Diese Studie wurde durch Zuschüsse aus dem National Health and Medical Research Council of Australia (Zuschuss # 606658) an RLM ausgezeichnet finanziert.

1. Cell Culture (3-7 Tage vor BBB Versammlung) 1.1. Primary Human Brain mikrovaskulären Endothelzellen (BEK) BECs wurden im Handel erhalten. Die Zellen wurden durch Dispase Dissoziation von normalen menschlichen Hirnrinde Gewebe hergestellt und bereitgestellt bei Passage 3 (&lt;12 Populationsverdopplungen) eingefroren. <ol><li> Substrat: Mantel Gewebekulturgefäße mit &quot;Anhang Factor&quot; nach den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Zellenpflege: Pflegen BECs in serumhaltigem Vollmedium. Für Experimente, die Kultur in BECs komplette Serum-freien Medium. Aufrechterhaltung der Zellen in einer befeuchteten 5% CO 2, 21% O 2-Inkubator bei 37 ° C Hinweis: Als Alternative zu Spezialreagenzien, 0,1% (w / v) Gelatine-Lösung kann als eine Beschichtung Reagenz dienen, während DMEM/F-12, supplementiert mit 15 mM HEPES, 10% (v / v) fötalem Kälberserum (FCS), 2 mM L-Glutamin, 50 ug/ Ml Gentamycin, 20 ug / ml Heparin und 20 ug / ml Endothelzellen Wachstumsergänzung für BEC Wartung verwendet werden. </li><li> Subkultivierung für Experimente: Split konfluenten BECs in einem Verhältnis von 1:3 bis 1:6, je nach der vorgesehenen Zeit für die nächste Nutzung (3-7 Tage). Ändern Sie den Erhaltungsmedium alle 3 Tage. Verwenden BECs bis zu 15 Passagen. </li></ol> 1.2. SVG menschlichen fetalen Zellen Astroglia-line SVG menschlichen fetalen Zellen Astroglia-22 wurden ursprünglich aus Primärkulturen von menschlichen fetalen Gehirns mit replikationsdefizient Simian Virus 40 umgewandelt abgeleitet. <ol><li> Wartungs: Kultur SVG Zellen in Minimalmedium mit Earle-balancierter Salzlösung mit 20% (v / v) FCS (gleiche Serumprozent zur Elternprimärzellen 22 zu halten), 2 mM L-Glutamin, 50 U / ml Penicillin und ergänzt 50 ug / ml Streptomycin. Aufrechterhaltung der Zellen in einer befeuchteten 5% CO 2, 21% O 2 </sub&gt; Brutschrank bei 37 ° C. </li><li> Subkultivierung für Experimente: Split konfluenten SVG in einem Verhältnis von 1:5 bis 1:10, abhängig von der beabsichtigten Verwendung für das nächste Mal (3-7 Tage). Entfernung von Trypsin ist nicht durch den hohen Gehalt an Serum im Medium erforderlich. Ändern Sie das Medium alle 3 Tage. Verwenden Sie SVG-Dateien bis zu 20 Passagen. </li></ol> 2. Montage-und Co-Kultivierung der menschlichen In-vitro-Modell BBB (Tag 0) Kommentar: Der Mensch in vitro Kontakt BBB Modell ist nach den veröffentlichten Protokollen 13,23 vorbereitet, mit Modifikationen. 2.1. Beschichtung von Inserts <ol><li> Platzieren Gewebekultureinsätze (6,5 mm Durchmesser, mit Polyester poröse Membran, 3 &amp;mgr; m Porengrße) in die Vertiefungen der zugeführten 24-Well-Platte. Beschichtung der Lumenoberfläche der Einsätze <s> </s> über Nacht in einer feuchten 37 º C-Inkubator mit Ratten-Kollagen I (20 &amp;mgr; g / cm 2, 50 &amp;mgr; l 132 &amp;mgr; g/ Ml Kollagen I in 0,02% Essigsäure in Milli-Q-Wasser (MQH 2 O)). Einmal zu waschen die Einsätze (beide von der abluminalen und luminalen Seite) mit MQH 2 O, um die restliche Säure zu entfernen. Hinweis: Basalmembran der Kapillaren des Gehirns enthält keine Kollagen I, sondern vor allem Lamininen, Kollagen Typ IV-Isoformen, Nidogene und Heparansulfatproteoglycanen 9. Aus diesem Grund verwenden einige Forscher Beschichtungsmittel wie Collagen IV, Fibronectin 13 oder Matrigel (BD Biosciences) 16 für eine authentische BBB Modellierung. </li></ol> 2.2. Seeding SVG auf der Unterseite (abluminale) Membranfläche <ol><li> Kehren Sie die Einsatz und sanft passen rund um den Rand der porösen Membran ein kurzes Stück elastischen Silikonschlauch (&quot;externe Schläuche&quot;, ~ 10 mm lang, 8 mm Innendurchmesser, 1,6 mm Wand), im Wesentlichen die Schaffung eines neuen deutlich über der Oberfläche abluminale (Fig. 2A). </li><li> Die Unterseite des Einsatzes geb.ds abzudichtenden Medien Auslaufen zu verhindern. Zuerst bereiten einen Stecker (2A und 2B) aus einem Silikonschlauch (&quot;innere Schlauch&quot; bezeichnet; ~ 8 mm lang, 3,2 mm Innendurchmesser, 1,6 mm Wand; 2B) gemacht, an einem Ende mit einem Kunststoffdichtkegel versiegelt (~ 3 mm lang; vorbereitet, indem die Unterseite einer 0,2 ml-Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-Rohr; 2B). Dieser Kegel dichtet nicht nur die internen Rohr Lumen, sondern auch erweitert seine Kante für engere Fitting in den Einsatz. Danach wird unter Verwendung einer sterilen Pinzette, legen Sie die Silikon-Stecker in die Lumenhöhle und voraus, bis es up-to ~ 1-2 mm von der Membran (2A) erreicht. </li><li> Nächstes Saatgut 4 x 10 4 SVG Zellen in 200 ul SVG Erhaltungsmedium (section 1.2.2) direkt in die Silikon deutlich über der abluminalen Membranoberfläche (2A). SVG ermöglichen, für mindestens 4 Stunden in den Inkubator zu haften. Hinweis: Zur Aufrechterhaltung der Sterilität transportieren die versammelten Einsätze zwischen zwei 6-Well-Platten (eine Platte über die andere umgekehrt, 2C), um die Exposition gegenüber ungefilterter Luft während des Verfahrens zu minimieren. Silikonschläuche und Stecker werden in Ethanol gewaschen und für eine spätere Verwendung autoklaviert. Hinweis: Verwenden Sie Stecker (Abschnitt 2.2.2) nur für Einsätze mit Membranporengrößen größer als 1 um. Membranen mit Porendurchmesser ≤ 1 um selten auslaufen und benötigen nur die Montage der externen Silikonschlauch (Abschnitt 2.2.1). Darüber hinaus sind einige andere als Beschichtungsmittel Kollagen I (siehe Anmerkung zu Abschnitt 2.1) kann auch durch Undichtigkeit 3 ​​um Poren zu verhindern. Bestimmen Sie diese empirisch. </li><li> Um die Einhaltung Zustand Ihrer Astrozyten zu überwachen, Saatgut parallel inein Standard-96-Well eine identische Volumen der Astrozyten-Zellsuspension. Dies hat auch den gleichen Oberflächenbereich wie der 6,5-mm-Einsatz (0,33 cm 2) und eine einfachere Visualisierung von Zellen, die durch Phasenkontrastmikroskopie als der Einsatz Membran. Wenn Sie ausreichende Haftung der Astrozyten in der Steuer beobachten 96-well, die Astrozyten haben ausreichend auch für den Einsatz Membran geklebt. </li><li> Wenn Astrozyten haben ausreichend in der Steuer 96-Loch geklebt, übertragen Sie die Einsatzanordnungen zu der Gewebekultur Haube (siehe Hinweis oben) und vorsichtig die äußere Silikonschlauch und Stecker entfernen. Zurück Einsätze in den normalen (also aufrecht)-Orientierung in den mitgelieferten Vertiefungen mit 800 ul / BEC Erhaltungsmedium (Abschnitt 1.1.2 oben). </li></ol> 2.3. Seeding von BECs in die Luminal Kammer über den Astrozyten Seed 2x10 4 BECs in 200 ul auf die Kollagen-beschichteten Lumenoberfläche und geben die inserts in den Brutschrank. 2.4. Co-Kultivierung Co-Kultur der SVG / BEC ausgesät Einsätze für 3 Tage im BEC-Medium ohne Medienwechsel vor dem Experiment. 3. Experimentieren mit dem Human BBB-Modell (Tag 3) <ol><li> Um die in vitro BBB ersten Wasch Zellen zu stimulieren, indem die luminalen und abluminalen Medium mit 600 &amp;mgr; l und 100 &amp;mgr; l serumfreien Medium BECs sind. </li><li> Saugen Sie den Lumen Medium wieder und ersetzen mit 100 ul Serum-freien Medium mit stimulierenden Substanzen. Hinweis: Wenn die Stimulation des abluminale Kammer erforderlich ist (um die in-vitro-BBB aus der Astrozyten Fach zu aktivieren) absaugen abluminale Medium und ersetzen mit 600 ul Serum-freiem Medium mit stimulierenden Substanzen. </li><li> Testen Sie jede Versuchsgruppe in dreifacher Ausfertigung (also wenn Lumen Stimulation durchgeführt, die 3 x 100 ul erfordert, empfehlen wir die Verdünnung der Wieder<html> Mittel, um ihre Endkonzentrationen in 350 &amp;mgr; l serumfreiem Medium pro Gruppe Pipettierfehlern zwischen den Wells zu minimieren). </li><li> Führen Standardparazellulären und / oder transzellulären Assays markierter Tracer 16,24 (bei ​​letzterem wir Fluorescein-Isothiocyanat (FITC)-konjugierten Albumin) und / oder die Messung der TEER 13,16,25, wie zuvor beschrieben. </li></ol> Um Schwankungen der Ausgangsdurchlässigkeit Konto zwischen Experimenten analysiert Änderungen in der Permeabilität relativ zu einem beschichteten Einsatzes ohne Zellen (die als Referenz für die maximale Durchlässigkeit dient) und der Träger-behandelten Gruppe mit der Formel: Durchlässigkeit (% max) = ( Durchlässigkeitswert von Versuchseinsatz - mittlere Permeabilität Wert der Fahrzeuggruppe) / (Durchlässigkeitswert des Rohlings Einsatz - mittlere Permeabilität Wert der Fahrzeuggruppe) X 100. 4. Visualisierung von Zellen auf porösen Membranen nt &quot;&gt; Kommentar: ungefärbte Zellen auf Einsatz Membranen sind schwer zu Phasenkontrast-oder Differentialinterferenzkontrast (DIC) Mikroskopie beobachten, da die Membran ist ziemlich undurchsichtig und stört Lichttransmission Um mit diesem Problem, das wir verschiedene Färbeverfahren von Zellen auf entwickelt umzugehen. Einsätze, die eine wesentlich bessere Zell Aussehen auf der Membran. Allgemeinen färben die Einlage Membranen während sie noch an dem Einsatz angebracht ist, in den Vertiefungen. Die Membranen erst am Ende des Färbeverfahrens zu Montagezwecken entfernt werden. 4.1. Hämatoxylin-Färbung <ol><li> Fix Einsätze mit eiskaltem 4% (w / v) Paraformaldehyd (PFA) in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS; 130 mM NaCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 10 mM NaH 2 PO 4, pH 7,2) für 20 min. Einmal in PBS waschen. </li><li> Tauchen Sie den Einsatz in 0,1% Mayers Hämatoxylin-Lösung für 2 min. </li><li> Vorsichtig waschen den Einsatz mit Leitungswasser (durch Eintauchen die Insin ein Becherglas mit Leitungswasser ert und vorsichtiges Pipettieren das überschüssige Wasser aus). Übertragen des Einsatzes an Scotts Leitungswasser-Lösung (2 g / l NaHCO 3, 20 g / l MgSO 4) für ~ 20 Sekunden, bis die gewünschte blaue Farbe entwickelt. Waschen Sie den Einsatz wieder mit Leitungswasser (Abschnitt 4.1.3). Eine optionale Eosin-Färbung kann dabei durch Eintauchen des Einsatzes in 1% Eosin-Lösung für 10 Sekunden, gefolgt von einer Leitungswasserwäsche eingebracht werden. </li><li> Luft trocknen den Einsatz Membran. Mit einem Skalpell (Schneid um den Membranrand) entfernen Sie die Membran und klebe sie auf einen Glasobjektträger für Hellfeldaufnahme Hinweis: Wenn di-N-butylphthalateinxylene (DPX) Montagemedium verwendet wird, waschen Sie den Einsatz mit 100% Ethanol, gefolgt von Xylol vor dem Entfernen und Montage der Membran. </li></ol> 4.2. Rasterelektronenmikroskop (SEM) <ol><li> Fix Einsätze mit eiskaltem 4% (w / v) PFA in PBS für 20min. Dreimal in PBS waschen. </li><li> Post fixieren die Membranen für 30 min in 1% (w / v) Osmiumtetroxid in MQH 2 O. </li><li> Waschen Einsätze in Wasser (Abschnitt 4.1.3) und entwässern in einer eskalierenden Ethanol-Gradienten (50%, 70%, 90% für jeweils 5 Minuten, dann 3x mit 100% Ethanol für 10 Minuten pro Intervall). </li><li> Behandlung von dehydrierten Einsätze mit einer Mischung aus Hexamethyldisilazan (HMDS): Ethanol (2:1 01.02 dann 5 min). </li><li> Gönnen Einsätze mit 100% HMDS für 5 min an der Luft trocknen und lagern unter Bedingungen trocknet. </li><li> Entfernen Sie die Membran mit einem Skalpell (Schneid um den Membranrand). Untersuchen Membranen durch Rasterelektronenmikroskopie. </li></ol> 4.3. Immunfluoreszenz <ol><li> Fix Einsätze mit eiskaltem 4% (w / v) PFA in PBS für 20 Minuten, einmal Waschen in Tris-gepufferter Salzlösung (TBS, 50 mM Tris-HCl pH 7,6, 154 mM NaCl, 0,22 um gefiltert). </li><li> Führen Immunfärbung der Zellen auf der Membraneinsatz 26, wie zuvor beschrieben. </li><li> Entfernen Sie die Membran mit einem Skalpell (Schneid um den Membranrand) und klebe sie auf aglass Schlitten mit Fluoreszenz-Eindeckmedium. Untersuchen Membran durch Fluoreszenzmikroskopie. </li></ol>

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Invest. 112, 1533-1540 (2003).</li><li>Abu Fanne, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+permeability+and+tPA-mediated+neurotoxicity.">Blood-brain barrier permeability and tPA-mediated neurotoxicity.</a> Neuropharmacology. 58, 972-980 (1016).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipoprotein+receptor-mediated+induction+of+matrix+metalloproteinase+by+tissue+plasminogen+activator.">Lipoprotein receptor-mediated induction of matrix metalloproteinase by tissue plasminogen activator.</a> Nat. Med. 9, 1313-1317 (2003).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+hemorrhagic+transformation+after+tissue+plasminogen+activator+reperfusion+therapy+for+ischemic+stroke.">Mechanisms of hemorrhagic transformation after tissue plasminogen activator reperfusion therapy for ischemic stroke.</a> Stroke. 35, 2726-2730 (2004).</li><li>Donnan, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+better+use+of+thrombolytic+therapy+in+acute+ischemic+stroke.">How to make better use of thrombolytic therapy in acute ischemic stroke.</a> Nat. Rev. Neurol. 7, 400-409 (2011).</li><li>Acheampong, P., Ford, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacokinetics+of+alteplase+in+the+treatment+of+ischaemic+stroke.">Pharmacokinetics of alteplase in the treatment of ischaemic stroke.</a> Expert Opin. Drug Metab. Toxicol. 8, 271-281 (2012).</li><li>Derex, L., Nighoghossian, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracerebral+haemorrhage+after+thrombolysis+for+acute+ischaemic+stroke:+an+update.">Intracerebral haemorrhage after thrombolysis for acute ischaemic stroke: an update.</a> J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry. 79, 1093-1099 (2008).</li><li>Garber, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stroke+treatment--light+at+the+end+of+the+tunnel.">Stroke treatment--light at the end of the tunnel.</a> Nat. Biotechnol. 25, 838-840 (2007).</li><li>Liebeskind, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversing+Stroke+in+the+2010s.">Reversing Stroke in the 2010s.</a> Stroke. 40, 3156-3158 (2009).</li><li>Weksler, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier-specific+properties+of+a+human+adult+brain+endothelial+cell+line.">Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line.</a> FASEB J. 19, 1872-1874 (2005).</li><li>Song, L., Pachter, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+murine+brain+microvascular+endothelial+cells+that+maintain+expression+and+cytoskeletal+association+of+tight+junction-associated+proteins.">Culture of murine brain microvascular endothelial cells that maintain expression and cytoskeletal association of tight junction-associated proteins.</a> In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 39 (2003), 313-320 (2003).</li><li>Steiner, O., Coisne, C., Engelhardt, B., Lyck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+immortalized+bEnd5+and+primary+mouse+brain+microvascular+endothelial+cells+as+in+vitro+blood-brain+barrier+models+for+the+study+of+T+cell+extravasation.">Comparison of immortalized bEnd5 and primary mouse brain microvascular endothelial cells as in vitro blood-brain barrier models for the study of T cell extravasation.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 31, 315-327 (2011).</li></ol>

Autoren haben nichts zu offenbaren.

Medizinische Forschung in Hirnerkrankungen leidet viel translationale Schwierigkeiten. Im Bereich des akuten ischämischen Schlaganfalls, zum Beispiel viele Medikamente, die große Verheißung in Tiermodellen zeigten, scheiterte an der Klinik 38,39. Die Gründe für diese enttäuschende Ergebnisse sind vielfältig und umfassen Untreue der präklinischen Testsysteme auf den menschlichen Schlaganfall-Szenario und Überbewertung der Ergebnisse aus Tierstudien, 21 erhalten. Eine Strategie, um den Vorhe...

Die BBB ist eine spezielle Schnittstelle zwischen der peripheren Durchblutung und des zentralen Nervensystems, entscheidend für die Aufrechterhaltung der Hämostase Gehirn verantwortlich. Es umfasst verschiedene Hirnmikrovaskulären Endothelzellen (BEK), die funktional durch wenige zellulären und zellfreien Komponenten (unten) beeinflusst werden, um eine enge und dynamische Gateway in das Gehirn bilden. Unter physiologischen Bedingungen ist die BBB schränkt den Durchtritt von Blutzellen, Plasmabestandteile und Schadstoffe, alle potentiell neurotoxische, in das Gehirn. Parallel dazu wird die BBB selektiv tauscht Schlüssel-Ionen und Nährstoffe (Glukose und Aminosäuren) und Stoffwechselabfallprodukte zwischen dem Gehirn und den Kreislauf, genau die Gehirnumgebung 1,2 zu halten. In den letzten Jahren ist es immer deutlicher, dass Versagen der BBB in einer Vielzahl von chronischen Hirnerkrankungen, wie z. B. neurodegenerative oder entzündungsbedingten Krankheiten (z. B. Alzheimer-Krankheit und tritt multiple Sklerose, beziehungsweise) 3, sowie bei akuten Erkrankungen wie Schlaganfall 4. Die einzigartigen Eigenschaften von BBB Hirnendothelzellen (BECs) sind weitgehend durch ihre Gehirnumgebung 5 induziert, insbesondere durch Astrozyten 6,7. Es gibt ein wachsendes Verständnis, dass andere Zelltypen, wie Perizyten 8, Nervenzellen und Mikroglia 1,3 sowie die Basalmembran 9, unterstützt BECs und bilden zusammen eine Funktionseinheit als der &quot;neurovaskuläre Einheit&quot; (NVU), die gleichzeitig Paare neuronalen Stoffwechselanforderungen, um ihre Versorgung Kapillaren 10. Die Beteiligung des BBB in pathologischen Situationen zugrunde zahlreiche Versuche, in-vitro-Modelle zu entwickeln, um BBB in BBB-Forschung 11,12 unterstützen. Diese Modelle versuchen, so nah wie möglich in vivo nachahmen BBB Eigenschaften nach der NVU-Prinzip. In-vitro- </em&gt; BBB-Modelle basieren im Allgemeinen auf einer Monolage von Tight-Junction-bildenden BECs (vor allem aus Rinder 13, Menschen 14, 15 Ratte, Maus 16, 17,18 und Schweine Herkunft), auf einer porösen Membran kultiviert zusammen mit unterstützenden Astrozyten (ausführlich bis zum Jahr 2005 11 Deli et al. prüft). Astrozyten in der berührungslosen Bedingungen auf dem Boden einer Gewebekulturvertiefung, von BECs (auf der oberen Oberfläche der Membran kultiviert) noch durch das Kulturmedium mit BECs Kommunikation über lösliche Faktoren 16 getrennt gehalten werden. In fortgeschritteneren Modelle, die besser ähneln die anatomische Struktur der BBB in vivo werden in Astrozyten Kontaktbedingungen und unmittelbar auf der gegenüberliegenden Seite der Membran in nächster Nähe zu BECs 13,15,17 (Fig. 1) kultiviert gehalten. Diese Konfiguration ermöglicht physischen Kontakt zwischen BEK und Astrozyten gegründet, als Astrozyten Projektihre Prozesse durch die poröse Membran. Wichtig ist, dass für einen echten Kontakt zu treten die Poren sollte 1 um im Durchmesser ≥ werden, da Astrozyten End-Füße können nicht durch kleinere Porengrößen (dh 0,4 um) 14,15 geben. Insbesondere werden Kontakt BBB Systeme in einigen Studien gezeigt, überlegen ihrer berührungsGegen hinsichtlich ihrer trans-endothelialen elektrische Widerstand (TEER) und endotheliale Permeabilität Werte verschiedener Tracer 13,17,18 sein. Eine zusätzliche Dimension der Medienfluss wurde kürzlich in einer Reihe von in vitro-Modellen BBB Scherkräfte am Endothel engere Simulation des Hirngefäßsystems gelten 12,19 aufgenommen. Ein technisches Hindernis bei der Erzeugung eines Kontakt BBB Modell zu überwinden, ist das Impfen von Astrozyten gegen die Schwerkraft auf der abluminalen Oberfläche der porösen Membran. Vorherige Protokolle 13,20, wo Astrozyten wurden einfach in einem Tropfen Medien nicht auf eine in ausgesätumgewandelt Einsatz, erlaubt nur kurze Aussaatzeiten (dh 10 min 13 oder 2 Std. 20), die in unseren Händen gefunden wurden, nicht ausreichend für die ordnungsgemäße Zellhaftung zu sein. Unter Verwendung dieses Grundverfahren eine längere Periode Astrozyten Befestigung erfordert eine ständige Überwachung der Einsätze durch häufiges Öffnen des Inkubators (was Schwankungen in Temperatur, pH und Luftfeuchtigkeit) und ist auch anfällig für ungleichmäßige Zellaussaat durch Leckage von Medium durch die Poren, insbesondere Wenn Poren größer als 1 &amp;mgr; m verwendet. Hier beschreiben wir ein allgemeines Protokoll für die Herstellung einer Kontakt BBB Modell. Unser Verfahren schließt ein alternatives Verfahren für die Zellaussaat auf invertierte Einsätze, die die oben genannten Einschränkungen Adressen. Das Verfahren ermöglicht die Einhaltung von Astrozyten ungestört auf der abluminalen Membranoberfläche, äquilibriert in einem Inkubator, für einen längeren Zeitraum. Als Ergebnis wird eine gleichmäßige Aussaat von Astrozyten erreicht, die Barrierequalität erhöhtund minimiert die basale Durchlässigkeit Variationen zwischen den Einsätzen. Da die Verwendung von menschlichen Zellen ist wichtig für die Mensch-relevanten Forschungs 21, zusätzlich haben wir in diesem Artikel zeigen, die spezifische Nutzung einer neuartigen Kombination von primären humanen BECs und verewigt menschlichen Astrozyten für die Einrichtung einer Kontakt menschlichen BBB-Modell mit einem Hochdurchsatz-Screening-Kapazität . Da die Anzeige von Zellen auf porösen Membranen kann schwierig wir auch ausführlich Färbetechniken, die bei der Bestimmung der Zusammenfluss und Zellmorphologie auf den porösen Membranen unterstützen kann. Schließlich veranschaulichen wir, wie unsere menschlichen BBB-Modell kann genutzt werden, um die Wirkung von Gewebe-Plasminogen-Aktivator (t-PA) zu untersuchen - ein Blutgerinnsel Zerschlagung Enzym, das als einzige Behandlungsoption für akuten ischämischen Schlaganfall dient - auf der BBB.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="863">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Attachment Factor</td>
			<td style="width:193px;">Cell-Systems Corporation</td>
			<td style="width:171px;">4Z0-210</td>
			<td style="width:243px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Brain microvascular endothelial cells (BECs), primary, human</td>
			<td style="width:193px;">Cell-Systems Corporation</td>
			<td style="width:171px;">ACBRI 376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Complete medium</td>
			<td style="width:193px;">Cell-Systems Corporation</td>
			<td style="width:171px;">4Z0-500</td>
			<td style="width:243px;">Supplemented with CSC JetFuel</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Complete serum-free medium</td>
			<td style="width:193px;">Cell-Systems Corporation</td>
			<td style="width:171px;">SF-4Z0-500</td>
			<td style="width:243px;">Supplemented with CSC RocketFue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">DMEM/F-12 with 15 mM HEPES</td>
			<td style="width:193px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:171px;">11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Endothelial cells growth supplement (from bovine origin)</td>
			<td style="width:193px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:171px;">E2759-15MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">External silicone tubing</td>
			<td style="width:193px;">Watson-Marlow</td>
			<td style="width:171px;">913.A080.016</td>
			<td style="width:243px;">Pumpsil brand, 8 mm internal diameter, 1.6 mm wall</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Foetal calf serum</td>
			<td style="width:193px;">Lonza</td>
			<td style="width:171px;">14-501F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Gentamycin sulfate</td>
			<td style="width:193px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:171px;">15750-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Heparin sodium</td>
			<td style="width:193px;">Pfizer</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:243px;">1,000 U/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Hexamethyldisilazane (HMDS)</td>
			<td style="width:193px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:171px;">H4875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Human brain microvascular endothelial cells</td>
			<td style="width:193px;">Cell-Systems Corporation</td>
			<td style="width:171px;">ACBRI 376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Internal silicone tubing</td>
			<td style="width:193px;">Watson-Marlow</td>
			<td style="width:171px;">913.A032.016</td>
			<td style="width:243px;">Pumpsil brand, 3.2 mm internal diameter, 1.6 mm wall</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:193px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:171px;">25030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Mayer&#8217;s hematoxylin solution</td>
			<td style="width:193px;">Amber Scientific</td>
			<td style="width:171px;">MH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Minimum essential medium with Earle&#8217;s balanced salt solution</td>
			<td style="width:193px;">HyClone Laboratories</td>
			<td style="width:171px;">SH30244.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:193px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:171px;">15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Rat collagen I</td>
			<td style="width:193px;">Trevigen</td>
			<td style="width:171px;">3440-100-01</td>
			<td style="width:243px;">Cultrex brand</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:257px;">Tissue culture inserts</td>
			<td style="width:193px;">Corning Life Sciences</td>
			<td style="width:171px;">3472</td>
			<td style="width:243px;">Transwell brand, 6.5 mm in diameter, with polyester porous membrane, 3 &#181;m pore-size</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improved method for the preparation of a human cell-based, contact model of the blood-brain barrier

Die Blut-Hirn-Schranke (BBB) ​​umfasst undurchlässig, aber anpassungsfähig Gehirn Kapillaren, die genau steuern das Gehirn Umwelt. Ausfall der BBB hat in der Ätiologie von vielen Hirnerkrankungen deutet worden, entsteht ein Bedarf für die Entwicklung von humanen in vitro Modellen BBB in klinisch relevanten Forschung zu unterstützen. Unter den zahlreichen BBB-Modelle bisher beschrieben, eine statische (ohne Strömung), wenden BBB-Modell, bei dem Astrozyten und Gehirn-Endothelzellen (BEK) auf den gegenüberliegenden Seiten einer porösen Membran kokultiviert, entpuppte sich als ein vereinfachtes System, um noch authentisch zu simulieren, die BBB mit Hochdurchsatz-Screening Kapazität. Dennoch ist die Erzeugung eines solchen Modells stellt einige technische Herausforderungen. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Herstellung eines Humankontakt BBB Modell unter Verwendung einer neuartigen Kombination von primären humanen BECs und immortalisierten menschlichen Astrozyten. Insbesondere haben wir ausführlich eine innovative Methode zur Zellaussaat auf invertiert Einsätze sowie Insertion angebent Färbetechniken und veranschau, wie wir unser Modell für BBB-Forschung zu verwenden.

Um einen Menschen, Kontakt BBB Modell mussten wir SVG-Dateien und BECs auf porösen Membranen mit einem 3 um Porengröße, um den Durchgang gezeigt Astrozyten End-Füße für den Kontakt mit Endothelzellen 14,15,27,28 erlauben pflegen zu etablieren. Eine schematische Darstellung des kompletten Kontaktmodell ist in Abbildung 1 (linke Abbildung) dargestellt. Die wichtigsten technischen Herausforderungen durch ein Kontaktsystem dargestellt ist die Notwendigkeit, Astrozyten gegen die Schwerkraft ...

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Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

Einrichtung von Menschenmodelle der Blut-Hirn-Schranke (BBB) ​​kann die Forschung in Gehirn Bedingungen mit BBB Versagen profitieren. Wir beschreiben hier ein verbessertes Verfahren zur Herstellung einer Kontakt BBB Modell, das Co-Kultur von Astrozyten und menschlichen Endothelzellen des Gehirns auf den gegenüberliegenden Seiten einer porösen Membran erlaubt.

Verbesserte Methode zur Präparation einer menschlichen Zelle-basierte, Kontakt Modell der Blut-Hirn-Schranke

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

improved-method-for-preparation-human-cell-based-contact-model-blood

Research

JoVE Journal

Bioengineering

16.2K Aufrufe.  Monash University.  Einrichtung von Menschenmodelle der Blut-Hirn-Schranke (BBB) ​​kann die Forschung in Gehirn Bedingungen mit BBB Versagen profitieren. Wir beschreiben hier ein verbessertes Verfahren zur Herstellung einer Kontakt BBB Modell, das Co-Kultur von Astrozyten und menschlichen Endothelzellen des Gehirns auf den gegenüberliegenden Seiten einer porösen Membran erlaubt. 

Serie: Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform to study protein-protein and protein-lipid interactions3, monitor drug delivery4,5, and encapsulation4. Phospholipids naturally create curved lipid bilayers, distinguishing itself from a micelle.6 Liposomes are traditionally classified by size and number of bilayers, i.e. large unilamellar vesicles (LUVs), small unilamellar vesicles (SUVs) and multilamellar vesicles (MLVs)7. In particular, the preparation of homogeneous liposomes of various sizes is important for studying membrane curvature that plays a vital role in cell signaling, endo- and exocytosis, membrane fusion, and protein trafficking8. Several groups analyze how proteins are used to modulate processes that involve membrane curvature and thus prepare liposomes of diameters &lt;100 - 400 nm to study their behavior on cell functions3. Others focus on liposome-drug encapsulation, studying liposomes as vehicles to carry and deliver a drug of interest9. Drug encapsulation can be achieved as reported during liposome formation9. Our extrusion step should not affect the encapsulated drug for two reasons, i.e. (1) drug encapsulation should be achieved prior to this step and (2) liposomes should retain their natural biophysical stability, securely carrying the drug in the aqueous core. These research goals further suggest the need for an optimized method to design stable sub-micron lipid vesicles.
Nonetheless, the current liposome preparation technologies (sonication10, freeze-and-thaw10, sedimentation) do not allow preparation of liposomes with highly curved surface (i.e. diameter &lt;100 nm) with high consistency and efficiency10,5, which limits the biophysical studies of an emerging field of membrane curvature sensing. Herein, we present a robust preparation method for a variety of biologically relevant liposomes.
Manual extrusion using gas-tight syringes and polycarbonate membranes10,5 is a common practice but heterogeneity is often observed when using pore sizes &lt;100 nm due to due to variability of manual pressure applied. We employed a constant pressure-controlled extrusion apparatus to prepare synthetic liposomes whose diameters range between 30 and 400 nm. Dynamic light scattering (DLS)10, electron microscopy11 and nanoparticle tracking analysis (NTA)12 were used to quantify the liposome sizes as described in our protocol, with commercial polystyrene (PS) beads used as a calibration standard. A near linear correlation was observed between the employed pore sizes and the experimentally determined liposomes, indicating high fidelity of our pressure-controlled liposome preparation method. Further, we have shown that this lipid vesicle preparation method is generally applicable, independent of various liposome sizes. Lastly, we have also demonstrated in a time course study that these prepared liposomes were stable for up to 16 hours. A representative nano-sized liposome preparation protocol is demonstrated below.

This protocol describes an extrusion method for preparing lipid vesicles of sub-micron sizes with a high degree of homogeneity. This method uses a pressure-controlled system with controlled nitrogen flow rates for liposome preparation. The lipid preparation1,2, liposome extrusion, and size characterization will be presented herein.

Constant Pressure-gesteuerte Extrusionsverfahren zur Herstellung von Nano-Größe Lipidvesikeln

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform ...

Forschung

Biotechnik

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced birth defects and many later studies afterwards proved the opposite. Today several harmful xenobiotics like nicotine, heroin, methadone or drugs as well as environmental pollutants were described to overcome this barrier. With the growing use of nanotechnology, the placenta is likely to come into contact with novel nanoparticles either accidentally through exposure or intentionally in the case of potential nanomedical applications. Data from animal experiments cannot be extrapolated to humans because the placenta is the most species-specific mammalian organ 1. Therefore, the ex vivo dual recirculating human placental perfusion, developed by Panigel et al. in 1967 2 and continuously modified by Schneider et al. in 1972 3, can serve as an excellent model to study the transfer of xenobiotics or particles.
Here, we focus on the ex vivo dual recirculating human placental perfusion protocol and its further development to acquire reproducible results.
The placentae were obtained after informed consent of the mothers from uncomplicated term pregnancies undergoing caesarean delivery. The fetal and maternal vessels of an intact cotyledon were cannulated and perfused at least for five hours. As a model particle fluorescently labelled polystyrene particles with sizes of 80 and 500 nm in diameter were added to the maternal circuit. The 80 nm particles were able to cross the placental barrier and provide a perfect example for a substance which is transferred across the placenta to the fetus while the 500 nm particles were retained in the placental tissue or maternal circuit. The ex vivo human placental perfusion model is one of few models providing reliable information about the transport behavior of xenobiotics at an important tissue barrier which delivers predictive and clinical relevant data.

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

The ex vivo dual recirculating human placental perfusion model can be used to investigate the transfer of xenobiotics and nanoparticles across the human placenta. In this video protocol we describe the equipment and techniques required for a successful execution of a placenta perfusion.

Bestimmung der Transport von Xenobiotika und Nanomaterialien über die Plazenta mit dem<em&gt; Ex vivo</em&gt; Menschliche Plazentaperfusion Modell

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. Clinically, this protein is widely used for cosmetic surgery, dermal injections, bone grafting, and reconstructive surgery. The sources of COL1 for these procedures are commonly nonhuman, which increases the potential for inflammation and rejection as well as xenobiotic disease transmission. In view of this, a method to efficiently and quickly purify COL1 from limited quantities of autologously-derived tissues would circumvent many of these issues; however, standard isolation protocols are lengthy and often require large quantities of collagenous tissues. Here, we demonstrate an efficient COL1 extraction method that reduces the time needed to isolate and purify this protein from about 10 days to less than 3 hr. We chose the dermis as our tissue source because of its availability during many surgical procedures. This method uses traditional extraction buffers combined with forceful agitation and centrifugal filtration to obtain highly-pure, soluble COL1 from small amounts of corium. Briefly, dermal biopsies are washed thoroughly in ice-cold dH2O after removing fat, connective tissue, and hair. The skin samples are stripped of noncollagenous proteins and polysaccharides using 0.5 M sodium acetate and a high speed bench-top homogenizer. Collagen from residual solids is subsequently extracted with a 0.075 M sodium citrate buffer using the homogenizer. These extracts are purified using 100,000 MW cut-off centrifugal filters that yield COL1 preparations of comparable or superior quality to commercial products or those obtained using traditional procedures. We anticipate this method will facilitate the utilization of autologously-derived COL1 for a multitude of research and clinical applications.

Traditional procedures for the isolation of soluble type 1 collagen (COL1) require about 10 days from start to finish because of lengthy buffer incubations and laborious resuspensions of fibrils. Here, we describe a means to purify COL1 from small dermal biopsies in less than 3 hr.

Ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Typ I-Kollagen aus der Haut

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. ...

Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons

A major challenge in neurobiology is to understand the molecular underpinnings of neural circuitry that govern a specific behavior. Once the specific molecular mechanisms are identified, new therapeutic strategies can be developed to treat abnormalities in specific behaviors caused by degenerative diseases or aging of the nervous system. The marine snail Aplysia californica is well suited for the investigations of cellular and molecular basis of behavior because neural circuitry underlying a specific behavior could be easily determined and the individual components of the circuitry could be easily manipulated. These advantages of Aplysia have led to several fundamental discoveries of neurobiology of learning and memory. Here we describe a preparation of the Aplysia nervous system for the electrophysiological and molecular analyses of individual neurons. Briefly, ganglion dissected from the nervous system is exposed to protease to remove the ganglion sheath such that neurons are exposed but retain neuronal activity as in the intact animal. This preparation is used to carry out electrophysiological measurements of single or multiple neurons. Importantly, following the recording using a simple methodology, the neurons could be isolated directly from the ganglia for gene expression analysis. These protocols were used to carry out simultaneous electrophysiological recordings from L7 and R15 neurons, study their response to acetylcholine and quantitating expression of CREB1 gene in isolated single L7, L11, R15, and R2 neurons of Aplysia.

Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons

Marine snail Aplysia californica has been widely used as a neurobiology model for the studies on cellular and molecular basis of behavior. Here a methodology is described for exploring the nervous system of Aplysia for the electrophysiological and molecular analyses of single neurons of identified neural circuitry.

Aplysia Ganglien-Vorbereitung für elektrophysiologische und molekulare Analysen einzelner Neuronen

A major challenge in neurobiology is to understand the molecular underpinnings of neural circuitry that govern a specific behavior. Once the specific ...

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on Poly(&#949;-caprolactone) Electrospun Yarns

Research into biomaterials and tissue engineering often includes cell-based in vitro investigations, which require initial knowledge of the starting cell number. While researchers commonly reference their seeding density this does not necessarily indicate the actual number of cells that have adhered to the material in question. This is particularly the case for materials, or scaffolds, that do not cover the base of standard cell culture well plates. This study investigates the initial attachment of human mesenchymal stem cells seeded at a known number onto electrospun poly(&#949;-caprolactone) yarn after 4 hr in culture. Electrospun yarns were held within several different set-ups, including bioreactor vessels rotating at 9 rpm, cell culture inserts positioned in low binding well plates and polytetrafluoroethylene (PTFE) troughs placed within petri dishes. The latter two were subjected to either static conditions or positioned on a shaker plate (30 rpm). After 4 hr incubation at 37&#160;oC, 5% CO2, the location of seeded cells was determined by cell DNA assay. Scaffolds were removed from their containers and placed in lysis buffer. The media fraction was similarly removed and centrifuged &#8211; the supernatant discarded and pellet broken up with lysis buffer. Lysis buffer was added to each receptacle, or well, and scraped to free any cells that may be present. The cell DNA assay determined the percentage of cells present within the scaffold, media and well fractions. Cell attachment was low for all experimental set-ups, with greatest attachment (30%) for yarns held within cell culture inserts and subjected to shaking motion. This study raises awareness to the actual number of cells attaching to scaffolds irrespective of the stated cell seeding density.

This article describes a range of set-ups for seeding human mesenchymal stem cells onto materials, in this case electrospun yarns, that do not cover the base of standard culture well plates in order to maximize and quantify the number of cells that initially attach compared to the known seeding density.

Optimierung der Befestigung der humanen mesenchymalen Stammzellen auf Poly (ε-caprolacton) Elektrogesponnene Garne

Research into biomaterials and tissue engineering often includes cell-based in vitro investigations, which require initial knowledge of the starting cell ...

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., flasks or dishes). In fact, it is widely recognized that cells grown in flasks or dishes tend to de-differentiate and lose specialized features of the tissues from which they were derived. Currently, there are mainly two types of 3-D culture systems where the cells are seeded into scaffolds mimicking the native extracellular matrix (ECM): (a) static models and (b) models using bioreactors. The first breakthrough was the static 3-D models. 3-D models using bioreactors such as the rotating-wall-vessel (RWV) bioreactors are a more recent development. The original concept of the RWV bioreactors was developed at NASA&#39;s Johnson Space Center in the early 1990s and is believed to overcome the limitations of static models such as the development of hypoxic, necrotic cores. The RWV bioreactors might circumvent this problem by providing fluid dynamics that allow the efficient diffusion of nutrients and oxygen. These bioreactors consist of a rotator base that serves to support and rotate two different formats of culture vessels that differ by their aeration source type: (1) Slow Turning Lateral Vessels (STLVs) with a co-axial oxygenator in the center, or (2) High Aspect Ratio Vessels (HARVs) with oxygenation via a flat, silicone rubber gas transfer membrane. These vessels allow efficient gas transfer while avoiding bubble formation and consequent turbulence. These conditions result in laminar flow and minimal shear force that models reduced gravity (microgravity) inside the culture vessel. Here we describe the development of a multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa composed of an intestinal epithelial cell line and primary human lymphocytes, endothelial cells and fibroblasts cultured under microgravity provided by the RWV bioreactor.

Cells growing in a three-dimensional (3-D) environment represent a marked improvement over cell cultivation in 2-D environments (e.g., flasks or dishes). Here we describe the development of a multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa cultured under microgravity provided by rotating-wall-vessel (RWV) bioreactors.

Entwicklung eines unter Schwerelosigkeits Vielzellige Dreidimensionale Organotypischen Modell des menschlichen Darmschleimhaut Grown

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...

In Vitro Permeation of FITC-loaded Ferritins Across a Rat Blood-brain Barrier: a Model to Study the Delivery of Nanoformulated Molecules

Brain microvascular endothelial cells, supported by pericytes and astrocytes endfeet, are responsible for the low permeation of large hydrosoluble drugs through the blood-brain barrier (BBB), causing difficulties for effective pharmacological therapies. In recent years, different strategies for promoting brain targeting have aimed to improve drug delivery and activity at this site, including innovative nanosystems for drug delivery across the BBB. In this context, an in vitro approach based on a simplified cellular model of the BBB provides a useful tool to investigate the effect of nanoformulations on the trans-BBB permeation of molecules. This study describes the development of a double-layer BBB, consisting of co-cultured commercially available primary rat brain microvascular endothelial cells and astrocytes. A multiparametric approach for the validation of the model, based on the measurement of the transendothelial electrical resistance and the apparent permeability of a high molecular weight dextran, is also described. As proof of concept for the employment of this BBB model to study the effect of different nanoformulations on the translocation of fluorescent molecules across the barrier, we describe the use of fluorescein isothiocyanate (FITC), loaded into ferritin nanoparticles. The ability of ferritins to improve the trans-BBB permeation of FITC was demonstrated by flux measurements and confocal microscopy analyses. The results suggest this is a useful system for validating nanosystems for delivery of drugs across the BBB.

In Vitro Permeation of FITC-loaded Ferritins Across a Rat Blood-brain Barrier: a Model to Study the Delivery of Nanoformulated Molecules

A method to establish an in vitro model of blood-brain barrier based on a co-culture of rat brain microvascular endothelial cells and astrocytes is described and validated. This system proved to be a valid tool to study the effect of nanoformulation on the trans-barrier permeation of fluorescent molecules.

In - vitro - Permeation von FITC-geladen Ferritine Über eine Ratte Blut-Hirn - Schranke: ein Modell für die Lieferung von Nanoformulated Moleküle zu studieren

Brain microvascular endothelial cells, supported by pericytes and astrocytes endfeet, are responsible for the low permeation of large hydrosoluble drugs ...

Lucifer Yellow - A Robust Paracellular Permeability Marker in a Cell Model of the Human Blood-brain Barrier

The blood-brain barrier BBB consists of endothelial cells that form a barrier between the systemic circulation and the brain to prevent the exchange of non-essential ions and toxic substances. Tight junctions (TJ) effectively seal the paracellular space in the monolayers resulting in an intact barrier. This study describes a LY-based fluorescence assay that can be used to determine its apparent permeability coefficient (Papp) and in turn can be used to determine the kinetics of the formation of confluent monolayers and the resulting tight junction barrier integrity in hCMEC/D3 monolayers. We further demonstrate an additional utility of this assay to determine TJ functional integrity in transfected cells. Our data from the LY Papp assay shows that the hCMEC/D3 cells seeded in a transwell setup effectively limit LY paracellular transport 7 days-post culture. As an additional utility of the presented assay, we also demonstrate that the DNA nanoparticle transfection does not alter LY paracellular transport in hCMEC/D3 monolayers.

We present a fluorescence assay to demonstrate that Lucifer Yellow (LY) is a robust marker to determine the apparent paracellular permeability of hCMEC/D3 cell monolayers, an in vitro model of the human blood-brain barrier. We used this assay to determine the kinetics of a confluent monolayer formation in cultured hCMEC/D3 cells.

Luzifergelb - Ein robuster parazellulärer Permeabilitätsmarker in einem Zellmodell der menschlichen Blut-Hirn-Barriere

The blood-brain barrier BBB consists of endothelial cells that form a barrier between the systemic circulation and the brain to prevent the exchange of ...

Bioparticle Microarrays for Chemotactic and Molecular Analysis of Human Neutrophil Swarming in vitro

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically been studied in vivo in animal models showing characteristic patterns of cell migration. However, in vivo models have several limitations, including intercellular mediators that are difficult to access and analyze, as well as the inability to directly analyze human neutrophils. Because of these limitations, there is a need for an in vitro platform that studies swarming with human neutrophils and provides easy access to the molecular signals generated during swarming. Here, a multistep microstamping process is used to generate a bioparticle microarray that stimulates swarming by mimicking an in vivo infection. The bioparticle microarray induces neutrophils to swarm in a controlled and stable manner. On the microarray, neutrophils increase in speed and form stable swarms around bioparticle clusters. Additionally, supernatant generated by the neutrophils was analyzed and 16 proteins were discovered to have been differentially expressed over the course of swarming. This in vitro swarming platform facilitates direct analysis of neutrophil migration and protein release in a reproducible, spatially controlled manner.

This protocol generates bioparticle microarrays that provide spatially controlled neutrophil swarming. It provides easy access to the mediators that neutrophils release during migration and allows for quantitative imaging analysis.

Biopartikel-Mikroarrays für chemotaktische und molekulare Analysen des menschlichen Neutrophilen-Schwärmens in vitro

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically ...

Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between animal and clinical trials. Numerous animal and cell models have been used to examine the effects of drugs, yet these responses often differ in humans. Human cardiac slices offer an advantage for drug testing in that they are directly derived from viable human hearts. In addition to having preserved multicellular structures, cell-cell coupling, and extracellular matrix environments, human cardiac tissue slices can be used to directly test the effect of innumerable drugs on adult human cardiac physiology. What distinguishes this model from other heart preparations, such as whole hearts or wedges, is that slices can be subjected to longer-term culture. As such, cardiac slices allow for studying the acute as well as chronic effects of drugs. Furthermore, the ability to collect several hundred to a thousand slices from a single heart makes this a high-throughput model to test several drugs at varying concentrations and combinations with other drugs at the same time. Slices can be prepared from any given region of the heart. In this protocol, we describe the preparation of left ventricular slices by isolating tissue cubes from the left ventricular free wall and sectioning them into slices using a high precision vibrating microtome. These slices can then either be subjected to acute experiments to measure baseline cardiac electrophysiological function or cultured for chronic drug studies. This protocol also describes dual optical mapping of cardiac slices for simultaneous recordings of transmembrane potentials and intracellular calcium dynamics to determine the effects of the drugs being investigated.

This protocol describes the procedure for sectioning and culturing human cardiac slices for preclinical drug testing and details the use of optical mapping for recording transmembrane voltage and intracellular calcium signals simultaneously from these slices.

Präklinische Kardiale Elektrophysiologie Bewertung durch Dual Voltage und Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between ...