observed between the employed pore sizes and the experimentally determined liposomes, indicating high fidelity of our pressure-controlled liposome preparation method. Further, we have shown that this lipid vesicle preparation method is generally applicable, independent of various liposome sizes. Lastly, we have also demonstrated in a time course study that these prepared liposomes were stable for up to 16 hours. A representative nano-sized liposome preparation protocol is demonstrated below.

This protocol describes an extrusion method for preparing lipid vesicles of sub-micron sizes with a high degree of homogeneity. This method uses a pressure-controlled system with controlled nitrogen flow rates for liposome preparation. The lipid preparation1,2, liposome extrusion, and size characterization will be presented herein.

ثابت الطريقة النتوء الضغط التي تسيطر عليها لإعداد الحويصلات الدهن نانو الحجم

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform ...

An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. Clinically, this protein is widely used for cosmetic surgery, dermal injections, bone grafting, and reconstructive surgery. The sources of COL1 for these procedures are commonly nonhuman, which increases the potential for inflammation and rejection as well as xenobiotic disease transmission. In view of this, a method to efficiently and quickly purify COL1 from limited quantities of autologously-derived tissues would circumvent many of these issues; however, standard isolation protocols are lengthy and often require large quantities of collagenous tissues. Here, we demonstrate an efficient COL1 extraction method that reduces the time needed to isolate and purify this protein from about 10 days to less than 3 hr. We chose the dermis as our tissue source because of its availability during many surgical procedures. This method uses traditional extraction buffers combined with forceful agitation and centrifugal filtration to obtain highly-pure, soluble COL1 from small amounts of corium. Briefly, dermal biopsies are washed thoroughly in ice-cold dH2O after removing fat, connective tissue, and hair. The skin samples are stripped of noncollagenous proteins and polysaccharides using 0.5 M sodium acetate and a high speed bench-top homogenizer. Collagen from residual solids is subsequently extracted with a 0.075 M sodium citrate buffer using the homogenizer. These extracts are purified using 100,000 MW cut-off centrifugal filters that yield COL1 preparations of comparable or superior quality to commercial products or those obtained using traditional procedures. We anticipate this method will facilitate the utilization of autologously-derived COL1 for a multitude of research and clinical applications.

Traditional procedures for the isolation of soluble type 1 collagen (COL1) require about 10 days from start to finish because of lengthy buffer incubations and laborious resuspensions of fibrils. Here, we describe a means to purify COL1 from small dermal biopsies in less than 3 hr.

طريقة محسنة لإعداد النوع الأول الكولاجين من الجلد

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. ...

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., flasks or dishes). In fact, it is widely recognized that cells grown in flasks or dishes tend to de-differentiate and lose specialized features of the tissues from which they were derived. Currently, there are mainly two types of 3-D culture systems where the cells are seeded into scaffolds mimicking the native extracellular matrix (ECM): (a) static models and (b) models using bioreactors. The first breakthrough was the static 3-D models. 3-D models using bioreactors such as the rotating-wall-vessel (RWV) bioreactors are a more recent development. The original concept of the RWV bioreactors was developed at NASA&#39;s Johnson Space Center in the early 1990s and is believed to overcome the limitations of static models such as the development of hypoxic, necrotic cores. The RWV bioreactors might circumvent this problem by providing fluid dynamics that allow the efficient diffusion of nutrients and oxygen. These bioreactors consist of a rotator base that serves to support and rotate two different formats of culture vessels that differ by their aeration source type: (1) Slow Turning Lateral Vessels (STLVs) with a co-axial oxygenator in the center, or (2) High Aspect Ratio Vessels (HARVs) with oxygenation via a flat, silicone rubber gas transfer membrane. These vessels allow efficient gas transfer while avoiding bubble formation and consequent turbulence. These conditions result in laminar flow and minimal shear force that models reduced gravity (microgravity) inside the culture vessel. Here we describe the development of a multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa composed of an intestinal epithelial cell line and primary human lymphocytes, endothelial cells and fibroblasts cultured under microgravity provided by the RWV bioreactor.

Cells growing in a three-dimensional (3-D) environment represent a marked improvement over cell cultivation in 2-D environments (e.g., flasks or dishes). Here we describe the development of a multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa cultured under microgravity provided by rotating-wall-vessel (RWV) bioreactors.

تطوير عضوي نموذج متعددة الخلايا ثلاثي الأبعاد من الأمعاء الغشاء المخاطي الإنسان نمت في ظل الجاذبية

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...

In Vitro Permeation of FITC-loaded Ferritins Across a Rat Blood-brain Barrier: a Model to Study the Delivery of Nanoformulated Molecules

Brain microvascular endothelial cells, supported by pericytes and astrocytes endfeet, are responsible for the low permeation of large hydrosoluble drugs through the blood-brain barrier (BBB), causing difficulties for effective pharmacological therapies. In recent years, different strategies for promoting brain targeting have aimed to improve drug delivery and activity at this site, including innovative nanosystems for drug delivery across the BBB. In this context, an in vitro approach based on a simplified cellular model of the BBB provides a useful tool to investigate the effect of nanoformulations on the trans-BBB permeation of molecules. This study describes the development of a double-layer BBB, consisting of co-cultured commercially available primary rat brain microvascular endothelial cells and astrocytes. A multiparametric approach for the validation of the model, based on the measurement of the transendothelial electrical resistance and the apparent permeability of a high molecular weight dextran, is also described. As proof of concept for the employment of this BBB model to study the effect of different nanoformulations on the translocation of fluorescent molecules across the barrier, we describe the use of fluorescein isothiocyanate (FITC), loaded into ferritin nanoparticles. The ability of ferritins to improve the trans-BBB permeation of FITC was demonstrated by flux measurements and confocal microscopy analyses. The results suggest this is a useful system for validating nanosystems for delivery of drugs across the BBB.

In Vitro Permeation of FITC-loaded Ferritins Across a Rat Blood-brain Barrier: a Model to Study the Delivery of Nanoformulated Molecules

A method to establish an in vitro model of blood-brain barrier based on a co-culture of rat brain microvascular endothelial cells and astrocytes is described and validated. This system proved to be a valid tool to study the effect of nanoformulation on the trans-barrier permeation of fluorescent molecules.

في المختبر تخلل من Ferritins تحميل FITC-عبر الفأر حاجز الدم في الدماغ: نموذج لدراسة تسليم Nanoformulated الجزيئات

Brain microvascular endothelial cells, supported by pericytes and astrocytes endfeet, are responsible for the low permeation of large hydrosoluble drugs ...

Lucifer Yellow - A Robust Paracellular Permeability Marker in a Cell Model of the Human Blood-brain Barrier

The blood-brain barrier BBB consists of endothelial cells that form a barrier between the systemic circulation and the brain to prevent the exchange of non-essential ions and toxic substances. Tight junctions (TJ) effectively seal the paracellular space in the monolayers resulting in an intact barrier. This study describes a LY-based fluorescence assay that can be used to determine its apparent permeability coefficient (Papp) and in turn can be used to determine the kinetics of the formation of confluent monolayers and the resulting tight junction barrier integrity in hCMEC/D3 monolayers. We further demonstrate an additional utility of this assay to determine TJ functional integrity in transfected cells. Our data from the LY Papp assay shows that the hCMEC/D3 cells seeded in a transwell setup effectively limit LY paracellular transport 7 days-post culture. As an additional utility of the presented assay, we also demonstrate that the DNA nanoparticle transfection does not alter LY paracellular transport in hCMEC/D3 monolayers.

We present a fluorescence assay to demonstrate that Lucifer Yellow (LY) is a robust marker to determine the apparent paracellular permeability of hCMEC/D3 cell monolayers, an in vitro model of the human blood-brain barrier. We used this assay to determine the kinetics of a confluent monolayer formation in cultured hCMEC/D3 cells.

لوسيفر الأصفر - علامة نفاذية شبه خلوية قوية في نموذج خلية من حاجز الدم في الدماغ البشري

The blood-brain barrier BBB consists of endothelial cells that form a barrier between the systemic circulation and the brain to prevent the exchange of ...

Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and cancer biology. An in vitro cell culture assay is often used to learn about the contribution of different tryptophan catabolites in a disease mechanism and for testing therapeutic strategies. Cell culture medium that is rich in secreted metabolites and signaling molecules reflects the status of tryptophan metabolism and other cellular events. New protocols for the reliable quantification of multiple kynurenines in the complex cell culture medium are desired to allow for a reliable and quick analysis of multiple samples. This can be accomplished with liquid chromatography coupled with mass spectrometry. This powerful technique is employed in many clinical and research laboratories for the quantification of metabolites and can be used for measuring kynurenines.
Presented here is the use of liquid chromatography coupled with single quadrupole mass spectrometry (LC-SQ) for the simultaneous determination of four kynurenines, i.e., kynurenine, 3-hydroxykynurenine, 3-hydroxyanthranilic, and xanthurenic acid in the medium collected from in vitro cultured cancer cells. SQ detector is simple to use and less expensive compared to other mass spectrometers. In the SQ-MS analysis, multiple ions from the sample are generated and separated according to their specific mass-to-charge ratio (m/z), followed by the detection using a Single Ion Monitoring (SIM) mode.
This paper draws the attention on the advantages of the reported method and indicates some weak points. It is focused on critical elements of LC-SQ analysis including sample preparation along with chromatography and mass spectrometry analysis. The quality control, method calibration conditions and matrix effect issues are also discussed. We described a simple application of 3-nitrotyrosine as one analog standard for all target analytes. As confirmed by experiments with human ovary and breast cancer cells, the proposed LC-SQ method&#160;generates reliable results and can be further applied to other in vitro cellular models.

Described here is a protocol for the determination of four different tryptophan metabolites generated in the kynurenine pathway (kynurenine, 3-hydroxykynurenine, xanthurenic acid, 3-hydroxyanthranilic acid) in the medium collected from cancer cell cultures analyzed by liquid chromatography coupled with a single quadrupole mass spectrometry.

القياس الكمي المتزامن لـ Kynurenines المختارة التي تم تحليلها بواسطة الكروماتوغرافيا السائلة- القياس الطيفي الكتلي في المتوسط الذي تم جمعه من ثقافات الخلايا السرطانية

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and ...

Transplantation of a 3D Bioprinted Patch in a Murine Model of Myocardial Infarction

Testing regenerative properties of 3D bioprinted cardiac patches in vivo using murine models of heart failure via permanent left anterior descending (LAD) ligation is a challenging procedure and has a high mortality rate due to its nature. We developed a method to consistently transplant bioprinted patches of cells and hydrogels onto the epicardium of an infarcted mouse heart to test their regenerative properties in a robust and feasible way. First, a deeply anesthetized mouse is carefully intubated and ventilated. Following left lateral thoracotomy (surgical opening of the chest), the exposed LAD is permanently ligated and the bioprinted patch transplanted onto the epicardium. The mouse quickly recovers from the procedure after chest closure. The advantages of this robust and quick approach include a predicted 28-day mortality rate of up to 30% (lower than the 44% reported by other studies using a similar model of permanent LAD ligation in mice). Moreover, the approach described in this protocol is versatile and could be adapted to test bioprinted patches using different cell types or hydrogels where high numbers of animals are needed to optimally power studies. Overall, we present this as an advantageous approach which may change preclinical testing in future studies for the field of cardiac regeneration and tissue engineering.

This protocol aims to transplant a 3D bioprinted patch onto the epicardium of infarcted mice modeling heart failure. It includes details regarding anesthesia, the surgical chest opening, permanent ligation of the left anterior descending (LAD) coronary artery and application of a bioprinted patch onto the infarcted area of the heart.

زرع رقعة مطبوعة بيولوجية ثلاثية الأبعاد في نموذج مورين من احتشاء عضلة القلب

Testing regenerative properties of 3D bioprinted cardiac patches in vivo using murine models of heart failure via permanent left anterior descending (LAD) ...

طريقة حقن بطيئة طفيفة التوغل لتقليل إصابة الأنسجة

A Novel Cell Injection Method with Minimum Invasion

Directly injecting cells into tissues is a necessary process in cell administration and/or replacement therapy. The cell injection requires a sufficient amount of suspension solution to allow the cells to enter the tissue. The volume of the suspension solution affects the tissue, and this can cause major invasive injury as a result of the cell injection. This paper reports on a novel cell injection method, called slow injection, that aims to avoid this injury. However, pushing out the cells from the needle tip requires a sufficiently high injection speed according to Newton's law of shear force. To solve the above contradiction, a non-Newtonian fluid, such as gelatin solution, was used as the cell suspension solution in this work. Gelatins solution have temperature sensitivity, as their form changes from gel to sol at approximately 20 &#176;C. Therefore, to maintain the cell suspension solution in the gel form, the syringe was kept cooled in this protocol; however, once the solution was injected into the body, the body temperature converted it to a sol. The interstitial tissue fluid flow can absorb excess solution. In this work, the slow injection technique allowed cardiomyocyte balls to enter the host myocardium and engraft without surrounding fibrosis. This study employed a slow injection method to inject purified and ball-formed neonatal rat cardiomyocytes into a remote area of myocardial infarction in the adult rat heart. At 2 months following the injection, the hearts of the transplanted groups showed significantly improved contractile function. Furthermore, histological analyses of the slow-injected hearts revealed seamless connections between the host and graft cardiomyocytes via intercalated disks containing gap junction connections. This method could contribute to next-generation cell therapies, particularly in cardiac regenerative medicine.

تسليط الضوء على المؤلف: طريقة حقن خلية جديدة مع الحد الأدنى من الغزو  

This method eliminates any major invasion during cell injections caused by the cell suspension solution.

طريقة جديدة لحقن الخلايا مع الحد الأدنى من الغزو

Directly injecting cells into tissues is a necessary process in cell administration and/or replacement therapy. The cell injection requires a sufficient ...