ويدعم هذا العمل جزئيا صندوق جامعة واغنينغن، وبرنامج مجلس المنح الدراسية الصيني لطلاب الدراسات العليا، ومنحة NWO-VIDI 12378.

1. زراعة النباتات وظروف الاختبار
<ol><li>زراعة وصيانة النباتات في الدفيئات الخاضعة للرقابة أو غرف المناخ ضمن نطاق درجة الحرارة من 18-22 درجة مئوية وفي ظل نظام الضوء الطبيعي أو مع نظام 16 ساعة / 8 ساعة ليلا / نهارا. إزالة الفروع الإضافية من أجل جعل النباتات أكثر قابلية للإدارة.</li>
	<li>للبطاطس، والحفاظ على النباتات في المختبر في الجرار البلاستيكية العقيمة التي تحتوي على موراشيج سكوغ (MS) المتوسطة (20 غرام / لتر السكروز، 5 غ/لتر أملاح التصلب المتعدد مع الفيتامينات، 8 غرام/ لتر أجار، درجة الحموضة 5.8) في ظل ظروف خاضعة للرقابة في غرف المناخ عند 18 درجة مئوية مع نظام نهاري/ليلي لمدة أسبوعين لمدة 16 ساعة/8 ساعات، ثم نقلها إلى أواني من التربة المعقمة في مقصورات الدفيئة المنظمة.</li>
</ol>2. الترشيح الزراعي
<ol><li>المواد النباتية: لنيكوتيانا بنثاميانا, استخدام حوالي 4-5 أسابيع من النباتات المزروعة بالبذور القديمة. للبطاطا، استخدم حوالي 4-5 أسابيع من عمليات زرع الأعضاء القديمة من المختبر. اختيار الشباب، وأوراق صحية ومطورة تماما لعمليات التسلل.</li>
	<li>
ثقافة البكتيريا الزراعية:<ol>
<li>إعداد وسيط YEB مقدما (الجدول 1). ملء أنابيب 50 مل مع 10 مل YEB المتوسطة تكملها مع 1 ميكرولتر acetosyringone (200 mM), 100 ميكرولتر MES العازلة (2-(N-morpholino) - حمض سلفونيك الإيثان, 1 M) والمضادات الحيوية المناسبة. ماصة 20 ميكرولتر مخزون الجلسيرول من السلالات المطلوبة (الجدول 2) (تحتوي على جين الفائدة) في YEB. بدء الثقافات لجميع سلالات Agrobacterium في هذا المقايسة في نفس الوقت. احتضان الخلايا عن طريق اهتزاز لمدة 1-2 أيام في 28 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة إلى OD600 من حوالي 1.0.</li>
		<li>حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 3000 × غرام لمدة 10 دقائق. صب قبالة supernatant و resuspend بيليه في المتوسطة MMA الطازجة (الجدول 3) إلى OD600 من 0.3. دوامة الخلايا برفق لإعادة إنفاقها. لترشيح عملة من اثنين من السلالات البكتيرية، وخلط الثقافة في نسبة 1:1.</li>
		<li>اترك الثقافة على مقاعد البدلاء في درجة حرارة الغرفة لمدة 1-6 ساعات قبل التسلل. في غضون ذلك، تسمية النباتات التي سيتم اختراقها وتاريخ التجربة.</li>
	</ol>
</li>
	<li>عمليات التسلل: استخدام حقنة 1 مل إبرة التسلل تعليق Agrobacterium. بعناية وببطء حقن لوحات ورقة مع تعليق من المحاقن (لأسباب تتعلق بالصحة والسلامة يجب أن ترتديه حماية العين خلال هذه العملية). التسلل ما لا يقل عن ثلاثة مصانع لكل سلالة. استخدام ثلاث أوراق لكل نبات لتكون بمثابة ثلاثية. ملاحظة: عادة، 1 مل من Agrobacterium تعليق ق يمكن أن تكون كافية ل 3 نباتات N. بنثاميانا. بالنسبة للبطاطا، هناك حاجة إلى مزيد من التعليق لأن أوراق أنواع سولانوم أكثر صعوبة في التسلل. تعتمد الكميات المطلوبة من عمليات التعليق على أنواع سولانوم. تجنب التلوث المتبادل عن طريق تغيير القفازات أو تعقيم القفازات بالإيثانول بين عمليات التسلل وعدم سقي النباتات حتى اليوم التالي للتلقيح.</li>
	<li>سجل: تسجيل الاستجابات العيانية حوالي 3 أيام بعد التسلل عندما يكون النمط الظاهري موت الخلية واضح(الشكل 1). إذا كان النمط الظاهري لوفيات الخلايا كميا، فاستخدم المعايير المحددة(الشكل 2). باختصار، تعتمد مقاييس التهديف العياني لوفيات الخلايا بشكل رئيسي على نسب موت الخلية في المنطقة المخترقة. يتم تصوير النسب المئوية لوفيات الخلايا على مقياس من 0٪ (بدون أعراض) إلى 100٪ (موت الخلايا الملتخمة). وتتراوح الاستجابات المتوسطة من الاستجابات الضعيفة مثل داء الكلوروز إلى زيادة مستويات موت الخلايا. إذا رغبت في ذلك ، يمكن أيضا تقييم الدرجات العيانية كميا باستخدام معدات التصوير الضوئي الحديثة.</li>
</ol>3. PVX العدوى الزراعية
<ol><li>المواد النباتية: لN. بنثاميانا, استخدام حوالي 2-3 النباتات المزروعة بالبذور الأسبوع القديم. للبطاطا، استخدم حوالي 2-3 أسابيع من عمليات زرع الأعضاء القديمة من المختبر. للاختبارات واسعة النطاق، استخدم النباتات الأقدم قليلا (4-5 أسابيع)، لأن هذه النباتات لديها أوراق أكثر وأكبر لاستيعاب أعداد أكبر من بقع تلقيح البكتيريا الزراعية.</li>
	<li>
زراعة البكتيريا الزراعية: <ol>
<li>قم بإعداد وسيط YEB مسبقا. ملء أنابيب 10 مل مع 3 مل YEB تكملها المضادات الحيوية المناسبة. ماصة 20 ميكرولتر مخزون الجلسيرول من السلالات المطلوبة (الجدول 2) (تحتوي على جين الفائدة) في YEB. بدء الثقافات لجميع سلالات Agrobacterium في هذا المقايسة في نفس الوقت. احتضان الخلايا عن طريق اهتزاز لمدة 1-2 أيام في 28 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة إلى OD600 من حوالي 1.0.</li>
		<li>ماصة حوالي 300 ميكرولتر من كل سلالة Agrobacterium ونشرها على لوحات LB Agar الصلبة المتوسطة تكملها المضادات الحيوية المناسبة والخلايا المحتضنة في 28 درجة مئوية لمدة 1-2 أيام.</li>
	</ol>
</li>
	<li>الالتهابات: استخدام ملعقة لجمع ثقافة Agrobacterium في لوحة. تراجع مسواك خشبية في ثقافة Agrobacterium على ملعقة وثقب الأوراق لتطعيم كمية كبيرة من البكتيريا. تلقيح ما لا يقل عن ثلاثة نباتات لكل سلالة. استخدام ثلاث أوراق لكل نبات لتكون بمثابة ثلاثية. في كل ورقة، وجعل مواقع التطعيم متعددة لكل سلالة.</li>
	<li>سجل: تسجيل الاستجابات العيانية بعد حوالي أسبوعين من التطعيم (الشكل 3). بالنسبة للشاشات عالية الإنتاجية، سجل الاستجابات النوعية (نعم/لا) لكل بقعة تلقيح. ثم حساب النسبة المئوية للمواقع المستجيبة ومقارنتها مع عناصر التحكم.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Vleeshouwers, V. G. A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+and+exploiting+late+blight+resistance+in+the+age+of+effectors.">Understanding and exploiting late blight resistance in the age of effectors.</a> Ann. Rev. Phytopathol. 49, 507-531 (2011).</li><li>Ellis, J. G., Rafiqi, M., Gan, P., Chakrabarti, A., Dodds, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+discovery+and+functional+analysis+of+effector+proteins+of+fungal+and+oomycete+plant+pathogens.">Recent progress in discovery and functional analysis of effector proteins of fungal and oomycete plant pathogens.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 12, 399-405 (2009).</li><li>Vleeshouwers, V. G. A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+genomics+accelerates+discovery+and+functional+profiling+of+potato+disease+resistance+and+Phytophthora+infestans+avirulence+genes.">Effector genomics accelerates discovery and functional profiling of potato disease resistance and Phytophthora infestans avirulence genes.</a> Plos One. 3, 1-10 (2008).</li><li>Oh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+planta+expression+screens+of+Phytophthora+infestans+RXLR+effectors+reveal+diverse+phenotypes,+including+activation+of+the+Solanum+bulbocastanum+disease+resistance+protein+Rpi-blb2.">In planta expression screens of Phytophthora infestans RXLR effectors reveal diverse phenotypes, including activation of the Solanum bulbocastanum disease resistance protein Rpi-blb2.</a> Plant Cell. 21, 2928-2947 (2009).</li><li>Tyler, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phytophthora+genome+sequences+uncover+evolutionary+origins+and+mechanisms+of+pathogenesis.">Phytophthora genome sequences uncover evolutionary origins and mechanisms of pathogenesis.</a> Science. 313, 1261-1266 (2006).</li><li>Haas, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequence+and+analysis+of+the+Irish+potato+famine+pathogen+Phytophthora+infestans.">Genome sequence and analysis of the Irish potato famine pathogen Phytophthora infestans.</a> Nature. 461, 393-398 (2009).</li><li>Levesque, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequence+of+the+necrotrophic+plant+pathogen+Pythium+ultimum+reveals+original+pathogenicity+mechanisms+and+effector+repertoire.">Genome sequence of the necrotrophic plant pathogen Pythium ultimum reveals original pathogenicity mechanisms and effector repertoire.</a> Genome Biol. 11, 1-22 (2010).</li><li>Lamour, K. H., Win, J., Kamoun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oomycete+genomics:+new+insights+and+future+directions.">Oomycete genomics: new insights and future directions.</a> FEMS Microbiol. Lett. 274, 1-8 (2007).</li><li>Stassen, J. H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+identification+in+the+lettuce+downy+mildew+Bremia+lactucae+by+massively+parallel+transcriptome+sequencing.">Effector identification in the lettuce downy mildew Bremia lactucae by massively parallel transcriptome sequencing.</a> Mol. Plant Pathol. 13, 719-731 (2012).</li><li>Kemen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+gain+and+loss+during+evolution+of+obligate+parasitism+in+the+white+rust+pathogen+of+Arabidopsis+thaliana.">Gene gain and loss during evolution of obligate parasitism in the white rust pathogen of Arabidopsis thaliana.</a> PLoS Biol. 9, 1-21 (2011).</li><li>Win, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Effector biology of plant-associated organisms: concepts and perspectives. , 1-13 (2012).</li><li>Hogenhout, S. A., van der Hoorn, R. A. L., Terauchi, R., Kamoun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+concepts+in+effector+biology+of+plant-associated+organisms.">Emerging concepts in effector biology of plant-associated organisms.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 22, 115-122 (2009).</li><li>Kamoun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+catalogue+of+the+effector+secretome+of+plant+pathogenic+oomycetes.">A catalogue of the effector secretome of plant pathogenic oomycetes.</a> Ann. Rev. Phytopathol. 44, 41-60 (2006).</li><li>van der Hoorn, R. A. L., Laurent, F., Roth, R., De Wit, P. J. G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agroinfiltration+is+a+versatile+tool+that+facilitates+comparative+analyses+of+Avr9/Cf-9-induced+and+Avr4/Cf-4-induced+necrosis.">Agroinfiltration is a versatile tool that facilitates comparative analyses of Avr9/Cf-9-induced and Avr4/Cf-4-induced necrosis.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 13, 439-446 (2000).</li><li>Dangl, J. L., Jones, J. D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+pathogens+and+integrated+defence+responses+to+infection.">Plant pathogens and integrated defence responses to infection.</a> Nature. 411, 826-833 (2001).</li><li>Kapila, J., de Rycke, R., van Montagu, M., Angenon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Agrobacterium-mediated+transient+gene+expression+system+for+intact+leaves.">An Agrobacterium-mediated transient gene expression system for intact leaves.</a> Plant Sci. 122, 101-108 (1997).</li><li>Kanneganti, T. D., Huitema, E., Kamoun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+planta+expression+of+oomycete+and+fungal+genes.">In planta expression of oomycete and fungal genes.</a> Methods Mol. Biol. 354, 35-43 (2007).</li><li>Vleeshouwers, V. G. G. A., Rietman, H., Lamour, K., Kamoun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+planta+expression+systems.+Oomycete+Genetics+and+Genomics.">In planta expression systems. Oomycete Genetics and Genomics.</a> Diversity, Interactions, and Research Tools. 23, 455-475 (2009).</li><li>Peng, W. T., Lee, Y. W., Nester, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phenolic+recognition+profiles+of+the+Agrobacterium+tumefaciens+VirA+protein+are+broadened+by+a+high+level+of+the+sugar+binding+protein+ChvE.">The phenolic recognition profiles of the Agrobacterium tumefaciens VirA protein are broadened by a high level of the sugar binding protein ChvE.</a> J. Bacteriol. 180, 5632-5638 (1998).</li><li>Lu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+virus-induced+gene+silencing+implicates+heat+shock+protein+90+in+plant+disease+resistance.">High throughput virus-induced gene silencing implicates heat shock protein 90 in plant disease resistance.</a> EMBO J. 22, 5690-5699 (2003).</li><li>Ma, L., Lukasik, E., Gawehns, F., Takken, F. L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+agroinfiltration+for+transient+expression+of+plant+resistance+and+fungal+effector+proteins+in+Nicotiana+benthamiana+leaves.">The use of agroinfiltration for transient expression of plant resistance and fungal effector proteins in Nicotiana benthamiana leaves.</a> Methods Mol. Biol. 835, 61-74 (2012).</li><li>Bhaskar, P. B., Venkateshwaran, M., Wu, L., An&#233;, J. M., Jiang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transient+gene+expression+and+silencing:+A+rapid+tool+for+functional+gene+assay+in+potato.">Agrobacterium-mediated transient gene expression and silencing: A rapid tool for functional gene assay in potato.</a> Plos One. 4, 1-8 (2009).</li><li>van der Fits, L., Deakin, E. A., Hoge, J. H. C., Memelink, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ternary+transformation+system:+constitutive+virG+on+a+compatible+plasmid+dramatically+increases+Agrobacterium-mediated+plant+transformation.">The ternary transformation system: constitutive virG on a compatible plasmid dramatically increases Agrobacterium-mediated plant transformation.</a> Plant Mol. Biol. 43, 495-502 (2000).</li><li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+genomics+enabled+the+isolation+of+the+R3a+late+blight+resistance+gene+in+potato.">Comparative genomics enabled the isolation of the R3a late blight resistance gene in potato.</a> Plant J. 42, 251-261 (2005).</li><li>Armstrong, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ancestral+oomycete+locus+contains+late+blight+avirulence+gene+Avr3a,+encoding+a+protein+that+is+recognized+in+the+host+cytoplasm.">An ancestral oomycete locus contains late blight avirulence gene Avr3a, encoding a protein that is recognized in the host cytoplasm.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 7766-7771 (2005).</li><li>Kim, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad+spectrum+late+blight+resistance+in+potato+differential+set+plants+MaR8+and+MaR9+is+conferred+by+multiple+stacked+R+genes.">Broad spectrum late blight resistance in potato differential set plants MaR8 and MaR9 is conferred by multiple stacked R genes.</a> Theor. Appl. Genet. 124, 923-935 (2012).</li><li>Torto, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EST+mining+and+functional+expression+assays+identify+extracellular+effector+proteins+from+the+plant+pathogen+Phytophthora.">EST mining and functional expression assays identify extracellular effector proteins from the plant pathogen Phytophthora.</a> Genome Res. 13, 1675-1685 (2003).</li><li>Vleeshouwers, V. G. A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agroinfection-based+high-throughput+screening+reveals+specific+recognition+of+INF+elicitins+in+Solanum.">Agroinfection-based high-throughput screening reveals specific recognition of INF elicitins in Solanum.</a> Mol. Plant Pathol. 7, 499-510 (2006).</li><li>Koncz, C., Schell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promoter+of+TL-DNA+gene+5+controls+the+tissue-specific+expression+of+chimeric+genes+carried+by+a+novel+type+of+agrobacterium+binary.">The promoter of TL-DNA gene 5 controls the tissue-specific expression of chimeric genes carried by a novel type of agrobacterium binary.</a> Mol. Gen. Genet. 204, 383-396 (1986).</li><li>Lazo, G. R., Stein, P. A., Ludwig, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA+transformation-competent+Arabidopsis+genomic+library+in+Agrobacterium.">A DNA transformation-competent Arabidopsis genomic library in Agrobacterium.</a> Bio-Technol. 9, 963-967 (1991).</li><li>Rietman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Putting the Phytophthora infestans genome sequence at work; multiple novel avirulence and potato resistance gene candidates revealed [PhD thesis]. , (2011).</li><li>Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+Agrobacterium-mediated+transient+assays+of+gene+expression+in+lettuce,+tomato+and+Arabidopsis.">Optimization of Agrobacterium-mediated transient assays of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis.</a> Plant Biotechnol. J. 3, 259-273 (2005).</li><li>van engelen, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pBINPLUS+-+an+improved+plant+transformation+vector+based+on+pBIN19.">pBINPLUS - an improved plant transformation vector based on pBIN19.</a> Transgenic Res. 4, 288-290 (1995).</li><li>Karimi, M., Inze, D., Depicker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GATEWAYTM+vectors+for+Agrobacterium-mediated+plant+transformation.">GATEWAYTM vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation.</a> Trends Plant Sci. 7, 193-195 (2002).</li><li>Xiang, C. B., Han, P., Lutziger, I., Wang, K., Oliver, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mini+binary+vector+series+for+plant+transformation.">A mini binary vector series for plant transformation.</a> Plant Mol. Biol. 40, 711-717 (1999).</li><li>Curtis, M. D., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gateway+cloning+vector+set+for+high-throughput+functional+analysis+of+genes+in+planta.">A gateway cloning vector set for high-throughput functional analysis of genes in planta.</a> Plant Physiol. 133, 462-469 (2003).</li></ol>

ويعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

المقايسات العابرة مثل الترشيح الزراعي والإصابة الزراعية هي طرق فعالة حيوية لأبحاث علم الأمراض النباتية الجزيئية الحديثة. على الرغم من بعض القيود، تلبي هذه الأساليب الطلب على تحليل وظيفي عالي الإنتاجية وفعال وقوي في النباتات.
نظام الترشيح الزراعي هو المقايسة الوظيفية المستخدمة على نطاق واسع في مجموعة من الأنواع النباتية. يسهل الترشيح الزراعي تسليم العديد من المتحولين إلى نفس الخلية مع التعبير المتزامن عن البروتينات المتفاعلة. هذا مفيد لتلخيص العلاقات R-AVR، من خلال سلالات Agrobacterium coinfiltrating التي تعبر عن جينات Avr مع السلالات التي تعبر عن الجينات R مطابقة. أيضا، لأزواج R-AVR المعروفة، يمكن استخدام مثل هذه اللترات كعناصر تحكم إيجابية. ومن المهم إدراج هذه الضوابط لأن كفاءة التحويل في بعض الأنماط الجينية النباتية يمكن أن تكون دون العتبة للكشف عن الاستجابات. بما في ذلك الضوابط السلبية ، على سبيل المثال سلالة Agrobacterium التي تحتوي على ناقل دون إدراج الجينات ، أمر ضروري أيضا لتحديد ما إذا كان نوع وراثي نباتي معين يثير استجابات دفاعية غير محددة للبكتيريا الزراعية. تحدث هذه الميزة على تردد معين في جرثومة البطاطس ، وليس كل أنواع سولانوم مناسبة تماما لنظام التعبير القائم على Agrobacterium. عموما، يعمل المقايسة الترشيح الزراعي بشكل جيد جدا في N. بنثاميانا ومعظم الأنماط الجينية البطاطا. بالإضافة إلى علم التأثير، هناك تطبيقات محتملة أخرى مختلفة لتقنية الترشيح الزراعي، مثل إنتاج البروتينات من المتحولين جنسيا وتوطين البروتين في الخلايا النباتية عن طريق المجهر الكونفوجال.
PVX agrofection هو نظام فحص حساس للغاية وعادة ما يكون أكثر ملاءمة للفحوصات عالية الإنتاجية. وبما أن البكتيريا الزراعية موجودة الآن محليا فقط، فإن الاستجابات غير المحددة لهذه البكتيريا ليست مزعجة للغاية الآن، حيث أن فيروس PVX يتولى المزيد من انتشار المتحولين جنسيا. ومع ذلك، قد تكون النباتات مقاومة ل PVX، أو جبل المقاومة القصوى (ER) الاستجابات، وفي هذه الحالة طريقة العدوى الزراعية ليست مناسبة. وثمة قيد آخر على طريقة الإصابة الزراعية PVX هو إدراج حجم الجين المثير للاهتمام. قد تختلف الأنماط الظاهرية الملاحظة للاستجابات من نخر أسود شديد يحيط بالجرح إلى نخر خافت بالقرب من بقعة التطعيم. في كل من N. بنثاميانا وسولانوم الأنواع، ومن المسلم به PVX العدوى الزراعية باعتبارها أكثر حساسية من الترشيح الزراعي.
مع الأخذ في الاعتبار أن الخلفية الوراثية للأنماط الجينية النباتية المتنوعة التي تم اختبارها يمكن أن يكون لها بعض القيود (انظر أعلاه) ، نحصل بشكل عام على استنتاجات مماثلة من قبل PVX العدوى الزراعية والترشيح الزراعي. هذه النتائج هي أيضا قابلة للمقارنة كما تم الحصول عليها في المقايسات الأخرى، مثل تسلل البروتين29 و ELISA3. وبالنظر إلى مزايا والقيود المفروضة على كلا النظامين، نوصي باستخدام كلتا الطريقتين إما لاستكمال بعضهما البعض أو تأكيد النتائج المستقلة.

Effectoromics ، وقد برز مؤخرا نهج الجينوم وظيفية عالية الإنتاجية كأداة قوية لتحديد المقاومة (R) الجينات في نباتات المحاصيل ومطابقة avirulence(Avr)الجينات من مسببات الأمراض1-4. وعلى النقيض من التحول المستقر الأكثر استهلاكا للوقت مع جينات R، تستند استراتيجية علم التأثير إلى المقايسات العابرة لتسلسلات الجينات المسببة للأمراض.
منذ عصر الجينوم، تم استكشاف جينوم مسببات الأمراض النباتية على نطاق واسع. على سبيل المثال بالنسبة للوميسيتات ، والتي تشمل مسببات الأمراض النباتية الأكثر تدميرا ، تم إنشاء مجموعات كبيرة من التسلسلات وتحليلها للجينات التي تلعب دورا أثناء التفاعل مع النبات5-10. فئة واحدة من البروتينات المسببة للأمراض يمثل التأثيرات، والتي تعالج بنية الخلية المضيفة ووظيفة إما لتسهيل العدوى (عوامل الفوعة) أو لتحريك الاستجابات الدفاعية (عوامل avirulence)11-13. التعبير عن الجينات Avr في الخلايا النباتية التي تحتوي على الجينات R عادة ما يؤدي إلى استجابة موت الخلايا مفرط الحساسية (HR)14,15. في بلانتا التعبير عن الجينات R وAVR يمكن أن يتحقق باستخدام أنظمة التعبير عابرة مثل Tumefaciens Agrobacterium -التحول العابر القائم (الترشيح الزراعي)16. ويمكن أيضا تطبيق هذا التحول عابرة في تركيبة مع نظم التعبير الفيروسي (agroinfection)17,18.
بالنسبة للترشيح الزراعي ، فإن العامل الأكثر استخداما هو A. tumefaciens ، وهو مجموعة واسعة من مسببات الأمراض في نباتات الديكوت. يحتوي التوميفاسيان على بلازميد (Ti) مثير للورم. نقل الحمض النووي (تي الحمض النووي) من تي بلازميد سوف تنتقل إلى الخلايا النباتية بعد تنشيط آلية فحولة البكتيريا. ويمكن أن يحدث هذا في الخلايا النباتية الجرحى, من قبل المركبات الفينولية منخفضة الوزن الجزيئية الصادرة وmonosaccharaides في بيئة حمضية قليلا19. يتم تنشيط جين الفوعة بعد تسلل تعليق Agrobacterium إلى ألواح أوراق تحددها الأوردة الرئيسية. ثم سيتم تحويل الخلايا النباتية في لوحات ورقة والتعبير عن transgene (ق) الواردة في منطقة تي الحمض النووي.
ويستند العدوى الزراعية على Agrobacteriumتلقيح الجرح ، الذي يتوسط نقل الفيروس إلى الخلايا النباتية. ثم ينتشر الفيروس إلى الأنسجة النباتية المجاورة ، في غياب Agrobacterium. بالنسبة للإصابة الزراعية، يمكن استخدام العديد من الفيروسات النباتية. فيروسات الحمض النووي الريبي هي ناقلات مثالية للتعبير الجيني لأنها يمكن أن تتضاعف إلى مستويات عالية جدا في النباتات المصابة. من بين الفيروسات الحمض النووي الريبي النباتية، يستخدم على نطاق واسع فيروس البطاطا X (PVX) لشاشات علم التأثير. لتسهيل الاختبارات الوظيفية لجين إدراجها، تم استنساخ ناقلات ثنائية التي تحتوي على الجينوم PVX يحيط بها فيروس القرنبيط الفسيفساء 35S المروج والمنهي synthase nopaline، في T-DNA من A. tumefaciens20. بعد نقل الحمض النووي إلى خلايا نباتية ، يتم نسخ جينوم PVX الموجود في الحمض النووي T من مروج 35S. ثم تنتشر جزيئات الفيروس بشكل منهجي في النباتات المصابة ، مما يؤدي إلى التعبير عن الجين المدرج. وتسمى هذه الطريقة على أساس كل من Agrobacterium وPVX PVX العدوى الزراعية.
هنا نعرض أمثلة لكل من الترشيح الزراعي ومقاايسات العدوى الزراعية PVX. كما النباتات المضيفة نستخدم الجرثومة البطاطا (قسم سولانوم بيتوتا)،والتي نهج علم التأثير كانت رائدة وثبت نجاحها3،4. ونحن نستخدم أيضا نيكوتيانا بنثاميانا، والتي تشتهر بأنها مصنع نموذجي في النباتات سولاناسيوس 14،21،22.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="955">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col span="2" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Beef extract</td>
			<td style="width:267px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">B4888</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Bacteriological peptone</td>
			<td style="width:267px;">Oxoid</td>
			<td style="width:219px;">LP0037</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:267px;">Oxoid</td>
			<td style="width:219px;">LP0021</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">MgSO4</td>
			<td style="width:267px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">208094</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">MS salts (without vitamins)</td>
			<td style="width:267px;">Duchefa Biochemie</td>
			<td style="width:219px;">M0221</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">MES</td>
			<td style="width:267px;">Duchefa Biochemie</td>
			<td style="width:219px;">M1503</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">LB broth powder</td>
			<td style="width:267px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">L3022</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Acetosyringone</td>
			<td style="width:267px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">D134406</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Syringe (1 ml)</td>
			<td style="width:267px;">BD Plastipak</td>
			<td style="width:219px;">300013</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Incubator</td>
			<td style="width:267px;">Infors HT</td>
			<td style="width:219px;">Multitron II</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:267px;">Heraeus</td>
			<td style="width:219px;">Multifuge 3S-R</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:267px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:219px;">Biophotometer 6131</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

agroinfiltration and pvx agroinfection in potato and nicotiana benthamiana

الترشيح الزراعي والإصابة الزراعية PVX هما مقايستان تعبيرتان عابرتان فعالتان للتحليل الوظيفي للجينات المرشحة في النباتات. العامل الأكثر استخداما للترشيح الزراعي هو البكتيريا الزراعية tumefaciens، وهو ممرض للعديد من أنواع النباتات ديكوت. وهذا يعني أنه يمكن تطبيق الترشيح الزراعي على العديد من أنواع النباتات. هنا، نقدم بروتوكولاتنا والنتائج المتوقعة عند تطبيق هذه الطرق على البطاطا(سولانوم الدرنة)،والأنواع سولانوم البرية ذات الصلة الحاملة للدرنة(سولانوم قسم بيتوتا)والنموذج نبات نيكوتيانا بنثاميانا. بالإضافة إلى التحليل الوظيفي للجينات المفردة ، مثل المقاومة(R)أو avirulence(Avr)الجينات ، فإن فحص الترشيح الزراعي مناسب جدا لتلخيص تفاعلات R-AVR المرتبطة بتفاعلات مسببات الأمراض المضيفة المحددة بمجرد تسليم R و Avr transgenes إلى نفس الخلية. ومع ذلك، يمكن لبعض الأنماط الجينية النباتية رفع الاستجابات الدفاعية غير المحددة للبكتيريا الزراعية،كما لاحظنا على سبيل المثال للعديد من الأنماط الجينية للبطاطا. بالمقارنة مع الترشيح الزراعي ، فإن اكتشاف نشاط AVR مع العدوى الزراعية PVX أكثر حساسية ، وأكثر إنتاجية عالية في الشاشات الوظيفية وأقل حساسية للاستجابات الدفاعية غير المحددة للبكتيريا الزراعية. ومع ذلك ، يمكن أن يحدث دفاع غير محدد لPVX وهناك خطر أن تفوت الاستجابات بسبب المقاومة الشديدة الناجمة عن الفيروس. على الرغم من هذه القيود، في تجربتنا، الترشيح الزراعي والإصابة الزراعية PVX هي على حد سواء المقايسات المناسبة والتكميلية التي يمكن استخدامها في وقت واحد لتأكيد نتائج بعضها البعض.

ويبين الشكل 1 تجربة تمثيلية للترشيح الزراعي مع 7 محفزات مختلفة (E1-E7) في البطاطا وN. بنثاميانا. تظهر وفاة الخلية في ألواح الأوراق المتسللة بعد حوالي 3 أيام من التسلل. مدى النمط الظاهري موت الخلية يحتاج إلى مقارنة مع الضوابط. تم استخدام خليط من سلالة Agrobacterium AGL1 (pVirG)23 التي تحتوي على pBINplus-R3a و pK7WG2-AVR3a كتحكم إيجابي24,25، في حين تم استخدام AGL1 (pVirG) كتحكم سلبي. ويبين الشكلان 1 ألف و1ب أمثلة جيدة على التسلل الزراعي في النمط الجيني للبطاطا MaR8 (Mastenbroek R8)26 و N. benthamiana، على التوالي ، وهما قابلان جدا للترشيح الزراعي. هناك موت الخلايا التقاء في لوحة ورقة coinfiltrated مع السيطرة الإيجابية، في حين لا يحدث أي استجابة موت الخلية مع السيطرة السلبية أو pBINplus-R3a. في MaR8 ، اثنين من المفعول AVR3a (E2) وAVR4 (E3) تحفز موت الخلية ، في حين أن التأثيرات الأخرى (E1 و E4-E7) لا. في N. benthamiana ، لا أحد من المحفزات المختبرة تحفز استجابة موت الخلية. ويبين الشكلان 1C و1D أمثلة على التسلل الزراعي في البطاطا البرية سولانوم بيرتولتي 483-1 وسولانوم ريكهي 210-5، وهما غير قابلين جيدا لتقنية الترشيح الزراعي. في S. berthaultii 483-1 ، تظهر أنسجة الورق نخرا غير محدد للضوابط السلبية وكذلك لجميع المحفزات المختبرة. في S. rechei 210-5، تظهر ألواح الأوراق المخترقة استجابة ضعيفة جدا لوفاة الخلية للسيطرة الإيجابية.
ويبين الشكل 2 مجموعة من مقاييس التهديف التي يمكن استخدامها لقياس الاستجابة للبكتيريا الزراعية المصفاة. يتم تصوير النسب المئوية لوفيات الخلايا على مقياس 0-100٪. وتتراوح الأنماط الظاهرية الملاحظة من الأعراض غير المرئية بشكل كلي (0٪)، مرورا بمجموعة من الاستجابات الوسيطة التي تظهر الكلوروز وزيادة مستويات موت الخلايا، وحتى موت الخلايا الالتقاءية (100٪).
ويبين الشكل 3 تجربة تمثيلية بعد الإصابة بالزراعة في البطاطس. عادة، يمكن العثور على موت الخلايا الآخذ في التوسع في المواقع بعد حوالي أسبوعين من تلقيح اختيار الأسنان. كما هو مبين في كل من لوحات الشكل، وتوسيع موت الخلية موجود في المواقع التي تم تلقيحها مع pGR106-CRN2 (التحكم الإيجابي باستخدام crn2 المؤثر)، وهو موت الخلية العامة التي تحفز الجينات من P. infestans27. وبصرف النظر عن الاستجابة الطفيفة للجرح ، لا يلاحظ موت الخلايا الآخذة في التوسع في المواقع التي تم تلقيحها ب pGR106-empty (التحكم السلبي). في الشكل 3A، تمثل البطاطا النمط الجيني MaR3 (Mastenbroek R3) ، واثنين من pGR106 - التأثيرات (E1 و E2) لم تحفز موت الخلية. في الشكل 3B، يتم تقديم نتيجة إيجابية لفحص التأثير في زولانوم هوانكابينسي البرية 354-1 ؛ ولوحظت استجابة موت الخلية لاثنين من pGR106-effectors (E1-E3، تمثل elicitins)28.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50971/50971fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50971/50971fig1.jpg"> الشكل 1 - الأرقام 1- الأرقام 1 أمثلة على التسلل الزراعي في البطاطا وN. بنثاميانا. النباتات بما في ذلك (أ) نوع وراثي للبطاطس MaR8 (Mastenbroek R8) ، (ب) N. تم اختراق بنثاميانا،(C) سولانوم بيرتولتي 483-1 و (D) سولانوم ريسي 210-5 مع خليط من سلالة Agrobacterium AGL1 (pVirG) 23 التي تحتوي على pBINplus-R3a وpK7WG2-AVR3a (التحكم الإيجابي) ، AGL1 (pvirG) (السيطرة السلبية) ، pBINplus-R3a ، وسبعة محفزات (E1-E7). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50971/50971fig1highres.jpg" target="_blank">انقر هنا لعرض صورة أكبر</a>.
<img alt="Figure 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50971/50971fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50971/50971fig2.jpg"> الشكل 2 - الأرقام 2- الأرقام التي تم تحديد كمي لاستجابات الترشيح الزراعي. تظهر الصورة جداول تسجيل تمثيلية لوفيات الخلايا، تتراوح بين 0٪ (بدون أعراض) و100٪ (موت الخلايا الملتخمة). وتتراوح الاستجابات المتوسطة من الاستجابات الضعيفة مثل داء الكلوروز إلى زيادة مستويات موت الخلايا. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50971/50971fig2highres.jpg" target="_blank">انقر هنا لعرض صورة أكبر</a>.
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50971/50971fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50971/50971fig3.jpg"> الشكل 3 - الأرقام 3- الأرقام التي يمكن أن أمثلة على الإصابة الزراعية PVX في البطاطا. البطاطا النمط الجيني MaR3 (Mastenbroek R3) (أ) وسولانوم huancabambense 354-1(B)الأسنان اختيار تلقيح مع pGR106-CRN2 (السيطرة الإيجابية)، pGR106 فارغة (السيطرة السلبية) وpGR106-E1-2 (التأثيرات)، أو pGR106-E1-E3، على التوالي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50971/50971fig3highres.jpg" target="_blank">انقر هنا لعرض صورة أكبر</a>.
الجدول 1 - الجداول متوسط YEB
<table border="1"><tbody>
<tr>
<td>1 لتر</td>
			<td>المقطر H2O</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 جم</td>
			<td>سكروز</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 جم</td>
			<td>مستخلص لحم البقر</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 جم</td>
			<td>بيبتون البكتريولوجية</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 غرام</td>
			<td>استخراج الخميرة</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 مل</td>
			<td>MgSO4 (1 م)</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 2 - الأرباح النواقل والسلالات المستخدمة للترشيح الزراعي والإصابة الزراعية PVX. يمكن استخدام عدة متجهات ثنائية. ناقلات في القائمة أدناه تسمح التعبير عالية من الجينات المرشحة وعملت بشكل جيد في أيدينا. نحن نفضل استخدام سلالة Agrobacterium GV3101 (pMP90)29 في N. بنثاميانا والعثور على AGL130 التي تحتوي على المساعد بلازميد pVirG (pBBR1MCS-5.virGN54D)23 أكثر ملاءمة في البطاطا31. وقد تم تحليل سلالات إضافية في مجموعات أخرى على مختلف النباتات نموذج بما في ذلك N. بنثاميانا ولكن ليس في البطاطا32.
<img alt="Table 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50971/50971table2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50971/50971table2.jpg">
GW: إصدارالبوابة 36
الجدول 3 - الأرباح MMA المتوسطة. <img alt="Table 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50971/50971table3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50971/50971table3.jpg">
ضبط درجة الحموضة إلى 5.6.

Watch this Scientific Journal Video about Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana at JoVE.com

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

الترشيح الزراعي والإصابة الزراعية PVX هي المقايسات الوظيفية الروتينية للتعبير عن المنتبذ عابرة من الجينات في النباتات. هذه الأساليب هي المقايسات الفعالة في استراتيجيات علم الآثار (المقاومة السريعة واكتشاف الجينات avirulence) وحاسمة للبحوث الحديثة في علم الأمراض النباتية الجزيئية. وهي تلبي الطلب على تحليل وظيفي قوي عالي الإنتاجية في النباتات.

الترشيح الزراعي والإصابة بالزراعة PVX في البطاطا ونيكوتيانا بنثاميانا

Agroinfiltration and PVX agroinfection are two efficient transient expression assays for functional analysis of candidate genes in plants. The most ...

agroinfiltration-pvx-agroinfection-potato-nicotiana

Research

JoVE Journal

Biology

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

20.1K Views.  Wageningen University. الترشيح الزراعي والإصابة الزراعية PVX هي المقايسات الوظيفية الروتينية للتعبير عن المنتبذ عابرة من الجينات في النباتات. هذه الأساليب هي المقايسات الفعالة في استراتيجيات علم الآثار (المقاومة السريعة واكتشاف الجينات avirulence) وحاسمة للبحوث الحديثة في علم الأمراض ال?...

Video: Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA regulators: microRNAs, which are produced from non-protein coding genes and short interfering RNAs (siRNAs). Plants use RNAi to control transposons and to exert tight control over developmental processes such as flower organ formation and leaf development2,3,4. Plants also use RNAi to defend themselves against infection by viruses. Consequently, many viruses have evolved suppressors of gene silencing to allow their successful colonization of their host5.
Virus-induced gene silencing (VIGS) is a method that takes advantage of the plant RNAi-mediated antiviral defense mechanism. In plants infected with unmodified viruses the mechanism is specifically targeted against the viral genome. However, with virus vectors carrying sequences derived from host genes, the process can be additionally targeted against the corresponding host mRNAs. VIGS has been adapted for high-throughput functional genomics in plants by using the plant pathogen Agrobacterium tumefaciens to deliver, via its Ti plasmid, a recombinant virus carrying the entire or part of the gene sequence targeted for silencing. Systemic virus spread and the endogenous plant RNAi machinery take care of the rest. dsRNAs corresponding to the target gene are produced and then cleaved by the ribonuclease Dicer into siRNAs of 21 to 24 nucleotides in length. These siRNAs ultimately guide the RNA-induced silencing complex (RISC) to degrade the target transcript2.
Different vectors have been employed in VIGS and one of the most frequently used is based on tobacco rattle virus (TRV). TRV is a bipartite virus and, as such, two different A. tumefaciens strains are used for VIGS. One carries pTRV1, which encodes the replication and movement viral functions while the other, pTRV2, harbors the coat protein and the sequence used for VIGS6,7. Inoculation of Nicotiana benthamiana and tomato seedlings with a mixture of both strains results in gene silencing. Silencing of the endogenous phytoene desaturase (PDS) gene, which causes photobleaching, is used as a control for VIGS efficiency. It should be noted, however, that silencing in tomato is usually less efficient than in N. benthamiana. RNA transcript abundance of the gene of interest should always be measured to ensure that the target gene has efficiently been down-regulated. Nevertheless, heterologous gene sequences from N. benthamiana can be used to silence their respective orthologs in tomato and vice versa8.

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

Description of a virus-induced gene silencing (VIGS) method for knock-down of gene expression in Nicotiana benthamiana and tomato.

فيروس من صنع جين إسكات (VIGS) في نيكوتيانا benthamiana والطماطم

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing worldwide demand for pharmaceuticals due to its limited scalability and high cost. Plants have shown to be one of the most promising alternative pharmaceutical production platforms that are robust, scalable, low-cost and safe. The recent development of virus-based vectors has allowed rapid and high-level transient expression of recombinant proteins in plants. To further optimize the utility of the transient expression system, we demonstrate a simple, efficient and scalable methodology to introduce target-gene containing Agrobacterium into plant tissue in this study. Our results indicate that agroinfiltration with both syringe and vacuum methods have resulted in the efficient introduction of Agrobacterium into leaves and robust production of two fluorescent proteins; GFP and DsRed. Furthermore, we demonstrate the unique advantages offered by both methods. Syringe infiltration is simple and does not need expensive equipment. It also allows the flexibility to either infiltrate the entire leave with one target gene, or to introduce genes of multiple targets on one leaf. Thus, it can be used for laboratory scale expression of recombinant proteins as well as for comparing different proteins or vectors for yield or expression kinetics. The simplicity of syringe infiltration also suggests its utility in high school and college education for the subject of biotechnology. In contrast, vacuum infiltration is more robust and can be scaled-up for commercial manufacture of pharmaceutical proteins. It also offers the advantage of being able to agroinfiltrate plant species that are not amenable for syringe infiltration such as lettuce and Arabidopsis. Overall, the combination of syringe and vacuum agroinfiltration provides researchers and educators a simple, efficient, and robust methodology for transient protein expression. It will greatly facilitate the development of pharmaceutical proteins and promote science education.

Plants offer a novel system for the production of pharmaceutical proteins on a commercial scale that is more scalable, cost-efficient and safe than current expression paradigms. In this study, we report a simple and convenient, yet scalable approach to introduce target-gene containing Agrobacterium tumefaciens into plants for protein transient expression.

Agroinfiltration كفاءة من النباتات للتعبير عابر الرفيع المستوى من البروتينات المؤتلف

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short period of time. However, this technology is only just beginning to be applied to large-scale production as many technological obstacles to scale up are now being overcome. Here, we demonstrate a simple and reproducible method for industrial-scale transient protein production based on vacuum infiltration of Nicotiana plants with Agrobacteria carrying launch vectors. Optimization of Agrobacterium cultivation in AB medium allows direct dilution of the bacterial culture in Milli-Q water, simplifying the infiltration process. Among three tested species of Nicotiana, N. excelsiana (N. benthamiana &#215; N. excelsior) was selected as the most promising host due to the ease of infiltration, high level of reporter protein production, and about two-fold higher biomass production under controlled environmental conditions. Induction of Agrobacterium harboring pBID4-GFP (Tobacco mosaic virus-based) using chemicals such as acetosyringone and monosaccharide had no effect on the protein production level. Infiltrating plant under 50 to 100 mbar for 30 or 60 sec resulted in about 95% infiltration of plant leaf tissues. Infiltration with Agrobacterium laboratory strain GV3101 showed the highest protein production compared to Agrobacteria laboratory strains LBA4404 and C58C1 and wild-type Agrobacteria strains at6, at10, at77 and A4. Co-expression of a viral RNA silencing suppressor, p23 or p19, in N. benthamiana resulted in earlier accumulation and increased production (15-25%) of target protein (influenza virus hemagglutinin).

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Transient protein production in Nicotiana plants based on vacuum infiltration with Agrobacteria carrying launch vectors (Tobacco mosaic virus-based) is a rapid and economic approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins. We simplified the procedure and improved target accumulation by optimizing conditions of bacteria cultivation, selecting host species, and co-introducing RNA silencing suppressors.

الأمثل والاستفادة من<em&gt; الأجرعية</em&gt; بوساطة إنتاج بروتين عابر في<em&gt; نيكوتيانا</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel protein-protein interaction pairs and monitoring protein interaction dynamics are of particular interest for revealing how plants respond to environmental factors and/or developmental signals. A plethora of approaches have been developed to examine protein-protein interactions, either in vitro or in vivo. Among them, the recently established luciferase complementation imaging (LCI) assay is the simplest and fastest method for demonstrating in vivo protein-protein interactions. In this assay, protein A or protein B is fused with the amino-terminal or carboxyl-terminal half of luciferase, respectively. When protein A interacts with protein B, the two halves of luciferase will be reconstituted to form a functional and active luciferase enzyme. Luciferase activity can be recorded with a luminometer or CCD-camera. Compared with other approaches, the LCI assay shows protein-protein interactions both qualitatively and quantitatively. Agrobacterium infiltration in Nicotiana benthamiana leaves is a widely used system for transient protein expression. With the combination of LCI and transient expression, these approaches show that the physical interaction between COP1 and SPA1 was gradually reduced after jasmonate treatment.

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

This manuscript describes an easy and rapid experimental procedure for determining protein-protein interactions based on the measurement of luciferase activity.

لوسيفراس "التكامل بالتصوير الإنزيم" في أوراق نيكوتيانا بينثاميانا "تحديد عابر ديناميات التفاعل" البروتين-بروتين

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...

Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana

High demand for antibodies as therapeutic interventions for various infectious, metabolic, autoimmune, neoplastic, and other diseases creates a growing need in developing efficient methods for recombinant antibody production. As of 2019, there were more than 70 FDA-approved monoclonal antibodies, and there is exponential growth potential. Despite their promise, limiting factors for widespread use are manufacturing costs and complexity. Potentially, plants offer low-cost, safe, and easily scalable protein manufacturing&#160;strategies. Plants like Nicotiana benthamiana not only can correctly fold and assemble complex mammalian proteins but also can add critical post-translational modifications similar to those offered by mammalian cell cultures. In this work, by using native GFP and an acid-stable variant of green fluorescent protein (GFP) fused to human monoclonal antibodies, we were able to visualize the entire transient antibody expression and purification process from N. benthamiana plants. Depending on the experiment&#39;s purpose, native GFP fusion can ensure easier visualization during the expression phase in the plants, while acid-stable GFP fusion allows for visualization during downstream processing. This scalable and straightforward procedure can be performed by a single researcher to produce milligram quantities of highly pure antibody or antibody fusion proteins in a matter of days using only a few small plants. Such a technique can be extended to the visualization of any type of antibody purification process and potentially many other proteins, both in plant and other expression systems. Moreover, these techniques can benefit virtual instructions and be executed in a teaching laboratory by undergraduate students possessing minimal prior experience with molecular biology techniques, providing a foundation for project-based exploration with real-world applications.

Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana

We describe here a simple method for expression, extraction, and purification of recombinant human IgG fused to GFP in Nicotiana benthamiana. This protocol can be extended to purification and visualization of numerous proteins that utilize column chromatography. Moreover, the protocol is adaptable to the in-person and virtual college teaching laboratory, providing project-based exploration.

إنتاج بروتينات IgG فيوجن أعرب عنها بشكل عابر في نيكوتيانا بنثاميانا

High demand for antibodies as therapeutic interventions for various infectious, metabolic, autoimmune, neoplastic, and other diseases creates a growing ...

القياس الكمي لبدء موت الخلايا من خلال التصوير المستمر

Studying Cell Death Initiation Using a Digital Microscope

Hypersensitive response (HR)-conferred resistance is an effective defense response that can be determined by the N resistance genes. HR is manifested as the formation of cell death zones on inoculated leaves. Here, a protocol for studying the rate of cell death initiation by imaging inoculated leaves in the time between the cell death initiation and the cell death appearance using a digital microscope is presented. The digital microscope enables a continuous imaging process in desired intervals, which allows an accurate determination of cell death initiation rate up to minutes exactly, as opposed to hours in traditional methods. Imaging with the digital microscope is also independent of light and can therefore be used during day and night without disturbing the circadian rhythm of the plant. Different pathosystems resulting in programmed cell death development could be studied using this protocol with minor modifications. Overall, the protocol thus allows simple, accurate, and inexpensive identification of cell death initiation rate.

تسليط الضوء على المؤلف: نهج مبسط لدراسة بدء موت الخلايا في استجابة شديدة الحساسية 

Here we present a protocol for studying the rate of programmed cell death initiation by continuously imaging inoculated leaves following cell death induction.

دراسة بدء موت الخلايا باستخدام المجهر الرقمي

Hypersensitive response (HR)-conferred resistance is an effective defense response that can be determined by the N resistance genes. HR is manifested as ...

An Experimental Study on Colorado Potato Beetle Hibernation Under Natural Conditions

One of the major pests of potato Solanum tuberosum L. in the temperate zone is the insect Colorado potato beetle (CPB). Most studies on the immunity and diseases of the CPB are conducted during active feeding stages. Nonetheless, there are fewer studies on resting stages, although these beetles spend most of their life cycle in a state of winter diapause (hibernation). In this work, a method for investigating CPB hibernation under natural conditions was developed and tested, offering an opportunity to collect a sufficient number of individuals in winter. In this article, CPB survival was assessed, and infectious agents at different stages of hibernation were identified. CPB mortality increased during the hibernation, reaching a maximum in April-May. Entomopathogenic fungi (Beauveria, Isaria, and Lecanicillium) and bacteria Bacillus, Sphingobacterium, Peribacillus, Pseudomonas, and Serratia were isolated&#160;from the dead insects. The survival rate of the beetles for the entire hibernation period was 61%. No frozen or desiccated beetles were found, indicating the success of the presented method.

Here we present a method for studying Colorado potato beetle hibernation under the natural conditions of the temperate zone as well as a technique for collecting beetles in winter. This method allows to obtain a desired number of overwintering individuals for various analyses at any stage of hibernation.

دراسة تجريبية على سبات خنفساء البطاطس في كولورادو في ظل الظروف الطبيعية

One of the major pests of potato Solanum tuberosum L. in the temperate zone is the insect Colorado potato beetle (CPB). Most studies on the immunity and ...

تحليل قدرة البطاطا على الصمود في ظل الضغوط المرتبطة بالمناخ

High Throughput Image-Based Phenotyping for Determining Morphological and Physiological Responses to Single and Combined Stresses in Potato

High throughput image-based phenotyping is a powerful tool to non-invasively determine the development and performance of plants under specific conditions over time. By using multiple imaging sensors, many traits of interest can be assessed, including plant biomass, photosynthetic efficiency, canopy temperature, and leaf reflectance indices. Plants are frequently exposed to multiple stresses under field conditions where severe heat waves, flooding, and drought events seriously threaten crop productivity. When stresses coincide, resulting effects on plants can be distinct due to synergistic or antagonistic interactions. To elucidate how potato plants respond to single and combined stresses that resemble naturally occurring stress scenarios, five different treatments were imposed on a selected potato cultivar (Solanum tuberosum L., cv. Lady Rosetta) at the onset of tuberization, i.e. control, drought, heat, waterlogging, and combinations of heat, drought, and waterlogging stresses. Our analysis shows that waterlogging stress had the most detrimental effect on plant performance, leading to fast and drastic physiological responses related to stomatal closure, including a reduction in the quantum yield and efficiency of photosystem II and an increase in canopy temperature and water index. Under heat and combined stress treatments, the relative growth rate was reduced in the early phase of stress. Under drought and combined stresses, plant volume and photosynthetic performance dropped with an increased temperature and stomata closure in the late phase of stress. The combination of optimized stress treatment under defined environmental conditions together with selected phenotyping protocols allowed to reveal&#160;the dynamics of morphological and physiological responses to single and combined stresses. Here, a useful tool is presented for plant researchers looking to identify plant traits indicative of resilience to several climate change-related stresses.

تسليط الضوء على المؤلف: كشف استجابات النبات للضغوط اللاأحيائية باستخدام منصة PlantScreen الروبوتية

We designed an image-based phenotyping protocol to determine the morphological and physiological responses to single and combined heat, drought, and waterlogging treatments. This approach enabled the identification of early, late, and recovery responses at a whole plant level, particularly above-ground parts, and highlighted the necessity of using multiple imaging sensors.

التنميط الظاهري القائم على الصور عالي الإنتاجية لتحديد الاستجابات المورفولوجية والفسيولوجية للإجهادات المفردة والمركبة في البطاطس

High throughput image-based phenotyping is a powerful tool to non-invasively determine the development and performance of plants under specific conditions ...