وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة بيل وميليندا غيتس (المنحة 53085)، ومؤسسة JR Oishei، وجمعية الرئة الأمريكية (المنحة RG-123721-N) لAPH، والمعاهد الوطنية للصحة (NIDCD) الزمالات F31DC011218 لEAC.

<ol>
	<li>Hakansson, A., Zhivotovsky, B., Orrenius, S., Sabharwal, H., Svanborg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+induced+by+a+human+milk+protein.">Apoptosis induced by a human milk protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (17), 8064-8068 (1995).</li><li>Hakansson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+folding+variant+of+alpha-lactalbumin+with+bactericidal+activity+against+Streptococcus+pneumoniae.">A folding variant of alpha-lactalbumin with bactericidal activity against Streptococcus pneumoniae.</a> Mol. Microbiol. 35 (3), 589-600 (2000).</li><li>Hakansson, A. P., Roche-Hakansson, H., Mossberg, A. K., Svanborg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis-Like+Death+in+Bacteria+Induced+by+HAMLET,+a+Human+Milk+Lipid-Protein+Complex.">Apoptosis-Like Death in Bacteria Induced by HAMLET, a Human Milk Lipid-Protein Complex.</a> PLoS One. 6 (3), (2011).</li><li>Kohler, C., Gogvadze, V., Hakansson, A., Svanborg, C., Orrenius, S., Zhivotovsky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+folding+variant+of+human+alpha-lactalbumin+induces+mitochondrial+permeability+transition+in+isolated+mitochondria.">A folding variant of human alpha-lactalbumin induces mitochondrial permeability transition in isolated mitochondria.</a> Eur. J. Biochem. 268 (1), 186-191 (2001).</li><li>Ly, J. D., Grubb, D. R., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+membrane+potential+(&#916;&#968;+m)+in+apoptosis;+an+update.">The mitochondrial membrane potential (&#916;&#968; m) in apoptosis; an update.</a> Apoptosis. 8 (2), 115-128 (2003).</li><li>Dominguez, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signalling+in+bacteria.">Calcium signalling in bacteria.</a> Mol. Microbiol. 54 (2), 291-297 (2004).</li><li>Corratge-Faillie, C., Jabnoune, M., Zimmermann, S., Very, A. A., Fizames, C., Sentenac, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+and+sodium+transport+in+non-animal+cells:+the+Trk/Ktr/HKT+transporter+family.">Potassium and sodium transport in non-animal cells: the Trk/Ktr/HKT transporter family.</a> Cell Mol. Life Sci. 67 (15), 2511-2532 (2010).</li><li>Szabo, I., Petronilli, V., Zoratti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+patch-clamp+study+of+Bacillus+subtilis.">A patch-clamp study of Bacillus subtilis.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1112 (1), 29-38 (1992).</li><li>Zoratti, M., Petronilli, V., Szabo, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch-activated+composite+ion+channels+in+Bacillus+subtilis.">Stretch-activated composite ion channels in Bacillus subtilis.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 168 (2), 443-450 (1990).</li><li>Novo, D., Perlmutter, N. G., Hunt, R. H., Shapiro, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+flow+cytometric+membrane+potential+measurement+in+bacteria+using+diethyloxacarbocyanine+and+a+ratiometric+technique.">Accurate flow cytometric membrane potential measurement in bacteria using diethyloxacarbocyanine and a ratiometric technique.</a> Cytometry. 35 (1), 55-63 (1999).</li><li>Novo, D. J., Perlmutter, N. G., Hunt, R. H., Shapiro, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+flow+cytometric+analysis+of+antibiotic+effects+on+membrane+potential,+membrane+permeability,+and+bacterial+counts+of+Staphylococcus+aureus+and+Micrococcus+luteus.">Multiparameter flow cytometric analysis of antibiotic effects on membrane potential, membrane permeability, and bacterial counts of Staphylococcus aureus and Micrococcus luteus.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 44 (4), 827-834 (2000).</li><li>Shapiro, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+potential+estimation+by+flow+cytometry.">Membrane potential estimation by flow cytometry.</a> Methods. 21 (3), 271-279 (2000).</li><li>Shapiro, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+analysis+at+the+single-cell+level:+tasks+and+techniques.">Microbial analysis at the single-cell level: tasks and techniques.</a> J. Microbiol. Methods. 42 (1), 3-16 (2000).</li><li>Bashford, C. L., Chance, B., Smith, J. C., Yoshida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+behavior+of+oxonol+dyes+in+phospholipid+dispersions.">The behavior of oxonol dyes in phospholipid dispersions.</a> Biophys. J. 25 (1), 63-85 (1979).</li><li>Suzuki, H., Wang, Z. -. Y., Yamakoshi, M., Kobayashi, M., Nozawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+transmembrane+potential+of+bacterial+cells+by+voltage-sensitive+dyes.">Probing the transmembrane potential of bacterial cells by voltage-sensitive dyes.</a> Anal. Sci. 19 (9), 1239-1242 (2003).</li><li>Breeuwer, P., Abee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+the+membrane+potential,+intracellular+pH+and+respiration+of+bacteria+employing+fluorescence+techniques.">Assessment of the membrane potential, intracellular pH and respiration of bacteria employing fluorescence techniques.</a> Mol. Microb. Ecol. Manual. 8, 1563-1580 (2004).</li><li>Mortimer, F. C., Mason, D. J., Gant, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+monitoring+of+antibiotic-induced+injury+in+Escherichia+coli+using+cell-impermeant+fluorescent+probes.">Flow cytometric monitoring of antibiotic-induced injury in Escherichia coli using cell-impermeant fluorescent probes.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 44 (3), 676-681 (2000).</li><li>Clementi, E. A., Marks, L. R., Duffey, M. E., Hakansson, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Initiation+Mechanism+of+Death+in+Streptococcus+pneumoniae+Induced+by+the+Human+Milk+Protein-Lipid+Complex+HAMLET+and+Activated+during+Physiological+Death.">A Novel Initiation Mechanism of Death in Streptococcus pneumoniae Induced by the Human Milk Protein-Lipid Complex HAMLET and Activated during Physiological Death.</a> J. Biol. Chem. 287 (32), 27168-27182 (2012).</li><li>Trombe, M. C., Laneelle, G., Sicard, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+Streptococcus+pneumoniae+mutant+with+altered+electric+transmembrane+potential.">Characterization of a Streptococcus pneumoniae mutant with altered electric transmembrane potential.</a> J. Bacteriol. 158 (3), 1109-1114 (1984).</li><li>Trombe, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+calcium+porter+of+Streptococcus+pneumoniae+involved+in+calcium+regulation+of+growth+and+competence.">Characterization of a calcium porter of Streptococcus pneumoniae involved in calcium regulation of growth and competence.</a> J. Gen. Microbiol. 139 (3), 433-439 (1993).</li><li>Marks, L. R., Clementi, E. A., Hakansson, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitization+of+Staphylococcus+aureus+to+Methicillin+and+Other+Antibiotics+In+Vitro+and+In+Vivo+in+the+Presence+of+HAMLET.">Sensitization of Staphylococcus aureus to Methicillin and Other Antibiotics In Vitro and In Vivo in the Presence of HAMLET.</a> PLoS ONE. 8 (5), (2013).</li><li>Futsaether, C. M., Johnsson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+fura-2+to+measure+intracellular+free+calcium+in+Propionibacterium+acnes.">Using fura-2 to measure intracellular free calcium in Propionibacterium acnes.</a> Can. J. Microbiol. 40 (6), 439-445 (1994).</li><li>Tisa, L. S., Adler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotactic+properties+of+Escherichia+coli+mutants+having+abnormal+Ca2++content.">Chemotactic properties of Escherichia coli mutants having abnormal Ca2+ content.</a> J. Bacteriol. 177 (24), 7112-7118 (1995).</li><li>Werthen, M., Lundgren, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Ca2++mobilization+and+kinase+activity+during+acylated+homoserine+lactone-dependent+quorum+sensing+in+Serratia+liquefaciens.">Intracellular Ca2+ mobilization and kinase activity during acylated homoserine lactone-dependent quorum sensing in Serratia liquefaciens.</a> J. Biol. Chem. 276 (9), 6468-6472 (2001).</li><li>Avery, O. T., MacLeod, C. M., McCarty, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+chemical+nature+of+the+substance+inducing+transformation+of+pneumococcal+types.+Induction+of+transformation+by+a+dexoxyribonuceic+acid+fraction+isolated+from+pneumococcus+type+III.">Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types. Induction of transformation by a dexoxyribonuceic acid fraction isolated from pneumococcus type III.</a> J. Exp. Med. 79, 137-158 (1944).</li><li>Clementi, E. A., Wilhelm, K. R., Schleucher, J., Morozova-Roche, L. A., Hakansson, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Complex+of+Equine+Lysozyme+and+Oleic+Acid+with+Bactericidal+Activity+against.">A Complex of Equine Lysozyme and Oleic Acid with Bactericidal Activity against.</a> PLoS One. . 8, (2013).</li></ol>

والكتاب ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة إلى إعلان.

على الرغم من القيد الذي يطرح حجم واستخدام أساليب الكهربية الكلاسيكية للكشف عن تغيرات في الاستقطاب وسلامة الغشاء والتغيرات في تركيز أيون داخل البكتيريا، التي وصفناها وسيلة لقياس هذه الأحداث في S. الرئوية باستخدام الأصباغ الفلورية. بروتوكولات لدينا هي الأولى من ...

وقد حددت لدينا مختبر مجمع البروتين الدهني من الحليب البشري اسمه هاملت (لالإنسان ألفا ألبومين اللبن مصنوعة قاتلة للخلايا السرطانية) أن يستحث موت الخلايا المبرمج في الخلايا السرطانية، ولكن هي أيضا قادرة على قتل مجموعة متنوعة من الأنواع البكتيرية 1،2. وكانت الأنواع التي وجدت لتكون حساسة بشكل خاص تلك التي تستهدف الجهاز التنفسي، مع العقدية الرئوية (المكورة الرئوية و) عرض أعظم حساسية والنمط الظاهري مثل موت الخلايا المبرمج وفاة 2،3. الأحداث النقل الاستقطاب الغشاء والأيونات محددة هي موصوفة وصفا جيدا والأحداث الحاسمة خلال موت الخلايا المبرمج في الخلايا حقيقية النواة، خاصة في الميتوكوندريا، حيث استخدمت TPP المشعة + الأيونات والأصباغ الفلورية بما JC-1 وTMRE لإثبات الاستقطاب للغشاء الميتوكوندريا 3 -5. وبالتالي، سعينا لمعرفة المزيد حول تأثير هاملت على هذه الميزات ذات الصلة في غشاء الرئوية كما ركزنا جهودنا لتطوير فهم أفضل للمكونات الميكانيكية من النمط الظاهري مثل موت الخلايا المبرمج في البكتيريا، مع إمكانات كبيرة للعلاجات المضادة للبكتيريا تحديد رواية أو اللقاحات المرشحة في هذه العملية. في السعي لوضع بروتوكولات للدراسات الآلية لدينا، اكتشفنا أنه خلافا للمنهجية موصوفة وصفا جيدا في أنظمة حقيقية النواة، وهناك عدد قليل جدا من الدراسات التي نشرت تفاصيل آليات الكهربية والنقل ايون من 6،7 غشاء البكتيريا. ويعزى هذا أساسا إلى حجم أصغر من الكائنات الحية الدقيقة والهندسة المعمارية سطحها، وخصوصا وجود جدار الخلية، والتي تقيد الوصول للغشاء لاستخدام الأساليب التقليدية مثل حقيقية النواة لقط التصحيح، على الرغم من أن بعض الدراسات باستخدام protoplasts العملاقة وقد أجريت بدرجات متفاوتة من النجاح 8،9. كما عمل مع هذه protoplasts العملاقة ليست طريقة مثالية أو حتى العملية لمعظم الأنواع البكتيرية لأنه يتطلب رجلالبكتيريا ipulated في حالة غير طبيعية وغير الحيوية، ودراسات محدودة من بكتيريا قطبية غشاء التي تم تنفيذها قد استخدمت في المقام الأول التدفق الخلوي واستخدام cyanine وoxonol الأصباغ الفلورية 10-16. بدلا من التدفق الخلوي، التي تجمع قراءات مضان الفردية من بكتيريا واحدة في كل نقطة زمنية واحدة، واخترنا لاستخدام قارئ لوحة مضان الكشف للكشف عن كثافة مضان من تعليق البكتيرية في شكل لوحة 96 جيدا مع مرور الوقت. هذا مكننا لعلاج السكان من البكتيريا في نقاط زمنية مختلفة مع أكبر بكثير البساطة وسهولة، وبشكل مستمر رصد حركية مضان من السكان لفترات طويلة من الزمن، وهو أمر صعب تحقيقه من خلال استخدام التدفق الخلوي. بعد اختبار مجموعة واسعة من الأصباغ الفلورية المحتملة تراعي (بما في ذلك تلك المذكورة أعلاه للاستخدام مع الميتوكوندريا)، حققنا أفضل نجاح التقنية والعملية باستخداممكرر oxonol صبغة تسمى DiBAC 4 (3) (مكرر (حمض 1،3-dibutylbarbituric) trimethine oxonol) لرصد التغيرات في قطبية. وجدنا أيضا أنه قيمة لرصد الاضطرابات في نفس الوقت على سلامة الغشاء باستخدام يوديد propidium (PI). هذه الصبغة تتفلور عليها ملزمة لالحمض النووي، ولكن هو فقط قادرة على القيام بذلك عندما يتم المساس سلامة غشاء البكتيريا، مما يجعلها عنصرا شعبية تستخدم للكشف عن الخلايا الميتة في المقايسات تلطيخ الحية ميتة. بالإضافة إلى PI، SYTOX الخضراء وTO-PRO-1 هي الأصباغ الفلورية التي تشبه في العمل، وقد سبق استخدامها للبكتيريا في عدد قليل من الدراسات التي تستخدم التدفق الخلوي طرق الكشف 17. اخترنا لاستخدام PI بسبب الطول الموجي الإثارة لأنه سمح لنا لرصد مضان لها بالتزامن مع DiBAC في عينة معينة. في دراستنا، لاحظنا أن هاملت، فضلا عن مجمع آخر البروتين الدهني ذات الصلة مع النشاط جراثيمالمعروفة باسم ELOA، الاستقطاب الناجم عن وتمزق الغشاء الجرثومي كما يتبين من زيادات في مضان من كل من الأصباغ على علاج المكورات الرئوية 3،18،26. لكل من المجمعات، لاحظنا أن كثافة مضان من DiBAC 4 (3) زيادة قبل الزيادة في كثافة PI، مشيرا إلى أن الاستقطاب وقعت قبل تمزق، وبالتالي، حدث معين الناجمة عن لدينا المجمعات البروتين الدهني جراثيم من الفائدة. هذا التمييز مهم لجعل، وتمزق الغشاء يمكن أن يسبب الاستقطاب نفسها غير محددة. يسمح حركية قياس وتحليل كل DiBAC 4 (3) وPI مضان في وقت واحد منا لدراسة هذه العلاقة بين الحدثين الغشاء، وهي ميزة إضافية لاستخدام التألق بدلا من التدفق الخلوي. لرصد بكتيريا تدفق أيون، كان هناك بعض النجاح السابق مع استخدام النظائر المشعة، بما في ذلك قياس امتصاص45 كا 2 + في المكورة الرئوية 19،20، ونحن قد استخدمت أيضا في دراساتنا الأخيرة 18 و 21. ومع ذلك، والعمل مع هذه الأيونات المشعة لديها العديد من السلبيات. يمكن أن يكون مكلفا، وتستغرق وقتا طويلا، والفوضى، ويمكن أيضا أن تعرض الأفراد الذين يؤدون هذه التجربة لإلحاق الضرر، اعتمادا على النظائر من الفائدة. بالإضافة إلى ذلك، فإنه من الصعب رصد التغيرات السريعة مع مرور الوقت. وبالتالي، لجأنا نحو طريقة بديلة القياس التي تستخدم إصدارات acetoxymethyl (AM) استر من الأصباغ الفلورية مؤشر الحساسة ليثيوم. في حد ذاته، وجهت للصبغ ومؤشر لا تمر عبر الغشاء بسهولة، ولكن مع إضافة مجموعة استر محبة للدهون، يمكن للجزيء الآن بدون تهمة تمر عبر غشاء البكتيريا. عند دخول المناطق الداخلية، والاسترات البكتيرية يلتصق مجموعة استر، وترك الصبغة حرة داخل الخلية واتهم مرة أخرى، وتباطؤ كبير قدرته على الخروج من الخلية والسماح للر صبغس تتراكم داخل بمرور الوقت. ومع ذلك، فقد وصفت فقط استخدام هذه الأصباغ استر في عدد قليل من الأنواع البكتيرية للكشف عن تغيرات في الخلايا كا 2 + H + 22-24 و16، مع أساليب مختلفة من التحميل، والكشف، والنجاح. مع الرغبة في رصد التغيرات في الخلايا كا 2 +، وكذلك + K + H والمستويات في S. الرئوية عند العلاج مع هاملت وغيرها من المركبات، أنشأنا بنجاح بروتوكولات لتحميل الأصباغ الفلورية مؤشر بكفاءة في الخلايا البكتيرية. التحميل فعالة في البكتيريا المطلوبة سواء البروبينسيد الذي يزيد احتباس الصبغة عن طريق منع أنيون النقل وPowerLoad، وهو مركب الملكية من تقنيات الحياة تؤدي إلى زيادة الكفاءة التحميل. Fura-2/AM (كشف كا 2 +)، PBFI / AM (كشف K +)، وBCECF / AM (H + كشف) تم تحميلها بنجاح في كل من unencapsulated ومغلفة المكورات الرئوية الحادي والامطار تمكين قياس أنماط مضان الناتج بعد إضافة ionophores، مثل ionomycin (كا 2 + uncoupler)، valinomycin (K + uncoupler) وCCCP (H + uncoupler) باستخدام قارئ لوحة مضان كشف 18 و 21.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="864">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:359px;">Todd Hewitt</td>
			<td style="width:139px;">Bacto, BD Diagnostics</td>
			<td style="width:143px;">249240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:359px;">Yeast Extract</td>
			<td style="width:139px;">Bacto, BD Diagnostics</td>
			<td style="width:143px;">212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Phosphate Buffered Saline (PBS; pH 7.2)</td>
			<td style="width:139px;">Invitrogen (GIBCO)</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">D5879</td>
			<td>DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:359px;">DiBAC4(3) (bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol)</td>
			<td style="width:139px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:143px;">B-438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Propidium Iodide</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">P4170</td>
			<td>Make up in deionized water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">PowerLoad</td>
			<td style="width:139px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:143px;">P10020</td>
			<td>100X concentrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Probenecid</td>
			<td style="width:139px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:143px;">P36400</td>
			<td>Make 100X stock by adding 1 ml of PBS to one 77 mg vial</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Fura-2/AM</td>
			<td style="width:139px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:143px;">F1221</td>
			<td>Special packaging (50 &#181;g aliquots)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">PBFI/AM</td>
			<td style="width:139px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:143px;">P1267</td>
			<td>Special packaging (50 &#181;g aliquots)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Nigericin</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">N7143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:359px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:139px;">JT Baker</td>
			<td style="width:143px;">3246-01</td>
			<td>monobasic</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:359px;">K2HPO4</td>
			<td style="width:139px;">JT Baker</td>
			<td style="width:143px;">4012-01</td>
			<td>dibasic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">NaOH</td>
			<td style="width:139px;">JT Baker</td>
			<td style="width:143px;">5565-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">BCECF/AM</td>
			<td style="width:139px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:143px;">B1170</td>
			<td>Special packaging (50 &#181;g aliquots)</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:359px;">CCCP</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td>Protonophore that causes an influx of H+ into the cytoplasm,</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>&#160;dissipating the electrical potential and the H+ gradient.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Culture tube&#160;</td>
			<td style="width:139px;">VWR</td>
			<td style="width:143px;">53283-802</td>
			<td>Fits the Spectronic spectrophotometer; borosilicate glass</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td>Spectronic 20D+</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">15 ml plastic conical tube</td>
			<td style="width:139px;">Corning</td>
			<td style="width:143px;">430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Clear 96-well polystyrene microtiter plate</td>
			<td style="width:139px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:143px;">12-565-501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:359px;">Plate reader</td>
			<td style="width:139px;">BioTek</td>
			<td style="width:143px;">Synergy 2 Multi-Mode&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:143px;">Microplate Reader</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:359px;">Gen5 software</td>
			<td style="width:139px;">BioTek</td>
			<td style="width:143px;">Gen5&#8482; Software</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring changes in membrane polarity, membrane integrity, and intracellular ion concentrations in streptococcus pneumoniae using fluorescent dyes

الاستقطاب الغشاء والأيونات تدفقات هي الأحداث التي تمت دراستها على نطاق واسع في النظم البيولوجية بسبب قدرتها على التأثير بعمق الوظائف الخلوية، بما في ذلك علم الطاقة وtransductions الإشارة. في حين أن كلا أساليب الفلورسنت والكهربية، بما في ذلك استخدام القطب والتصحيح، لقط، تم متطورة لقياس هذه الأحداث في الخلايا حقيقية النواة، ومنهجية لقياس أحداث مماثلة في الكائنات الحية الدقيقة أثبتت أكثر تحديا لتطوير نظرا لحجمها الصغير في تركيبة مع أكثر تعقيدا السطح الخارجي للبكتيريا يحمي الغشاء. خلال دراساتنا من الموت الشروع في العقدية الرئوية (المكورات الرئوية)، أردنا توضيح دور الأحداث الغشاء، بما في ذلك التغيرات في قطبية، والنزاهة، وتركيزات أيون بين الخلايا. البحث في الأدب، وجدنا أن عدد قليل جدا من الدراسات وجود لها. وكان المحققون أخرى رصدها امتصاص النظائر المشعة أو التوازن لقياس انفلونزا أيونXES وغشاء المحتملة وعدد محدود من الدراسات، ومعظمها في الكائنات سالبة الجرام، قد شهدت بعض النجاح باستخدام carbocyanine أو oxonol الأصباغ الفلورية لقياس غشاء المحتملة، أو تحميل البكتيريا مع خلايا acetoxymethyl نفيذ (AM) إصدارات استر حساسة ليثيوم مؤشر الأصباغ الفلورية. لذا أنشأنا والبروتوكولات الأمثل لقياس غشاء المحتملة، وتمزق، وايون النقل في الحي إيجابية الجرام S. الرئوية. طورنا البروتوكولات باستخدام الصبغة مكرر oxonol DiBAC 4 (3) وخلايا الصبغة impermeant يوديد propidium لقياس الاستقطاب الغشاء وتمزق، على التوالي، فضلا عن أساليب لتحميل أمثل المكورات الرئوية مع استرات AM من الأصباغ ratiometric FURA-2، PBFI، وBCECF للكشف عن تغيرات في تركيزات داخل الخلايا كا 2 +، K +، وH +، على التوالي، وذلك باستخدام لوحة قارئ مضان الكشف. هذه البروتوكولات هي الأولى من نوعها لالمكورة الرئويةوغالبية هذه الأصباغ لم يتم استخدامها في أي نوع من الأنواع البكتيرية الأخرى. على الرغم وقد تم تحسين بروتوكولات لدينا S. الرئوية، ونحن نعتقد أن هذه الأساليب تشكل نقطة انطلاق ممتازة لدراسات مماثلة في الأنواع البكتيرية الأخرى.

لجميع التجارب، وهناك عينة واحدة ومجموعة من الشروط موجودة في كل بئر. وبالتالي، يمثل كل تتبع كثافة مضان من السكان من البكتيريا مع مرور الوقت. ينبغي أن تكون النتائج للتفسير بسهولة، مع تمييز واضح بين مضان من العينات المعالجة وذلك من ضوابط غير المعالجة. يمكن أن حركية ...

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes at JoVE.c

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

على عكس ما تشهده لحقيقيات النوى، وهناك ندرة في الدراسات التي الاستقطاب الغشاء التفاصيل وتركيز أيون التغييرات في البكتيريا، في المقام الأول وصغر حجمها يجعل الأساليب التقليدية لقياس صعوبة. هنا، ونحن البروتوكولات التفاصيل لرصد مثل هذه الأحداث في الغرام إيجابية هامة الممرض العقدية الرئوية باستخدام تقنيات مضان.

رصد التغيرات في غشاء التقاطب، غشاء النزاهة، وبين الخلايا ايون التركيزات في<em&gt; العقدية الرئوية</em&gt; استخدام الأصباغ نيون

Membrane depolarization and ion fluxes are events that have been studied extensively in biological systems due to their ability to profoundly impact ...

monitoring-changes-membrane-polarity-membrane-integrity-intracellular

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

13.5K Views.  University at Buffalo, State University of New York.  على عكس ما تشهده لحقيقيات النوى، وهناك ندرة في الدراسات التي الاستقطاب الغشاء التفاصيل وتركيز أيون التغييرات في البكتيريا، في المقام الأول وصغر حجمها يجعل الأساليب التقليدية لقياس صعوبة. هنا، ونحن البروتوكولات التفاصيل لرصد مثل هذه الأح...

Video: Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

باستخدام التصوير Bioluminescent بالتحقيق في التآزر بين العقدية الرئوية والأنفلونزا من الفيروسات في الفئران الرضع

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not representative of the behavior, status or phenotype of single cells. Due to this new insight the number of single cell studies rises continuously (for recent reviews see 1,2,3). However, many of the single cell techniques applied do not allow monitoring the development and behavior of one specific single cell in time (e.g. flow cytometry or standard microscopy).
Here, we provide a detailed description of a microscopy method used in several recent studies 4, 5, 6, 7, which allows following and recording (fluorescence of) individual bacterial cells of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae through growth and division for many generations. The resulting movies can be used to construct phylogenetic lineage trees by tracing back the history of a single cell within a population that originated from one common ancestor. This time-lapse fluorescence microscopy method cannot only be used to investigate growth, division and differentiation of individual cells, but also to analyze the effect of cell history and ancestry on specific cellular behavior. Furthermore, time-lapse microscopy is ideally suited to examine gene expression dynamics and protein localization during the bacterial cell cycle. The method explains how to prepare the bacterial cells and construct the microscope slide to enable the outgrowth of single cells into a microcolony. In short, single cells are spotted on a semi-solid surface consisting of growth medium supplemented with agarose on which they grow and divide under a fluorescence microscope within a temperature controlled environmental chamber. Images are captured at specific intervals and are later analyzed using the open source software ImageJ.

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

This protocol provides a step-by-step procedure to monitor single cell behavior of different bacteria in time using automated fluorescence time-lapse microscopy. Furthermore, we provide guidelines how to analyze the microscopy images.

تعيش خلية من التصوير<emالعصوية الرقيقة> و العقدية الرئوية الآلي باستخدام الميكروسكوب مرور الزمن

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing the mucosal surface of the nasopharynx, where it can reside, multiply and eventually overcome host defences to invade to other tissues of the host. Establishment of an infection in the normally lower respiratory tract results in pneumonia. Alternatively, the bacteria can disseminate into the bloodstream causing bacteraemia, which is associated with high mortality rates2, or else lead directly to the development of pneumococcal meningitis. Understanding the kinetics of, and immune responses to, nasopharyngeal colonization is an important aspect of S. pneumoniae infection models.
Our mouse model of intranasal colonization is adapted from human models3 and has been used by multiple research groups in the study of host-pathogen responses in the nasopharynx4-7. In the first part of the model, we use a clinical isolate of S. pneumoniae to establish a self-limiting bacterial colonization that is similar to carriage events in human adults. The procedure detailed herein involves preparation of a bacterial inoculum, followed by the establishment of a colonization event through delivery of the inoculum via an intranasal route of administration. Resident macrophages are the predominant cell type in the nasopharynx during the steady state. Typically, there are few lymphocytes present in uninfected mice8, however mucosal colonization will lead to low- to high-grade inflammation (depending on the virulence of the bacterial species and strain) that will result in an immune response and the subsequent recruitment of host immune cells. These cells can be isolated by a lavage of the tracheal contents through the nares, and correlated to the density of colonization bacteria to better understand the kinetics of the infection.

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Colonization of the murine nasopharynx with Streptococcus pneumoniae and the subsequent extraction of adherent or recruited cells is described. This technique involves flushing the nasopharynx and collection of the fluid through the nares and is adaptable for various readouts, including differential cell quantification and analysis of mRNA expression in situ.

توصيف الاستجابات الالتهابية خلال الاستعمار داخل الشرج مع الالتهاب الرئوي العقدي

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of sexually transmitted infection and also the primary cause of preventable blindness in the world. An essential determinant for successful infection of host cells by Chlamydia is the bacterium's ability to manipulate host cell signaling from within a novel, vacuolar compartment called the inclusion. From within the inclusion, Chlamydia acquire nutrients required for their 2-3 day developmental growth, and they additionally secrete a panel of effector proteins onto the cytosolic face of the vacuole membrane and into the host cytosol. Gaps in our understanding of Chlamydia biology, however, present significant challenges for visualizing and analyzing this intracellular compartment. Recently, a reverse-imaging strategy for visualizing the inclusion using GFP expressing host cells was described. This approach rationally exploits the intrinsic impermeability of the inclusion membrane to large molecules such as GFP. In this work, we describe how GFP- or mCherry-expressing host cells are generated for subsequent visualization of chlamydial inclusions. Furthermore, this method is shown to effectively substitute for costly antibody-based enumeration methods, can be used in tandem with other fluorescent labels, such as GFP-expressing Chlamydia, and can be exploited to derive key quantitative data about inclusion membrane growth from a range of Chlamydia species and strains.

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

A live cell fluorescent protein based method for illuminating cellular vacuoles (inclusions) containing Chlamydia is described. This strategy enables rapid, automated determination of Chlamydia infectivity in samples and can be used to quantitatively investigate inclusion growth dynamics.

باستخدام نيون البروتينات إلى تصور وQuantitate<em&gt; الكلاميديا</em&gt; فجوة النمو حيوية في الخلايا الحية

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

There are over 90 different capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). As well as being a tool for understanding pneumococcal epidemiology, capsular serotyping can provide useful information for vaccine efficacy and impact studies.&#160;The Quellung reaction is the gold standard method for pneumococcal capsular serotyping. The method involves testing a pneumococcal cell suspension with pooled and specific antisera directed against the capsular polysaccharide. The antigen-antibody reactions are observed microscopically. The protocol has three main steps: 1) preparation of a bacterial cell suspension, 2) mixing of cells and antisera on a glass slide, and 3) reading the Quellung reaction using a microscope. The Quellung reaction is reasonably simple to perform and can be applied wherever a suitable microscope and antisera are available.

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

The Quellung reaction is the gold standard technique for serotyping Streptococcus pneumoniae. This technique utilizes a microscope and specific pneumococcal antisera and is commonly used in reference and research laboratories worldwide.

المحفظة المصلي من<em&gt; العقدية الرئوية</em&gt; باستخدام تفاعل الانتباج

There are over 90 different capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). As well as being a tool for understanding pneumococcal ...

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major cause of morbidity and mortality world-wide. Current vaccines target the pneumococcal capsule, and there are over 90 capsular serotypes. Serotyping pneumococcal isolates is therefore important for assessing the impact of vaccination programs and for epidemiological purposes. The World Health Organization has recommended latex agglutination as an alternative method to the &#8216;gold standard&#8217; Quellung test for serotyping pneumococci. Latex agglutination is a relatively simple, quick and inexpensive method; and is therefore suitable for resource-poor settings as well as laboratories with high-volume workloads. Latex agglutination reagents can be prepared in-house utilizing commercially-sourced antibodies that are passively attached to latex particles. This manuscript describes a method of production and quality control of latex agglutination reagents, and details a sequential testing approach which is time- and cost-effective. 
This method of production and quality control may also be suitable for other testing purposes.

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

Latex agglutination testing is a simple, rapid and inexpensive method for serotyping Streptococcus pneumoniae, and has also been widely applied in diagnostic microbiology. This manuscript describes the in-house production of latex agglutination reagents, quality control procedures and the application of this technique to pneumococcal serotyping.

المحفظة المصلي من<em&gt; العقدية الرئوية</em&gt; من جانب تراص اللاتكس

Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major ...

Antibody Labeling with Fluorescent Dyes Using Magnetic Protein A and Protein G Beads

Antibodies labeled with small molecules like fluorescent dyes, cytotoxic drugs, and radioactive tracers are essential tools in biomedical research, immunodiagnostics and more recently as therapeutic agents. Traditional methods for labeling antibodies with small molecules require purified antibodies at relatively high concentration, involve multiple dialysis steps and have limited throughput. However, several applications, including the field of Antibody Drug Conjugates (ADCs), will benefit from new methods that will allow labeling of antibodies directly from cell media. Such methods may allow antibodies to be screened in biologically relevant assays, for example, the receptor-mediated antibody internalization assay in the case of ADCs. Here, we describe a method (on-bead method) that enables labeling of small amounts of antibodies directly from cell media. This approach utilizes high capacity magnetic Protein A and Protein G affinity beads to capture antibodies from the cell media followed by labeling with small molecules using either amine or thiol chemistry and subsequent elution of the labeled antibodies. Taking fluorescent dyes as surrogates for small molecules, we demonstrate the on-bead labeling of three different mouse antibodies directly from cell media using both amine and thiol labeling chemistry. The high binding affinity of antibodies to Protein A and Protein G ensures high recoveries as well as high purity of the labeled antibodies. In addition, use of magnetic beads allows multiple samples to be handled manually, thereby significantly improving labeling throughput.

The on-bead method for labeling antibodies with small molecules enables labeling of a small amount of antibodies directly from cell media. This method is compatible with amine and thiol chemistry, and can handle multiple samples in parallel, manually or using automated platforms.

الأجسام المضادة وصفها مع الأصباغ نيون عن طريق المغناطيسي البروتين والبروتين الخرز G

Antibodies labeled with small molecules like fluorescent dyes, cytotoxic drugs, and radioactive tracers are essential tools in biomedical research, ...

Purification of the Membrane Compartment for Endoplasmic Reticulum-associated Degradation of Exogenous Antigens in Cross-presentation

Dendritic cells (DCs) are highly capable of processing and presenting internalized exogenous antigens upon major histocompatibility class (MHC) I molecules also known as cross-presentation (CP). CP plays an important role not only in the stimulation of na&#239;ve CD8+ T cells and memory CD8+ T cells for infectious and tumor immunity but also in the inactivation of self-acting na&#239;ve T cells by T cell anergy or T cell deletion. Although the critical molecular mechanism of CP remains to be elucidated, accumulating evidence indicates that exogenous antigens are processed through endoplasmic reticulum-associated degradation (ERAD) after export from non-classical endocytic compartments. Until recently, characterizations of these endocytic compartments were limited because there were no specific molecular markers other than exogenous antigens. The method described here is a new vesicle isolation protocol, which allows for the purification of these endocytic compartments. Using this purified microsome, we reconstituted the ERAD-like transport, ubiquitination, and processing of the exogenous antigen in vitro, suggesting that the ubiquitin-proteasome system processed the exogenous antigen after export from this cellular compartment. This protocol can be further applied to other cell types to clarify the molecular mechanism of CP.

The method described here is a new vesicle isolation protocol, which allows for the purification of the cellular compartments where exogenous antigens are processed by endoplasmic reticulum-associated degradation in cross-presentation.

تنقية المقصورة غشاء للتدهور المرتبطة هيولى المستضدات خارجية المنشأ في العرض التقديمي عبر

Dendritic cells (DCs) are highly capable of processing and presenting internalized exogenous antigens upon major histocompatibility class (MHC) I ...

Cell Membrane Repair Assay Using a Two-photon Laser Microscope

Numerous pathophysiological insults can cause damage to cell membranes and, when coupled with innate defects in cell membrane repair or integrity, can result in disease. Understanding the underlying molecular mechanisms surrounding cell membrane repair is, therefore, an important objective to the development of novel therapeutic strategies for diseases associated with dysfunctional cell membrane dynamics. Many in vitro and in vivo studies aimed at understanding cell membrane resealing in various disease contexts utilize two-photon laser ablation as a standard for determining functional outcomes following experimental treatments. In this assay, cell membranes are subjected to wounding with a two-photon laser, which causes the cell membrane to rupture and fluorescent dye to infiltrate the cell. The intensity of fluorescence within the cell can then be monitored to quantify the cell's ability to reseal itself. There are several alternative methods for assessing cell membrane response to injury, as well as great variation in the two-photon laser wounding approach itself, therefore, a single, unified model of cell wounding would beneficially serve to decrease the variation between these methodologies. In this article, we outline a simple two-photon laser wounding protocol for assessing cell membrane repair in vitro in both healthy and dysferlinopathy patient fibroblast cells transfected with or without a full-length dysferlin plasmid.

Cell membrane wounding via two-photon laser is a widely used method for assessing membrane resealing ability and can be applied to multiple cell types. Here, we describe a protocol for in vitro live-imaging of membrane resealing in dysferlinopathy patient cells following two-photon laser ablation.

مقايسة إصلاح غشاء الخلية باستخدام مجهر ليزر اثنين-فوتون

Numerous pathophysiological insults can cause damage to cell membranes and, when coupled with innate defects in cell membrane repair or integrity, can ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In response to these damages, complex molecular machineries rapidly reseal the plasma membrane to restore its barrier function and maintain cell survival. Despite 60 years of research in this field, we still lack a thorough understanding of the cell resealing machinery. With the goal of identifying cellular components that control plasma membrane resealing or drugs that can improve resealing, we have developed a fluorescence-based high-throughput assay that measures the plasma membrane resealing efficiency in mammalian cells cultured in microplates. As a model system for plasma membrane damage, cells are exposed to the bacterial pore-forming toxin listeriolysin O (LLO), which forms large 30-50 nm diameter proteinaceous pores in cholesterol-containing membranes. The use of a temperature-controlled multi-mode microplate reader allows for rapid and sensitive spectrofluorometric measurements in combination with brightfield and fluorescence microscopy imaging of living cells. Kinetic analysis of the fluorescence intensity emitted by a membrane impermeant nucleic acid-binding fluorochrome reflects the extent of membrane wounding and resealing at the cell population level, allowing for the calculation of the cell resealing efficiency. Fluorescence microscopy imaging allows for the enumeration of cells, which constitutively express a fluorescent chimera of the nuclear protein histone 2B, in each well of the microplate to account for potential variations in their number and allows for eventual identification of distinct cell populations. This high-throughput assay is a powerful tool expected to expand our understanding of membrane repair mechanisms via screening for host genes or exogenously added compounds that control plasma membrane resealing.

Here we describe a high-throughput fluorescence-based assay that measures the plasma membrane resealing efficiency through fluorometric and imaging analyses in living cells. This assay can be used for screening drugs or target genes that regulate plasma membrane resealing in mammalian cells.

قياس الإنتاجية العالية من غشاء البلازما إعادة ختم الكفاءة في خلايا الثدييات

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...