<p class="jove_content"وقد تم تمويل&gt; RN جزئيا من قبل ماري كوري الأوروبي منح إعادة الإدماج (أرج) من البرنامج الإطاري السابع للجماعة الأوروبية، رقم المشروع 268324.</p&gt;

1. عزل PMNs من دم الإنسان عن طريق الطرد المركزي الكثافة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رسم 5 9 أنابيب مل من الدم الوريدي heparinized. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد طبقة مزدوجة Ficoll التدرجات (4 تدرجات لمدة 5 أنابيب الدم) على النحو التالي: صب 12 مل من الكثافة 1.119 غ / مل حل ficoll في أنبوب مل 50 و بعناية طبقة 10 مل من الكثافة 1.077 غ / مل حل ficoll على القمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع الدم مع حجم مساو من برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طبقة الدم المخفف بعناية على طبقة مزدوجة Ficoll التدرج؛ 20-25 مل لكل التدرج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة في 396 XG في الدوار الدلو المتأرجح، 22 ° C دون الكبح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد RPMI الباردة التي تحتوي على 0.05٪ الإنسان مصل الزلال (RPMI-HSA). أيضا بإعداد 9 مل العقيمة منزوع الأيونات H 2 O. قبل بارد كل من RPMI وH 2 O على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح طبقة أعلى Ficoll تحتوي على البلازما (صفراء اللون) وPBMC، والطبقة الثانية من Ficoll (أبيض اللون) مع استخدام مضخة فراغ (وضع تلميح ماصة معقمة علىماصة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع PMNs في 50 مل أنابيب باستخدام ماصة بلاستيكية صغيرة (1 أنبوب للكسور PMN من كل التدرجات 2)، ووضعها على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة الباردة RPMI-HSA إلى وحدة تخزين ما مجموعه 50 مل وأجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 249 XG في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلع طاف مع استخدام مضخة فراغ، ودوامة بلطف بيليه (الكريات الحمراء وPMNs). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 9 مل العقيمة منزوع الأيونات H 2 O وبدء موقت. وقف صدمة فرط ناضح بعد 30 ثانية بالضبط، وذلك بإضافة 1 مل 10 مرات المركزة PBS. ملاحظة: 30 ثانية هي حرجة للغاية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة الباردة RPMI-HSA إلى وحدة تخزين ما مجموعه 50 مل وأجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 249 XG في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلع طاف مع استخدام مضخة فراغ وجمع PMN بيليه في 1 أنبوب مع حجم محدد (1-2 مل) RPMI-HSA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد كمية الخلايا وضبط تركيز إلى 1.10 7 خلية / مل. اعتمادا على الجهة المانحة، فإن العائد من PMNs معزولة يكون betweEN 5 × 10 6 و 3 × 10 7 PMNs من كل أنبوب مل 9 من الدم </li></ol> 2. تدفق الفحص Cytometric لتقدير تعبئة الكالسيوم في PMNs الإنسان <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا الحمل (5 × 10 6 خلية / مل) مع 2 ميكرومتر فلوو-3-AM في RPMI-HSA واحتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة هزاز ببطء، وذلك باستخدام هزاز على سبيل المثال على منصة شاكر، محمية من الضوء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في هذه الأثناء بإعداد التخفيف المتسلسل (مثلا 3 أضعاف) من التحفيز في 10X تركيز النهائي. يستخدم PSMα3 في هذا البروتوكول، ولكن أي حافز النوع من الاختزال الذي يعمل على العدلات هو مناسب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد المانع المركزة 10X من مستقبلات في RPMI-HSA. عندما يتصرف المانع على التحفيز (مثل HDL على PSMα3) قبل احتضان 25 ميكرولتر التحفيز مع حجم مساو من مثبط لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا من خلال إضافة 10 مل من RPMI-HSA وأجهزة الطرد المركزي ل249 XG في درجة حرارة الغرفة. Resuspend الخلايا إلى 5 ×10 6 خلية / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فقط قبل التجربة، وتمييع الخلايا إلى الخلايا 2x10 6 / مل في RPMI-HSA وإضافة 200 ميكرولتر خلايا في أنبوب FACS. PMNs المخفف هشة جدا. سوف ابقائها فترة طويلة جدا في هذا التركيز يؤدي إلى صناعة السيارات في تفعيل، والشيء نفسه ينطبق على قوي يهز أو pipetting ل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نعلق الأنبوب إلى تدفق عداد الكريات، وانتظر 3 ثوانى وبدء الاستحواذ. بعد فترة زمنية محددة (على سبيل المثال 8 ثانية)، خلع الأنبوب بسرعة وإضافة 50 ميكرولتر التحفيز للعينة. على الفور إعادة نعلق الأنبوب على صاحب العينة ومواصلة عملية الاستحواذ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نبدأ مع أدنى ونهاية مع أعلى تركيز من التحفيز. غسل إبرة قياس التدفق الخلوي بانتظام بعد كل تشغيل مع RPMI-HSA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل البيانات مع برمجيات تحليل تدفق الخلوي. مقارنة متوسط ​​إشارة مضان قبل الجمع من التحفيز لأنه بعد إضافة الحافز واستخدام الضوابط الإيجابية والسلبية المناسبة لحساب ميلانقوة tivation لكل التخفيف قياسها. </li></ol> بدلا من ذلك عندما يتصرف المانع على مستقبلات قبل احتضان الخلايا مع مثبط. 3. التحليل المجهري مضان من البكتيريا التعبير GFP بعد البلعمة من PMNs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو S. سلالات المكورات تحتوي على بناء مراسل الفائدة أكثر من ليلة في مرق (مع المضادات الحيوية عند الحاجة للحفاظ على مراسل البلازميد). في هذه السلالة حالة MW2 تحتوي يستخدم PSMα GFP بناء مراسل 10، ونمت في أنبوب بلاستيكي 50 مل مع 5 مل من LB مستنبت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإزالة كل من GFP O / N التعبير، ويخفف من الثقافات إلى OD 660 0.01 وتنمو إلى OD 660 0.1. Redilute هذا 01:30 ثقافة، ورصد النمو حتى يصل إلى ثقافة OD 660 من 0.1. جمع البكتيريا عن طريق الطرد المركزي ويغسل مرة واحدة في DPBS. resuspend في 01:10 من حجم الأصلي للحصول على OD 660 من 1.0 أو Roughly 5.10 8 كفو / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج البكتيريا (1.10 7 / مل) مع PMNs المعزولة حديثا (1.10 6 / مل) في RPMI-HSA (نسبة 10:1) في microtube 1.5 مل وإضافة مصل الإنسان المجمعة إلى تركيز النهائي من 10٪. يهز على منصة تهتز لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية لتحفيز البلعمة. تمييع PMNs محملة البكتيريا إلى 5.10 5 PMNs / مل و 250 ميكرولتر ماصة في بئر من 8 غرف جيدا انزلاق الغطاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صورة PMNs مع البكتيريا على المجهر. مجهر مقلوب مجهزة NA الهدف 40X/0.85 يعمل بشكل جيد، وينبغي المغطى في غرفة مظلمة البيئة للحفاظ على البيئة مستقر عند 37 درجة مئوية. الحصول على صور لعدد من وظائف محددة مسبقا باستخدام الكاميرا كل 5-10 دقيقة في كل من حقل مشرق وقناة GFP لمتابعة إنتاج GFP في الوقت المناسب. </li></ol>

<ol>
	<li>Rigby, K. M., DeLeo, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+innate+host+defense+against+Staphylococcus+aureus+infections.">Neutrophils in innate host defense against Staphylococcus aureus infections.</a> Semin. Immunopathol. 34, 237-259 (2012).</li><li>Voyich, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+Mechanisms+Used+by+Staphylococcus+aureus+to+Avoid+Destruction+by+Human+Neutrophils.">Insights into Mechanisms Used by Staphylococcus aureus to Avoid Destruction by Human Neutrophils.</a> The Journal of Immunology. 175, 3907-3919 (2005).</li><li>Kobayashi, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+neutrophil+destruction+following+phagocytosis+of+Staphylococcus+aureus.">Rapid neutrophil destruction following phagocytosis of Staphylococcus aureus.</a> J. Innate Immun. 2, 560-575 (2010).</li><li>DeLeo, F. R., Otto, M., Kreiswirth, B. N., Chambers, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Community-associated+meticillin-resistant+Staphylococcus+aureus.">Community-associated meticillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> The Lancet. 375, 1557 (2010).</li><li>David, M. Z., Daum, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Community-Associated+Methicillin-Resistant+Staphylococcus+aureus:+Epidemiology+and+Clinical+Consequences+of+an+Emerging+Epidemic.">Community-Associated Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus: Epidemiology and Clinical Consequences of an Emerging Epidemic.</a> Clinical Microbiology Reviews. 23, 616-687 (2010).</li><li>Kretschmer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Formyl+Peptide+Receptor+2+Senses+Highly+Pathogenic+Staphylococcus+aureus.">Human Formyl Peptide Receptor 2 Senses Highly Pathogenic Staphylococcus aureus.</a> Cell Host &amp; Microbe. 7, 463 (2010).</li><li>Prat, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+homolog+of+formyl+peptide+receptor-like+1+(FPRL1)+inhibitor+from+Staphylococcus+aureus+(FPRL1+inhibitory+protein)+that+inhibits+FPRL1+and+FPR.">A homolog of formyl peptide receptor-like 1 (FPRL1) inhibitor from Staphylococcus aureus (FPRL1 inhibitory protein) that inhibits FPRL1 and FPR.</a> J. Immunol. 183, 6569-6578 (2009).</li><li>Prat, C., Bestebroer, J., de Haas, C. J. C., van Strijp, J. A. G., van Kessel, K. P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+Staphylococcal+Anti-Inflammatory+Protein+That+Antagonizes+the+Formyl+Peptide+Receptor-Like+1.">A New Staphylococcal Anti-Inflammatory Protein That Antagonizes the Formyl Peptide Receptor-Like 1.</a> The Journal of Immunology. 177, 8017-8026 (2006).</li><li>de Haas, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+inhibitory+protein+of+Staphylococcus+aureus,+a+bacterial+antiinflammatory+agent.">Chemotaxis inhibitory protein of Staphylococcus aureus, a bacterial antiinflammatory agent.</a> The Journal of Experimental Medicine. 199, 687-695 (2004).</li><li>Surewaard, B. G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+Staphylococcal+Phenol+Soluble+Modulins+by+Serum+Lipoprotein+Particles.">Inactivation of Staphylococcal Phenol Soluble Modulins by Serum Lipoprotein Particles.</a> PLoS Pathog. 8, e1002606 (2012).</li><li>Kubica, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Potential+New+Pathway+for+Staphylococcus+aureus+Dissemination:+The+Silent+Survival+of+S.+aureus+Phagocytosed+by+Human+Monocyte-Derived+Macrophages.">A Potential New Pathway for Staphylococcus aureus Dissemination: The Silent Survival of S. aureus Phagocytosed by Human Monocyte-Derived Macrophages.</a> PLoS ONE. 3, e1409 (2008).</li><li>Surewaard, B. G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcal+alpha-phenol+soluble+modulins+contribute+to+neutrophil+lysis+after+phagocytosis.">Staphylococcal alpha-phenol soluble modulins contribute to neutrophil lysis after phagocytosis.</a> Cellular Microbiology. , (2013).</li><li>Queck, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAIII-Independent+Target+Gene+Control+by+the+agr+Quorum-Sensing+System:+Insight+into+the+Evolution+of+Virulence+Regulation+in+Staphylococcus+aureus.">RNAIII-Independent Target Gene Control by the agr Quorum-Sensing System: Insight into the Evolution of Virulence Regulation in Staphylococcus aureus.</a> Molecular Cell. 32, 150 (2008).</li><li>Baban, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescent+Bacterial+Imaging+In+Vivo.">Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo.</a> J. Vis. Exp. (69), e4318 (2012).</li></ol>

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

في الأساليب المذكورة هنا بعض الخطوات هي حرجة للغاية. سوف نسلط الضوء هذه هنا. لعزل العدلات بواسطة الطرد المركزي المتدرج الكثافة من المهم عدم تعكير صفو طبقات أثناء أو بعد الخطوات الطرد المركزي. عندما الشفط العدلات باستخدام ماصة بل?...

العدلات (PMNs) هي البالعات المهنية التي تلعب دورا رئيسيا في الاستجابة المناعية الفطرية ضد المكورات العنقودية الذهبية 1. وقد قاد معركة مستمرة بين المضيف وميكروب إلى سباق تسلح من الاثنين معا. مؤخرا، المجتمع المصاحب (CA) سلالات مقاومة meticillin S. العنقودية الذهبية (الجرثومة) ظهرت الذي يبدو أن تكون فعالة جدا في التحايل على العدلة مقتل 2،3. ارتبط ذوبان modulin (PSMS) الإنتاج المفرط من الفينول CA-MRSA مع ارتفاع الفوعة 4،5. ويمكن التعرف على هذه العدلات الإنسان PSMS عبر FPR2 التي تؤدي إلى تفعيل هذا البروتين يقترن G-مستقبلات 6. واحدة من أقرب الأحداث هو تعبئة مخازن داخل الخلايا من الكالسيوم (كا 2 +). كا 2 + بمثابة رسول الثانوية لمجموعة متنوعة من المهام بما في ذلك المستجيب من PMNs تحبب والبلعمة 7. ولذلك كا 2 + هو مؤشر حساس جدا للالقدرات الوظيفية للPSMS لتفعيل PMNs. لدراسة آثار PSMS على العدلات، يتم عزل العدلات الطازجة ومحملة صبغة تتفلور على تعبئة الكالسيوم. في تجربة التدفق الخلوي ويمكن قياس هذه التعبئة السريعة. باستخدام هذا الأسلوب، فمن الممكن لدراسة الآثار المباشرة للمكونات السامة وغيرها من العدلات، وتحديد أقل تركيز في هذه التي هي بالموقع. بالنسبة لنا، بل هو أداة مفيدة جدا لدراسة تأثير العديد من البروتينات التي تنتجها S. المكورات المشاركة في التهرب المناعي، مثل FPR2 البروتين المثبطة (FLIPr) 8، FLIPr مثل 7، والانجذاب الكيميائي البروتين المثبطة من المكورات العنقودية الذهبية (رقائق) 9. وقد تبين أن كل هذه البروتينات لمنع تعبئة الكالسيوم في العدلات ملزمة لمستقبلات الاعتراف ناهض. في الآونة الأخيرة، وقد وصفت مجموعتنا أن PSMS حرمانهم ظيفيا بواسطة البروتينات الدهنية في الدم 10 &lt;/ سوب&gt;. هذه البروتينات الدهنية موجودة بوفرة داخل الدم والأنسجة البشرية، مشيرا إلى أن PSMS ممارسة وظيفتها في المقام الأول في البيئة داخل الخلايا. سمح بتوفر فحص تعبئة الكالسيوم لنا أن نقيس بدقة تأثير البروتينات الدهنية في الدم على تفعيل العدلات من قبل PSMS، يدل على ذلك تثبيط كبيرا من تركيزات منخفضة جدا من المصل. منذ PSMS وتحول دون وظيفيا عن طريق المصل، ونحن افترضنا أن هناك وظيفة هامة لPSMS كما السموم داخل الخلايا. ولذلك سعينا إلى تحديد دور PSMS بعد البلعمة. للتحقيق في التعبير عن PSMS في الفضاء بين الخلايا، لقد شيدت اندماج مراسل من المروج من الاوبرون psmα إلى GFP. عندما تكون هذه السلالات مراسل S. تم المبتلعة الذهبية من قبل العدلات، تم ملاحظتها تحريض التعبير باستخدام المجهر مضان 10. ومن الواضح أن هذا تكhnique يسمح الدراسة للتعبير عن عدد كبير من الجينات في S. المذهبة أو الجراثيم الأخرى بعد البلعمة. منذ لS. الذهبية على قيد الحياة في محراب بين الخلايا مهم جدا للتغلب على نظام المناعة الفطرية 11 10 12، ودراسة دور الجينات تفعيلها في هذا المتخصصة هي ذات أهمية كبيرة لفهم شدته.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-3, AM</td>
			<td>Molecular Probes / Life Technologies</td>
			<td>F-1241</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5442-03</td>
			<td>density 1.077 g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histopaque</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11191</td>
			<td>density 1.119 g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>52400-025</td>
			<td>contains 25 mM HEPES and L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP5 microscope</td>
			<td>Leica Microsystems, The Netherlands</td>
			<td>TCS SP5</td>
			<td>objective: HCX PL APO 40X/0.85</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSCalibur</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACSCalibur</td>
			<td>Very important that the tube can be removed and replaced during the measurement process</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying interactions of staphylococcus aureus with neutrophils by flow cytometry and time lapse microscopy

نقدم أساليب لدراسة تأثير modulins ذوبان الفينول (PSMS) وغيرها من السموم المنتجة ويفرز من قبل المكورات العنقودية الذهبية على العدلات. لدراسة الآثار المترتبة على PSMS على العدلات ونحن عزل العدلات الطازجة باستخدام الطرد المركزي المتدرج الكثافة. يتم تحميل هذه العدلات مع صبغة تتفلور على تعبئة الكالسيوم. تفعيل العدلات بواسطة PSMS يبدأ الزيادة السريعة وعابرة في تركيز الكالسيوم داخل الخلايا الحرة. في تجربة التدفق الخلوي ويمكن قياس هذه التعبئة السريعة من خلال رصد مضان من صبغة محملة مسبقا أن يتفاعل مع زيادة تركيز الكالسيوم الحرة 2 +. باستخدام هذه الطريقة يمكننا تحديد تركيز PSM اللازمة لتفعيل العدلات، وقياس آثار مثبطات المحددة والعامة من تفعيل العدلات. للتحقيق في التعبير عن PSMS في الفضاء داخل الخلايا، ثه وقد شيدت اندماج مراسل من المروج من الاوبرون PSMα إلى GFP. عندما تكون هذه السلالات مراسل S. والمبتلعة الذهبية من قبل العدلات، يمكن ملاحظة تحريض التعبير باستخدام المجهر مضان.

تدفق cytometric فحص لتقييم تعبئة الكالسيوم في PMNs الإنسان يحتضنها العدلات مع سلسلة تركيز PSMα3 الاصطناعية مما أدى إلى تفعيل السريع مقاسا تدفق الكالسيوم، والذي يظهر من خلال زيادة في إشارة في FL-1. ما قبل الحضانة الاصطناعية PSMα3 مع 0.01٪، مصل ال?...

Watch this Scientific Journal Video about Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy at JoVE.com

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

نقدم أساليب لدراسة تأثير PSMS وغيرها من السموم التي يفرزها<em&gt; المكورات العنقودية الذهبية</em&gt; على العدلات باستخدام التدفق الخلوي ومضان المجهري.

دراسة تفاعلات<em&gt; المكورات العنقودية الذهبية</em&gt; مع العدلات بواسطة التدفق الخلوي والوقت الفاصل بين المجهري

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

studying-interactions-staphylococcus-aureus-with-neutrophils-flow

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

13.0K Views.  University Medical Center Utrecht. نقدم أساليب لدراسة تأثير PSMS وغيرها من السموم التي يفرزها المكورات العنقودية الذهبية على العدلات باستخدام التدفق الخلوي ومضان المجهري.

Video: Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

Most microbes in nature are thought to exist as surface-associated communities in biofilms.1 Bacterial biofilms are encased within a matrix and attached to a surface.2 Biofilm formation and development are commonly studied in the laboratory using batch systems such as microtiter plates or flow systems, such as flow-cells. These methodologies are useful for screening mutant and chemical libraries (microtiter plates)3 or growing biofilms for visualization (flow cells)4. Here we present detailed protocols for growing Staphylococcus aureus in two additional types of flow system biofilms: the drip flow biofilm reactor and the rotating disk biofilm reactor.
Drip flow biofilm reactors are designed for the study of biofilms grown under low shear conditions.5 The drip flow reactor consists of four parallel test channels, each capable of holding one standard glass microscope slide sized coupon, or a length of catheter or stint. The drip flow reactor is ideal for microsensor monitoring, general biofilm studies, biofilm cryosectioning samples, high biomass production, medical material evaluations, and indwelling medical device testing.6,7,8,9
The rotating disk reactor consists of a teflon disk containing recesses for removable coupons.10 The removable coupons can by made from any machinable material. The bottom of the rotating disk contains a bar magnet to allow disk rotation to create liquid surface shear across surface-flush coupons. The entire disk containing 18 coupons is placed in a 1000 mL glass side-arm reactor vessel. A liquid growth media is circulated through the vessel while the disk is rotated by a magnetic stirrer. The coupons are removed from the reactor vessel and then scraped to collect the biofilm sample for further study or microscopy imaging. Rotating disc reactors are designed for laboratory evaluations of biocide efficacy, biofilm removal, and performance of anti-fouling materials.9,11,12,13

The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

Protocols for utilizing open system flow biofilms with drip flow reactors and rotating disk reactors are presented in detail.

استخدام الري بالتنقيط وتدفق مفاعلات الأقراص الدوارة ل المكورات العنقودية الذهبية التحليل بيوفيلم

Most microbes in nature are thought to exist as surface-associated communities in biofilms.1  Bacterial biofilms are encased within a matrix and attached ...

Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA)

MRSA is a worldwide threat to public health, and MRSA skin and soft-tissue infections now account for more than half of all soft-tissue infections in the United States. Among soft-tissue infections, myositis, pyomyositis, and necrotizing fasciitis have been increasingly reported in association with MRSA arising from the community. To understand the interplay between MRSA and host immunity leading to more severe infection, the availability of animal models is critical, permitting the study of host and bacterial factors. Several infection models have been introduced to assess the pathogenesis of S. aureus during superficial skin infection. Here, we describe a subcutaneous infection model that examines the skin, subcutaneous, and muscle pathologies.

Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus MRSA

Murine skin and soft tissue infection model is utilized for assessing the virulence function of methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and the host immunological responses. Here, we presented a subcutaneous infection model for skin and soft tissue infection.

تحت الجلد من العدوى المكورات العنقودية المذهبة المقاومة للميثيسيلين (MRSA)

MRSA is a worldwide threat to public health, and MRSA skin and soft-tissue infections now account for more than half of all soft-tissue infections in the ...

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

S. aureus is a pathogenic bacterium that requires iron to carry out vital metabolic functions and cause disease. The most abundant reservoir of iron inside the human host is heme, which is the cofactor of hemoglobin. To acquire iron from hemoglobin, S. aureus utilizes an elaborate system known as the iron-regulated surface determinant (Isd) system1. Components of the Isd system first bind host hemoglobin, then extract and import heme, and finally liberate iron from heme in the bacterial cytoplasm2,3. This pathway has been dissected through numerous in vitro studies4-9. Further, the contribution of the Isd system to infection has been repeatedly demonstrated in mouse models8,10-14. Establishing the contribution of the Isd system to hemoglobin-derived iron acquisition and growth has proven to be more challenging. Growth assays using hemoglobin as a sole iron source are complicated by the instability of commercially available hemoglobin, contaminating free iron in the growth medium, and toxicity associated with iron chelators. Here we present a method that overcomes these limitations. High quality hemoglobin is prepared from fresh blood and is stored in liquid nitrogen. Purified hemoglobin is supplemented into iron-deplete medium mimicking the iron-poor environment encountered by pathogens inside the vertebrate host. By starving S. aureus of free iron and supplementing with a minimally manipulated form of hemoglobin we induce growth in a manner that is entirely dependent on the ability to bind hemoglobin, extract heme, pass heme through the bacterial cell envelope and degrade heme in the cytoplasm. This assay will be useful for researchers seeking to elucidate the mechanisms of hemoglobin-/heme-derived iron acquisition in S. aureus and possibly other bacterial pathogens.

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

Here we describe a growth assay for Staphylococcus aureus using hemoglobin as the sole source of available nutrient iron. This assay establishes the role of bacterial factors involved in hemoglobin-derived iron acquisition.

المكورات العنقودية الذهبية النمو باستخدام الهيموجلوبين الإنسان باعتبارها المصدر الحديد

S. aureus is a pathogenic bacterium that requires iron to  carry out vital metabolic functions and cause disease. The most abundant  reservoir of iron ...

A Simple and Efficient Method to Detect Nuclear Factor Activation in Human Neutrophils by Flow Cytometry

Neutrophils are the most abundant leukocytes in peripheral blood. These cells are the first to appear at sites of inflammation and infection, thus becoming the first line of defense against invading microorganisms. Neutrophils possess important antimicrobial functions such as phagocytosis, release of lytic enzymes, and production of reactive oxygen species. In addition to these important defense functions, neutrophils perform other tasks in response to infection such as production of proinflammatory cytokines and inhibition of apoptosis. Cytokines recruit other leukocytes that help clear the infection, and inhibition of apoptosis allows the neutrophil to live longer at the site of infection. These functions are regulated at the level of transcription. However, because neutrophils are short-lived cells, the study of transcriptionally regulated responses in these cells cannot be performed with conventional reporter gene methods since there are no efficient techniques for neutrophil transfection. Here, we present a simple and efficient method that allows detection and quantification of nuclear factors in isolated and immunolabeled nuclei by flow cytometry. We describe techniques to isolate pure neutrophils from human peripheral blood, stimulate these cells with anti-receptor antibodies, isolate and immunolabel nuclei, and analyze nuclei by flow cytometry. The method has been successfully used to detect NF-&kappa;B and Elk-1 nuclear factors in nuclei from neutrophils and other cell types. Thus, this method represents an option for analyzing activation of transcription factors in isolated nuclei from a variety of cell types.

Neutrophils are the most abundant leukocytes in blood. Neutrophils possess transcriptionally regulated functions such as production of proinflammatory cytokines and inhibition of apoptosis. These functions can be studied with the method presented here, which allows detection and quantification of nuclear factors by flow cytometry in isolated nuclei

طريقة بسيطة وفعالة لكشف النووية في تفعيل عامل العدلات الإنسان من قياس التدفق الخلوي

Neutrophils  are the most abundant leukocytes in peripheral blood. These cells are the first  to appear at sites of inflammation and infection, thus ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable method of analysis by flow cytometry to study nanoparticle interaction with immune cells. Primary immune cells can be easily purified from human or mouse tissues by antibody-mediated magnetic isolation. In the first instance, the different cell populations running in a flow cytometer can be distinguished by the forward-scattered light (FSC), which is proportional to cell size, and the side-scattered light (SSC), related to cell internal complexity. Furthermore, fluorescently labeled antibodies against specific cell surface receptors permit the identification of several subpopulations within the same sample. Often, all these features vary when cells are boosted by external stimuli that change their physiological and morphological state. Here, 50 nm FITC-SiO2 nanoparticles are used as a model to identify the internalization of nanostructured materials in human blood immune cells. The cell fluorescence and side-scattered light increase after incubation with nanoparticles allowed us to define time and concentration dependence of nanoparticle-cell interaction. Moreover, such protocol can be extended to investigate Rhodamine-SiO2 nanoparticle interaction with primary microglia, the central nervous system resident immune cells, isolated from mutant mice that specifically express the Green Fluorescent Protein (GFP) in the monocyte/macrophage lineage. Finally, flow cytometry data related to nanoparticle internalization into the cells have been confirmed by confocal microscopy.

Analysis of nanoparticle interaction with defined subpopulations of immune cells by flow cytometry.

الكشف عن جسيمات متناهية الصغر نيون التفاعل مع مجموعات سكانية فرعية خلية المناعة الأولية من قبل التدفق الخلوي

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in vivo is crucial for understanding the molecular basis of leukocyte transendothelial migration and interaction with vascular endothelium. One powerful approach involves intravital microscopy on transgenic mice expressing fluorescent proteins in cells of interest.
Here we present a protocol for imaging monocytes and neutrophils in the CX3CR1gfp/wt mouse i.v. injected with orange dye-labeled neutrophils with an inverted confocal microscope. Time-lapse movies gathered from 30 min&#160;to several hours of imaging allow the analysis of leukocyte behavior in mesenteric veins under both steady state and inflammatory conditions. We also describe the steps to locally induce blood vessel inflammation with TLR2/TLR1 agonist Pam3SK4 and monitor the subsequent recruitment of neutrophils and monocytes.
The presented technique can also be used to monitor other populations of leukocytes and investigate molecules implicated in leukocyte recruitment or trafficking using other stimuli or transgenic mice.

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

التصوير العدلات وحيدات في مساريقي الأوردة التي كتبها حيوي داخلي المجهري على الفئران مخدرة في الوقت الحقيقي

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, therefore, suitable to be used for routine purposes. For best resolution, data evaluation and data management, a miniaturized electrophoresis system is required. Together with such an electrophoresis system and the in-house developed software (freely available here) assignment of the pattern of bands to a genotype is standardized and straight forward. DNA extraction is simple (boiling prep), setting-up of the reactions is easy and they can be run on any standard PCR machine. PCR cycling is common except prolonged ramping and elongation times. Compared to spa typing and Multi Locus Sequence Typing (MLST), RS-PCR does not require DNA sequencing what simplifies the analysis considerably and allows a high throughput. Furthermore, the resolution for bovine strains of S. aureus is at least as good as spa typing and better than MLST or pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). The RS-PCR data base includes presently a total of 141 genotypes and variants. The method is highly associated with the virulence gene pattern, contagiosity and pathogenicity of S. aureus strains involved in bovine mastitis. S. aureus genotype B (GTB) is contagious and causes herds problems causing large costs in the Switzerland and other European countries. All the other genotypes observed in Switzerland infect individual cows and quarters. Genotyping by RS-PCR allows the reliable prediction of the epidemiological and the pathogenic potential of S. aureus involved in bovine intramammary infection (IMI), two key factors for clinical veterinary medicine. Because of these beneficial properties together with moderate costs and a high sample throughput the goal of this publication is to give a detailed, step-by-step protocol for easily establishing and running RS-PCR for genotyping S. aureus in other laboratories.

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR RS-PCR

Here, ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is used together with a miniaturized electrophoresis system as a fast and high resolution method for genotyping S. aureus at moderate costs allowing a high throughput.

التنميط الجيني ل<em&gt; المكورات العنقودية الذهبية</em&gt; من جانب خاص بالريبوسوم فاصل PCR (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, ...

Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus

One important feature of the major opportunistic human pathogen Staphylococcus aureus is its extraordinary ability to rapidly acquire resistance to antibiotics. Genomic studies reveal that S. aureus carries many virulence and resistance genes located in mobile genetic elements, suggesting that horizontal gene transfer (HGT) plays a critical role in S. aureus evolution. However, a full and detailed description of the methodology used to study HGT in S. aureus is still lacking, especially regarding natural transformation, which has been recently reported in this bacterium. This work describes three protocols that are useful for the in vitro investigation of HGT in S. aureus: conjugation, phage transduction, and natural transformation. To this aim, the cfr gene (chloramphenicol/florfenicol resistance), which confers the Phenicols, Lincosamides, Oxazolidinones, Pleuromutilins, and Streptogramin A (PhLOPSA)-resistance phenotype, was used. Understanding the mechanisms through which S. aureus transfers genetic materials to other strains is essential to comprehending the rapid acquisition of resistance and helps to clarify the modes of dissemination reported in surveillance programs or to further predict the spreading mode in the future.

Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus

We describe here three different protocols for the in vitro investigation of conjugation, transduction, and natural transformation in Staphylococcus aureus.

منهجية لدراسة نقل أفقي جين في<em&gt; المكورات العنقودية الذهبية</em

One important feature of the major opportunistic human pathogen Staphylococcus aureus is its extraordinary ability to rapidly acquire resistance to ...

Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of the actin cytoskeleton to capture, envelop and engulf large particles. Although phagocytic receptors, downstream signaling pathways, and effectors, such as Rho GTPases, have been identified, the dynamic cytoskeletal remodeling of specific receptor-mediated phagocytic events remain unclear. Four decades ago, two distinct mechanisms of phagocytosis, exemplified by Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)- and complement receptor (CR)-mediated phagocytosis, were identified using scanning electron microscopy. Binding of immunoglobulin G (IgG)-opsonized particles to Fc&#947;Rs triggers the protrusion of thin membrane extensions, which initially form a so-called phagocytic cup around the particle before it becomes completely enclosed and retracted into the cell. In contrast, complement opsonized particles appear to sink into the phagocyte following binding to complement receptors. These two modes of phagocytosis, phagocytic cup formation and sinking in, have become well established in the literature. However, the distinctions between the two modes have become blurred by reports that complement receptor-mediated phagocytosis may induce various membrane protrusions. With the availability of high resolution imaging techniques, phagocytosis assays are required that allow real-time 3D (three dimensional) visualization of how specific phagocytic receptors mediate the uptake of individual particles. More commonly used approaches for the study of phagocytosis, such as end-point assays, miss the opportunity to understand what is happening at the interface of particles and phagocytes. Here we describe phagocytic assays, using time-lapse spinning disk confocal microscopy, that allow 3D imaging of single phagocytic events. In addition, we describe assays to unambiguously image Fc&#947; receptor- or complement receptor-mediated phagocytosis.

Here we describe methods using spinning disk confocal microscopy to image single phagocytic events by mouse resident peritoneal macrophages. The protocols can be extended to other phagocytic cells.

الوقت الفاصل بين التصوير 3D البلعمه التي الضامة الماوس

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of ...

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence rates of S. aureus infection climbing annually, there is a demand for additional research in its&#160;pathogenicity. Animal models of infectious disease advance our understanding of the host-pathogen response and lead to the development of effective therapeutics. Neutrophils play a primary role in the innate immune response that controls S. aureus infections by forming an abscess to wall off the infection and facilitate bacterial clearance; the number of neutrophils that infiltrate an S. aureus skin infection often correlates with disease outcome. LysM-EGFP mice, which possess the enhanced green fluorescent protein (EGFP) inserted in the Lysozyme M (LysM) promoter region (expressed primarily by neutrophils), when used in conjunction with in vivo whole animal fluorescence imaging (FLI) provide&#160;a means of quantifying neutrophil emigration noninvasively and longitudinally into wounded skin. When combined with a bioluminescent S. aureus strain and sequential in vivo whole animal bioluminescent imaging (BLI), it is possible to longitudinally monitor both the neutrophil recruitment dynamics and in vivo bacterial burden at the site of infection in anesthetized mice from onset of infection to resolution or death. Mice are more resistant to a number of virulence factors produced by S. aureus that facilitate effective colonization and infection in humans. Immunodeficient mice provide a more sensitive animal model to examine persistent S. aureus infections and the ability of therapeutics to boost innate immune responses. Herein, we characterize responses in LysM-EGFP mice that have been bred to MyD88-deficient mice (LysM-EGFP&#215;MyD88-/- mice) along with wild-type LysM-EGFP mice to investigate S. aureus skin wound infection. Multispectral simultaneous detection enabled study of neutrophil recruitment dynamics by using in vivo FLI, bacterial burden by using in vivo BLI, and wound healing longitudinally and noninvasively over time.

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

An approach is described for real-time detection of the innate immune response to cutaneous wounding and Staphylococcus aureus infection of mice. By comparing LysM-EGFP mice (which possess fluorescent neutrophils) with a LysM-EGFP crossbred immunodeficient mouse strain, we advance our understanding of infection and the development of approaches to combat infection.

نموذج الماوس لتقييم الفطرية الاستجابة المناعية للعدوى المكوّرات العنقودية الذهبية

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence ...