Çalışma kısmen Wageningen Üniversite Fonu (WUF), Çin Lisansüstü Öğrenciler Burs Konseyi Programı ve 12378 NWO-VIDI hibesi tarafından desteklenmektedir.

1. Bitki Yetiştirme ve Test Koşulları
<ol><li>Bitkileri 18-22 °C sıcaklık aralığında ve doğal ışık rejimi altında veya 16 saat/8 saat gündüz/gece rejimi ile kontrollü seralarda veya iklim odalarında yetiştirin ve bakımını sağlayın. Bitkileri daha yönetilebilir hale getirmek için aksiller dalları çıkarın.</li>
	<li>Patates için, Murashige-Skoog (MS) ortamı (20 g/L sakkaroz) içeren steril plastik kavanozlarda in vitro plantletleri muhafaza edin, 5 g/L MS vitaminli tuz, 8 g/L agar, pH 5.8) 18 °C'deki iklim odalarında kontrollü koşullarda iki hafta boyunca 16 saat/8 saat gündüz/gece rejimi ile ve daha sonra düzenlenmiş sera bölmelerinde sterilize edilmiş toprak saksılara aktarın.</li>
</ol>2. Agroinfiltrasyon
<ol><li>Bitki malzemesi: Nicotiana benthamianaiçin, yaklaşık 4-5 haftalık tohum yetiştirilen bitkileri kullanın. Patates için, in vitrodanyaklaşık 4-5 haftalık nakiller kullanın. Sızmalar için genç, sağlıklı ve tamamen gelişmiş yaprakları seçin.</li>
	<li>
Agrobakteri kültürü:<ol>
<li>YEB ortamını önceden hazırlayın (Tablo 1). 50 ml'lik tüpleri 1 μl asetosyringon (200 mM), 100 μl MES tamponu (2-(N-morpholino)-etan sülfik asit, 1 M) ve uygun antibiyotiklerle desteklenmiş 10 ml YEB ortamı ile doldurun. Yeb içine istenen suşların pipet20μl gliserol stoku ( Tablo 2 ) (ilgi genini içeren). Bu testteki tüm Agrobacterium suşları için kültürleri aynı anda başlatın. Hücreleri 28 °C ve 200 rpm'de 1-2 gün boyunca yaklaşık 1.0'ın OD600'üne sallayarak kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Hücreleri 10 dakika boyunca 3.000 x g'da santrifüjleme ile hasat edin. Süpernatant dökün ve peleti taze yapılmış MMA ortamında ( Tablo 3 )0.3'ünOD600'üne yeniden harcayın. Onları yeniden diriltmek için hafifçe girdap hücreleri. İki bakteri suşunun coinfiltrasyonunu için kültürü 1:1 oranında karıştırın.</li>
		<li>Sızmalardan önce kültürü oda sıcaklığında 1-6 saat boyunca tezgahta bırakın. Bu arada, sızılacak bitkileri ve deney tarihini etiketleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sızmalar: Agrobacterium süspansiyonlarına sızmak için 1 ml iğnesiz şırınga kullanın. Şırıngan süspansiyonları ile yaprak panelleri dikkatlice ve yavaşça enjekte edin (sağlık ve güvenlik nedenleriyle bu işlem sırasında göz koruması giyilmelidir). Her suş için en az üç bitkiye sız. Üç taraflı olarak hizmet etmek için bitki başına üç yaprak kullanın. Not: Normalde, 1 ml Agrobacterium süspansiyon s 3 N. benthamianabitkisi için yeterli olabilir. Patates için daha fazla süspansiyona ihtiyaç vardır, çünkü Solanum türlerinin yapraklarına sızmak daha zordur. Gerekli süspansiyon hacimleri Solanum türlerine bağlıdır. Eldivenleri değiştirerek veya eldivenleri sızmalar arasında etanol ile sterilize ederek ve aşıdan sonraki güne kadar bitkileri sulamayarak çapraz kontaminasyondan kaçının.</li>
	<li>Puanlama: Hücre ölümü fenotipi net olduğunda sızmadan yaklaşık 3 gün sonra makroskopik yanıtlar puanlama(Şekil 1). Hücre ölümü fenotipi nicel ise, verilen kriterleri kullanın (Şekil 2). Kısaca, hücre ölümünün makroskopik olarak puanlama ölçekleri esas olarak sızılan bölgenin hücre ölüm yüzdelerine bağlıdır. Hücre ölüm yüzdeleri %0 (semptomsuz) ile %100 (birikmiş hücre ölümü) arasında bir ölçekte tasvir edilir. Ara yanıtlar kloroz gibi zayıf yanıtlardan artan hücre ölümü seviyelerine kadar uzanır. İstenirse, makroskopik puanlama modern fotoğraf görüntüleme ekipmanı kullanılarak nicel olarak da değerlendirilebilir.</li>
</ol>3. PVX Agroinfection
<ol><li>Bitki malzemesi: N. benthamianaiçin, yaklaşık 2-3 haftalık tohum yetiştirilen bitkileri kullanın. Patates için, in vitrodanyaklaşık 2-3 haftalık nakiller kullanın. Büyük ölçekli testler için, biraz daha eski (4-5 hafta) bitkiler kullanın, çünkü bu bitkiler daha fazla sayıda Agrobacterium aşı lekesini barındırmak için daha fazla ve daha büyük yapraklara sahiptir.</li>
	<li>
Agrobacterium kültürü:<ol>
<li>YEB ortamını önceden hazırlayın. 10 ml'lik tüpleri uygun antibiyotiklerle desteklenmiş 3 ml YEB ile doldurun. Yeb içine istenen suşların pipet20μl gliserol stoku ( Tablo 2 ) (ilgi genini içeren). Bu testteki tüm Agrobacterium suşları için kültürleri aynı anda başlatın. Hücreleri 28 °C ve 200 rpm'de 1-2 gün boyunca yaklaşık 1.0'ın OD600'üne sallayarak kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Pipet her Agrobacterium suşunun yaklaşık 300 μl'si ve bunları uygun antibiyotiklerle desteklenmiş LB katı agar orta plakalarına yayın ve 28 °C'de 1-2 gün boyunca hücreleri kuluçkaya yatır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Enfeksiyon: Tabakta Agrobacterium kültürünü toplamak için bir spatula kullanın. Spatula üzerindeki Agrobacterium kültürüne ahşap bir kürdan batırın ve çok miktarda bakteri aşılamak için yaprakları delin. Her suş için en az üç bitki aşılayın. Üç taraflı olarak hizmet etmek için bitki başına üç yaprak kullanın. Her yaprakta, her suş için birden fazla aşılama bölgesi yapın.</li>
	<li>Puanlama: Aşılamadan yaklaşık iki hafta sonra makroskopik yanıtlar puanlama(Şekil 3). Yüksek aktarım hızına sahip ekranlar için, her aşı noktası için nitel yanıtları (evet/hayır) kaydedin. Ardından yanıt veren sitelerin yüzdesini hesaplayın ve bunları denetimlerle karşılaştırın.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Vleeshouwers, V. G. A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+and+exploiting+late+blight+resistance+in+the+age+of+effectors.">Understanding and exploiting late blight resistance in the age of effectors.</a> Ann. Rev. Phytopathol. 49, 507-531 (2011).</li><li>Ellis, J. G., Rafiqi, M., Gan, P., Chakrabarti, A., Dodds, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+discovery+and+functional+analysis+of+effector+proteins+of+fungal+and+oomycete+plant+pathogens.">Recent progress in discovery and functional analysis of effector proteins of fungal and oomycete plant pathogens.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 12, 399-405 (2009).</li><li>Vleeshouwers, V. G. A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+genomics+accelerates+discovery+and+functional+profiling+of+potato+disease+resistance+and+Phytophthora+infestans+avirulence+genes.">Effector genomics accelerates discovery and functional profiling of potato disease resistance and Phytophthora infestans avirulence genes.</a> Plos One. 3, 1-10 (2008).</li><li>Oh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+planta+expression+screens+of+Phytophthora+infestans+RXLR+effectors+reveal+diverse+phenotypes,+including+activation+of+the+Solanum+bulbocastanum+disease+resistance+protein+Rpi-blb2.">In planta expression screens of Phytophthora infestans RXLR effectors reveal diverse phenotypes, including activation of the Solanum bulbocastanum disease resistance protein Rpi-blb2.</a> Plant Cell. 21, 2928-2947 (2009).</li><li>Tyler, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phytophthora+genome+sequences+uncover+evolutionary+origins+and+mechanisms+of+pathogenesis.">Phytophthora genome sequences uncover evolutionary origins and mechanisms of pathogenesis.</a> Science. 313, 1261-1266 (2006).</li><li>Haas, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequence+and+analysis+of+the+Irish+potato+famine+pathogen+Phytophthora+infestans.">Genome sequence and analysis of the Irish potato famine pathogen Phytophthora infestans.</a> Nature. 461, 393-398 (2009).</li><li>Levesque, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequence+of+the+necrotrophic+plant+pathogen+Pythium+ultimum+reveals+original+pathogenicity+mechanisms+and+effector+repertoire.">Genome sequence of the necrotrophic plant pathogen Pythium ultimum reveals original pathogenicity mechanisms and effector repertoire.</a> Genome Biol. 11, 1-22 (2010).</li><li>Lamour, K. H., Win, J., Kamoun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oomycete+genomics:+new+insights+and+future+directions.">Oomycete genomics: new insights and future directions.</a> FEMS Microbiol. Lett. 274, 1-8 (2007).</li><li>Stassen, J. H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+identification+in+the+lettuce+downy+mildew+Bremia+lactucae+by+massively+parallel+transcriptome+sequencing.">Effector identification in the lettuce downy mildew Bremia lactucae by massively parallel transcriptome sequencing.</a> Mol. Plant Pathol. 13, 719-731 (2012).</li><li>Kemen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+gain+and+loss+during+evolution+of+obligate+parasitism+in+the+white+rust+pathogen+of+Arabidopsis+thaliana.">Gene gain and loss during evolution of obligate parasitism in the white rust pathogen of Arabidopsis thaliana.</a> PLoS Biol. 9, 1-21 (2011).</li><li>Win, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Effector biology of plant-associated organisms: concepts and perspectives. , 1-13 (2012).</li><li>Hogenhout, S. A., van der Hoorn, R. A. L., Terauchi, R., Kamoun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+concepts+in+effector+biology+of+plant-associated+organisms.">Emerging concepts in effector biology of plant-associated organisms.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 22, 115-122 (2009).</li><li>Kamoun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+catalogue+of+the+effector+secretome+of+plant+pathogenic+oomycetes.">A catalogue of the effector secretome of plant pathogenic oomycetes.</a> Ann. Rev. Phytopathol. 44, 41-60 (2006).</li><li>van der Hoorn, R. A. L., Laurent, F., Roth, R., De Wit, P. J. G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agroinfiltration+is+a+versatile+tool+that+facilitates+comparative+analyses+of+Avr9/Cf-9-induced+and+Avr4/Cf-4-induced+necrosis.">Agroinfiltration is a versatile tool that facilitates comparative analyses of Avr9/Cf-9-induced and Avr4/Cf-4-induced necrosis.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 13, 439-446 (2000).</li><li>Dangl, J. L., Jones, J. D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+pathogens+and+integrated+defence+responses+to+infection.">Plant pathogens and integrated defence responses to infection.</a> Nature. 411, 826-833 (2001).</li><li>Kapila, J., de Rycke, R., van Montagu, M., Angenon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Agrobacterium-mediated+transient+gene+expression+system+for+intact+leaves.">An Agrobacterium-mediated transient gene expression system for intact leaves.</a> Plant Sci. 122, 101-108 (1997).</li><li>Kanneganti, T. D., Huitema, E., Kamoun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+planta+expression+of+oomycete+and+fungal+genes.">In planta expression of oomycete and fungal genes.</a> Methods Mol. Biol. 354, 35-43 (2007).</li><li>Vleeshouwers, V. G. G. A., Rietman, H., Lamour, K., Kamoun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+planta+expression+systems.+Oomycete+Genetics+and+Genomics.">In planta expression systems. Oomycete Genetics and Genomics.</a> Diversity, Interactions, and Research Tools. 23, 455-475 (2009).</li><li>Peng, W. T., Lee, Y. W., Nester, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phenolic+recognition+profiles+of+the+Agrobacterium+tumefaciens+VirA+protein+are+broadened+by+a+high+level+of+the+sugar+binding+protein+ChvE.">The phenolic recognition profiles of the Agrobacterium tumefaciens VirA protein are broadened by a high level of the sugar binding protein ChvE.</a> J. Bacteriol. 180, 5632-5638 (1998).</li><li>Lu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+virus-induced+gene+silencing+implicates+heat+shock+protein+90+in+plant+disease+resistance.">High throughput virus-induced gene silencing implicates heat shock protein 90 in plant disease resistance.</a> EMBO J. 22, 5690-5699 (2003).</li><li>Ma, L., Lukasik, E., Gawehns, F., Takken, F. L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+agroinfiltration+for+transient+expression+of+plant+resistance+and+fungal+effector+proteins+in+Nicotiana+benthamiana+leaves.">The use of agroinfiltration for transient expression of plant resistance and fungal effector proteins in Nicotiana benthamiana leaves.</a> Methods Mol. Biol. 835, 61-74 (2012).</li><li>Bhaskar, P. B., Venkateshwaran, M., Wu, L., An&#233;, J. M., Jiang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transient+gene+expression+and+silencing:+A+rapid+tool+for+functional+gene+assay+in+potato.">Agrobacterium-mediated transient gene expression and silencing: A rapid tool for functional gene assay in potato.</a> Plos One. 4, 1-8 (2009).</li><li>van der Fits, L., Deakin, E. A., Hoge, J. H. C., Memelink, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ternary+transformation+system:+constitutive+virG+on+a+compatible+plasmid+dramatically+increases+Agrobacterium-mediated+plant+transformation.">The ternary transformation system: constitutive virG on a compatible plasmid dramatically increases Agrobacterium-mediated plant transformation.</a> Plant Mol. Biol. 43, 495-502 (2000).</li><li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+genomics+enabled+the+isolation+of+the+R3a+late+blight+resistance+gene+in+potato.">Comparative genomics enabled the isolation of the R3a late blight resistance gene in potato.</a> Plant J. 42, 251-261 (2005).</li><li>Armstrong, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ancestral+oomycete+locus+contains+late+blight+avirulence+gene+Avr3a,+encoding+a+protein+that+is+recognized+in+the+host+cytoplasm.">An ancestral oomycete locus contains late blight avirulence gene Avr3a, encoding a protein that is recognized in the host cytoplasm.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 7766-7771 (2005).</li><li>Kim, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad+spectrum+late+blight+resistance+in+potato+differential+set+plants+MaR8+and+MaR9+is+conferred+by+multiple+stacked+R+genes.">Broad spectrum late blight resistance in potato differential set plants MaR8 and MaR9 is conferred by multiple stacked R genes.</a> Theor. Appl. Genet. 124, 923-935 (2012).</li><li>Torto, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EST+mining+and+functional+expression+assays+identify+extracellular+effector+proteins+from+the+plant+pathogen+Phytophthora.">EST mining and functional expression assays identify extracellular effector proteins from the plant pathogen Phytophthora.</a> Genome Res. 13, 1675-1685 (2003).</li><li>Vleeshouwers, V. G. A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agroinfection-based+high-throughput+screening+reveals+specific+recognition+of+INF+elicitins+in+Solanum.">Agroinfection-based high-throughput screening reveals specific recognition of INF elicitins in Solanum.</a> Mol. Plant Pathol. 7, 499-510 (2006).</li><li>Koncz, C., Schell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promoter+of+TL-DNA+gene+5+controls+the+tissue-specific+expression+of+chimeric+genes+carried+by+a+novel+type+of+agrobacterium+binary.">The promoter of TL-DNA gene 5 controls the tissue-specific expression of chimeric genes carried by a novel type of agrobacterium binary.</a> Mol. Gen. Genet. 204, 383-396 (1986).</li><li>Lazo, G. R., Stein, P. A., Ludwig, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA+transformation-competent+Arabidopsis+genomic+library+in+Agrobacterium.">A DNA transformation-competent Arabidopsis genomic library in Agrobacterium.</a> Bio-Technol. 9, 963-967 (1991).</li><li>Rietman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Putting the Phytophthora infestans genome sequence at work; multiple novel avirulence and potato resistance gene candidates revealed [PhD thesis]. , (2011).</li><li>Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+Agrobacterium-mediated+transient+assays+of+gene+expression+in+lettuce,+tomato+and+Arabidopsis.">Optimization of Agrobacterium-mediated transient assays of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis.</a> Plant Biotechnol. J. 3, 259-273 (2005).</li><li>van engelen, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pBINPLUS+-+an+improved+plant+transformation+vector+based+on+pBIN19.">pBINPLUS - an improved plant transformation vector based on pBIN19.</a> Transgenic Res. 4, 288-290 (1995).</li><li>Karimi, M., Inze, D., Depicker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GATEWAYTM+vectors+for+Agrobacterium-mediated+plant+transformation.">GATEWAYTM vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation.</a> Trends Plant Sci. 7, 193-195 (2002).</li><li>Xiang, C. B., Han, P., Lutziger, I., Wang, K., Oliver, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mini+binary+vector+series+for+plant+transformation.">A mini binary vector series for plant transformation.</a> Plant Mol. Biol. 40, 711-717 (1999).</li><li>Curtis, M. D., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gateway+cloning+vector+set+for+high-throughput+functional+analysis+of+genes+in+planta.">A gateway cloning vector set for high-throughput functional analysis of genes in planta.</a> Plant Physiol. 133, 462-469 (2003).</li></ol>

Yazarlar rakip finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Agroinfiltrasyon ve agroinfection gibi geçici tahliller, modern moleküler bitki patolojisi araştırmaları için hayati önem taşıyan etkili yöntemlerdir. Bazı sınırlamalara rağmen, bu yöntemler tesislerde verimli ve sağlam yüksek verimli fonksiyonel analiz talebini karşılar.
Agroinfiltrasyon sistemi, çeşitli bitki türlerinde yaygın olarak kullanılan işlevsel bir testtir. Agroinfiltrasyon, etkileşime giren proteinlerin eşzamanlı ifadesiyle aynı hücreye birkaç transjenin verilmesini kolaylaştırır. Bu, Avr genlerini ifade eden Agrobacterium suşlarını eşleşen R genlerini ifade eden suşlarla birleştirmekle R-AVR ilişkilerinin yeniden kapsüllanması için avantajlıdır. Ayrıca, bilinen R-AVR çiftleri için, bu tür coinfiltrations pozitif kontroller olarak kullanılabilir. Bu tür denetimlerin dahil edilmesi önemlidir, çünkü bazı bitki genotiplerinde, dönüşüm verimliliği yanıtları algılamak için eşiğin altında olabilir. Negatif kontroller de dahil olmak üzere, örneğin gen kesici ucu olmayan bir vektör içeren bir Agrobacterium suşu, belirli bir bitki genotipinin Agrobacterium'aspesifik olmayan savunma yanıtlarını yükseltip yükseltmediğini belirlemek için de gereklidir. Bu özellik patates germplazmasında belirli bir sıklıkta ortaya çıkar ve tüm Solanum türleri bu Agrobakterimbazlı ifade sistemi için iyi uygun değildir. Genellikle, agroinfiltrasyon tahlilleri N. benthamiana ve çoğu patates genotipinde çok iyi çalışır. Efekoromiklere ek olarak, agroinfiltrasyon tekniği için transgenelerden protein üretimi ve konfokal mikroskopi ile bitki hücrelerinde protein lokalizasyonu gibi çeşitli potansiyel uygulamalar vardır.
PVX agroinfection oldukça hassas bir tarama sistemidir ve genellikle yüksek verimli taramalar için daha uygundur. Agrobacterium artık sadece yerel olarak mevcut olduğundan, PVX virüsü transjenin daha fazla yayılmasını ele aldığından, bu bakteriye spesifik olmayan yanıtlar artık çok rahatsız edici değildir. Bununla birlikte, bitkiler PVX'e karşı dirençli olabilir veya aşırı direnç (ER) yanıtları monte edebilir ve bu durumda agroinfeksiyon yöntemi uygun değildir. PVX agroinfection yönteminin bir başka sınırlaması, ilgi çekici genin kesici uç boyutudur. Gözlenen yanıt fenotipleri, yarayı çevreleyen yoğun siyah nekrozdan aşı noktasının yakınındaki soluk nekroza kadar değişebilir. Hem N. benthamiana hem de Solanum türlerinde, PVX agroinfection agroinfiltrasyondan daha hassas olarak kabul edilir.
Çeşitli test edilmiş bitki genotiplerinin genetik arka planının bazı kısıtlamalara sahip olabileceğini göz önünde bulundurarak (yukarıya bakın), genellikle PVX agroinfection ve agroinfiltrasyon ile benzer sonuçlar elde ediyoruz. Bu sonuçlar, protein infiltrationları29 ve ELISA3gibi diğer tahlillerde elde edildiği gibi karşılaştırılabilir. Her iki sistemin avantajlarını ve sınırlamalarını göz önünde bulundurarak, birbirini tamamlamak veya bağımsız sonuçları onaylamak için her iki yöntemi de kullanmanızı öneririz.

Effectoromics, yüksek verimli fonksiyonel genomik yaklaşım son zamanlarda mahsul bitkilerinde direnç (R) genlerini ve patojenlerin eşleşen avirulence(Avr) genlerini tanımlamak için güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır1-4. R genleri ile daha fazla zaman alan kararlı dönüşümün aksine, efekoromik stratejisi patojen gen dizilerinin geçici testlerine dayanmaktadır.
Genomik dönemden bu yana, bitki patojenlerinin genomları yaygın olarak araştırılmaktadır. Örneğin, en yıkıcı bitki patojenlerini içeren oomycetes için, bitki ile etkileşim sırasında rol oynayan genler için büyük dizi koleksiyonları oluşturulmuş ve analiz edilmiştir5-10. Patojen proteinlerinin bir sınıfı, enfeksiyonu (virülans faktörleri) kolaylaştırmak veya savunma yanıtlarını (avirulence faktörleri) tetiklemek için konak hücre yapısını ve işlevini manipüle eden efektörleri temsil eder11-13. R genleri içeren bitki hücrelerinde Avr genlerinin ekspresy ekspresyotiği genellikle aşırı duyarlı hücre ölüm yanıtı (HR)14,15ile sonuçlanır. R ve Avr genlerinin planta ifadesinde Agrobacterium tumefaciensgibi geçici ekspresyon sistemleri kullanılarak gerçekleştirilebilir - tabanlı geçici dönüşüm (agroinfiltrasyon)16. Bu geçici dönüşüm viral ekspresyon sistemleri (agroinfection)17,18ile birlikte de uygulanabilir.
Agroinfiltrasyon için, en sık kullanılan ajan, dikot bitkilerinin geniş bir konak aralığı patojeni olan A . tumefaciens'tir. A . tumefaciens tümör indükleyen (Ti) plazmid içerir. Bir Ti plazmidinden DNA (T-DNA) transferi, bakterinin virülans makineleri aktive edildikten sonra bitki hücrelerine yerleştirilecektir. Bu, hafif asidik bir ortamda salınan düşük moleküler ağırlıklı fenolik bileşikler ve monoakkaritler tarafından yaralı bitki hücrelerinde tetiklenebilir19. Virülans geni, Agrobacterium süspansiyonlarının ana damarlar tarafından tanımlanan yaprak panellerine sızması sonrasında aktive edilir. Daha sonra yaprak panellerindeki bitki hücreleri dönüştürülecek ve T-DNA bölgesinde bulunan transgene(ler) ifade edilecektir.
Agroinfection, bir virüsün bitki hücrelerine nakline aracılık eden yara aşılanmış Agrobacterium'a dayanır. Virüs daha sonra Agrobacteriumyokluğunda bitişik bitki dokularına daha da yayılır. Agroinfection için birkaç bitki virüsü kullanılabilir. RNA virüsleri gen ekspresyörü için ideal vektörlerdir çünkü enfekte bitkilerde çok yüksek seviyelere çarpabilirler. Bitki RNA virüsleri arasında, Patates Virüsü X (PVX) efekoromik ekranlar için yaygın olarak kullanılır. Eklenen bir gen için fonksiyonel testleri kolaylaştırmak için, Karnabahar mozaik virüsü 35S promotörü ve nopalin sintans terminatörü tarafından kuşatılan PVX genomu içeren ikili vektörler, A. tumefaciens20'ninT-DNA'sına klonlandı. T-DNA bitki hücrelerine aktarıldıktan sonra, T-DNA'da bulunan PVX genom 35S promotöründen yazıya dökülür. Daha sonra virüs parçacıkları enfekte bitkilerde sistemik olarak yayılır ve eklenen genin ekspresykülü ile sonuçlanır. Hem Agrobacterium hem de PVX'e dayanan bu yönteme PVX agroinfection denir.
Burada hem agroinfiltrasyon hem de PVX agroinfection tahlilleri için örnekler gösteriyoruz. Konak bitkiler olarak, efekoromik yaklaşımların öncülük edildiği ve başarılı olduğu kanıtlanmış patates germplasm(Solanum bölümü Petota)kullanıyoruz3,4. Biz de kullanırız Nicotiana benthamiana, Solanaceous bitkilerinde bir model bitki olarak ünlüdür14,21,22.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="955">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col span="2" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Beef extract</td>
			<td style="width:267px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">B4888</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Bacteriological peptone</td>
			<td style="width:267px;">Oxoid</td>
			<td style="width:219px;">LP0037</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:267px;">Oxoid</td>
			<td style="width:219px;">LP0021</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">MgSO4</td>
			<td style="width:267px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">208094</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">MS salts (without vitamins)</td>
			<td style="width:267px;">Duchefa Biochemie</td>
			<td style="width:219px;">M0221</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">MES</td>
			<td style="width:267px;">Duchefa Biochemie</td>
			<td style="width:219px;">M1503</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">LB broth powder</td>
			<td style="width:267px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">L3022</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Acetosyringone</td>
			<td style="width:267px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">D134406</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Syringe (1 ml)</td>
			<td style="width:267px;">BD Plastipak</td>
			<td style="width:219px;">300013</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Incubator</td>
			<td style="width:267px;">Infors HT</td>
			<td style="width:219px;">Multitron II</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:267px;">Heraeus</td>
			<td style="width:219px;">Multifuge 3S-R</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:267px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:219px;">Biophotometer 6131</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

agroinfiltration and pvx agroinfection in potato and nicotiana benthamiana

Agroinfiltrasyon ve PVX agroinfection, bitkilerdeki aday genlerin fonksiyonel analizi için iki etkili geçici ifade tahlilleridir. Agroinfiltrasyon için en sık kullanılan ajan, birçok dikot bitki türünün patojeni olan Agrobacterium tumefaciens'tir. Bu, agroinfiltrasyonun birçok bitki türüne uygulanabileceği anlamına gelir. Burada, bu yöntemleri patatese (Solanum tuberosum), ilgili yabani yumru taşıyan Solanum türlerine (Solanum bölümü Petota) ve model bitki Nicotiana benthamiana' ya uygularken protokollerimizi ve beklenen sonuçları sunuyoruz. Direnç (R) veya avirulence(Avr) genleri gibi tek genlerin fonksiyonel analizine ek olarak, agroinfiltrasyon tahlili, R ve Avr transgenes'i aynı hücreye teslim ederek belirli konak patojen etkileşimleriyle ilişkili R-AVR etkileşimlerini yeniden yakalamak için çok uygundur. Bununla birlikte, bazı bitki genotipleri Agrobacterium'a spesifik olmayan savunma yanıtları örneğin birkaç patates genotipi için gözlemlediğimiz gibi yükseltebilir. Agroinfiltrasyon ile karşılaştırıldığında, PVX agroinfection ile AVR aktivitesinin tespiti daha hassastır, fonksiyonel ekranlarda daha yüksek verim ve Agrobacterium'aspesifik olmayan savunma yanıtlarına karşı daha az hassastır. Bununla birlikte, PVX'e spesifik olmayan savunma oluşabilir ve virüs kaynaklı aşırı direnç nedeniyle yanıtları kaçırma riski vardır. Bu sınırlamalara rağmen, deneyimlerimize göre, agroinfiltrasyon ve PVX agroinfection, birbirlerinin sonuçlarını doğrulamak için aynı anda kullanılabilecek hem uygun hem de tamamlayıcı testlerdir.

Şekil 1 patates ve N. benthamiana'da 7 farklı efektör (E1-E7) ile agroinfiltrasyonun temsili bir deneyini göstermektedir. Hücre ölümü, sızmadan yaklaşık 3 gün sonra sızan yaprak panellerinde görülür. Hücre ölümü fenotipinin kapsamı kontrollerle karşılaştırılmalıdır. PBINplus-R3a ve pK7WG2-AVR3a içeren Agrobacterium strain AGL1(pVirG)23 karışımı pozitif kontrol24,25, AGL1 (pVirG) ise negatif kontrol olarak kullanılmıştır. Şekil 1A ve 1B patates genotipi MaR8 (Mastenbroek R8)26 ve N. benthamiana, sırasıyla, agroinfiltrasyon için çok uygun olan agroinfiltrasyon iyi örnekler göstermektedir. Pozitif kontrol ile çakışan yaprak panelinde birikmiş hücre ölümü bulunurken, negatif kontrol veya pBINplus-R3a ile hücre ölümü yanıtı oluşmaz. MaR8'de, iki efektör AVR3a (E2) ve AVR4 (E3) bir hücre ölümüne neden olurken, diğer efektörler (E1 ve E4-E7) bunu yapmaz. Şekil 1C ve 1D, agroinfiltrasyon tekniği için uygun olmayan yabani patates Solanum berthaultii 483-1 ve Solanum rechei 210-5'teki agroinfiltrasyon örneklerini göstermektedir. S. berthaultii 483-1'de yaprak dokusu negatif kontrollere ve test edilen tüm efektörlere spesifik olmayan bir nekroz gösterir. S. rechei 210-5'te, sızan yaprak panelleri pozitif kontrole karşı çok zayıf hücre ölümü yanıtı gösterir.
Şekil 2, agroinfiltrated Agrobacterium'averilen yanıtı ölçmek için kullanılabilecek bir dizi puanlama ölçeğini göstermektedir. Hücre ölüm yüzdeleri% 0-100 ölçeğinde tasvir edilir. Gözlenen fenotipler makroskopik olarak görünmeyen semptomlardan (%0), kloroz gösteren ve hücre ölüm seviyelerini artıran bir dizi ara yanıttan konfüler hücre ölümüne (%100) kadar değişmektedir.
Şekil 3, patateste PVX agroinfection'dan sonra temsili bir deney göstermektedir. Normalde, diş çekme inoktülasyonundan yaklaşık iki hafta sonra sitelerde hücre ölümünün genişletilmesine rastlanabilir. Her iki şekil panelinde de gösterildiği gibi, pGR106-CRN2 (efektör crinkler Crn2 kullanılarak pozitif kontrol) ile aşılanan diş çekme bölgelerinde hücre ölümünün genişletilmesi mevcuttur, bu da P. infestans27'dengen indükleyen genel bir hücre ölümüdür. Yaralamaya verilen küçük tepkinin yanı sıra, pGR106-boş (negatif kontrol) ile aşılanan diş çekme bölgelerinde genişleyen hücre ölümü belirtilmez. Patates genotipi MaR3'ü (Mastenbroek R3) temsil eden Şekil 3A'da,iki pGR106 etkili (E1 ve E2) hücre ölümünü teşvik etmedi. Şekil 3B'de, vahşi Solanum huancabambense 354-1'de efektör taramasının olumlu bir sonucu sunulmaktadır; hücre ölümü yanıtı iki pGR106 etkiliye (E1-E3, elicitinleri temsil eden)28gözlendi.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50971/50971fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50971/50971fig1.jpg"> Şekil 1. Patates ve N. benthamiana'da agroinfiltrasyon örnekleri. (A) patates genotipi MaR8 (Mastenbroek R8), (B) N. benthamiana, (C) Solanum berthaultii 483-1 ve (D) Solanum rechei 210-5 dahil olmak üzere bitkilere sızıldı pBINplus-R3a ve pK7WG2-AVR3a (pozitif kontrol), AGL1(pvirG) (negatif kontrol), pBINplus-R3a içeren Agrobacterium strain AGL1(pVirG) 23 karışımı, ve yedi efektör (E1-E7). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50971/50971fig1highres.jpg" target="_blank">Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.</a>
<img alt="Figure 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50971/50971fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50971/50971fig2.jpg"> Şekil 2. Agroinfiltrasyon yanıtlarının nicelleştirilmesi. Fotoğrafta hücre ölümü için %0 (semptom yok) ile %100 (konfluent hücre ölümü) arasında değişen temsili puanlama ölçekleri göstermektedir. Ara yanıtlar kloroz gibi zayıf yanıtlardan artan hücre ölümü seviyelerine kadar uzanır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50971/50971fig2highres.jpg" target="_blank">Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.</a>
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50971/50971fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50971/50971fig3.jpg"> Şekil 3. Patateste PVX agroinfection örnekleri. Patates genotipi MaR3 (Mastenbroek R3) (A) ve Solanum huancabambense 354-1(B) pGR106-CRN2 (pozitif kontrol), pGR106-boş (negatif kontrol) ve pGR106-E1-2 (efektörler) veya pGR106-E1-E3 ile aşılanmış diş çekme. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50971/50971fig3highres.jpg" target="_blank">Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.</a>
Tablo 1. YEB ortamı
<table border="1"><tbody>
<tr>
<td>1 L</td>
			<td>damıtılmış H2O</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 g</td>
			<td>Sakaroz</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 g</td>
			<td>sığır eti özü</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 g</td>
			<td>bakteriyolojik pepton</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 g</td>
			<td>maya özü</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 ml</td>
			<td>MgSO4 (1 M)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 2. Agroinfiltrasyon ve PVX agroinfection için kullanılan vektörler ve suşlar. Birkaç ikili vektör kullanılabilir. Aşağıdaki listedeki vektörler, aday genlerin yüksek oranda ifade olmasına izin verir ve elimizde iyi çalışmıştır. Biz N. benthamiana Agrobacterium suşu GV3101 (pMP90)29 kullanmayı tercih ve yardımcı plazmid pVirG (pBBR1MCS-5.virGN54D) içeren AGL130 bulmak 23 patates31daha uygun. Ek suşlar, N. benthamiana dahil olmak üzere çeşitli model bitkilerde diğer gruplarda analiz edilmiştir, ancak patates32'dedeğildir.
<img alt="Table 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50971/50971table2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50971/50971table2.jpg">
GW: ağ geçidi sürüm36
Tablo 3. MMA ortamı. <img alt="Table 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50971/50971table3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50971/50971table3.jpg">
pH'ı 5,6'ya ayarlayın.

Watch this Scientific Journal Video about Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana at JoVE.com

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Agroinfiltrasyon ve PVX agroinfection, bitkilerdeki genlerin geçici ektopik ekspresyonu için rutin fonksiyonel tahlillerdir. Bu yöntemler, efektoromik stratejilerde (hızlı direnç ve avirulence gen keşfi) etkili tahlillerdir ve moleküler bitki patolojisinde modern araştırmalar için çok önemlidir. Tesislerde sağlam yüksek verimli fonksiyonel analiz talebini karşılarlar.

Patates ve Nicotiana benthamiana'da Agroinfiltrasyon ve PVX Agroinfection

Agroinfiltration and PVX agroinfection are two efficient transient expression assays for functional analysis of candidate genes in plants. The most ...

agroinfiltration-pvx-agroinfection-potato-nicotiana

Research

JoVE Journal

Biology

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

20.1K Görüntüleme.  Wageningen University. Agroinfiltrasyon ve PVX agroinfection, bitkilerdeki genlerin geçici ektopik ekspresyonu için rutin fonksiyonel tahlillerdir. Bu yöntemler, efektoromik stratejilerde (hızlı direnç ve avirulence gen keşfi) etkili tahlillerdir ve moleküler bitki patolojisinde modern araştırmalar için çok önemlidir. Tesislerde sağlam yüksek verimli fonksiyonel analiz talebini karşılarlar.

Video: Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA regulators: microRNAs, which are produced from non-protein coding genes and short interfering RNAs (siRNAs). Plants use RNAi to control transposons and to exert tight control over developmental processes such as flower organ formation and leaf development2,3,4. Plants also use RNAi to defend themselves against infection by viruses. Consequently, many viruses have evolved suppressors of gene silencing to allow their successful colonization of their host5.
Virus-induced gene silencing (VIGS) is a method that takes advantage of the plant RNAi-mediated antiviral defense mechanism. In plants infected with unmodified viruses the mechanism is specifically targeted against the viral genome. However, with virus vectors carrying sequences derived from host genes, the process can be additionally targeted against the corresponding host mRNAs. VIGS has been adapted for high-throughput functional genomics in plants by using the plant pathogen Agrobacterium tumefaciens to deliver, via its Ti plasmid, a recombinant virus carrying the entire or part of the gene sequence targeted for silencing. Systemic virus spread and the endogenous plant RNAi machinery take care of the rest. dsRNAs corresponding to the target gene are produced and then cleaved by the ribonuclease Dicer into siRNAs of 21 to 24 nucleotides in length. These siRNAs ultimately guide the RNA-induced silencing complex (RISC) to degrade the target transcript2.
Different vectors have been employed in VIGS and one of the most frequently used is based on tobacco rattle virus (TRV). TRV is a bipartite virus and, as such, two different A. tumefaciens strains are used for VIGS. One carries pTRV1, which encodes the replication and movement viral functions while the other, pTRV2, harbors the coat protein and the sequence used for VIGS6,7. Inoculation of Nicotiana benthamiana and tomato seedlings with a mixture of both strains results in gene silencing. Silencing of the endogenous phytoene desaturase (PDS) gene, which causes photobleaching, is used as a control for VIGS efficiency. It should be noted, however, that silencing in tomato is usually less efficient than in N. benthamiana. RNA transcript abundance of the gene of interest should always be measured to ensure that the target gene has efficiently been down-regulated. Nevertheless, heterologous gene sequences from N. benthamiana can be used to silence their respective orthologs in tomato and vice versa8.

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

Description of a virus-induced gene silencing (VIGS) method for knock-down of gene expression in Nicotiana benthamiana and tomato.

Virüs indüklenen gen susturma (VIGS) Nicotiana benthamiana Ve Domates

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

Biyoloji

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing worldwide demand for pharmaceuticals due to its limited scalability and high cost. Plants have shown to be one of the most promising alternative pharmaceutical production platforms that are robust, scalable, low-cost and safe. The recent development of virus-based vectors has allowed rapid and high-level transient expression of recombinant proteins in plants. To further optimize the utility of the transient expression system, we demonstrate a simple, efficient and scalable methodology to introduce target-gene containing Agrobacterium into plant tissue in this study. Our results indicate that agroinfiltration with both syringe and vacuum methods have resulted in the efficient introduction of Agrobacterium into leaves and robust production of two fluorescent proteins; GFP and DsRed. Furthermore, we demonstrate the unique advantages offered by both methods. Syringe infiltration is simple and does not need expensive equipment. It also allows the flexibility to either infiltrate the entire leave with one target gene, or to introduce genes of multiple targets on one leaf. Thus, it can be used for laboratory scale expression of recombinant proteins as well as for comparing different proteins or vectors for yield or expression kinetics. The simplicity of syringe infiltration also suggests its utility in high school and college education for the subject of biotechnology. In contrast, vacuum infiltration is more robust and can be scaled-up for commercial manufacture of pharmaceutical proteins. It also offers the advantage of being able to agroinfiltrate plant species that are not amenable for syringe infiltration such as lettuce and Arabidopsis. Overall, the combination of syringe and vacuum agroinfiltration provides researchers and educators a simple, efficient, and robust methodology for transient protein expression. It will greatly facilitate the development of pharmaceutical proteins and promote science education.

Plants offer a novel system for the production of pharmaceutical proteins on a commercial scale that is more scalable, cost-efficient and safe than current expression paradigms. In this study, we report a simple and convenient, yet scalable approach to introduce target-gene containing Agrobacterium tumefaciens into plants for protein transient expression.

Rekombinant Proteinlerin Yüksek-düzey Geçici İfade için Bitkiler Verimli Agroinfiltration

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short period of time. However, this technology is only just beginning to be applied to large-scale production as many technological obstacles to scale up are now being overcome. Here, we demonstrate a simple and reproducible method for industrial-scale transient protein production based on vacuum infiltration of Nicotiana plants with Agrobacteria carrying launch vectors. Optimization of Agrobacterium cultivation in AB medium allows direct dilution of the bacterial culture in Milli-Q water, simplifying the infiltration process. Among three tested species of Nicotiana, N. excelsiana (N. benthamiana &#215; N. excelsior) was selected as the most promising host due to the ease of infiltration, high level of reporter protein production, and about two-fold higher biomass production under controlled environmental conditions. Induction of Agrobacterium harboring pBID4-GFP (Tobacco mosaic virus-based) using chemicals such as acetosyringone and monosaccharide had no effect on the protein production level. Infiltrating plant under 50 to 100 mbar for 30 or 60 sec resulted in about 95% infiltration of plant leaf tissues. Infiltration with Agrobacterium laboratory strain GV3101 showed the highest protein production compared to Agrobacteria laboratory strains LBA4404 and C58C1 and wild-type Agrobacteria strains at6, at10, at77 and A4. Co-expression of a viral RNA silencing suppressor, p23 or p19, in N. benthamiana resulted in earlier accumulation and increased production (15-25%) of target protein (influenza virus hemagglutinin).

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Transient protein production in Nicotiana plants based on vacuum infiltration with Agrobacteria carrying launch vectors (Tobacco mosaic virus-based) is a rapid and economic approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins. We simplified the procedure and improved target accumulation by optimizing conditions of bacteria cultivation, selecting host species, and co-introducing RNA silencing suppressors.

Optimizasyon ve Kullanımı<em&gt; Agrobacterium</emIn&gt; aracılı Geçici Protein Üretimi<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel protein-protein interaction pairs and monitoring protein interaction dynamics are of particular interest for revealing how plants respond to environmental factors and/or developmental signals. A plethora of approaches have been developed to examine protein-protein interactions, either in vitro or in vivo. Among them, the recently established luciferase complementation imaging (LCI) assay is the simplest and fastest method for demonstrating in vivo protein-protein interactions. In this assay, protein A or protein B is fused with the amino-terminal or carboxyl-terminal half of luciferase, respectively. When protein A interacts with protein B, the two halves of luciferase will be reconstituted to form a functional and active luciferase enzyme. Luciferase activity can be recorded with a luminometer or CCD-camera. Compared with other approaches, the LCI assay shows protein-protein interactions both qualitatively and quantitatively. Agrobacterium infiltration in Nicotiana benthamiana leaves is a widely used system for transient protein expression. With the combination of LCI and transient expression, these approaches show that the physical interaction between COP1 and SPA1 was gradually reduced after jasmonate treatment.

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

This manuscript describes an easy and rapid experimental procedure for determining protein-protein interactions based on the measurement of luciferase activity.

Luciferase tamamlayıcı Imaging tahlil Nicotiana benthamiana yaprakları Protein-protein etkileşim Dynamics geçici belirlenmesi için

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...

Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana

High demand for antibodies as therapeutic interventions for various infectious, metabolic, autoimmune, neoplastic, and other diseases creates a growing need in developing efficient methods for recombinant antibody production. As of 2019, there were more than 70 FDA-approved monoclonal antibodies, and there is exponential growth potential. Despite their promise, limiting factors for widespread use are manufacturing costs and complexity. Potentially, plants offer low-cost, safe, and easily scalable protein manufacturing&#160;strategies. Plants like Nicotiana benthamiana not only can correctly fold and assemble complex mammalian proteins but also can add critical post-translational modifications similar to those offered by mammalian cell cultures. In this work, by using native GFP and an acid-stable variant of green fluorescent protein (GFP) fused to human monoclonal antibodies, we were able to visualize the entire transient antibody expression and purification process from N. benthamiana plants. Depending on the experiment&#39;s purpose, native GFP fusion can ensure easier visualization during the expression phase in the plants, while acid-stable GFP fusion allows for visualization during downstream processing. This scalable and straightforward procedure can be performed by a single researcher to produce milligram quantities of highly pure antibody or antibody fusion proteins in a matter of days using only a few small plants. Such a technique can be extended to the visualization of any type of antibody purification process and potentially many other proteins, both in plant and other expression systems. Moreover, these techniques can benefit virtual instructions and be executed in a teaching laboratory by undergraduate students possessing minimal prior experience with molecular biology techniques, providing a foundation for project-based exploration with real-world applications.

Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana

We describe here a simple method for expression, extraction, and purification of recombinant human IgG fused to GFP in Nicotiana benthamiana. This protocol can be extended to purification and visualization of numerous proteins that utilize column chromatography. Moreover, the protocol is adaptable to the in-person and virtual college teaching laboratory, providing project-based exploration.

Nicotiana benthamiana'da Geçici Olarak Ifade Edilen IgG Füzyon Proteinlerinin Üretimi

High demand for antibodies as therapeutic interventions for various infectious, metabolic, autoimmune, neoplastic, and other diseases creates a growing ...

An Experimental Study on Colorado Potato Beetle Hibernation Under Natural Conditions

One of the major pests of potato Solanum tuberosum L. in the temperate zone is the insect Colorado potato beetle (CPB). Most studies on the immunity and diseases of the CPB are conducted during active feeding stages. Nonetheless, there are fewer studies on resting stages, although these beetles spend most of their life cycle in a state of winter diapause (hibernation). In this work, a method for investigating CPB hibernation under natural conditions was developed and tested, offering an opportunity to collect a sufficient number of individuals in winter. In this article, CPB survival was assessed, and infectious agents at different stages of hibernation were identified. CPB mortality increased during the hibernation, reaching a maximum in April-May. Entomopathogenic fungi (Beauveria, Isaria, and Lecanicillium) and bacteria Bacillus, Sphingobacterium, Peribacillus, Pseudomonas, and Serratia were isolated&#160;from the dead insects. The survival rate of the beetles for the entire hibernation period was 61%. No frozen or desiccated beetles were found, indicating the success of the presented method.

Here we present a method for studying Colorado potato beetle hibernation under the natural conditions of the temperate zone as well as a technique for collecting beetles in winter. This method allows to obtain a desired number of overwintering individuals for various analyses at any stage of hibernation.

Colorado Patates Böceği Kış Uykusuna Yatması Üzerine Doğal Koşullar Altında Deneysel Bir Çalışma

One of the major pests of potato Solanum tuberosum L. in the temperate zone is the insect Colorado potato beetle (CPB). Most studies on the immunity and ...

İklimle İlgili Stresler Altında Patates Dayanıklılık Analizi

High Throughput Image-Based Phenotyping for Determining Morphological and Physiological Responses to Single and Combined Stresses in Potato

High throughput image-based phenotyping is a powerful tool to non-invasively determine the development and performance of plants under specific conditions over time. By using multiple imaging sensors, many traits of interest can be assessed, including plant biomass, photosynthetic efficiency, canopy temperature, and leaf reflectance indices. Plants are frequently exposed to multiple stresses under field conditions where severe heat waves, flooding, and drought events seriously threaten crop productivity. When stresses coincide, resulting effects on plants can be distinct due to synergistic or antagonistic interactions. To elucidate how potato plants respond to single and combined stresses that resemble naturally occurring stress scenarios, five different treatments were imposed on a selected potato cultivar (Solanum tuberosum L., cv. Lady Rosetta) at the onset of tuberization, i.e. control, drought, heat, waterlogging, and combinations of heat, drought, and waterlogging stresses. Our analysis shows that waterlogging stress had the most detrimental effect on plant performance, leading to fast and drastic physiological responses related to stomatal closure, including a reduction in the quantum yield and efficiency of photosystem II and an increase in canopy temperature and water index. Under heat and combined stress treatments, the relative growth rate was reduced in the early phase of stress. Under drought and combined stresses, plant volume and photosynthetic performance dropped with an increased temperature and stomata closure in the late phase of stress. The combination of optimized stress treatment under defined environmental conditions together with selected phenotyping protocols allowed to reveal&#160;the dynamics of morphological and physiological responses to single and combined stresses. Here, a useful tool is presented for plant researchers looking to identify plant traits indicative of resilience to several climate change-related stresses.

Yazar Spot Işığı: PlantScreen Robotik Platformunu Kullanarak Abiyotik Streslere Bitki Tepkilerini Çözme

We designed an image-based phenotyping protocol to determine the morphological and physiological responses to single and combined heat, drought, and waterlogging treatments. This approach enabled the identification of early, late, and recovery responses at a whole plant level, particularly above-ground parts, and highlighted the necessity of using multiple imaging sensors.

Patateste Tek ve Kombine Streslere Morfolojik ve Fizyolojik Tepkileri Belirlemek için Yüksek Verimli Görüntü Tabanlı Fenotipleme

High throughput image-based phenotyping is a powerful tool to non-invasively determine the development and performance of plants under specific conditions ...

N. benthamiana Yapraklarından GFP-His'in Verimli Ekstraksiyonu ve Saflaştırılması

Apoplast-Extraction Based Method to Improve the Purity of Plant Produced Recombinant Protein  

Plants are a newly developing eukaryotic expression system being explored to produce therapeutic proteins. Purification of recombinant proteins from plants is one of the most critical steps in the production process. Typically, proteins were purified from total soluble proteins (TSP), and the presence of miscellaneous intracellular proteins and cytochromes poses challenges for subsequent protein purification steps. Moreover, most therapeutic proteins like antigens and antibodies are secreted to obtain proper glycosylation, and the presence of incompletely modified proteins leads to inconsistent antigen or antibody structures. This work introduces a more effective method to obtain highly purified recombinant proteins from the plant apoplastic space. The recombinant Green fluorescent protein (GFP) is engineered to be secreted into the apoplast of Nicotiana benthamiana and is then extracted using an infiltration-centrifugation method. The GFP-His from the extracted apoplast is then purified by nickel affinity chromatography. In contrast to the traditional methods from TSP, purification from the apoplast produces highly purified recombinant proteins. This represents an important technological improvement for plant production systems.

Yazar Spotlight: Bitki Hücrelerinden Rekombinant Proteinlerin Verimli Bir Şekilde Geri Kazanılması için Apoplast Protein Ekstraksiyonunun Optimize Edilmesi

The purification of recombinant proteins from plant systems is usually challenged by plant proteins. This work provides a method to effectively extract and purify a secreted recombinant protein from the apoplast of Nicotiana benthamiana.

Bitki Tarafından Üretilen Rekombinant Proteinin Saflığını Artırmak için Apoplast-Ekstraksiyon Bazlı Yöntem  

Plants are a newly developing eukaryotic expression system being explored to produce therapeutic proteins. Purification of recombinant proteins from ...