Il lavoro è parzialmente supportato dal Wageningen University Fund (WUF), dal China Scholarship Council Program for Graduate Students e da una borsa di studio NWO-VIDI 12378.

1. Condizioni di coltivazione e collaudo delle piante
<ol><li>Coltivare e mantenere piante in serre controllate o camere climatiche entro l'intervallo di temperatura di 18-22 °C e sotto regime di luce naturale o con un regime giorno/notte di 16 ore / 8 ore. Rimuovere i rami ascellari per rendere le piante più gestibili.</li>
	<li>Per le patate, mantenere le fiorine in vitro in barattoli di plastica sterili contenenti mezzo Murashige-Skoog (MS) (20 g/L di saccarosio, 5 g/L S.M. sali con vitamine, 8 g/L di agar, pH 5.8) in condizioni controllate in camere climatiche a 18 °C con regime giorno/notte di 16 ore/8 ore per due settimane e quindi trasferirli in vasi di terreno sterilizzato in compartimenti di serra regolamentati.</li>
</ol>2. Agroinfiltrazione
<ol><li>Materiale vegetale: Per Nicotiana benthamiana,utilizzare piante coltivate a semi di circa 4-5 settimane. Per la patata, utilizzare circa 4-5 settimane di trapianti da in vitro. Scegli foglie giovani, sane e completamente sviluppate per le infiltrazioni.</li>
	<li>
Cultura agrobatterio:<ol>
<li>Preparare in anticipo il mezzo YEB(tabella 1). Riempire i tubi da 50 ml con mezzo YEB da 10 ml integrato con acido solfonico di acetosyringone da 1 μl (200 mM), tampone MES da 100 μl (acido solfonico 2-(N-morfolino)-etano, 1 M) e gli antibiotici appropriati. Pipetta 20 μl di glicerolo dei ceppi desiderati(tabella 2) (contenente il gene di interesse) nello YEB. Inizia le colture per tutti i ceppi di Agrobacterium in questo saggio allo stesso tempo. Incubare le cellule tremando per 1-2 giorni a 28 °C e 200 giri/min a un OD600 di circa 1,0.</li>
		<li>Raccogliere le cellule per centrifugazione a 3.000 x g per 10 min. Versare il supernatante e resospendare il pellet in mezzo MMA appena fatto(tabella 3)ad un OD600 di 0,3. Delicatamente cellule vortice per ripreposerle. Per la coinfiltrazione di due ceppi batterici, mescolare la coltura in un rapporto 1:1.</li>
		<li>Lasciare la coltura in panchina a temperatura ambiente per 1-6 ore prima delle infiltrazioni. Nel frattempo, etichettare le piante da infiltrare e la data dell'esperimento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Infiltrazioni: Utilizzare una siringa senza ago da 1 ml per infiltrarsi nelle sospensioni agrobacterium. Iniettare con attenzione e lentamente pannelli fogliari con le sospensioni dalla siringa (per motivi di salute e sicurezza la protezione degli occhi deve essere indossata durante questo processo). Infiltrarsi in almeno tre piante per ogni ceppo. Utilizzare tre foglie per pianta per servire come triplicati. Nota: Normalmente, 1 ml di sospensioni agrobatterio potrebbe essere sufficiente per 3 piante di N. benthamiana. Per la patata, è necessaria una maggiore sospensione perché le foglie delle specie Solanum sono più difficili da infiltrare. I volumi richiesti di sospensioni dipendono dalla specie Solanum. Evitare la contaminazione incrociata cambiando guanti o sterilizzando guanti con etanolo tra infiltrazioni e non annaffiando le piante fino al giorno dopo l'inoculazione.</li>
	<li>punteggio: Segnare risposte macroscopiche circa 3 giorni dopo l'infiltrazione quando il fenotipo di morte cellulare è chiaro (Figura 1). Se il fenotipo di morte cellulare è quantitativo, utilizzare i criteri specificati (Figura 2). In breve, le scale per il punteggio macroscopico della morte cellulare dipendono principalmente dalle percentuali di morte cellulare dell'area infiltrata. Le percentuali di morte cellulare sono raffigurate su una scala dallo 0% (nessun sintomo) al 100% (morte cellulare confluente). Le risposte intermedie vanno da risposte deboli come la clorosi all'aumento dei livelli di morte cellulare. Se lo si desidera, il punteggio macroscopico può anche essere valutato quantitativamente utilizzando moderne apparecchiature di foto-imaging.</li>
</ol>3. Agroinfezione PVX
<ol><li>Materiale vegetale: Per N. benthamiana,utilizzare circa 2-3 settimane di piante coltivate a semi. Per la patata, utilizzare circa 2-3 settimane di trapianti da in vitro. Per i test su larga scala, utilizzare piante leggermente più vecchie (4-5 settimane), poiché queste piante hanno foglie sempre più grandi per ospitare un numero maggiore di macchie di inoculazione di Agrobacterium.</li>
	<li>
Coltivazione dell'agrobatterio:<ol>
<li>Preparare il mezzo YEB in anticipo. Riempire i tubi da 10 ml con 3 ml di YEB integrati con gli antibiotici appropriati. Pipetta 20 μl di glicerolo dei ceppi desiderati(tabella 2) (contenente il gene di interesse) nello YEB. Inizia le colture per tutti i ceppi di Agrobacterium in questo saggio allo stesso tempo. Incubare le cellule tremando per 1-2 giorni a 28 °C e 200 giri/min a un OD600 di circa 1,0.</li>
		<li>Pipetta circa 300 μl di ogni ceppo agrobatterio e stenderli su piastre medie di agar solido LB integrate con gli antibiotici appropriati e incubare le cellule a 28 °C per 1-2 giorni.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Infezioni: Usa una spatola per raccogliere la coltura di Agrobacterium nel piatto. Immergere uno stuzzicadenti di legno nella coltura di Agrobacterium sulla spatola e perforare le foglie per inoculare una grande quantità di batteri. Inoculare almeno tre piante per ogni ceppo. Utilizzare tre foglie per pianta per servire come triplicati. In ogni foglia, creare più siti di inoculazione per ogni ceppo.</li>
	<li>punteggio: Segnare risposte macroscopiche circa due settimane dopo l'inoculazione (Figura 3). Per gli schermi ad alta velocità effettiva, registrare le risposte qualitative (sì/no) per ogni punto di inoculazione. Quindi calcola la percentuale di siti che rispondono e confrontali con i controlli.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Vleeshouwers, V. G. A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+and+exploiting+late+blight+resistance+in+the+age+of+effectors.">Understanding and exploiting late blight resistance in the age of effectors.</a> Ann. Rev. Phytopathol. 49, 507-531 (2011).</li><li>Ellis, J. G., Rafiqi, M., Gan, P., Chakrabarti, A., Dodds, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+discovery+and+functional+analysis+of+effector+proteins+of+fungal+and+oomycete+plant+pathogens.">Recent progress in discovery and functional analysis of effector proteins of fungal and oomycete plant pathogens.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 12, 399-405 (2009).</li><li>Vleeshouwers, V. G. A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+genomics+accelerates+discovery+and+functional+profiling+of+potato+disease+resistance+and+Phytophthora+infestans+avirulence+genes.">Effector genomics accelerates discovery and functional profiling of potato disease resistance and Phytophthora infestans avirulence genes.</a> Plos One. 3, 1-10 (2008).</li><li>Oh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+planta+expression+screens+of+Phytophthora+infestans+RXLR+effectors+reveal+diverse+phenotypes,+including+activation+of+the+Solanum+bulbocastanum+disease+resistance+protein+Rpi-blb2.">In planta expression screens of Phytophthora infestans RXLR effectors reveal diverse phenotypes, including activation of the Solanum bulbocastanum disease resistance protein Rpi-blb2.</a> Plant Cell. 21, 2928-2947 (2009).</li><li>Tyler, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phytophthora+genome+sequences+uncover+evolutionary+origins+and+mechanisms+of+pathogenesis.">Phytophthora genome sequences uncover evolutionary origins and mechanisms of pathogenesis.</a> Science. 313, 1261-1266 (2006).</li><li>Haas, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequence+and+analysis+of+the+Irish+potato+famine+pathogen+Phytophthora+infestans.">Genome sequence and analysis of the Irish potato famine pathogen Phytophthora infestans.</a> Nature. 461, 393-398 (2009).</li><li>Levesque, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequence+of+the+necrotrophic+plant+pathogen+Pythium+ultimum+reveals+original+pathogenicity+mechanisms+and+effector+repertoire.">Genome sequence of the necrotrophic plant pathogen Pythium ultimum reveals original pathogenicity mechanisms and effector repertoire.</a> Genome Biol. 11, 1-22 (2010).</li><li>Lamour, K. H., Win, J., Kamoun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oomycete+genomics:+new+insights+and+future+directions.">Oomycete genomics: new insights and future directions.</a> FEMS Microbiol. Lett. 274, 1-8 (2007).</li><li>Stassen, J. H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+identification+in+the+lettuce+downy+mildew+Bremia+lactucae+by+massively+parallel+transcriptome+sequencing.">Effector identification in the lettuce downy mildew Bremia lactucae by massively parallel transcriptome sequencing.</a> Mol. Plant Pathol. 13, 719-731 (2012).</li><li>Kemen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+gain+and+loss+during+evolution+of+obligate+parasitism+in+the+white+rust+pathogen+of+Arabidopsis+thaliana.">Gene gain and loss during evolution of obligate parasitism in the white rust pathogen of Arabidopsis thaliana.</a> PLoS Biol. 9, 1-21 (2011).</li><li>Win, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Effector biology of plant-associated organisms: concepts and perspectives. , 1-13 (2012).</li><li>Hogenhout, S. A., van der Hoorn, R. A. L., Terauchi, R., Kamoun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+concepts+in+effector+biology+of+plant-associated+organisms.">Emerging concepts in effector biology of plant-associated organisms.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 22, 115-122 (2009).</li><li>Kamoun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+catalogue+of+the+effector+secretome+of+plant+pathogenic+oomycetes.">A catalogue of the effector secretome of plant pathogenic oomycetes.</a> Ann. Rev. Phytopathol. 44, 41-60 (2006).</li><li>van der Hoorn, R. A. L., Laurent, F., Roth, R., De Wit, P. J. G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agroinfiltration+is+a+versatile+tool+that+facilitates+comparative+analyses+of+Avr9/Cf-9-induced+and+Avr4/Cf-4-induced+necrosis.">Agroinfiltration is a versatile tool that facilitates comparative analyses of Avr9/Cf-9-induced and Avr4/Cf-4-induced necrosis.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 13, 439-446 (2000).</li><li>Dangl, J. L., Jones, J. D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+pathogens+and+integrated+defence+responses+to+infection.">Plant pathogens and integrated defence responses to infection.</a> Nature. 411, 826-833 (2001).</li><li>Kapila, J., de Rycke, R., van Montagu, M., Angenon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Agrobacterium-mediated+transient+gene+expression+system+for+intact+leaves.">An Agrobacterium-mediated transient gene expression system for intact leaves.</a> Plant Sci. 122, 101-108 (1997).</li><li>Kanneganti, T. D., Huitema, E., Kamoun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+planta+expression+of+oomycete+and+fungal+genes.">In planta expression of oomycete and fungal genes.</a> Methods Mol. Biol. 354, 35-43 (2007).</li><li>Vleeshouwers, V. G. G. A., Rietman, H., Lamour, K., Kamoun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+planta+expression+systems.+Oomycete+Genetics+and+Genomics.">In planta expression systems. Oomycete Genetics and Genomics.</a> Diversity, Interactions, and Research Tools. 23, 455-475 (2009).</li><li>Peng, W. T., Lee, Y. W., Nester, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phenolic+recognition+profiles+of+the+Agrobacterium+tumefaciens+VirA+protein+are+broadened+by+a+high+level+of+the+sugar+binding+protein+ChvE.">The phenolic recognition profiles of the Agrobacterium tumefaciens VirA protein are broadened by a high level of the sugar binding protein ChvE.</a> J. Bacteriol. 180, 5632-5638 (1998).</li><li>Lu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+virus-induced+gene+silencing+implicates+heat+shock+protein+90+in+plant+disease+resistance.">High throughput virus-induced gene silencing implicates heat shock protein 90 in plant disease resistance.</a> EMBO J. 22, 5690-5699 (2003).</li><li>Ma, L., Lukasik, E., Gawehns, F., Takken, F. L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+agroinfiltration+for+transient+expression+of+plant+resistance+and+fungal+effector+proteins+in+Nicotiana+benthamiana+leaves.">The use of agroinfiltration for transient expression of plant resistance and fungal effector proteins in Nicotiana benthamiana leaves.</a> Methods Mol. Biol. 835, 61-74 (2012).</li><li>Bhaskar, P. B., Venkateshwaran, M., Wu, L., An&#233;, J. M., Jiang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transient+gene+expression+and+silencing:+A+rapid+tool+for+functional+gene+assay+in+potato.">Agrobacterium-mediated transient gene expression and silencing: A rapid tool for functional gene assay in potato.</a> Plos One. 4, 1-8 (2009).</li><li>van der Fits, L., Deakin, E. A., Hoge, J. H. C., Memelink, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ternary+transformation+system:+constitutive+virG+on+a+compatible+plasmid+dramatically+increases+Agrobacterium-mediated+plant+transformation.">The ternary transformation system: constitutive virG on a compatible plasmid dramatically increases Agrobacterium-mediated plant transformation.</a> Plant Mol. Biol. 43, 495-502 (2000).</li><li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+genomics+enabled+the+isolation+of+the+R3a+late+blight+resistance+gene+in+potato.">Comparative genomics enabled the isolation of the R3a late blight resistance gene in potato.</a> Plant J. 42, 251-261 (2005).</li><li>Armstrong, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ancestral+oomycete+locus+contains+late+blight+avirulence+gene+Avr3a,+encoding+a+protein+that+is+recognized+in+the+host+cytoplasm.">An ancestral oomycete locus contains late blight avirulence gene Avr3a, encoding a protein that is recognized in the host cytoplasm.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 7766-7771 (2005).</li><li>Kim, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad+spectrum+late+blight+resistance+in+potato+differential+set+plants+MaR8+and+MaR9+is+conferred+by+multiple+stacked+R+genes.">Broad spectrum late blight resistance in potato differential set plants MaR8 and MaR9 is conferred by multiple stacked R genes.</a> Theor. Appl. Genet. 124, 923-935 (2012).</li><li>Torto, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EST+mining+and+functional+expression+assays+identify+extracellular+effector+proteins+from+the+plant+pathogen+Phytophthora.">EST mining and functional expression assays identify extracellular effector proteins from the plant pathogen Phytophthora.</a> Genome Res. 13, 1675-1685 (2003).</li><li>Vleeshouwers, V. G. A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agroinfection-based+high-throughput+screening+reveals+specific+recognition+of+INF+elicitins+in+Solanum.">Agroinfection-based high-throughput screening reveals specific recognition of INF elicitins in Solanum.</a> Mol. Plant Pathol. 7, 499-510 (2006).</li><li>Koncz, C., Schell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promoter+of+TL-DNA+gene+5+controls+the+tissue-specific+expression+of+chimeric+genes+carried+by+a+novel+type+of+agrobacterium+binary.">The promoter of TL-DNA gene 5 controls the tissue-specific expression of chimeric genes carried by a novel type of agrobacterium binary.</a> Mol. Gen. Genet. 204, 383-396 (1986).</li><li>Lazo, G. R., Stein, P. A., Ludwig, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA+transformation-competent+Arabidopsis+genomic+library+in+Agrobacterium.">A DNA transformation-competent Arabidopsis genomic library in Agrobacterium.</a> Bio-Technol. 9, 963-967 (1991).</li><li>Rietman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Putting the Phytophthora infestans genome sequence at work; multiple novel avirulence and potato resistance gene candidates revealed [PhD thesis]. , (2011).</li><li>Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+Agrobacterium-mediated+transient+assays+of+gene+expression+in+lettuce,+tomato+and+Arabidopsis.">Optimization of Agrobacterium-mediated transient assays of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis.</a> Plant Biotechnol. J. 3, 259-273 (2005).</li><li>van engelen, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pBINPLUS+-+an+improved+plant+transformation+vector+based+on+pBIN19.">pBINPLUS - an improved plant transformation vector based on pBIN19.</a> Transgenic Res. 4, 288-290 (1995).</li><li>Karimi, M., Inze, D., Depicker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GATEWAYTM+vectors+for+Agrobacterium-mediated+plant+transformation.">GATEWAYTM vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation.</a> Trends Plant Sci. 7, 193-195 (2002).</li><li>Xiang, C. B., Han, P., Lutziger, I., Wang, K., Oliver, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mini+binary+vector+series+for+plant+transformation.">A mini binary vector series for plant transformation.</a> Plant Mol. Biol. 40, 711-717 (1999).</li><li>Curtis, M. D., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gateway+cloning+vector+set+for+high-throughput+functional+analysis+of+genes+in+planta.">A gateway cloning vector set for high-throughput functional analysis of genes in planta.</a> Plant Physiol. 133, 462-469 (2003).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Saggi transitori come l'agroinfiltrazione e l'agroinfezione sono metodi efficienti che sono vitali per la moderna ricerca sulla patologia vegetale molecolare. Nonostante alcune limitazioni, questi metodi soddisfano la domanda di analisi funzionali ad alta produttività efficienti e robuste negli impianti.
Il sistema di agroinfiltrazione è un saggio funzionale ampiamente utilizzato in una serie di specie vegetali. L'agroinfiltrazione facilita la consegna di diversi transgeni nella stessa cellula con espressione simultanea di proteine interagenti. Questo è vantaggioso per ricapitolare le relazioni R-AVR, coniando ceppi di Agrobacterium che esprimono geni Avr con ceppi che esprimono i geni R corrispondenti. Inoltre, per le coppie R-AVR note, tali coinfiltrazioni possono essere utilizzate come controlli positivi. L'inclusione di tali controlli è importante perché in alcuni genotipi dell'impianto, l'efficienza di trasformazione può essere inferiore alla soglia per rilevare le risposte. Includere controlli negativi, ad esempio un ceppo di Agrobatteri contenenti un vettore senza un inserto genico, è anche essenziale per determinare se un certo genotipo vegetale solleva risposte di difesa non specifiche all'Agrobacterium. Questa caratteristica si verifica a una certa frequenza nel germplasma delle patate, e non tutte le specie Solanum sono ben adatte per questo sistema di espressione a base di Agrobacterium. Generalmente, il saggio di agroinfiltrazione funziona molto bene in N. benthamiana e nella maggior parte dei genotipi di patate. Oltre all'effettioromica, ci sono varie altre potenziali applicazioni per la tecnica di agroinfiltrazione, come la produzione di proteine dai transgeni e la localizzazione proteica nelle cellule vegetali mediante microscopia confocale.
L'agroinfezione PVX è un sistema di screening altamente sensibile e in genere più adatto per screening ad alta produttività. Poiché l'Agrobacterium è ora presente solo localmente, le risposte non specifiche a questo batterio non sono ora molto inquietanti, poiché il virus PVX assume un'ulteriore diffusione del transgene. Tuttavia, le piante possono essere resistenti al PVX o montare risposte di resistenza estrema (ER) e in tal caso il metodo di agroinfezione non è adatto. Un'altra limitazione del metodo di agroinfezione PVX è la dimensione dell'inserto del gene di interesse. I fenotipi osservati di risposte possono variare da un'intensa necrosi nera che circonda la ferita a una debole necrosi vicino al punto di inoculazione. Sia nelle specie N. benthamiana che Solanum, l'agroinfezione PVX è riconosciuta come più sensibile dell'agroinfiltrazione.
Tenendo conto del fatto che il background genetico dei diversi genotipi vegetali testati può avere alcune restrizioni (vedi sopra), generalmente otteniamo conclusioni simili per agroinfezione PVX e agroinfiltrazione. Questi risultati sono comparabili anche come si ottengono in altri saggi, come le infiltrazioni proteiche29 ed ELISA3. Considerando i vantaggi e i limiti di entrambi i sistemi, si consiglia di utilizzare entrambi i metodi per completarsi a vicenda o confermare risultati indipendenti.

L'effectoromica, un approccio genomico funzionale ad alta produttività è recentemente emerso come un potente strumento per identificare igeni di resistenza (R)nelle piante coltivate e abbinare i geni di avirulenza(Avr)degli agenti patogeni1-4. In contrasto con la trasformazione stabile più dispendiosa in termini di tempo con i geni R, la strategia dell'effettoromica si basa su saggi transitori di sequenze geniche patogene.
Fin dall'era genomica, i genomi degli agenti patogeni vegetali sono stati ampiamente esplorati. Ad esempio per gli oomiceti, che includono gli agenti patogeni vegetali più devastanti, sono state generate e analizzate grandi raccolte di sequenze per geni che svolgono un ruolo durantel'interazione con la pianta 5-10. Una classe di proteine patogene rappresenta gli effettori, che manipolano la struttura e la funzione delle cellule ospiti sia per facilitare l'infezione (fattori di virulenza) sia per innescare risposte di difesa (fattori di avirulenza)11-13. L'espressione dei geni Avr nelle cellule vegetali contenenti geni R di solito si traduce nella risposta di morte cellulare ipersensibile (HR)14,15. Nella planta espressione dei geni R e Avr può essere realizzata utilizzando sistemi di espressione transitoria come Agrobacterium tumefaciens -trasformazione transitoria basata sulla base (agroinfiltrazione)16. Questa trasformazione transitoria può essere applicata anche in combinazione con sistemi di espressione virale (agroinfezione)17,18.
Per l'agroinfiltrazione, l'agente più comunemente usato è A . tumefaciens, un'ampia gamma di agenti patogeni delle piante dicot. Un tumefaciens contiene un plasmide che induce il tumore (Ti). Trasferire il DNA (T-DNA) da un plasmide Ti si trasferirà nelle cellule vegetali dopo l'attivazione del meccanismo di virulenza del batterio. Questo può essere innescato nelle cellule vegetali ferite, dai composti fenolici a basso peso molecolare rilasciati e dai monosaccaridi in un ambiente leggermente acido19. Il gene della virulenza si attiva dopo l'infiltrazione delle sospensioni dell'Agrobacterium nei pannelli fogliari definiti dalle vene maggiori. Quindi le cellule vegetali nei pannelli fogliari saranno trasformate ed esprimeranno i transgeni contenuti nella regione T-DNA.
L'agroinfezione si basa sull'Agrobatterioinoculato dalla ferita , che media la traslocazione di un virus alle cellule vegetali. Il virus si diffonde quindi ulteriormente ai tessuti vegetali adiacenti, in assenza di Agrobacterium. Per l'agroinfezione, è possibile utilizzare diversi virus vegetali. I virus dell'RNA sono vettori ideali per l'espressione genica perché possono moltiplicarsi a livelli molto alti nelle piante infette. Tra i virus dell'RNA vegetale, Potato Virus X (PVX) è ampiamente utilizzato per gli schermi di effettioromica. Per facilitare i test funzionali per un gene inserito, i vettori binari che contengono il genoma PVX affiancato dal promotore del virus del mosaico di Cavolfiore 35S e dal terminatore della nopalina sintasi, sono stati clonati nel T-DNA di A. tumefaciens20. Dopo che il T-DNA è stato trasferito in cellule vegetali, il genoma PVX contenuto nel T-DNA viene trascritto dal promotore 35S. Quindi le particelle virali si diffondono sistemicamente nelle piante infette, con conseguente espressione del gene inserito. Questo metodo basato sia sull'Agrobatterio che sul PVX è chiamato agroinfezione PVX.
Qui mostriamo esempi sia per i saggi di agroinfiltrazione che per i saggi di agroinfezione PVX. Come piante ospiti utilizziamo il germoplasma delle patate(sezione Solanum Petota), per il quale gli approcci di effettioromica sono stati pionieri e si sonodimostrati efficaci 3,4. Utilizziamo anche Nicotiana benthamiana,rinomata come impianto modello nelle piante Solanaceous 14,21,22.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="955">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col span="2" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Beef extract</td>
			<td style="width:267px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">B4888</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Bacteriological peptone</td>
			<td style="width:267px;">Oxoid</td>
			<td style="width:219px;">LP0037</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:267px;">Oxoid</td>
			<td style="width:219px;">LP0021</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">MgSO4</td>
			<td style="width:267px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">208094</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">MS salts (without vitamins)</td>
			<td style="width:267px;">Duchefa Biochemie</td>
			<td style="width:219px;">M0221</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">MES</td>
			<td style="width:267px;">Duchefa Biochemie</td>
			<td style="width:219px;">M1503</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">LB broth powder</td>
			<td style="width:267px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">L3022</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Acetosyringone</td>
			<td style="width:267px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">D134406</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Syringe (1 ml)</td>
			<td style="width:267px;">BD Plastipak</td>
			<td style="width:219px;">300013</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Incubator</td>
			<td style="width:267px;">Infors HT</td>
			<td style="width:219px;">Multitron II</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:267px;">Heraeus</td>
			<td style="width:219px;">Multifuge 3S-R</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:267px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:219px;">Biophotometer 6131</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

agroinfiltration and pvx agroinfection in potato and nicotiana benthamiana

Agroinfiltrazione e agroinfezione PVX sono due efficaci saggi di espressione transitoria per l'analisi funzionale dei geni candidati nelle piante. L'agente più comunemente usato per l'agroinfiltrazione è Agrobacterium tumefaciens, un agente patogeno di molte specie di piante dicot. Ciò implica che l'agroinfiltrazione può essere applicata a molte specie vegetali. Qui presentiamo i nostri protocolli e i risultati attesi quando applichiamo questi metodi allapatata (Solanum tuberosum),alle sue specie solanum porta tuberiche selvatiche correlate(sezione Solanum Petota)e alla pianta modello Nicotiana benthamiana. Oltre all'analisi funzionale di singoli geni, come i geni di resistenza (R) o avirulenza(Avr), il saggio di agroinfiltrazione è molto adatto per ricapitolare le interazioni R-AVR associate a specifiche interazioni patogene ospiti semplicemente fornendo transgeni R e Avr nella stessa cellula. Tuttavia, alcuni genotipi vegetali possono aumentare le risposte di difesa non specifiche all'Agrobacterium, come abbiamo osservato ad esempio per diversi genotipi di patate. Rispetto all'agroinfiltrazione, il rilevamento dell'attività AVR con agroinfezione PVX è più sensibile, più ad alto throughput negli schermi funzionali e meno sensibile alle risposte di difesa aspecifiche all'Agrobacterium. Tuttavia, può verificarsi una difesa aspecifica del PVX e c'è il rischio di perdere risposte a causa di una resistenza estrema indotta da virus. Nonostante tali limitazioni, nella nostra esperienza, l'agroinfiltrazione e l'agroinfezione PVX sono saggi adatti e complementari che possono essere utilizzati contemporaneamente per confermare i risultati l'uno dell'altro.

La figura 1 mostra un esperimento rappresentativo di agroinfiltrazione con 7 diversi effettori (E1-E7) in patate e N. benthamiana. La morte cellulare appare nei pannelli fogliari infiltrati circa 3 giorni dopo l'infiltrazione. L'estensione del fenotipo di morte cellulare deve essere confrontata con i controlli. Una miscela del ceppo Agrobacterium AGL1(pVirG)23 contenente pBINplus-R3a e pK7WG2-AVR3a è stata utilizzata come controllo positivo24,25, mentre AGL1(pVirG) è stato utilizzato come controllo negativo. Le figure 1A e 1B mostrano buoni esempi di agroinfiltrazione nel genotipo di patata MaR8 (Mastenbroek R8)26 e N. benthamiana, rispettivamente, che sono molto suscettibili di agroinfiltrazione. C'è una morte cellulare confluente nel pannello fogliare coinfiltrato con controllo positivo, mentre non si verifica alcuna risposta di morte cellulare con controllo negativo o pBINplus-R3a. In MaR8, due effettori AVR3a (E2) e AVR4 (E3) inducono una morte cellulare, mentre gli altri effettori (E1 ed E4-E7) non lo fanno. In N. benthamiana, nessuno degli effettori testati induce una risposta di morte cellulare. Le figure 1C e 1D mostrano esempi di agroinfiltrazione nella patata selvatica Solanum berthaultii 483-1 e Solanum rechei 210-5, che non sono ben disponibili per la tecnica di agroinfiltrazione. In S. berthaultii 483-1, il tessuto fogliare mostra una necrosi non specifica ai controlli negativi e a tutti gli effettori testati. In S. rechei 210-5, i pannelli fogliari infiltrati mostrano una risposta di morte cellulare molto debole al controllo positivo.
La figura 2 mostra una serie di scale di punteggio che possono essere utilizzate per quantificare la risposta all'Agrobatterio agroinfiltrato . Le percentuali di morte cellulare sono raffigurate su una scala dello 0-100%. I fenotipi osservati vanno da sintomi macroscopicamente non visibili (0%), attraverso una serie di risposte intermedie che mostrano clorosi e livelli crescenti di morte cellulare, fino alla morte cellulare confluente (100%).
La figura 3 mostra un esperimento rappresentativo dopo l'agroinfezione PVX nella patata. Normalmente, l'espansione della morte cellulare può essere trovata nei siti circa due settimane dopo l'inoculazione del dente. Come mostrato in entrambi i pannelli di figura, la morte cellulare in espansione è presente nei siti che sono stati inoculati con pGR106-CRN2 (controllo positivo usando l'effettore crinkler Crn2), che è un gene che induce la morte cellulare generale da P. infestans27. A parte una risposta minore al mento, non si nota alcuna morte cellulare in espansione nei siti che sono stati inoculati con il pGR106-vuoto (controllo negativo). Nella figura 3A, che rappresenta il genotipo di patata MaR3 (Mastenbroek R3), due effetti pGR106 (E1 ed E2) non hanno indotto la morte cellulare. Nella figura 3Bviene presentato un risultato positivo dello screening dell'effettore nella selvaggia Solanum huancabambense 354-1; la risposta di morte cellulare è stata osservata a due pGR106-effettori (E1-E3, che rappresentano le elicitina)28.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50971/50971fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50971/50971fig1.jpg"> Figura 1. Esempi di agroinfiltrazione in patate e N. benthamiana. Piante tra cui (A) un genotipo di patata MaR8 (Mastenbroek R8), (B) N. benthamiana, (C) Solanum berthaultii 483-1 e (D) Solanum rechei 210-5 sono stati infiltrati con una miscela del ceppo agrobatterio AGL1(pVirG) 23 contenente pBINplus-R3a e pK7WG2-AVR3a (controllo positivo), AGL1(pvirG) (controllo negativo), pBINplus-R3a, e sette effettori (E1-E7). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50971/50971fig1highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare l'immagine più grande</a>.
<img alt="Figure 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50971/50971fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50971/50971fig2.jpg"> Figura 2. Quantificazione delle risposte agroinfiltrazione. La fotografia mostra scale di punteggio rappresentative per la morte cellulare, che vanno dallo 0% (nessun sintomo) al 100% (morte cellulare confluente). Le risposte intermedie vanno da risposte deboli come la clorosi all'aumento dei livelli di morte cellulare. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50971/50971fig2highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare l'immagine più grande</a>.
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50971/50971fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50971/50971fig3.jpg"> Figura 3. Esempi di agroinfezione PVX in patate. Genotipo di patata MaR3 (Mastenbroek R3) (A) e Solanum huancabambense 354-1 (B) dente inoculato con pGR106-CRN2 (controllo positivo), pGR106-vuoto (controllo negativo) e pGR106-E1-2 (effettori) o pGR106-E1-E3, rispettivamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50971/50971fig3highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare l'immagine più grande</a>.
La tabella 1. Mezzo YEB
<table border="1"><tbody>
<tr>
<td>1 L</td>
			<td>distillato H2O</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 g</td>
			<td>saccarosio</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 g</td>
			<td>estratto di manzo</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 g</td>
			<td>peptone batteriologico</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 g</td>
			<td>estratto di lievito</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 ml</td>
			<td>MgSO4 (1 M)</td>
		</tr>
</tbody></table>La tabella 2. Vettori e ceppi utilizzati per l'agroinfiltrazione e l'agroinfezione PVX. È possibile utilizzare diversi vettori binari. I vettori nella lista seguente consentono un'alta espressione dei geni candidati e hanno funzionato bene nelle nostre mani. Preferiamo utilizzare il ceppo Agrobacterium GV3101(pMP90)29 in N. benthamiana e trovare AGL130 contenente il pVirG plasmide aiutante (pBBR1MCS-5.virGN54D)23 più adatto nellapatata 31. Ulteriori ceppi sono stati analizzati in altri gruppi su varie piante modello tra cui N. benthamiana ma non nella patata32.
<img alt="Table 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50971/50971table2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50971/50971table2.jpg">
GW: gateway versione36
La tabella 3. Media MMA. <img alt="Table 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50971/50971table3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50971/50971table3.jpg">
Regolare il pH a 5,6.

Watch this Scientific Journal Video about Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana at JoVE.com

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

L'agroinfiltrazione e l'agroinfezione PVX sono test funzionali di routine per l'espressione ectopica transitoria dei geni nelle piante. Questi metodi sono test efficienti nelle strategie di effettioromica (rapida resistenza e scoperta del gene dell'avirulenza) e cruciali per la moderna ricerca nella patologia vegetale molecolare. Soddisfano la domanda di solide analisi funzionali ad alta produttività negli impianti.

Agroinfiltrazione e Agroinfezione PVX in Benthamiana di Patate e Nicotiana

Agroinfiltration and PVX agroinfection are two efficient transient expression assays for functional analysis of candidate genes in plants. The most ...

agroinfiltration-pvx-agroinfection-potato-nicotiana

Research

JoVE Journal

Biology

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

20.1K Views.  Wageningen University. L'agroinfiltrazione e l'agroinfezione PVX sono test funzionali di routine per l'espressione ectopica transitoria dei geni nelle piante. Questi metodi sono test efficienti nelle strategie di effettioromica (rapida resistenza e scoperta del gene dell'avirulenza) e cruciali per la moderna ricerca nella patologia vegetale molecolare. Soddisfano la domanda di solide analisi funzionali ad alta produttività negli impianti.

Video: Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA regulators: microRNAs, which are produced from non-protein coding genes and short interfering RNAs (siRNAs). Plants use RNAi to control transposons and to exert tight control over developmental processes such as flower organ formation and leaf development2,3,4. Plants also use RNAi to defend themselves against infection by viruses. Consequently, many viruses have evolved suppressors of gene silencing to allow their successful colonization of their host5.
Virus-induced gene silencing (VIGS) is a method that takes advantage of the plant RNAi-mediated antiviral defense mechanism. In plants infected with unmodified viruses the mechanism is specifically targeted against the viral genome. However, with virus vectors carrying sequences derived from host genes, the process can be additionally targeted against the corresponding host mRNAs. VIGS has been adapted for high-throughput functional genomics in plants by using the plant pathogen Agrobacterium tumefaciens to deliver, via its Ti plasmid, a recombinant virus carrying the entire or part of the gene sequence targeted for silencing. Systemic virus spread and the endogenous plant RNAi machinery take care of the rest. dsRNAs corresponding to the target gene are produced and then cleaved by the ribonuclease Dicer into siRNAs of 21 to 24 nucleotides in length. These siRNAs ultimately guide the RNA-induced silencing complex (RISC) to degrade the target transcript2.
Different vectors have been employed in VIGS and one of the most frequently used is based on tobacco rattle virus (TRV). TRV is a bipartite virus and, as such, two different A. tumefaciens strains are used for VIGS. One carries pTRV1, which encodes the replication and movement viral functions while the other, pTRV2, harbors the coat protein and the sequence used for VIGS6,7. Inoculation of Nicotiana benthamiana and tomato seedlings with a mixture of both strains results in gene silencing. Silencing of the endogenous phytoene desaturase (PDS) gene, which causes photobleaching, is used as a control for VIGS efficiency. It should be noted, however, that silencing in tomato is usually less efficient than in N. benthamiana. RNA transcript abundance of the gene of interest should always be measured to ensure that the target gene has efficiently been down-regulated. Nevertheless, heterologous gene sequences from N. benthamiana can be used to silence their respective orthologs in tomato and vice versa8.

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

Description of a virus-induced gene silencing (VIGS) method for knock-down of gene expression in Nicotiana benthamiana and tomato.

Virale silenziamento genico (VIGS) in Nicotiana benthamiana E Pomodoro

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

Ricerca

Biologia

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing worldwide demand for pharmaceuticals due to its limited scalability and high cost. Plants have shown to be one of the most promising alternative pharmaceutical production platforms that are robust, scalable, low-cost and safe. The recent development of virus-based vectors has allowed rapid and high-level transient expression of recombinant proteins in plants. To further optimize the utility of the transient expression system, we demonstrate a simple, efficient and scalable methodology to introduce target-gene containing Agrobacterium into plant tissue in this study. Our results indicate that agroinfiltration with both syringe and vacuum methods have resulted in the efficient introduction of Agrobacterium into leaves and robust production of two fluorescent proteins; GFP and DsRed. Furthermore, we demonstrate the unique advantages offered by both methods. Syringe infiltration is simple and does not need expensive equipment. It also allows the flexibility to either infiltrate the entire leave with one target gene, or to introduce genes of multiple targets on one leaf. Thus, it can be used for laboratory scale expression of recombinant proteins as well as for comparing different proteins or vectors for yield or expression kinetics. The simplicity of syringe infiltration also suggests its utility in high school and college education for the subject of biotechnology. In contrast, vacuum infiltration is more robust and can be scaled-up for commercial manufacture of pharmaceutical proteins. It also offers the advantage of being able to agroinfiltrate plant species that are not amenable for syringe infiltration such as lettuce and Arabidopsis. Overall, the combination of syringe and vacuum agroinfiltration provides researchers and educators a simple, efficient, and robust methodology for transient protein expression. It will greatly facilitate the development of pharmaceutical proteins and promote science education.

Plants offer a novel system for the production of pharmaceutical proteins on a commercial scale that is more scalable, cost-efficient and safe than current expression paradigms. In this study, we report a simple and convenient, yet scalable approach to introduce target-gene containing Agrobacterium tumefaciens into plants for protein transient expression.

Agroinfiltration efficiente di impianti di alto livello espressione transiente di proteine ​​ricombinanti

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short period of time. However, this technology is only just beginning to be applied to large-scale production as many technological obstacles to scale up are now being overcome. Here, we demonstrate a simple and reproducible method for industrial-scale transient protein production based on vacuum infiltration of Nicotiana plants with Agrobacteria carrying launch vectors. Optimization of Agrobacterium cultivation in AB medium allows direct dilution of the bacterial culture in Milli-Q water, simplifying the infiltration process. Among three tested species of Nicotiana, N. excelsiana (N. benthamiana &#215; N. excelsior) was selected as the most promising host due to the ease of infiltration, high level of reporter protein production, and about two-fold higher biomass production under controlled environmental conditions. Induction of Agrobacterium harboring pBID4-GFP (Tobacco mosaic virus-based) using chemicals such as acetosyringone and monosaccharide had no effect on the protein production level. Infiltrating plant under 50 to 100 mbar for 30 or 60 sec resulted in about 95% infiltration of plant leaf tissues. Infiltration with Agrobacterium laboratory strain GV3101 showed the highest protein production compared to Agrobacteria laboratory strains LBA4404 and C58C1 and wild-type Agrobacteria strains at6, at10, at77 and A4. Co-expression of a viral RNA silencing suppressor, p23 or p19, in N. benthamiana resulted in earlier accumulation and increased production (15-25%) of target protein (influenza virus hemagglutinin).

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Transient protein production in Nicotiana plants based on vacuum infiltration with Agrobacteria carrying launch vectors (Tobacco mosaic virus-based) is a rapid and economic approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins. We simplified the procedure and improved target accumulation by optimizing conditions of bacteria cultivation, selecting host species, and co-introducing RNA silencing suppressors.

Ottimizzazione e utilizzo di<em&gt; Agrobacterium</em&gt;-Mediata transitoria produzione di proteine ​​in<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel protein-protein interaction pairs and monitoring protein interaction dynamics are of particular interest for revealing how plants respond to environmental factors and/or developmental signals. A plethora of approaches have been developed to examine protein-protein interactions, either in vitro or in vivo. Among them, the recently established luciferase complementation imaging (LCI) assay is the simplest and fastest method for demonstrating in vivo protein-protein interactions. In this assay, protein A or protein B is fused with the amino-terminal or carboxyl-terminal half of luciferase, respectively. When protein A interacts with protein B, the two halves of luciferase will be reconstituted to form a functional and active luciferase enzyme. Luciferase activity can be recorded with a luminometer or CCD-camera. Compared with other approaches, the LCI assay shows protein-protein interactions both qualitatively and quantitatively. Agrobacterium infiltration in Nicotiana benthamiana leaves is a widely used system for transient protein expression. With the combination of LCI and transient expression, these approaches show that the physical interaction between COP1 and SPA1 was gradually reduced after jasmonate treatment.

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

This manuscript describes an easy and rapid experimental procedure for determining protein-protein interactions based on the measurement of luciferase activity.

Analisi di Imaging di complementazione di luciferase in foglie di Nicotiana benthamiana per transitoriamente determinare dinamiche di interazione proteina-proteina

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...

Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana

High demand for antibodies as therapeutic interventions for various infectious, metabolic, autoimmune, neoplastic, and other diseases creates a growing need in developing efficient methods for recombinant antibody production. As of 2019, there were more than 70 FDA-approved monoclonal antibodies, and there is exponential growth potential. Despite their promise, limiting factors for widespread use are manufacturing costs and complexity. Potentially, plants offer low-cost, safe, and easily scalable protein manufacturing&#160;strategies. Plants like Nicotiana benthamiana not only can correctly fold and assemble complex mammalian proteins but also can add critical post-translational modifications similar to those offered by mammalian cell cultures. In this work, by using native GFP and an acid-stable variant of green fluorescent protein (GFP) fused to human monoclonal antibodies, we were able to visualize the entire transient antibody expression and purification process from N. benthamiana plants. Depending on the experiment&#39;s purpose, native GFP fusion can ensure easier visualization during the expression phase in the plants, while acid-stable GFP fusion allows for visualization during downstream processing. This scalable and straightforward procedure can be performed by a single researcher to produce milligram quantities of highly pure antibody or antibody fusion proteins in a matter of days using only a few small plants. Such a technique can be extended to the visualization of any type of antibody purification process and potentially many other proteins, both in plant and other expression systems. Moreover, these techniques can benefit virtual instructions and be executed in a teaching laboratory by undergraduate students possessing minimal prior experience with molecular biology techniques, providing a foundation for project-based exploration with real-world applications.

Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana

We describe here a simple method for expression, extraction, and purification of recombinant human IgG fused to GFP in Nicotiana benthamiana. This protocol can be extended to purification and visualization of numerous proteins that utilize column chromatography. Moreover, the protocol is adaptable to the in-person and virtual college teaching laboratory, providing project-based exploration.

Produzione di proteine di fusione IgG espresse transitoriamente in Nicotiana benthamiana

High demand for antibodies as therapeutic interventions for various infectious, metabolic, autoimmune, neoplastic, and other diseases creates a growing ...

An Experimental Study on Colorado Potato Beetle Hibernation Under Natural Conditions

One of the major pests of potato Solanum tuberosum L. in the temperate zone is the insect Colorado potato beetle (CPB). Most studies on the immunity and diseases of the CPB are conducted during active feeding stages. Nonetheless, there are fewer studies on resting stages, although these beetles spend most of their life cycle in a state of winter diapause (hibernation). In this work, a method for investigating CPB hibernation under natural conditions was developed and tested, offering an opportunity to collect a sufficient number of individuals in winter. In this article, CPB survival was assessed, and infectious agents at different stages of hibernation were identified. CPB mortality increased during the hibernation, reaching a maximum in April-May. Entomopathogenic fungi (Beauveria, Isaria, and Lecanicillium) and bacteria Bacillus, Sphingobacterium, Peribacillus, Pseudomonas, and Serratia were isolated&#160;from the dead insects. The survival rate of the beetles for the entire hibernation period was 61%. No frozen or desiccated beetles were found, indicating the success of the presented method.

Here we present a method for studying Colorado potato beetle hibernation under the natural conditions of the temperate zone as well as a technique for collecting beetles in winter. This method allows to obtain a desired number of overwintering individuals for various analyses at any stage of hibernation.

Uno studio sperimentale sull'ibernazione del coleottero della patata del Colorado in condizioni naturali

One of the major pests of potato Solanum tuberosum L. in the temperate zone is the insect Colorado potato beetle (CPB). Most studies on the immunity and ...

Analisi della resilienza della patata in condizioni di stress climatici

High Throughput Image-Based Phenotyping for Determining Morphological and Physiological Responses to Single and Combined Stresses in Potato

High throughput image-based phenotyping is a powerful tool to non-invasively determine the development and performance of plants under specific conditions over time. By using multiple imaging sensors, many traits of interest can be assessed, including plant biomass, photosynthetic efficiency, canopy temperature, and leaf reflectance indices. Plants are frequently exposed to multiple stresses under field conditions where severe heat waves, flooding, and drought events seriously threaten crop productivity. When stresses coincide, resulting effects on plants can be distinct due to synergistic or antagonistic interactions. To elucidate how potato plants respond to single and combined stresses that resemble naturally occurring stress scenarios, five different treatments were imposed on a selected potato cultivar (Solanum tuberosum L., cv. Lady Rosetta) at the onset of tuberization, i.e. control, drought, heat, waterlogging, and combinations of heat, drought, and waterlogging stresses. Our analysis shows that waterlogging stress had the most detrimental effect on plant performance, leading to fast and drastic physiological responses related to stomatal closure, including a reduction in the quantum yield and efficiency of photosystem II and an increase in canopy temperature and water index. Under heat and combined stress treatments, the relative growth rate was reduced in the early phase of stress. Under drought and combined stresses, plant volume and photosynthetic performance dropped with an increased temperature and stomata closure in the late phase of stress. The combination of optimized stress treatment under defined environmental conditions together with selected phenotyping protocols allowed to reveal&#160;the dynamics of morphological and physiological responses to single and combined stresses. Here, a useful tool is presented for plant researchers looking to identify plant traits indicative of resilience to several climate change-related stresses.

Autore in primo piano: Svelare le risposte delle piante agli stress abiotici utilizzando la piattaforma robotica PlantScreen

We designed an image-based phenotyping protocol to determine the morphological and physiological responses to single and combined heat, drought, and waterlogging treatments. This approach enabled the identification of early, late, and recovery responses at a whole plant level, particularly above-ground parts, and highlighted the necessity of using multiple imaging sensors.

Fenotipizzazione basata su immagini ad alta produttività per determinare le risposte morfologiche e fisiologiche a stress singoli e combinati nella patata

High throughput image-based phenotyping is a powerful tool to non-invasively determine the development and performance of plants under specific conditions ...

Estrazione e purificazione efficiente di GFP-His dalle foglie di N. benthamiana

Apoplast-Extraction Based Method to Improve the Purity of Plant Produced Recombinant Protein  

Plants are a newly developing eukaryotic expression system being explored to produce therapeutic proteins. Purification of recombinant proteins from plants is one of the most critical steps in the production process. Typically, proteins were purified from total soluble proteins (TSP), and the presence of miscellaneous intracellular proteins and cytochromes poses challenges for subsequent protein purification steps. Moreover, most therapeutic proteins like antigens and antibodies are secreted to obtain proper glycosylation, and the presence of incompletely modified proteins leads to inconsistent antigen or antibody structures. This work introduces a more effective method to obtain highly purified recombinant proteins from the plant apoplastic space. The recombinant Green fluorescent protein (GFP) is engineered to be secreted into the apoplast of Nicotiana benthamiana and is then extracted using an infiltration-centrifugation method. The GFP-His from the extracted apoplast is then purified by nickel affinity chromatography. In contrast to the traditional methods from TSP, purification from the apoplast produces highly purified recombinant proteins. This represents an important technological improvement for plant production systems.

Autore in primo piano: Ottimizzazione dell'estrazione delle proteine apoplast per un recupero efficiente delle proteine ricombinanti dalle cellule vegetali

The purification of recombinant proteins from plant systems is usually challenged by plant proteins. This work provides a method to effectively extract and purify a secreted recombinant protein from the apoplast of Nicotiana benthamiana.

Metodo basato sull'estrazione di Apoplast per migliorare la purezza delle proteine ricombinanti prodotte dalle piante  

Plants are a newly developing eukaryotic expression system being explored to produce therapeutic proteins. Purification of recombinant proteins from ...