העבודה נתמכת בחלקה על ידי קרן אוניברסיטת Wageningen (WUF), תוכנית מועצת המלגות של סין לסטודנטים לתארים מתקדמים ומענק NWO-VIDI 12378.

1. תנאי גידול ובדיקה של צמחים
<ol><li>לגדל ולתחזק צמחים בחממות מבוקרות או בתאי אקלים בטווח הטמפרטורות של 18-22 מעלות צלזיוס ותחת משטר אור טבעי או עם משטר של 16 שעות /8 שעות ביום / לילה. הסר ענפים בבית השחי על מנת להפוך את הצמחים לניהול יותר.</li>
	<li>עבור תפוחי אדמה, לשמור על עציצים במבחנה בצנצנות פלסטיק סטריליות המכילות Murashige-Skoog (MS) בינוני (20 גרם / L סוכרוז, 5 גרם / L MS מלחים עם ויטמינים, 8 גרם / L אגר, pH 5.8) בתנאים מבוקרים בתאי האקלים ב 18 °C (60 °F) עם משטר 16 שעות / 8 שעות ביום / לילה במשך שבועיים ולאחר מכן להעביר אותם סירים של אדמה מעוקרת בתאי חממה מוסדרים.</li>
</ol>2. חדירה אגרו-סינון
<ol><li>חומר צמחי: עבור Nicotiana benthamiana, השתמש סביב 4-5 שבועות זרעים גדל צמחים. עבור תפוחי אדמה, להשתמש סביב 4-5 שבועות השתלות מתוך במבחנה. בחר עלים צעירים, בריאים ומפותחים לחלוטין להסתננות.</li>
	<li>
תרבות אגרובקטריום:<ol>
<li>הכינו מראש את מדיום ה-YEB(טבלה 1). מלא את צינורות 50 מ"ל עם 10 מיליליטר YEB בינוני בתוספת 1 μl acetosyringone (200 מ"מ), 100 μl MES חוצץ (2-(N-מורפולינו)-אתאן חומצה גופריתית, 1 M) ואת האנטיביוטיקה המתאימה. פיפט 20 μl גליצרול מלאי של הזנים הרצויים (טבלה 2) (המכיל את הגן של עניין) לתוך YEB. ליזום תרבויות עבור כל זני אגרובקטריום ב assay זה בעת ובעונה אחת. דגירה תאים על ידי רועד במשך 1-2 ימים ב 28 °C (69 °F) ו 200 סל"ד כדי OD600 של כ 1.0.</li>
		<li>תאי קציר על ידי צנטריפוגה ב 3,000 x g במשך 10 דקות. יוצקים את supernatant ו resuspend גלולה במדיום MMA טרי(טבלה 3)כדי OD600 של 0.3. בעדינות תאי מערבולת כדי resuspend אותם. לסינון מטבעות של שני זנים חיידקיים, ערבבו את התרבות ביחס של 1:1.</li>
		<li>השאירו את התרבות על הספסל בטמפרטורת החדר במשך 1-6 שעות לפני חדירות. בינתיים, לתייג את הצמחים להסתנן ואת תאריך הניסוי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>חדירות: השתמש 1 מ"ל מזרק ללא מחט לחדור השעיות אגרובקטריום. בזהירות ולאט לאט להזריק לוחות עלה עם המתלים מן המזרק (מסיבות בריאותיות ובטיחותיות יש ללבוש הגנה על העיניים במהלך תהליך זה). לחדור לפחות שלושה צמחים לכל זן. השתמש שלושה עלים לכל צמח לשמש משולשים. הערה: בדרך כלל, 1 מ"ל של Agrobacterium השעיה s יכול להיות מספיק עבור 3 צמחים של N. benthamiana. עבור תפוחי אדמה, יש צורך בהשעיה נוספת מכיוון שקשה יותר לחדור לעלים של מיני סולנום. כמויות נדרשות של השעיות תלויות במין סולנום. הימנע זיהום צולב על ידי החלפת כפפות או כפפות עיקור עם אתנול בין חדירות ועל ידי לא להשקות את הצמחים עד היום לאחר החיסון.</li>
	<li>הבקיע: ציון תגובות מקרוסקופיות כשלושה ימים לאחר ההסתננות כאשר פנוטיפ המוות של התא ברור (איור 1). אם הפנוטיפ של מוות תאי הוא כמותי, השתמש בקריטריונים הנתונים (איור 2). בקצרה, המאזניים עבור ניקוד מקרוסקופי של מוות תאי תלויים בעיקר באחוזים מוות התא של האזור הסתנן. אחוזי המוות של תאים מתוארים בסולם של 0% (ללא תסמינים) עד 100% (מוות תאי בו זמנית). תגובות ביניים נעות בין תגובות חלשות כגון כלורוזיס לרמות הולכות וגדלות של מוות תאי. אם תרצה, ניתן גם להעריך את הניקוד המקרוסקופי באופן כמותי באמצעות ציוד הדמיית תמונות מודרני.</li>
</ol>3. אגרוינדיקציה PVX
<ol><li>חומר צמחי: עבור N. benthamiana, להשתמש סביב 2-3 שבועות זרעים גדל צמחים. עבור תפוחי אדמה, להשתמש סביב 2-3 שבועות השתלות בן במבחנה. עבור בדיקות בקנה מידה גדול, להשתמש מעט מבוגר יותר (4-5 שבועות) צמחים, כמו צמחים אלה יש עלים יותר ויותר כדי להתאים מספרים גבוהים יותר של כתמי חיסון אגרובקטריום.</li>
	<li>
פולחן אגרובקטריום: <ol>
<li>הכינו את המדיום YEB מראש. ממלאים את צינורות 10 מ"ל עם 3 מיליליטר YEB בתוספת אנטיביוטיקה המתאימה. פיפט 20 μl גליצרול מלאי של הזנים הרצויים (טבלה 2) (המכיל את הגן של עניין) לתוך YEB. ליזום תרבויות עבור כל זני אגרובקטריום ב assay זה בעת ובעונה אחת. דגירה תאים על ידי רועד במשך 1-2 ימים ב 28 °C (69 °F) ו 200 סל"ד כדי OD600 של כ 1.0.</li>
		<li>פיפטה על 300 μl של כל זן אגרובקטריום ולהפיץ אותם על LB מוצק אגר בינוני צלחות בתוספת אנטיביוטיקה מתאימים תאים דגירה ב 28 °C (69 °F) במשך 1-2 ימים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>זיהומים: השתמש מרית כדי לאסוף את התרבות אגרובקטריום בצלחת. טובלים קיסם עץ בתרבות האגרובקטריום על המרית ומנקבים את העלים כדי לחסן כמות גדולה של חיידקים. לחסן לפחות שלושה צמחים עבור כל זן. השתמש שלושה עלים לכל צמח לשמש משולשים. בכל עלה, להפוך אתרי חיסון מרובים עבור כל זן.</li>
	<li>הבקיע: ציון תגובות מקרוסקופיות כשבועיים לאחר החיסון (איור 3). עבור מסכי תפוקה גבוהה, הקלט את התגובות האיכותיות (כן/לא) עבור כל נקודת חיסון. לאחר מכן חשב את אחוז האתרים המגיבים והשווה אותם לפקדים.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Vleeshouwers, V. G. A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+and+exploiting+late+blight+resistance+in+the+age+of+effectors.">Understanding and exploiting late blight resistance in the age of effectors.</a> Ann. Rev. Phytopathol. 49, 507-531 (2011).</li><li>Ellis, J. G., Rafiqi, M., Gan, P., Chakrabarti, A., Dodds, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+discovery+and+functional+analysis+of+effector+proteins+of+fungal+and+oomycete+plant+pathogens.">Recent progress in discovery and functional analysis of effector proteins of fungal and oomycete plant pathogens.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 12, 399-405 (2009).</li><li>Vleeshouwers, V. G. A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+genomics+accelerates+discovery+and+functional+profiling+of+potato+disease+resistance+and+Phytophthora+infestans+avirulence+genes.">Effector genomics accelerates discovery and functional profiling of potato disease resistance and Phytophthora infestans avirulence genes.</a> Plos One. 3, 1-10 (2008).</li><li>Oh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+planta+expression+screens+of+Phytophthora+infestans+RXLR+effectors+reveal+diverse+phenotypes,+including+activation+of+the+Solanum+bulbocastanum+disease+resistance+protein+Rpi-blb2.">In planta expression screens of Phytophthora infestans RXLR effectors reveal diverse phenotypes, including activation of the Solanum bulbocastanum disease resistance protein Rpi-blb2.</a> Plant Cell. 21, 2928-2947 (2009).</li><li>Tyler, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phytophthora+genome+sequences+uncover+evolutionary+origins+and+mechanisms+of+pathogenesis.">Phytophthora genome sequences uncover evolutionary origins and mechanisms of pathogenesis.</a> Science. 313, 1261-1266 (2006).</li><li>Haas, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequence+and+analysis+of+the+Irish+potato+famine+pathogen+Phytophthora+infestans.">Genome sequence and analysis of the Irish potato famine pathogen Phytophthora infestans.</a> Nature. 461, 393-398 (2009).</li><li>Levesque, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequence+of+the+necrotrophic+plant+pathogen+Pythium+ultimum+reveals+original+pathogenicity+mechanisms+and+effector+repertoire.">Genome sequence of the necrotrophic plant pathogen Pythium ultimum reveals original pathogenicity mechanisms and effector repertoire.</a> Genome Biol. 11, 1-22 (2010).</li><li>Lamour, K. H., Win, J., Kamoun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oomycete+genomics:+new+insights+and+future+directions.">Oomycete genomics: new insights and future directions.</a> FEMS Microbiol. Lett. 274, 1-8 (2007).</li><li>Stassen, J. H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+identification+in+the+lettuce+downy+mildew+Bremia+lactucae+by+massively+parallel+transcriptome+sequencing.">Effector identification in the lettuce downy mildew Bremia lactucae by massively parallel transcriptome sequencing.</a> Mol. Plant Pathol. 13, 719-731 (2012).</li><li>Kemen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+gain+and+loss+during+evolution+of+obligate+parasitism+in+the+white+rust+pathogen+of+Arabidopsis+thaliana.">Gene gain and loss during evolution of obligate parasitism in the white rust pathogen of Arabidopsis thaliana.</a> PLoS Biol. 9, 1-21 (2011).</li><li>Win, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Effector biology of plant-associated organisms: concepts and perspectives. , 1-13 (2012).</li><li>Hogenhout, S. A., van der Hoorn, R. A. L., Terauchi, R., Kamoun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+concepts+in+effector+biology+of+plant-associated+organisms.">Emerging concepts in effector biology of plant-associated organisms.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 22, 115-122 (2009).</li><li>Kamoun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+catalogue+of+the+effector+secretome+of+plant+pathogenic+oomycetes.">A catalogue of the effector secretome of plant pathogenic oomycetes.</a> Ann. Rev. Phytopathol. 44, 41-60 (2006).</li><li>van der Hoorn, R. A. L., Laurent, F., Roth, R., De Wit, P. J. G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agroinfiltration+is+a+versatile+tool+that+facilitates+comparative+analyses+of+Avr9/Cf-9-induced+and+Avr4/Cf-4-induced+necrosis.">Agroinfiltration is a versatile tool that facilitates comparative analyses of Avr9/Cf-9-induced and Avr4/Cf-4-induced necrosis.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 13, 439-446 (2000).</li><li>Dangl, J. L., Jones, J. D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+pathogens+and+integrated+defence+responses+to+infection.">Plant pathogens and integrated defence responses to infection.</a> Nature. 411, 826-833 (2001).</li><li>Kapila, J., de Rycke, R., van Montagu, M., Angenon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Agrobacterium-mediated+transient+gene+expression+system+for+intact+leaves.">An Agrobacterium-mediated transient gene expression system for intact leaves.</a> Plant Sci. 122, 101-108 (1997).</li><li>Kanneganti, T. D., Huitema, E., Kamoun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+planta+expression+of+oomycete+and+fungal+genes.">In planta expression of oomycete and fungal genes.</a> Methods Mol. Biol. 354, 35-43 (2007).</li><li>Vleeshouwers, V. G. G. A., Rietman, H., Lamour, K., Kamoun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+planta+expression+systems.+Oomycete+Genetics+and+Genomics.">In planta expression systems. Oomycete Genetics and Genomics.</a> Diversity, Interactions, and Research Tools. 23, 455-475 (2009).</li><li>Peng, W. T., Lee, Y. W., Nester, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phenolic+recognition+profiles+of+the+Agrobacterium+tumefaciens+VirA+protein+are+broadened+by+a+high+level+of+the+sugar+binding+protein+ChvE.">The phenolic recognition profiles of the Agrobacterium tumefaciens VirA protein are broadened by a high level of the sugar binding protein ChvE.</a> J. Bacteriol. 180, 5632-5638 (1998).</li><li>Lu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+virus-induced+gene+silencing+implicates+heat+shock+protein+90+in+plant+disease+resistance.">High throughput virus-induced gene silencing implicates heat shock protein 90 in plant disease resistance.</a> EMBO J. 22, 5690-5699 (2003).</li><li>Ma, L., Lukasik, E., Gawehns, F., Takken, F. L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+agroinfiltration+for+transient+expression+of+plant+resistance+and+fungal+effector+proteins+in+Nicotiana+benthamiana+leaves.">The use of agroinfiltration for transient expression of plant resistance and fungal effector proteins in Nicotiana benthamiana leaves.</a> Methods Mol. Biol. 835, 61-74 (2012).</li><li>Bhaskar, P. B., Venkateshwaran, M., Wu, L., An&#233;, J. M., Jiang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transient+gene+expression+and+silencing:+A+rapid+tool+for+functional+gene+assay+in+potato.">Agrobacterium-mediated transient gene expression and silencing: A rapid tool for functional gene assay in potato.</a> Plos One. 4, 1-8 (2009).</li><li>van der Fits, L., Deakin, E. A., Hoge, J. H. C., Memelink, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ternary+transformation+system:+constitutive+virG+on+a+compatible+plasmid+dramatically+increases+Agrobacterium-mediated+plant+transformation.">The ternary transformation system: constitutive virG on a compatible plasmid dramatically increases Agrobacterium-mediated plant transformation.</a> Plant Mol. Biol. 43, 495-502 (2000).</li><li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+genomics+enabled+the+isolation+of+the+R3a+late+blight+resistance+gene+in+potato.">Comparative genomics enabled the isolation of the R3a late blight resistance gene in potato.</a> Plant J. 42, 251-261 (2005).</li><li>Armstrong, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ancestral+oomycete+locus+contains+late+blight+avirulence+gene+Avr3a,+encoding+a+protein+that+is+recognized+in+the+host+cytoplasm.">An ancestral oomycete locus contains late blight avirulence gene Avr3a, encoding a protein that is recognized in the host cytoplasm.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 7766-7771 (2005).</li><li>Kim, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad+spectrum+late+blight+resistance+in+potato+differential+set+plants+MaR8+and+MaR9+is+conferred+by+multiple+stacked+R+genes.">Broad spectrum late blight resistance in potato differential set plants MaR8 and MaR9 is conferred by multiple stacked R genes.</a> Theor. Appl. Genet. 124, 923-935 (2012).</li><li>Torto, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EST+mining+and+functional+expression+assays+identify+extracellular+effector+proteins+from+the+plant+pathogen+Phytophthora.">EST mining and functional expression assays identify extracellular effector proteins from the plant pathogen Phytophthora.</a> Genome Res. 13, 1675-1685 (2003).</li><li>Vleeshouwers, V. G. A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agroinfection-based+high-throughput+screening+reveals+specific+recognition+of+INF+elicitins+in+Solanum.">Agroinfection-based high-throughput screening reveals specific recognition of INF elicitins in Solanum.</a> Mol. Plant Pathol. 7, 499-510 (2006).</li><li>Koncz, C., Schell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promoter+of+TL-DNA+gene+5+controls+the+tissue-specific+expression+of+chimeric+genes+carried+by+a+novel+type+of+agrobacterium+binary.">The promoter of TL-DNA gene 5 controls the tissue-specific expression of chimeric genes carried by a novel type of agrobacterium binary.</a> Mol. Gen. Genet. 204, 383-396 (1986).</li><li>Lazo, G. R., Stein, P. A., Ludwig, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA+transformation-competent+Arabidopsis+genomic+library+in+Agrobacterium.">A DNA transformation-competent Arabidopsis genomic library in Agrobacterium.</a> Bio-Technol. 9, 963-967 (1991).</li><li>Rietman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Putting the Phytophthora infestans genome sequence at work; multiple novel avirulence and potato resistance gene candidates revealed [PhD thesis]. , (2011).</li><li>Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+Agrobacterium-mediated+transient+assays+of+gene+expression+in+lettuce,+tomato+and+Arabidopsis.">Optimization of Agrobacterium-mediated transient assays of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis.</a> Plant Biotechnol. J. 3, 259-273 (2005).</li><li>van engelen, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pBINPLUS+-+an+improved+plant+transformation+vector+based+on+pBIN19.">pBINPLUS - an improved plant transformation vector based on pBIN19.</a> Transgenic Res. 4, 288-290 (1995).</li><li>Karimi, M., Inze, D., Depicker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GATEWAYTM+vectors+for+Agrobacterium-mediated+plant+transformation.">GATEWAYTM vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation.</a> Trends Plant Sci. 7, 193-195 (2002).</li><li>Xiang, C. B., Han, P., Lutziger, I., Wang, K., Oliver, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mini+binary+vector+series+for+plant+transformation.">A mini binary vector series for plant transformation.</a> Plant Mol. Biol. 40, 711-717 (1999).</li><li>Curtis, M. D., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gateway+cloning+vector+set+for+high-throughput+functional+analysis+of+genes+in+planta.">A gateway cloning vector set for high-throughput functional analysis of genes in planta.</a> Plant Physiol. 133, 462-469 (2003).</li></ol>

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

מבחנים ארעיים כמו אגרואינפילטרציה ואגרואינפטיקציה הן שיטות יעילות החיוניות למחקר הפתולוגי של הצמח המולקולרי המודרני. למרות מגבלות מסוימות, שיטות אלה עונות על הביקוש לניתוח תפקודי יעיל וחזק בעל תפוקה גבוהה בצמחים.
מערכת סינון האגרו-סינון היא בדיקה תפקודית נפוצה במגוון מיני צמחים. Agroinfiltration מקל על אספקת מספר transgenes לאותו תא עם ביטוי בו זמנית של חלבונים אינטראקציה. זה יתרון עבור recapitulating R-AVR יחסים, על ידי חדירת זני אגרובקטריום המבטאים גנים Avr עם זנים המבטאים את הגנים R תואמים. כמו כן, עבור זוגות R-AVR ידועים, חדירות מטבע כאלה יכולות לשמש כפקדים חיוביים. הכללת פקדים כאלה חשובה מכיוון שבכמה גנוטיפים צמחיים, יעילות הטרנספורמציה יכולה להיות מתחת לסף כדי לזהות תגובות. כולל פקדים שליליים, למשל זן אגרובקטריום המכיל וקטור ללא תוסף גנים, הוא גם חיוני כדי לקבוע אם גנוטיפ צמח מסוים מעלה תגובות הגנה לא ספציפיות לאגרובקטריום. תכונה זו מתרחשת בתדירות מסוימת בחיידק תפוחי אדמה, ולא כל מיני סולנום מתאימים היטב למערכת ביטוי זו המבוססת על אגרובקטריום. בדרך כלל, Agroinfiltration assay עובד טוב מאוד N. benthamiana ורוב הגנוטיפים תפוחי אדמה. בנוסף לאפקטורומיקה, ישנם יישומים פוטנציאליים שונים אחרים לטכניקת סינון האגרו-סינון, כגון ייצור חלבונים בטרנגנסים ולוקליזציה של חלבונים בתאי הצמח על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית.
PVX agroinfection היא מערכת סינון רגישה מאוד ובדרך כלל מתאימה יותר להקרנות בתפוקה גבוהה. מאז האגרובקטריום הוא עכשיו רק מקומי נוכח, תגובות לא ספציפיות לחיידק זה הם עכשיו לא מאוד מטריד, כמו וירוס PVX משתלט על התפשטות נוספת של transgene. עם זאת, צמחים עשויים להיות עמידים PVX, או לטעון התנגדות קיצונית (ER) תגובות, ובמקרה זה שיטת agroinfection אינו מתאים. מגבלה נוספת של שיטת האגרו-נדיקציה של PVX היא גודל ההוספה של גן העניין. פנוטיפים שנצפו של תגובות עשויים להשתנות מנמק שחור אינטנסיבי המקיף את הפצע לנמק קלוש ליד נקודת החיסון. בשני המינים N. benthamiana ו Solanum, אגרוין PVX מוכר רגיש יותר מאשר agroinfiltration.
אם ניקח בחשבון כי הרקע הגנטי של גנוטיפים צמחיים שנבדקו מגוונים יכול להיות כמה הגבלות (ראה לעיל), אנו בדרך כלל להשיג מסקנות דומות על ידי אגרואינדיקציה PVX ו agroinfiltration. תוצאות אלה דומות גם כפי שהושגו מבחנים אחרים, כגון חדירות חלבון29 ו ELISA3. בהתחשב ביתרונות ובמגבלות של שתי המערכות, אנו ממליצים להשתמש בשתי השיטות כדי להשלים זו את זו או לאשר תוצאות עצמאיות.

Effectoromics, גישה גנומית תפקודית בעלת תפוקה גבוהה התפתחה לאחרונה ככלי רב עוצמה לזיהוי גנים עמידים (R) בצמחי יבול וגנים תואמים שלפתוגנים1-4. בניגוד לשינוי היציב שגוזל זמן רב יותר עם גנים R, אסטרטגיית ההשפעה מבוססת על מבחנים ארעיים של רצפי גנים פתוגן.
מאז עידן הגנומיקה, גנומים של פתוגנים צמחיים נחקרו באופן נרחב. לדוגמה עבור oomycetes, הכוללים את פתוגנים הצמח ההרסני ביותר, אוספים גדולים של רצפים נוצרו ונותחו עבור גנים לשחק תפקיד במהלך האינטראקציה עם הצמח5-10. מחלקה אחת של חלבוני פתוגן מייצגת אפקטים, אשר לתפעל את מבנה התא המארח ולתפקד או כדי להקל על זיהום (גורמי ארסיות) או לעורר תגובות הגנה (גורמי ארסיות)11-13. ביטוי של גנים Avr בתאי צמח המכילים גנים R בדרך כלל תוצאות תגובת מוות תא רגיש (HR)14,15. בביטוי פלנטה של גנים R ו- Avr ניתן להשיג באמצעות מערכות ביטוי ארעיות כגון אגרובקטריום tumefaciens -מבוסס טרנספורמציה חולפת (agroinfiltration)16. טרנספורמציה חולפת זו יכולה להיות מיושמת גם בשילוב עם מערכות ביטוי ויראלי (agroinfection)17,18.
עבור agroinfiltration, הסוכן הנפוץ ביותר הוא A . tumefaciens, פתוגן טווח מארח רחב של צמחי dicot. A . tumefaciens מכיל פלסמיד גרימת גידול (Ti). העברת DNA (T-DNA) מ פלסמיד Ti יהיה טרנסלוקציה לתוך תאי הצמח לאחר מכונות ארסיות של החיידק מופעל. זה יכול להיות מופעלות בתאי צמח פצועים, על ידי שוחרר במשקל מולקולרי נמוך תרכובות פנוליות monosaccharaides בסביבה חומצית מעט19. גן הארס מופעל לאחר חדירת השעיות אגרובקטריום ללוחות עלים המוגדרים על ידי ורידים גדולים. לאחר מכן תאי הצמח בלוחות העלים ישתנו ויבטאו את הטרנסג'ינים הכלולים באזור ה- T-DNA.
Agroinfection מבוסס על אגרובקטריוםמחוסן פצע , אשר מתווך טרנסלוקציה של וירוס לתאי הצמח. הנגיף מתפשט עוד יותר לרקמות צמחיות סמוכות, בהיעדר אגרובקטריום. עבור agroinfection, מספר וירוסים צמחיים ניתן להשתמש. וירוסי RNA הם וקטורים אידיאליים לביטוי גנים מכיוון שהם יכולים להתרבות לרמות גבוהות מאוד בצמחים נגועים. בין וירוסי RNA צמחיים, וירוס תפוחי אדמה X (PVX) נמצא בשימוש נרחב עבור מסכי אפקטים. כדי להקל על בדיקות תפקודיות עבור גן מוכנס, וקטורים בינאריים המכילים את הגנום PVX מוקף וירוס פסיפס כרובית 35S מקדם ואת שליחות קטלנית סינתאז nopaline, היו משובטים לתוך T-DNA של A. tumefaciens20. לאחר שה- T-DNA מועבר לתאי צמחים, הגנום של PVX הכלול ב- T-DNA מתמלל ממקדם 35S. ואז חלקיקי וירוסים מתפשטים באופן שיטתי בצמחים הנגועים, וכתוצאה מכך הביטוי של הגן שהוכנס. שיטה זו המבוססת הן על אגרובקטריום והן על PVX נקראת PVX agroinfection.
כאן אנו מציגים דוגמאות הן עבור agroinfiltration והן מבחני אגרואינדיקציה PVX. כצמחים מארחים אנו משתמשים בחיידק תפוחי אדמה (סעיףסולנום Petota),שעבורו גישות אפקטורומיקה היו חלוציות והוכחו כמוצלחות3,4. אנו משתמשים גם Nicotiana benthamiana, אשר ידוע כצמח מודל בצמחים Solanaceous 14,21,22.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="955">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col span="2" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Beef extract</td>
			<td style="width:267px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">B4888</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Bacteriological peptone</td>
			<td style="width:267px;">Oxoid</td>
			<td style="width:219px;">LP0037</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:267px;">Oxoid</td>
			<td style="width:219px;">LP0021</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">MgSO4</td>
			<td style="width:267px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">208094</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">MS salts (without vitamins)</td>
			<td style="width:267px;">Duchefa Biochemie</td>
			<td style="width:219px;">M0221</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">MES</td>
			<td style="width:267px;">Duchefa Biochemie</td>
			<td style="width:219px;">M1503</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">LB broth powder</td>
			<td style="width:267px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">L3022</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Acetosyringone</td>
			<td style="width:267px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">D134406</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Syringe (1 ml)</td>
			<td style="width:267px;">BD Plastipak</td>
			<td style="width:219px;">300013</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Incubator</td>
			<td style="width:267px;">Infors HT</td>
			<td style="width:219px;">Multitron II</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:267px;">Heraeus</td>
			<td style="width:219px;">Multifuge 3S-R</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:267px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:219px;">Biophotometer 6131</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

agroinfiltration and pvx agroinfection in potato and nicotiana benthamiana

אגרואינפיציה ו- PVX agroinfection הם שני מבחני ביטוי ארעיים יעילים לניתוח תפקודי של גנים מועמדים בצמחים. הסוכן הנפוץ ביותר עבור agroinfiltration הוא אגרובקטריום tumefaciens, פתוגן של מינים רבים של צמחי dicot. משמעות הדבר היא כי agroinfiltration יכול להיות מיושם על מיני צמחים רבים. כאן, אנו מציגים את הפרוטוקולים שלנו ואת התוצאות הצפויות בעת יישום שיטות אלה על תפוח האדמה(Solanum tuberosum),מינים הקשורים שלה נושא פקעת בר סולנום (סעיף סולנום Petota)ואת צמח המודל Nicotiana benthamiana. בנוסף לניתוח תפקודי של גנים בודדים, כגון גנים התנגדות (R) או ארסיות (Avr), בדיקת האגרואינציה מתאימה מאוד לסיכום אינטראקציות R-AVR הקשורות לאינטראקציות פתוגן מארח ספציפיות פשוט על ידי אספקת טרנסגנים R ו- Avr לאותו תא. עם זאת, כמה גנוטיפים צמחיים יכולים להעלות תגובות הגנה לא ספציפיות לאגרובקטריום, כפי שראינו למשל עבור כמה גנוטיפים תפוחי אדמה. בהשוואה לאגרו-סינון, זיהוי פעילות AVR עם אגרואינטציה של PVX רגיש יותר, בעל תפוקה גבוהה יותר במסכים פונקציונליים ופחות רגיש לתגובות הגנה לא ספציפיות לאגרובקטריום. עם זאת, הגנה לא ספציפית ל- PVX יכולה להתרחש ויש סיכון להחמיץ תגובות עקב התנגדות קיצונית הנגרמת על ידי וירוסים. למרות מגבלות כאלה, מניסיוננו, אגרואינפילטרציה ו- PVX agroinfection הם מבחנים מתאימים ומשלימים שניתן להשתמש בהם בו זמנית כדי לאשר את התוצאות אחד של השני.

איור 1 מציג ניסוי מייצג של חדירת אגרואינציה עם 7 משפיעים שונים (E1-E7) בתפוח אדמה ו- N. benthamiana. מוות תאי מופיע בלוחות העלים החודרים כשלושה ימים לאחר ההסתננות. יש להשוות את היקף הפנוטיפ של מוות תאי עם הפקדים. תערובת של זן אגרובקטריום AGL1(pVirG)23 המכיל pBINplus-R3a ו pK7WG2-AVR3a שימש שליטה חיובית24,25, בעוד AGL1(pVirG) שימש כשליטה שלילית. איורים 1A ו- 1B מראים דוגמאות טובות של חדירה בגנוטיפ תפוחי האדמה MaR8 (Mastenbroek R8)26 ו- N. benthamiana, בהתאמה, אשר נוחים מאוד עבור agroinfiltration. יש מוות תאי confluent בלוח העלה coinfiltrated עם שליטה חיובית, בעוד אין תגובת מוות של התא מתרחשת עם שליטה שלילית או pBINplus-R3a. ב- MaR8, שני משפיעים AVR3a (E2) ו- AVR4 (E3) גורמים למוות של תא, בעוד שהמשפיעים האחרים (E1 ו- E4-E7) אינם. ב- N. benthamiana, אף אחד מהמשפיעים שנבדקו אינו מחליף תגובת מוות של תא. איורים 1C ו- 1D מראים דוגמאות של חדירה אגרואינום בתפוח האדמה הפראי Solanum berthaultii 483-1 וסולנום rechei 210-5, אשר אינם נוחים היטב עבור טכניקת agroinfiltration. ב S. berthaultii 483-1, רקמת העלה מראה נמק לא ספציפי לבקרות שליליות, כמו גם לכל המשפיעים שנבדקו. ב S. rechei 210-5, לוחות עלה הסתננו להראות תגובה חלשה מאוד מוות תאי לשליטה חיובית.
איור 2 מציג טווח של קשקשי ניקוד שניתן להשתמש בהם כדי לכמת את התגובה לאגרובקטריוםמפושט . אחוזי המוות של תאים מתוארים בסולם של 0-100%. פנוטיפים שנצפו נעים בין סימפטומים מקרוסקופיים לא גלויים (0%), דרך מגוון של תגובות ביניים המציגות כלורוזיס ורמות הולכות וגדלות של מוות תאי, עד מוות תאי במקביל (100%).
איור 3 מציג ניסוי מייצג לאחר אגרואינדיקציה של PVX בתפוח אדמה. בדרך כלל, הרחבת מוות תאי ניתן למצוא באתרים כשבועיים לאחר חיסון לקטוף שיניים. כפי שמוצג בשני לוחות הדמות, הרחבת מוות תאי קיים באתרים שהיו לקטוף שיניים מחוסן עם pGR106-CRN2 (שליטה חיובית באמצעות Crn2 crinkler אפקטים), שהוא מוות כללי של התא גרימת גן מ P. infestans27. מלבד תגובה קלה לפציעה, לא צוין מוות תאי מתרחב באתרים שהיו מחוסנים עם pGR106-ריק (שליטה שלילית). באיור 3A, המייצג את הגנוטיפ של תפוחי האדמה MaR3 (Mastenbroek R3), שני pGR106-משפיעים (E1 ו- E2) לא גרם למוות של תאים. באיור 3Bמוצגת תוצאה חיובית של הקרנת אפקטים ב-Solanum huancabambense 354-1 הפראי; תגובת מוות תאי נצפתה שני pGR106-משפיעים (E1-E3, המייצגים elicitins)28.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50971/50971fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50971/50971fig1.jpg"> איור 1. דוגמאות של חדירה אגרו-אינפילציה בתפוח אדמה וN. benthamiana. צמחים הכוללים (A) גנוטיפ תפוחי אדמה MaR8 (Mastenbroek R8), (B) N. benthamiana , (C) סולנום ברתוטאי 483-1 ו (D) סולנום rechei 210-5 הסתננו עם תערובת של זן אגרובקטריום AGL1(pVirG) 23 המכיל pBINplus-R3a ו pK7WG2-AVR3a (שליטה חיובית), AGL1(pvirG) (שליטה שלילית), pBINplus-R3a, ושבעה אפקטים (E1-E7). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50971/50971fig1highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר</a>.
<img alt="Figure 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50971/50971fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50971/50971fig2.jpg"> איור 2. כימות תגובות לסינון אגרו-סינון. התצלום מראה סולמות ניקוד מייצגים למוות תאי, הנעים בין 0% (ללא תסמינים) ל -100% (מוות תאי משולב). תגובות ביניים נעות בין תגובות חלשות כגון כלורוזיס לרמות הולכות וגדלות של מוות תאי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50971/50971fig2highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר</a>.
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50971/50971fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50971/50971fig3.jpg"> איור 3. דוגמאות של אגרו-נדיקציה PVX בתפוח אדמה. גנוטיפ תפוחי אדמה MaR3 (Mastenbroek R3) (A) ו Solanum huancabambense 354-1 (B) לקטוף שיניים מחוסן עם pGR106-CRN2 (שליטה חיובית), pGR106-ריק (שליטה שלילית) ו pGR106-E1-2 (אפקטים), או pGR106-E1-E3, בהתאמה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50971/50971fig3highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר</a>.
שולחן 1. מדיום YEB
<table border="1"><tbody>
<tr>
<td>1 ליטר</td>
			<td>מזוקק H2O</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 גר'</td>
			<td>סוכרוז</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 גר'</td>
			<td>תמצית בקר</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 גר'</td>
			<td>פפטון בקטריולוגי</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 גרם</td>
			<td>תמצית שמרים</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 מ"ל</td>
			<td>MgSO4 (1 מ')</td>
		</tr>
</tbody></table>שולחן 2. וקטורים וזנים המשמשים לסינון אגרו-סינון ו-PVX. ניתן להשתמש במספר וקטורים בינאריים. וקטורים ברשימה שלהלן מאפשרים ביטוי גבוה של הגנים המועמדים ועבדו היטב בידינו. אנו מעדיפים להשתמש בזן אגרובקטריום GV3101(pMP90)29 ב N. benthamiana ולמצוא AGL130 המכיל את pVirG פלסמיד עוזר (pBBR1MCS-5.virGN54D)23 מתאים יותר תפוח אדמה31. זנים נוספים נותחו בקבוצות אחרות על צמחי מודל שונים כולל N. benthamiana אבל לא בתפוח אדמה32.
<img alt="Table 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50971/50971table2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50971/50971table2.jpg">
GW: שער גירסה36
שולחן 3. מדיום MMA. <img alt="Table 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50971/50971table3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50971/50971table3.jpg">
כוונן את ה- pH ל- 5.6.

Watch this Scientific Journal Video about Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana at JoVE.com

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

אגרואינפיציה ו- PVX agroinfection הם מבחנים תפקודיים שגרתיים לביטוי חוץ רחמי חולף של גנים בצמחים. שיטות אלה הן מבחנים יעילים באסטרטגיות אפקטאורומיות (התנגדות מהירה ותגלית גנים ארסית) וחיוניות למחקר מודרני בפתולוגיה של צמחים מולקולריים. הם עונים על הביקוש לניתוח תפקודי חזק בעל תפוקה גבוהה בצמחים.

אגרוינפינציה ו- PVX אגרוינבינציה בתפוח אדמה וניקוטיאנה בנתאמיאנה

Agroinfiltration and PVX agroinfection are two efficient transient expression assays for functional analysis of candidate genes in plants. The most ...

agroinfiltration-pvx-agroinfection-potato-nicotiana

Research

JoVE Journal

Biology

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

20.1K Views.  Wageningen University. אגרואינפיציה ו- PVX agroinfection הם מבחנים תפקודיים שגרתיים לביטוי חוץ רחמי חולף של גנים בצמחים. שיטות אלה הן מבחנים יעילים באסטרטגיות אפקטאורומיות (התנגדות מהירה ותגלית גנים ארסית) וחיוניות למחקר מודרני בפתולוגיה של צמחים מולקולריים. הם עונים על הביקוש לניתוח תפקודי...

Video: Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA regulators: microRNAs, which are produced from non-protein coding genes and short interfering RNAs (siRNAs). Plants use RNAi to control transposons and to exert tight control over developmental processes such as flower organ formation and leaf development2,3,4. Plants also use RNAi to defend themselves against infection by viruses. Consequently, many viruses have evolved suppressors of gene silencing to allow their successful colonization of their host5.
Virus-induced gene silencing (VIGS) is a method that takes advantage of the plant RNAi-mediated antiviral defense mechanism. In plants infected with unmodified viruses the mechanism is specifically targeted against the viral genome. However, with virus vectors carrying sequences derived from host genes, the process can be additionally targeted against the corresponding host mRNAs. VIGS has been adapted for high-throughput functional genomics in plants by using the plant pathogen Agrobacterium tumefaciens to deliver, via its Ti plasmid, a recombinant virus carrying the entire or part of the gene sequence targeted for silencing. Systemic virus spread and the endogenous plant RNAi machinery take care of the rest. dsRNAs corresponding to the target gene are produced and then cleaved by the ribonuclease Dicer into siRNAs of 21 to 24 nucleotides in length. These siRNAs ultimately guide the RNA-induced silencing complex (RISC) to degrade the target transcript2.
Different vectors have been employed in VIGS and one of the most frequently used is based on tobacco rattle virus (TRV). TRV is a bipartite virus and, as such, two different A. tumefaciens strains are used for VIGS. One carries pTRV1, which encodes the replication and movement viral functions while the other, pTRV2, harbors the coat protein and the sequence used for VIGS6,7. Inoculation of Nicotiana benthamiana and tomato seedlings with a mixture of both strains results in gene silencing. Silencing of the endogenous phytoene desaturase (PDS) gene, which causes photobleaching, is used as a control for VIGS efficiency. It should be noted, however, that silencing in tomato is usually less efficient than in N. benthamiana. RNA transcript abundance of the gene of interest should always be measured to ensure that the target gene has efficiently been down-regulated. Nevertheless, heterologous gene sequences from N. benthamiana can be used to silence their respective orthologs in tomato and vice versa8.

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

Description of a virus-induced gene silencing (VIGS) method for knock-down of gene expression in Nicotiana benthamiana and tomato.

Virus-Induced להשתקת גנים (VIGS) ב ניקוטיאנה benthamiana עגבניות

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing worldwide demand for pharmaceuticals due to its limited scalability and high cost. Plants have shown to be one of the most promising alternative pharmaceutical production platforms that are robust, scalable, low-cost and safe. The recent development of virus-based vectors has allowed rapid and high-level transient expression of recombinant proteins in plants. To further optimize the utility of the transient expression system, we demonstrate a simple, efficient and scalable methodology to introduce target-gene containing Agrobacterium into plant tissue in this study. Our results indicate that agroinfiltration with both syringe and vacuum methods have resulted in the efficient introduction of Agrobacterium into leaves and robust production of two fluorescent proteins; GFP and DsRed. Furthermore, we demonstrate the unique advantages offered by both methods. Syringe infiltration is simple and does not need expensive equipment. It also allows the flexibility to either infiltrate the entire leave with one target gene, or to introduce genes of multiple targets on one leaf. Thus, it can be used for laboratory scale expression of recombinant proteins as well as for comparing different proteins or vectors for yield or expression kinetics. The simplicity of syringe infiltration also suggests its utility in high school and college education for the subject of biotechnology. In contrast, vacuum infiltration is more robust and can be scaled-up for commercial manufacture of pharmaceutical proteins. It also offers the advantage of being able to agroinfiltrate plant species that are not amenable for syringe infiltration such as lettuce and Arabidopsis. Overall, the combination of syringe and vacuum agroinfiltration provides researchers and educators a simple, efficient, and robust methodology for transient protein expression. It will greatly facilitate the development of pharmaceutical proteins and promote science education.

Plants offer a novel system for the production of pharmaceutical proteins on a commercial scale that is more scalable, cost-efficient and safe than current expression paradigms. In this study, we report a simple and convenient, yet scalable approach to introduce target-gene containing Agrobacterium tumefaciens into plants for protein transient expression.

Agroinfiltration היעילה של צמחים לביטוי חולף ברמה גבוהה של חלבונים רקומביננטי

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short period of time. However, this technology is only just beginning to be applied to large-scale production as many technological obstacles to scale up are now being overcome. Here, we demonstrate a simple and reproducible method for industrial-scale transient protein production based on vacuum infiltration of Nicotiana plants with Agrobacteria carrying launch vectors. Optimization of Agrobacterium cultivation in AB medium allows direct dilution of the bacterial culture in Milli-Q water, simplifying the infiltration process. Among three tested species of Nicotiana, N. excelsiana (N. benthamiana &#215; N. excelsior) was selected as the most promising host due to the ease of infiltration, high level of reporter protein production, and about two-fold higher biomass production under controlled environmental conditions. Induction of Agrobacterium harboring pBID4-GFP (Tobacco mosaic virus-based) using chemicals such as acetosyringone and monosaccharide had no effect on the protein production level. Infiltrating plant under 50 to 100 mbar for 30 or 60 sec resulted in about 95% infiltration of plant leaf tissues. Infiltration with Agrobacterium laboratory strain GV3101 showed the highest protein production compared to Agrobacteria laboratory strains LBA4404 and C58C1 and wild-type Agrobacteria strains at6, at10, at77 and A4. Co-expression of a viral RNA silencing suppressor, p23 or p19, in N. benthamiana resulted in earlier accumulation and increased production (15-25%) of target protein (influenza virus hemagglutinin).

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Transient protein production in Nicotiana plants based on vacuum infiltration with Agrobacteria carrying launch vectors (Tobacco mosaic virus-based) is a rapid and economic approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins. We simplified the procedure and improved target accumulation by optimizing conditions of bacteria cultivation, selecting host species, and co-introducing RNA silencing suppressors.

אופטימיזציה וניצול<em&gt; Agrobacterium</emייצור חלבון חלוף&gt; בתיווך ב<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel protein-protein interaction pairs and monitoring protein interaction dynamics are of particular interest for revealing how plants respond to environmental factors and/or developmental signals. A plethora of approaches have been developed to examine protein-protein interactions, either in vitro or in vivo. Among them, the recently established luciferase complementation imaging (LCI) assay is the simplest and fastest method for demonstrating in vivo protein-protein interactions. In this assay, protein A or protein B is fused with the amino-terminal or carboxyl-terminal half of luciferase, respectively. When protein A interacts with protein B, the two halves of luciferase will be reconstituted to form a functional and active luciferase enzyme. Luciferase activity can be recorded with a luminometer or CCD-camera. Compared with other approaches, the LCI assay shows protein-protein interactions both qualitatively and quantitatively. Agrobacterium infiltration in Nicotiana benthamiana leaves is a widely used system for transient protein expression. With the combination of LCI and transient expression, these approaches show that the physical interaction between COP1 and SPA1 was gradually reduced after jasmonate treatment.

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

This manuscript describes an easy and rapid experimental procedure for determining protein-protein interactions based on the measurement of luciferase activity.

לוציפראז קומפלמנטציה הדמיה Assay העלים טבק benthamiana עבור Transiently קביעת חלבון אינטראקציה דינמיקה

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...

Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana

High demand for antibodies as therapeutic interventions for various infectious, metabolic, autoimmune, neoplastic, and other diseases creates a growing need in developing efficient methods for recombinant antibody production. As of 2019, there were more than 70 FDA-approved monoclonal antibodies, and there is exponential growth potential. Despite their promise, limiting factors for widespread use are manufacturing costs and complexity. Potentially, plants offer low-cost, safe, and easily scalable protein manufacturing&#160;strategies. Plants like Nicotiana benthamiana not only can correctly fold and assemble complex mammalian proteins but also can add critical post-translational modifications similar to those offered by mammalian cell cultures. In this work, by using native GFP and an acid-stable variant of green fluorescent protein (GFP) fused to human monoclonal antibodies, we were able to visualize the entire transient antibody expression and purification process from N. benthamiana plants. Depending on the experiment&#39;s purpose, native GFP fusion can ensure easier visualization during the expression phase in the plants, while acid-stable GFP fusion allows for visualization during downstream processing. This scalable and straightforward procedure can be performed by a single researcher to produce milligram quantities of highly pure antibody or antibody fusion proteins in a matter of days using only a few small plants. Such a technique can be extended to the visualization of any type of antibody purification process and potentially many other proteins, both in plant and other expression systems. Moreover, these techniques can benefit virtual instructions and be executed in a teaching laboratory by undergraduate students possessing minimal prior experience with molecular biology techniques, providing a foundation for project-based exploration with real-world applications.

Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana

We describe here a simple method for expression, extraction, and purification of recombinant human IgG fused to GFP in Nicotiana benthamiana. This protocol can be extended to purification and visualization of numerous proteins that utilize column chromatography. Moreover, the protocol is adaptable to the in-person and virtual college teaching laboratory, providing project-based exploration.

ייצור חלבוני פיוז'ן IgG המתבטאים באופן ארעי בניקוטיאנה

High demand for antibodies as therapeutic interventions for various infectious, metabolic, autoimmune, neoplastic, and other diseases creates a growing ...

כימות התחלת מוות תאי באמצעות הדמיה רציפה

Studying Cell Death Initiation Using a Digital Microscope

Hypersensitive response (HR)-conferred resistance is an effective defense response that can be determined by the N resistance genes. HR is manifested as the formation of cell death zones on inoculated leaves. Here, a protocol for studying the rate of cell death initiation by imaging inoculated leaves in the time between the cell death initiation and the cell death appearance using a digital microscope is presented. The digital microscope enables a continuous imaging process in desired intervals, which allows an accurate determination of cell death initiation rate up to minutes exactly, as opposed to hours in traditional methods. Imaging with the digital microscope is also independent of light and can therefore be used during day and night without disturbing the circadian rhythm of the plant. Different pathosystems resulting in programmed cell death development could be studied using this protocol with minor modifications. Overall, the protocol thus allows simple, accurate, and inexpensive identification of cell death initiation rate.

Author Spotlight: A Streamlined Approach to Study Cell Death Initiation in Hypersensitive Response 

Here we present a protocol for studying the rate of programmed cell death initiation by continuously imaging inoculated leaves following cell death induction.

חקר התחלת מוות תאי באמצעות מיקרוסקופ דיגיטלי

Hypersensitive response (HR)-conferred resistance is an effective defense response that can be determined by the N resistance genes. HR is manifested as ...

An Experimental Study on Colorado Potato Beetle Hibernation Under Natural Conditions

One of the major pests of potato Solanum tuberosum L. in the temperate zone is the insect Colorado potato beetle (CPB). Most studies on the immunity and diseases of the CPB are conducted during active feeding stages. Nonetheless, there are fewer studies on resting stages, although these beetles spend most of their life cycle in a state of winter diapause (hibernation). In this work, a method for investigating CPB hibernation under natural conditions was developed and tested, offering an opportunity to collect a sufficient number of individuals in winter. In this article, CPB survival was assessed, and infectious agents at different stages of hibernation were identified. CPB mortality increased during the hibernation, reaching a maximum in April-May. Entomopathogenic fungi (Beauveria, Isaria, and Lecanicillium) and bacteria Bacillus, Sphingobacterium, Peribacillus, Pseudomonas, and Serratia were isolated&#160;from the dead insects. The survival rate of the beetles for the entire hibernation period was 61%. No frozen or desiccated beetles were found, indicating the success of the presented method.

Here we present a method for studying Colorado potato beetle hibernation under the natural conditions of the temperate zone as well as a technique for collecting beetles in winter. This method allows to obtain a desired number of overwintering individuals for various analyses at any stage of hibernation.

מחקר ניסיוני על תרדמת חורף של חיפושית תפוחי אדמה בקולורדו בתנאים טבעיים

One of the major pests of potato Solanum tuberosum L. in the temperate zone is the insect Colorado potato beetle (CPB). Most studies on the immunity and ...

ניתוח עמידות תפוחי אדמה תחת לחצים הקשורים לאקלים

High Throughput Image-Based Phenotyping for Determining Morphological and Physiological Responses to Single and Combined Stresses in Potato

High throughput image-based phenotyping is a powerful tool to non-invasively determine the development and performance of plants under specific conditions over time. By using multiple imaging sensors, many traits of interest can be assessed, including plant biomass, photosynthetic efficiency, canopy temperature, and leaf reflectance indices. Plants are frequently exposed to multiple stresses under field conditions where severe heat waves, flooding, and drought events seriously threaten crop productivity. When stresses coincide, resulting effects on plants can be distinct due to synergistic or antagonistic interactions. To elucidate how potato plants respond to single and combined stresses that resemble naturally occurring stress scenarios, five different treatments were imposed on a selected potato cultivar (Solanum tuberosum L., cv. Lady Rosetta) at the onset of tuberization, i.e. control, drought, heat, waterlogging, and combinations of heat, drought, and waterlogging stresses. Our analysis shows that waterlogging stress had the most detrimental effect on plant performance, leading to fast and drastic physiological responses related to stomatal closure, including a reduction in the quantum yield and efficiency of photosystem II and an increase in canopy temperature and water index. Under heat and combined stress treatments, the relative growth rate was reduced in the early phase of stress. Under drought and combined stresses, plant volume and photosynthetic performance dropped with an increased temperature and stomata closure in the late phase of stress. The combination of optimized stress treatment under defined environmental conditions together with selected phenotyping protocols allowed to reveal&#160;the dynamics of morphological and physiological responses to single and combined stresses. Here, a useful tool is presented for plant researchers looking to identify plant traits indicative of resilience to several climate change-related stresses.

מחבר זרקור: חשיפת תגובות צמחים לעקות אביוטיות באמצעות הפלטפורמה הרובוטית PlantScreen

We designed an image-based phenotyping protocol to determine the morphological and physiological responses to single and combined heat, drought, and waterlogging treatments. This approach enabled the identification of early, late, and recovery responses at a whole plant level, particularly above-ground parts, and highlighted the necessity of using multiple imaging sensors.

פנוטיפ מבוסס תמונה בתפוקה גבוהה לקביעת תגובות מורפולוגיות ופיזיולוגיות ללחצים בודדים ומשולבים בתפוח אדמה

High throughput image-based phenotyping is a powerful tool to non-invasively determine the development and performance of plants under specific conditions ...